Kwantyfikacja oporności na antybiotyki za pośrednictwem plazmidu w podejściu ewolucji eksperymentalnej

Podsumowanie

Nasze eksperymentalne podejście dostarcza strategię śledzenia obfitości plazmidów i oporności na antybiotyki w czasie w populacjach bakterii.

Streszczenie

Plazmidy odgrywają ważną rolę w ekologii i ewolucji mikroorganizmów jako nośniki bocznego transferu genów i rezerwuary dodatkowych funkcji genów w populacjach mikroorganizmów. Dzieje się tak zwłaszcza w szybko zmieniających się środowiskach, takich jak zmienna ekspozycja na antybiotyki. Niedawno wykazaliśmy, że plazmidy utrzymują geny oporności na antybiotyki w Escherichia coli bez pozytywnej selekcji pod kątem obecności plazmidu. W tym miejscu opisujemy system eksperymentalny, który pozwala śledzić zarówno genotyp, jak i fenotyp plazmidu w długoterminowych eksperymentach ewolucyjnych. Używamy technik molekularnych do zaprojektowania modelowego plazmidu, który jest następnie wprowadzany do eksperymentalnego podejścia opartego na systemie wsadowym ewolucji u gospodarza E. coli. Śledzimy częstość plazmidów w czasie, stosując posiewanie replik populacji E. coli, jednocześnie określając ilościowo trwałość oporności na antybiotyki. Ponadto monitorujemy konformację plazmidów w komórkach gospodarza, analizując zakres tworzenia multimeru plazmidowego przez nacinanie plazmidu i elektroforezę w żelu agarozowym. Takie podejście pozwala nam na wizualizację nie tylko wielkości genomu ewoluujących plazmidów, ale także ich konformacji topologicznej - czynnika bardzo ważnego dla dziedziczenia plazmidów. Nasz system łączy strategie molekularne z tradycyjnymi podejściami mikrobiologicznymi i zapewnia konfigurację do śledzenia plazmidów w populacjach bakterii przez długi czas. Przedstawione podejście może być w przyszłości zastosowane do badania szerokiego zakresu ruchomych elementów genetycznych.

Wprowadzenie

Plazmidy to okrągłe, samoreplikujące się elementy genetyczne, które są wszechobecne u prokariontów. Są one agentami bocznego transferu genów, ponieważ mogą przenosić cechy między populacjami drobnoustrojów, a zatem uważa się, że odgrywają główną rolę w ewolucji drobnoustrojów. Plazmidy są motorami szybkiej adaptacji do warunków ograniczających wzrost w krótkim czasie (np. w obecności antybiotyków lub pestycydów¹) i są odpowiedzialne za długoterminowe przejście do innych trybów stylu życia (np. pojawienie się chorobotwórczości²). Najbardziej uderzające przykłady wpływu plazmidów na transfer genów są udokumentowane w ekosystemach narażonych na zmienne poziomy antybiotyków, takich jak kliniki medyczne lub gospodarstwa przemysłowe³. Ze względu na silną selekcję pozytywną, wiele plazmidów koduje geny oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe i często okazuje się, że nadają wielooporność swojemu gospodarzowi bakteryjnemu. Plazmidy umożliwiają migrację między populacjami lub gatunkami bakterii, co skutkuje szybką propagacją wielorakiej oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe. W warunkach nieselektywnych plazmidy nie są niezbędne dla komórki i często są nawet określane jako elementy pasożytnicze. Niemniej jednak plazmidy są wszechobecne w przyrodzie, a ich ewolucja jest silnie powiązana z ewolucją chromosomów bakteryjnych. Trwałość plazmidów w środowisku naturalnym (zmiennych i nieselektywnych) pozostaje słabo poznana, ale ma ona duże znaczenie dla naszego zrozumienia trwałości genów oporności na antybiotyki w przyrodzie.

