Method Article

Kwantyfikacja wielkości wątroby u larw danio pręgowanego za pomocą mikroskopii jasnego pola

DOI:

10.3791/60744

⸱

February 2nd, 2020

 ,  ,  , 
1Department of Pathology, Department of Oncological Sciences, and Huntsman Cancer Institute, University of Utah School of Medicine

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj demonstrujemy metodę ilościowego określania wielkości wątroby u larw danio pręgowanego, umożliwiając ocenę wpływu manipulacji genetycznych i farmakologicznych na wzrost i rozwój wątroby.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W kilku transgenicznych modelach raka wątrobowokomórkowego (HCC) zebryo można zaobserwować we wczesnych stadiach larwalnych. Kwantyfikacja wielkości wątroby larw w modelach HCC danio pręgowanego umożliwia szybką ocenę wpływu leków i innych manipulacji na fenotyp związany z onkogenem. Tutaj pokazujemy, jak naprawić larwy danio pręgowanego, wypreparować tkanki otaczające wątrobę, sfotografować wątroby za pomocą mikroskopii jasnego pola, zmierzyć obszar wątroby i przeanalizować wyniki. Protokół ten umożliwia szybkie i precyzyjne określenie ilościowe wielkości wątroby. Ponieważ metoda ta obejmuje pomiar obszaru wątroby, może zaniżać różnice w objętości wątroby i potrzebne są uzupełniające metodologie do rozróżnienia zmian wielkości komórek i zmian liczby komórek. Opisana tutaj technika preparacji jest doskonałym narzędziem do wizualizacji wątroby, jelit i trzustki w ich naturalnych pozycjach w niezliczonych dalszych zastosowaniach, w tym barwieniu immunofluorescencyjnym i hybrydyzacji in situ. Opisana strategia ilościowego określania wielkości wątroby larw ma zastosowanie do wielu aspektów rozwoju i regeneracji wątroby.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rak wątrobowokomórkowy (HCC) jest najczęstszym pierwotnym nowotworem złośliwym wątroby1 i trzecią najczęstszą przyczyną śmiertelności związanej z rakiem2. Aby lepiej zrozumieć mechanizmy hepatokarcynogenezy i zidentyfikować potencjalne terapie HCC, wraz z innymi opracowaliśmy transgenicznego danio pręgowanego, u którego ekspresja onkogenów specyficzna dla hepatocytów, takich jak β-katenina3,4, Kras(V12)5,6, Myc7, lub Yap18 prowadzi do HCC u dorosłych zwierząt. U tych danio pręgowanego powiększenie wątroby obserwuje się już po 6 dniach od zapłodnienia (dpf), co stanowi łatwą platformę do testowania wpływu leków i zmian genetycznych na przerost wątroby spowodowany onkogenami. Dokładny i precyzyjny pomiar wielkości wątroby larw jest niezbędny do określenia skutków tych manipulacji.

Rozmiar i kształt wątroby można ocenić półilościowo u stałych larw danio pręgowanego za pomocą CY3-SA labeling9 lub u żywych larw danio pręgowanego za pomocą specyficznych dla hepatocytów reporterów fluorescencyjnych i mikroskopii preparacyjnej fluorescencji5,6. Ta ostatnia metoda jest stosunkowo szybka, a jej brak precyzji można rozwiązać, fotografując i mierząc obszar każdej wątroby za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazu7,10. Jednak równomierne rozmieszczenie wszystkich żywych larw w eksperymencie w taki sposób, aby dwuwymiarowy obszar wątroby był dokładnym odwzorowaniem wielkości wątroby, może być technicznie trudne. Podobna technika ilościowego określania wielkości wątroby polega na użyciu mikroskopii fluorescencyjnej z użyciem lekkiego arkusza do ilościowego określenia objętości wątroby larw8, co może być dokładniejsze do wykrywania różnic w wielkości, gdy wątroba jest rozszerzona nierównomiernie w różnych wymiarach. Sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) może być używane do zliczania liczby znakowanych fluorescencyjnie hepatocytów i innych typów komórek wątroby w wątrobach larwalnych8,11. W tej metodzie wątroby larwalne są łączone i dysocjowane, więc informacje o indywidualnej wielkości i kształcie wątroby są tracone. W połączeniu z inną metodą określania wielkości wątroby, FACS umożliwia różnicowanie między zwiększoną liczbą komórek (hiperplazja) a zwiększoną wielkością komórek (hipertrofią). Wszystkie te metody wykorzystują kosztowną technologię fluorescencji (mikroskop lub sorter komórek) i, z wyjątkiem znakowania CY3-SA, wymagają znakowania hepatocytów za pomocą reportera fluorescencyjnego.