Eksperymentalna ewolucja to potężne narzędzie do badania populacji mikroorganizmów⁴. Ewolucja eksperymentalna wykazała, że narzucenie silnej selekcji w celu utrzymania plazmidu prowadzi do kompensacyjnej (tj. adaptacyjnej) ewolucji plazmidu lub chromosomu gospodarza, która zmniejsza koszt dopasowania plazmidu, a co za tym idzie, ułatwia obfitość plazmidu (tj. trwałość plazmidu)^5,6,7. Tak więc śledzenie interakcji plazmid-gospodarz w czasie może ujawnić ważne mechanizmy adaptacji obu elementów. Co więcej, ewolucja eksperymentalna umożliwia ilościowe określenie obfitości komórek przenoszących plazmid w czasie w różnych warunkach^8,9,10.

Trwałość plazmidu w eksperymentach ewolucyjnych może być monitorowana za pomocą kilku strategii, w tym cytometrii przepływowej za pomocą fluorescencyjnego sortowania komórek aktywowanych (FACS)¹¹, ilościowego PCR (qPCR)¹¹, lub w metodach opartych na uprawie. Cytometria przepływowa wymaga urządzenia FACS i wprowadzenia wykrywalnego (fluorescencyjnego) genu markerowego, takiego jak białko zielonej fluorescencji (GFP), na plazmidzie. Jednak ekspresja GFP może zmienić kilka właściwości komórkowych, a ponadto wpływać na lokalizację plazmidu w komórce¹², co z kolei może wpływać na dziedziczenie plazmidu podczas podziału komórki. Podejście qPCR do pomiaru obfitości plazmidu może być wysoce obciążone przez liczbę kopii plazmidu, która może się znacznie różnić w zależności od fazy wzrostu bakterii i w czasie¹³. Wreszcie, podejście oparte na hodowli i posiewie wymaga wprowadzenia wybieralnego genu markerowego. Może to być gen oporności na antybiotyki, który często jest kodowany w naturalnych plazmidach; W związku z tym nie jest konieczna żadna manipulacja genetyczna. Oporność na antybiotyki może iść w parze z tradycyjnym podejściem do posiewu replik. Tak więc, aby badać naturalną dynamikę plazmidu, posiewanie replik dobrze nadaje się do monitorowania odporności antybiotyków kodowanych przez plazmid¹⁴.

Aby zobrazować cząsteczki plazmidu (np. ocenić rozmiar plazmidu), można zastosować kilka metod. Całe plazmidy można amplifikować przy użyciu podejścia opartego na PCR. Wymaga to jednak zaprojektowania specyficznych starterów, co może być wyzwaniem podczas eksperymentu ewolucyjnego, ponieważ sekwencja plazmidu może się zmieniać w czasie. Ponadto trudno jest amplifikować multimery plazmidowe w podejściu opartym na PCR ze względu na wiele miejsc wiązania starterów PCR. Multimeryczne cząsteczki plazmidu mogą pojawić się po zakończeniu replikacji plazmidu lub w wyniku rekombinacji cząsteczek plazmidu i są najczęściej zorientowane od głowy do ogona¹⁵. Inne podejście do wizualizacji plazmidu łączy enzymatyczne trawienie cząsteczek plazmidu przez endonukleazy DNA, które rozszczepiają lub nacinają nić DNA plazmidu, z analizą elektroforezy w żelu agarozowym. Ten sam plazmid o różnych rozmiarach (np. monomery vs. multimery) powoduje różne ruchliwości żelu, które można zaobserwować podczas wizualizacji cząsteczek plazmidu. Takie podejście umożliwia wizualizację i kwantyfikację różnych konformacji plazmidów (tj. stanów multimeryzacji). Konformacja plazmidu może być używana jako wskaźnik stabilności plazmidu, ponieważ multimery plazmidowe są często tracone podczas podziału komórki¹⁶.

W niedawnej pracy obserwowaliśmy utrzymywanie się plazmidu w warunkach, które nie były selektywne dla obfitości plazmidu (tj. bez selekcji antybiotyków). Porównaliśmy trwałość plazmidu w dwóch różnych temperaturach (20 °C i 37 °C) i trzech wielkościach populacji (tj. Szybkościach rozcieńczenia). Zastosowanie różnych współczynników rozcieńczenia, czyli wąskich gardeł populacji, pozwala na zbadanie wpływu wielkości populacji na ewolucję bakterii i plazmidów. Opierając się na naszych wynikach, sugerujemy, że plazmidy mogą być obojętne dla swojego bakteryjnego gospodarza i mogą ewoluować stabilnie bez żadnej presji selekcyjnej⁸. Stabilność wyewoluowanego plazmidu jest zapewniona przez zmniejszenie tworzenia multimeru plazmidowego⁸.

Tutaj prezentujemy protokół do ilościowego oznaczania trwałości plazmidu i badania ewolucji plazmidu w odniesieniu do utrzymania genów oporności na antybiotyki. Metoda składa się z kilku etapów, w tym wstawienia genu oporności na antybiotyki do modelowego plazmidu (który można pominąć w przypadku stosowania naturalnego plazmidu oporności), a następnie zastosowania ewolucji eksperymentalnej w celu oceny potencjału plazmidu do przetrwania w warunkach nieselektywnych przy jednoczesnym określeniu dynamiki częstości plazmidu w czasie za pomocą posiewu repliki. oraz analiza genomu plazmidu poprzez wizualizację. Opisany tutaj protokół został opracowany w celu zbadania ewolucji i trwałości plazmidów, ale może być również stosowany do śledzenia ewolucji genów odporności chromosomalnej (lub innych genów markerowych) w czasie.

Protokół

1. Budowa modelowego plazmidu przenoszącego gen oporności na antybiotyki

UWAGA: Szczep Escherichia coli K-12 MG1655 był używany jako organizm modelowy we wszystkich eksperymentach (DSM nr 18039, Niemiecka Kolekcja Mikroorganizmów i Kultur Komórkowych, DSMZ). Podczas budowy plazmidu użyto szczepu E. coli DH5α¹⁷.

1. PCR amplifikuje wybrany szkielet plazmidowy i amplifikuje gen oporności, w tym region promotora, metodą PCR (Rysunek 1).
   1. PCR amplifikuje szkielet plazmidu za pomocą polimerazy o wysokiej wierności i oligonukleotydów pBBR1_for (5'-GCGGCCACCGGCTCTCT-3') i pBBR1_rev (5'-TACCGGCGCGGCAGCGTGACCC-3') na matrycy plazmidu pLC (GenBank wg. MH238456)¹⁸.
   2. PCR amplifikuje gen oporności nptII, w tym natywny promotor Tn5¹⁹ przy użyciu polimerazy o wysokiej wierności i oligonukleotydów nptII_gib_for (5'-GCGCCGGTAGATCTGCTCATGTTTGAAGCTTCACGCTGCCGCA-3') i nptII_gib_rev (5'-CGGTGGCCGCCAAAAAAGGCCATCCGTCAGGTCAGAAGAACTCGT-3'). Gen nptII koduje fosfotransferazę neomycyny i nadaje oporność na kanamycynę.
      UWAGA: Zaprojektuj startery dla genu oporności z około 20 pz sekwencji komplementarnej do szkieletu plazmidu, z którym zostanie połączony.
2. Wyczyść oba fragmenty PCR za pomocą wybranego zestawu.
3. Połącz oczyszczony produkt PCR z genem oporności na antybiotyki (w tym jego region promotora) z oczyszczonym szkieletem plazmidu i połącz regiony homologiczne za pomocą montażu izotermicznego²⁰, w temperaturze 50 °C przez 60 min.
4. Elektroporować stopiony produkt do szczepu E. coli DH5α.
   1. Wprowadzić 2 μl produktu z kroku 1.3 do 40 μl elektrokompetentnych ogniw w kuwetach 2 mm w temperaturze 4 °C i 2,5 kV. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml bulionu lizogenicznego (LB).
   2. Przenieść całkowitą objętość do probówki do mikrofuge i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C, wytrząsając z prędkością 250 obr./min w wytrząsarce orbitalnej, aby umożliwić ekspresję markera oporności na plazmidzie.
   3. Umieść 100 μl komórek na płytkach agarowych LB zawierających odpowiedni antybiotyk (kanamycyna 25 μg/ml) w celu selekcji genu oporności na antybiotyki, a tym samym selekcji komórek przenoszących plazmid. Resztę odkręcić, usunąć supernatant, ponownie zawiesić komórki w 100 μl LB i ułożyć je na selektywnej płytce agarowej. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.
5. W celu weryfikacji klonów należy wyekstrahować zbudowane plazmidy za pomocą lizy alkalicznej przy użyciu komercyjnego zestawu do przygotowania mini.
   1. Zbierz 5 ml stacjonarnej kultury przez noc, odwirowując przy 12 000 x g w temperaturze pokojowej. Ponownie zawiesić komórki w roztworze do ponownego zawieszania, a następnie poddać go lizie i zneutralizować. Wirować przez 5 minut przy 12 000 x g.
   2. Przenieść supernatant do kolumny wiążącej DNA dostarczonej w zestawie i przemyć kolumnę dwukrotnie 500 μl roztworu myjącego, odwirować 2x przed elucją, membranę kolumny buforem elucyjnym.
   3. Wykonaj sekwencjonowanie plazmidu metodą Sangera, aby potwierdzić, że sekwencja jest poprawna.
6. Po zweryfikowaniu trafności plazmidu należy poddać elektroporację plazmidu (teraz pCON) do szczepu E. coli MG1655, jak opisano powyżej. W ten sposób powstaje szczep E. coli MG1655 pCON.