Tutaj szczegółowo opisujemy metodę ilościowego określania obszaru wątroby larw danio pręgowanego za pomocą mikroskopii jasnego pola i oprogramowania do przetwarzania obrazów3,12,13,14. Protokół ten umożliwia precyzyjne określenie ilościowe obszaru poszczególnych wątrob in situ bez użycia mikroskopii fluorescencyjnej. Analizując rozmiar wątroby, zaślepiamy tożsamość obrazu, aby zmniejszyć stronniczość badaczy i poprawić rygor naukowy15.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania na zwierzętach są przeprowadzane zgodnie z procedurami zatwierdzonymi przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu w Utah.

1. Naprawianie larw

  1. Po 3–7 dniach od zapłodnienia (DPF) należy poddać larwy eutanazji metanosulfonianem trikainy (0,03%) i zebrać do 15 larw w probówce o pojemności 2 ml za pomocą szklanej pipety i pompki do pipet.
  2. Przemyć larwy dwukrotnie 1 ml zimnej (4 °C) soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) na lodzie. Przy każdym płukaniu usuń jak najwięcej płynu z probówki za pomocą szklanej pipety i pompki do pipet, a następnie dodaj 1 ml zimnego PBS do probówki.
  3. Usunąć jak najwięcej PBS za pomocą szklanej pipety i pompki do pipet, a następnie dodać 1 ml zimnego (4 °C) 4% paraformaldehydu (PFA) do PBS.
    UWAGA: PFA jest substancją drażniącą i podejrzewaną o działanie rakotwórcze. Podczas obchodzenia się z PFA należy nosić rękawice, a stężone roztwory należy obchodzić się w okapie oparów chemicznych.
  4. Inkubować w temperaturze 4 °C co najmniej przez noc (ale do kilku miesięcy) z delikatnym kołysaniem.

2. Sekcja tkanek otaczających wątrobę

  1. Usunąć larwy z PFA, spłukując 3x 1 ml zimnego (4 °C) PBS i kołysząc przez 5 minut między płukaniami.
    UWAGA: Opłukane larwy można przechowywać w PBS przez dzień lub dwa w temperaturze 4 °C.
  2. Odpipetować kilka larw z PBS do jednego dołka 9-dołkowego szklanego naczynia z okrągłym dnem.
  3. Usuń skórę otaczającą wątrobę.
    1. Użyj cienkich kleszczy, aby trzymać larwę na plecach (brzuchem do góry), chwytając po obu stronach głowy tak delikatnie, jak to możliwe. Następnie użyj bardzo cienkich kleszczyków w drugiej ręce, aby chwycić skórę tuż nad sercem.
    2. Pociągnij skórę w dół po przekątnej w kierunku ogona ryby i dna naczynia po lewej lub prawej stronie ryby. Powtórz dla drugiej strony (prawej lub lewej strony).
    3. Kontynuuj chwytanie płatów skóry i ciągnięcie w dół/do tyłu, aż cała skóra i melanofory leżące nad wątrobą lub w jej pobliżu zostaną usunięte.
  4. Usuń żółtko, jeśli jest obecne.
    1. W przypadku larw o objętości 5–6 dpf należy zdjąć żółtko w jednym kawałku, przytrzymując rybę cienkimi kleszczami na grzbiecie i delikatnie szturchając żółtko bardzo cienkimi kleszczami.
    2. W przypadku 3–4 larw dpf zeskrob żółtko na kawałki. Trzymaj rybę cienkimi kleszczami na grzbiecie i bardzo cienkimi kleszczami głaskaj żółtko, zaczynając od strony brzusznej.
  5. Wypreparowane larwy umieścić w świeżym, zimnym PBS za pomocą szklanej pipety i pompki do pipet.