2. Monitorowanie bakterii przenoszących plazmid w różnych warunkach w czasie

UWAGA: Eksperyment ewolucyjny jest przeprowadzany na szczepach przenoszących plazmid w warunkach nieselektywnych (pożywki LB) w dwóch temperaturach (37 °C i 20 °C) i trzech rozmiarach wąskich gardeł populacji. Projekt eksperymentalny służy do badania trwałości plazmidu w różnych warunkach.

1. Projekt eksperymentu ewolucyjnego w celu śledzenia częstości plazmidu w czasie (Rysunek 2)
   1. Uformowany szczep przenoszący plazmid (E. coli MG1655 pCON) należy umieścić na płytkach agarowych LB uzupełnionych antybiotykami (kanamycyna 25 μg/ml) i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
   2. Przygotuj 96 płytek z głębokim dołkiem po 1 ml pożywki LB w każdym dołku. Jako przodkowie bakterii wybierz osiem losowo izolowanych kolonii z płytki agarowej w niezależnych studzienkach. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C i prędkości 450 obr./min na wytrząsarce płytek przez 24 godziny. Przygotuj zamrożony zapas glicerolu z klonów przodków.
   3. Następnego dnia przenieś osiem powtórzonych populacji do nowych płytek głębinowych zgodnie z projektem eksperymentalnym (Rysunek 2). Kultury rozcieńcza się w stosunku 1:100 (duże wąskie gardło, L), 1:1,000 (średnie wąskie gardło, M) lub 1:10,000 (małe wąskie gardło, S) w całkowitej objętości 1 ml LB przy użyciu PBS do rozcieńczenia. Rozcieńczone kultury inkubuje się w temperaturze 37 °C i 20 °C.
      UWAGA: Bardzo ważne jest kontrolowanie zanieczyszczenia krzyżowego w płytce z 96 dołekami. Dlatego użyj projektu płytki w szachownicę, interkalując zaszczepione studzienki z wolnym od bakterii podłożem LB. Użyj tego wzorca przez cały eksperyment ewolucyjny.
   4. Kultury inkubowane w temperaturze 37 °C przenosi się co 12 godzin, natomiast kultury w temperaturze 20 °C przenosi się co 24 godziny.
      UWAGA: Podczas każdego zdarzenia transferowego stosowana jest metoda zmniejszania rozmiaru wąskiego gardła, a transfer szeregowy jest powtarzany w sumie przez 98 transferów. Liczba transferów będzie zależała od eksperymentalnego projektu czytników.
   5. Przygotuj zamrożony zapas glicerolu dla wszystkich populacji regularnie, 2x w tygodniu.
2. Monitorowanie częstości plazmidu za pomocą posiewu repliki (Rysunek 3)
   UWAGA: Podczas eksperymentu ewolucyjnego częstość występowania komórek przenoszących plazmid w populacji jest szacowana na podstawie proporcji gospodarzy. Protokół poszycia repliki jest pokazany w Rysunek 3.
   1. Aby określić częstość występowania plazmidu w populacji podczas eksperymentu ewolucyjnego, stacjonarne kultury są seryjnie rozcieńczane i posiewane na nieselektywnych płytkach agarowych LB. Dostosuj rozcieńczenie w zależności od wydajności 250-500 kolonii na płytkę.
      UWAGA: Przed posiewem przygotuj grube płytki agarowe LB (~30 ml agaru).
   2. Posiewane populacje są inkubowane w celu wzrostu przez noc zgodnie z ich temperaturą wzrostu w eksperymencie.
      UWAGA: Kolonie muszą być małe, dlatego inkubować <24 h w temperaturze 37 °C.
   3. Po nocnym wzroście policz wszystkie kolonie za pomocą ręcznej lub automatycznej stacji zliczania kolonii i oblicz całkowitą wielkość populacji bakterii w kulturach.
      UWAGA: Kolonie na krawędzi płytki agarowej nie powinny być wliczane do całkowitej liczby komórek bakteryjnych.
   4. Wysterylizuj kwadratowe kawałki (~20 x 20 cm) aksamitu bawełnianego przez autoklawowanie.
      UWAGA: Aksamitna ściereczka musi być w 100% bawełniana, aby można ją było sterylizować w autoklawie. Ważne jest, aby wysuszyć szmatkę po sterylizacji.
   5. Po wysterylizowaniu aksamitnej szmatki połóż szmatkę na okrągłym bloku i przymocuj ją metalowym pierścieniem. Bardzo ważne jest, aby unikać zmarszczek. Ostrożnie umieść płytkę z wyhodowanymi koloniami (agarem skierowanym w dół) na zamocowanej powierzchni aksamitnej tkaniny. Upewnij się, że wszystkie kolonie dotykają aksamitnej powierzchni, ostrożnie stukając w szalkę Petriego w okrężny sposób.
   6. Ostrożnie wyjąć płytkę agarową LB i umieścić selektywną płytkę uzupełnioną antybiotykami (kanamycyna 25 μg/ml) na aksamitnej szmatce. Upewnij się, że talerz dotyka całego aksamitu, ostrożnie stukając w szalkę Petriego, jak opisano wcześniej. Następnie wyjmij płytkę. Pozostaw płytki w temperaturze pokojowej do wzrostu przez noc.
   7. Następnego dnia oceń zarówno płytkę agarową LB, jak i płytkę selektywną. Kolonie, które rosną na selektywnych pożywkach, są liczone jako gospodarze plazmidowi (tj. Oporni na antybiotyki), podczas gdy miejsca wolne od kolonii to kolonie, które były wolne od plazmidu, a zatem nie są odporne na antybiotyk (tj. Utraciły plazmid). Odbywa się to poprzez umieszczenie płytek jedna na drugiej i porównanie wzrostu (tj. zaznaczenie brakujących kolonii) oraz zliczenie liczby kolonii na obu płytkach. W ten sposób uzyskuje się liczbę komórek, które utraciły plazmid podczas eksperymentu ewolucyjnego.
   8. Powtarzaj tę procedurę przez cały eksperyment ewolucyjny w regularny sposób (np. co 14 transferów).

3. Wizualizacja multimerów plazmidowych za pomocą elektroforezy żelowej

UWAGA: Ekstrakcja plazmidów o niskiej kopii często prowadzi do zanieczyszczenia chromosomalnym DNA gospodarza, które musi być enzymatycznie trawione przed wizualizacją.