3. Obrazowanie

  1. Aby zamontować larwy, wlej kilka ml 3% metylocelulozy na pokrywkę czystej plastikowej szalki Petriego.
  2. Użyj szklanej pipety i pompki do pipet, aby dodać larwy do metylocelulozy, dodając jak najmniej PBS z larwami.
  3. Pod mikroskopem preparacyjnym przy małym powiększeniu użyj drobnych kleszczy, aby ustawić rybę tak, aby leżała na prawym boku, zwrócona w lewo.
    UWAGA: Upewnij się, że ryby są idealnie ułożone na boku, w przeciwnym razie pomiary wątroby mogą nie być dokładne.
  4. Zrób zdjęcie każdej ryby.
    1. Upewnij się, że ryba, która ma być sfotografowana, jest idealnie wyrównana, z jednym okiem bezpośrednio na drugim oku. W razie potrzeby użyj cienkich kleszczy, aby lekko postukać w głowę lub ogon ryby, aby dostosować orientację. Jeśli ogon ryby jest zgięty, usuń ogon, mocno ściskając go kleszczami, aby usunąć go tak, aby ryba leżała płasko.
    2. Powiększ obraz w dużym powiększeniu i skup się na wątrobie, upewniając się, że kontur wątroby jest wyraźnie widoczny.
    3. Zrób zdjęcie i zapisz plik.
    4. Powtórz tę czynność dla wszystkich ryb, upewniając się, że powiększenie jest takie samo dla każdego obrazu.
    5. Zrób zdjęcie mikrometru przy użyciu tego samego powiększenia (patrz Rysunek 2H).

4. Analiza obrazu

  1. Zmierz obszar wątroby każdej ryby za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazu.
    1. Zaślep wszystkie zdjęcia wątroby, aby uniknąć potencjalnej stronniczości badacza i promować rygor naukowy15. Ten krok może być wykonany ręcznie przez innego członka laboratorium lub za pomocą programu komputerowego (Materiał uzupełniający). Zmieniaj losowo nazwy plików i utwórz "plik losowy" zawierający listę oryginalnych nazw plików i odpowiadających im zaślepionych nazw plików.
    2. Otwieraj losowe pliki w kolejności, zaczynając od pliku 1.
    3. Wybierz narzędzie do zaznaczania odręcznego i obrysuj każdą wątrobę.
    4. Naciśnij Ctrl-M, aby zmierzyć obszar każdej wątroby.
    5. W przypadku każdej wątroby, której nie można dokładnie zmierzyć, należy wprowadzić pomiar zastępczy (bardzo mały lub bardzo duży, aby można go było później łatwo wykluczyć).
    6. Zapisz pomiary w pliku tekstowym ("plik pomiarów").
  2. Odślepianie i analizowanie danych
    1. Otwórz "plik pomiarów" i "plik randomizacji" w arkuszu kalkulacyjnym.
    2. Wstaw nową kolumnę w "pliku pomiarów" i dodaj oryginalne nazwy plików dla zaślepionych plików, używając "pliku randomizacji". Zapisz ten plik jako "plik pomiarów odślepionych".
    3. Sortuj dane według oryginalnej nazwy pliku.
    4. Pamiętaj, aby wykluczyć wszelkie pomiary wątroby, dla których zdjęcia były nieodpowiednie (patrz Rysunek 2A–G).
    5. W razie potrzeby przelicz wartości pomiarów na żądaną skalę (np. mm2).
      1. Otwórz pasek skali w oprogramowaniu do przetwarzania obrazu.
      2. Użyj narzędzia do linii prostej, aby zmierzyć 1 mm na pasku skali. Oprogramowanie do przetwarzania obrazu będzie mierzyć w tych samych jednostkach co wątroby (piksele), podając współczynnik konwersji.
      3. Użyj współczynnika konwersji, aby przekonwertować pomiary w "niezaślepionym pliku pomiarów".
    6. Korzystając z arkusza kalkulacyjnego lub wklejając dane do naukowego oprogramowania do tworzenia wykresów i statystyk, określ średnią i odchylenie standardowe oraz oblicz wartość p.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Transgeniczny danio pręgowany wykazujący ekspresję specyficznej dla hepatocytów aktywowanej β-kateniny (Tg(fabp10a:pt-β-cat) danio pręgowany)3 i nietransgeniczne rodzeństwo kontrolne zostały poddane eutanazji przy 6 dpf, a obszar wątroby został określony ilościowo za pomocą mikroskopii jasnego pola i oprogramowania do przetwarzania obrazów. Transgeniczne danio pręgowane mają znacznie większy rozmiar wątroby (0,0006 cm2) w porównaniu do swojego nietransgenicznego rodzeń...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kwantyfikacja wielkości wątroby ma kluczowe znaczenie w badaniach mających na celu zrozumienie rozwoju, regeneracji i onkogenezy wątroby. Opisany tutaj protokół jest stosunkowo szybką, łatwą i tanią techniką ilościowego oznaczania wielkości wątroby u larw danio pręgowanego. Zachowanie odpowiedniej ostrożności podczas wykonywania niektórych aspektów protokołu może pomóc w zwiększeniu dokładności wyników i zmniejszeniu frustracji.

Właściwe utrwalenie larw ma kluczowe znaczenie dla uzyskania dobr...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować Maurine Hobbs i Centralized Zebrafish Animal Resource (CZAR) na Uniwersytecie Utah za udostępnienie hodowli danio pręgowanego, przestrzeni laboratoryjnej i sprzętu do przeprowadzenia części tych badań. Rozbudowa CZAR jest częściowo wspierana przez grant NIH # 1G20OD018369-01. Chcielibyśmy również podziękować Rodneyowi Stewartowi, Chloe Lim, Lance'owi Grahamowi, Cody'emu Jamesowi, Garrettowi Nickumowi i Huntsman Cancer Institute (HCI) Zebrafish Facility za opiekę nad danio pręgowanym. Chcielibyśmy podziękować Kennethowi Kompassowi za pomoc w programowaniu w języku R. Praca ta została częściowo sfinansowana z grantów Huntsman Cancer Foundation (w połączeniu z grantem P30 CA042014 przyznanym Huntsman Cancer Institute) (KJE) i NIH/NCI R01CA222570 (KJE).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Kamera do mikroskopu preparacyjnegoLeica, na przykład
Mikroskop preparacyjnyLeica, na przykład
Cienkie (Dumont #5) kleszczeFine Science Tools11254-20
Pipety szklaneVWR14672-608
Oprogramowanie do analizy obrazuObraz J/FIJIImageJ/FIJI można pobrać za darmo: https://imagej.net/Welcome
MetylocelulozaSigmaM0387
ParaformaldehydSigma AldrichP6148
Sól fizjologiczna buforowana fosforanamiRóżni dostawcy
Pompa do pipetVWR53502-233
Plastikowe szalki PetriegoUSA Scientific Inc2906
9-dołkowa szklana miska z okrągłym dnem PyrexVWR89090-482
Oprogramowanie do zaślepiania plikówR projektR można pobrać za darmo: https://www.r-project.org/
Oprogramowanie do tworzenia wykresów naukowych i statystykProgram arkusza kalkulacyjnego GraphPad Prism
Microsoft Excel
Metanosulfonian trikainy (Tricaine-S)Western Chemical200-226
Bardzo cienkie (Dumont #55) kleszczeNarzędzia do nauki pięknej11255-20