1. Ekstrahować plazmidowe DNA ze stacjonarnej hodowli komórkowej przez noc o pojemności 5 ml za pomocą lizy alkalicznej, jak opisano w kroku 1.5.
2. Następnie potraktuj wyekstrahowany plazmidowy DNA zależną od ATP DNazą, która tnie tylko chromosomalne DNA w celu usunięcia zanieczyszczenia chromosomalnego DNA (patrz Tabela materiałów). Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Następnie oczyść DNA za pomocą wybranego zestawu.
3. Aby utworzyć cząsteczki o otwartym okręgu wszystkich konformacji plazmidowych (monomerów lub multimerów), należy inkubować próbki plazmidowego DNA z enzymem nacinającym (Nb.BsrDI) i inkubować przez 30 minut w temperaturze 65 °C.
4. Równolegle, aby utworzyć liniowe cząsteczki plazmidu (tj. do porównania wielkości plazmidu), użyj wybranego enzymu restrykcyjnego (np. HindIII), który rozszczepia plazmid raz.
   UWAGA: W ten sposób powstają liniowe monomery plazmidu DNA. Cząsteczki z otwartym obiegiem nie migrują w sposób liniowy.
5. Aby uwidocznić rozmiar i konformację plazmidu, należy elektroforować wycięte i liniowe próbki DNA plazmidu przez 120 minut przy 4,3 V/cm w 1% (w/v) żelu agarozowym i buforze 1× TAE. Próbki są barwione kolorem Midori green, a żel jest wizualizowany w systemie obrazowania żelu (patrz Tabela materiałów). Użyj drabiny 1 kbp.

Wyniki

Tutaj prezentujemy podejście do badania ewolucji plazmidu poprzez ilościowe określenie trwałości plazmidu w populacji. Po pierwsze, pokazujemy, jak zbudować plazmid przenoszący szczep E. coli MG1655 pCON, który jest następnie wprowadzany do eksperymentu ewolucyjnego. Po drugie, przedstawiamy prostą metodę śledzenia obfitości plazmidu w ewoluujących populacjach bakterii. Na koniec pokazujemy, jak wizualizować wielkość i konformację cząsteczki plazmidu.

W naszej poprzedniej pracy⁸ stosując przedstawione podejście, przeprowadziliśmy eksperyment ewolucyjny po przetrwaniu plazmidów oporności na antybiotyki u E. coli przy braku antybiotyków (Rysunek 4). Nasze reprezentatywne wyniki pokazują ewolucję populacji w temperaturze 37 °C i współczynniku rozcieńczenia ^10-4. Podążając za obfitością komórek przenoszących plazmid, zaobserwowaliśmy spadek częstotliwości komórek gospodarza przenoszących plazmid w czasie (Rysunek 4). Nasze podejście pozwoliło nam odkryć, że utrata plazmidu była wynikiem architektury skondensowanego genomu plazmidu, co doprowadziło do niestabilności plazmidu spowodowanej konfliktami wprowadzonymi przez transkrypcję genu oporności i replikację samego plazmidu. Wizualizacja cząsteczek plazmidu pozwoliła nam odkryć, że te konflikty doprowadziły do niestabilnej konformacji plazmidu (tj. tworzenia multimeru plazmidowego, Rysunek 5). Niemniej jednak zaobserwowaliśmy ewolucję stabilności plazmidu bez ekspozycji na antybiotyki (Ryc. 4). Wyewoluowana stabilność została zapewniona przez wewnętrzną duplikację plazmidu, która zniosła konflikty transkrypcji-replikacji i doprowadziła do powstania stabilnie dziedziczonych plazmidów. Nasze wyniki pokazują zatem znaczenie rekombinacji i amplifikacji genomu w adaptacyjnej ewolucji elementów genetycznych.