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lin, D. -C., et al. Genomic and Epigenomic Heterogeneity of Hepatocellular Carcinoma. Cancer Research. 77 (9), 2255-2265 (2017).
  2. Ghouri, Y. A., Mian, I., Rowe, J. H. Review of hepatocellular carcinoma: Epidemiology, etiology, and carcinogenesis. Journal of Carcinogenesis. 16, 1(2017).
  3. Evason, K. J., et al. Identification of Chemical Inhibitors of β-Catenin-Driven Liver Tumorigenesis in Zebrafish. PLoS Genetics. 11 (7), 1005305(2015).
  4. Kalasekar, S. M., et al. Heterogeneous beta-catenin activation is sufficient to cause hepatocellular carcinoma in zebrafish. Biology Open. 8 (10), (2019).
  5. Nguyen, A. T., et al. A high level of liver-specific expression of oncogenic Kras(V12) drives robust liver tumorigenesis in transgenic zebrafish. Disease Models & Mechanisms. 4 (6), 801-813 (2011).
  6. Nguyen, A. T., et al. An inducible kras(V12) transgenic zebrafish model for liver tumorigenesis and chemical drug screening. Disease Models & Mechanisms. 5 (1), 63-72 (2012).
  7. Li, Z., et al. A transgenic zebrafish liver tumor model with inducible Myc expression reveals conserved Myc signatures with mammalian liver tumors. Disease Models & Mechanisms. 6 (2), 414-423 (2013).
  8. Cox, A. G., et al. Yap reprograms glutamine metabolism to increase nucleotide biosynthesis and enable liver growth. Nature Cell Biology. 18 (8), 886-896 (2016).
  9. Sadler, K. C., Amsterdam, A., Soroka, C., Boyer, J., Hopkins, N. A genetic screen in zebrafish identifies the mutants vps18, nf2 and foie gras as models of liver disease. Development. 132 (15), Cambridge, England. 3561-3572 (2005).
  10. Huang, X., Zhou, L., Gong, Z. Liver tumor models in transgenic zebrafish: an alternative in vivo approach to study hepatocarcinogenes. Future Oncology. 8 (1), London, England. 21-28 (2012).
  11. Yan, C., Yang, Q., Gong, Z. Tumor-Associated Neutrophils and Macrophages Promote Gender Disparity in Hepatocellular Carcinoma in Zebrafish. Cancer Research. 77 (6), 1395-1407 (2017).
  12. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  13. Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529(2017).
  14. Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis. Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 518-529 (2012).
  15. Landis, S. C., et al. A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research. Nature. 490 (7419), 187-191 (2012).
  16. Dai, W., et al. High fat plus high cholesterol diet lead to hepatic steatosis in zebrafish larvae: a novel model for screening anti-hepatic steatosis drugs. Nutrition & Metabolism. 12, 42(2015).
  17. Kim, S. -H., Speirs, C. K., Solnica-Krezel, L., Ess, K. C. Zebrafish model of tuberous sclerosis complex reveals cell-autonomous and non-cell-autonomous functions of mutant tuberin. Disease Models & Mechanisms. 4 (2), 255-267 (2011).
  18. Delous, M., et al. Sox9b is a key regulator of pancreaticobiliary ductal system development. PLoS Genetics. 8 (6), 1002754(2012).
  19. Shin, D., Lee, Y., Poss, K. D., Stainier, D. Y. R. Restriction of hepatic competence by Fgf signaling. Development. 138 (7), Cambridge, England. 1339-1348 (2011).
  20. Yin, C., Evason, K. J., Maher, J. J., Stainier, D. Y. R. The basic helix-loop-helix transcription factor, heart and neural crest derivatives expressed transcript 2, marks hepatic stellate cells in zebrafish: analysis of stellate cell entry into the developing liver. Hepatology. 56 (5), Baltimore, Md. 1958-1970 (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Liver Size QuantificationBrightfield MicroscopyZebrafish LarvaeTissue DissectionImage AnalysisPFA FixationMethylcellulose MountingFreehand SelectionScale Bar CalibrationHepatocellular Carcinoma

Related Articles