Rysunek 1: Plazmidowa konstrukcja pCON. Schematyczne przedstawienie strategii klonowania użytej do budowy plazmidu pCON. Szkielet plazmidowy (pBBR1) i gen oporności na antybiotyki (nptII) są amplifikowane metodą PCR i łączone metodą fuzji izotermicznej²⁰. W ten sposób uzyskuje się plazmid pCON i szczep MG1655 pCON. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Projekt długoterminowego eksperymentu ewolucji. Schematyczne przedstawienie eksperymentu z transferem szeregowym. Populacje przenoszące plazmid (pCON) są siane na pożywkach selektywnych. Kolonie przodków są losowo wybierane z tabliczki i wprowadzane do systemu transferu szeregowego. Transfery przeprowadza się przy użyciu trzech różnych podejść do rozcieńczania w celu symulacji wąskich gardeł populacji o różnej wielkości. Rozcieńczenia są powtarzane seryjnie. Eksperyment przeprowadzany jest w dwóch reżimach temperaturowych. Częstość plazmid-gospodarz jest mierzona wzdłuż eksperymentu za pomocą posiewu repliki. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Poszycie repliki. Schematyczne przedstawienie etapów stosowanych w replikowaniu posiewów populacji bakterii. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Reprezentatywna częstość pCON w czasie. Trwałość pCON jest pokazana jako odsetek gospodarzy (reprezentatywnych populacji replikowanych) podczas eksperymentu ewolucyjnego. Dla 98 transferów populacje plazmidów pCON ewoluowały w warunkach nieselektywnych ze współczynnikiem rozcieńczenia ^10-4. Wszystkie kontrpróby przenoszące plazmid pCON zmniejszyły się w populacji. Następnie populacje zostały wystawione na działanie antybiotyków w celu inkubacji przez noc i ponownie hodowane w warunkach nieselektywnych w celu zbadania ewolucji stabilności plazmidu. Ten rysunek został zmodyfikowany z Wein et al.⁸ Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 5: Reprezentatywna analiza konformacji plazmidu. Wizualizacja modelu plazmidu pCON. Wizualizowane jest nieleczone plazmidowe DNA bezpośrednio po ekstrakcji, zlinearyzowane plazmidowe DNA i potraktowane DNazą, która tnie tylko chromosomalne DNA, a także enzymatycznie nacięte DNA (tj. DNA plazmidu o otwartym okręgu). Linearyzacja plazmidu pokazuje, że wszystkie plazmidy są tego samego rozmiaru. Usunięcie chromosomalnego DNA i nacięcie pCON ujawnia obecność dimerów i innych multimerów. Ten rysunek został zmodyfikowany z Wein et al.⁸. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

W tym protokole przedstawiamy podejście, które łączy techniki biologii molekularnej, ewolucji eksperymentalnej i wizualizacji DNA w celu zbadania roli ewolucji plazmidu dla utrzymywania się oporności na antybiotyki u bakterii. Mimo, że prezentowane podejście łączy w sobie metody z różnych obszarów badawczych, wszystkie stosowane techniki są proste i mogą być wykonywane w standardowym laboratorium mikrobiologicznym.

Najbardziej krytyczne kroki w protokole obejmują budowę modelowego szczepu systemowego, który obejmuje genetyczną walidację genotypu przenoszącego plazmid. Warto zauważyć, że wiele plazmidów naturalnie koduje geny oporności na antybiotyki. W związku z tym czytelnik może pominąć krok 1 protokołu i bezpośrednio przejść do kroku 2. Następnie, eksperymenty ewolucyjne powinny obejmować losowy projekt populacji powtórzonych, tak aby wyniki nie były zniekształcone przez położenie populacji powtórzonych w płytce głębinowej. Ponadto szczególnie ważne jest staranne przeprowadzenie etapów transferu seryjnego i rozcieńczania w eksperymencie ewolucji, ponieważ zanieczyszczenie mogłoby zafałszować wyniki. Wreszcie, poszycie repliki powinno być przeprowadzone z dużą ostrożnością. Duży rozmiar kolonii może być problemem, ale można go uniknąć, inkubując płytki przez mniej niż 24 godziny. Podobnie, liczba kolonii na jednej płytce może zniekształcać wyniki posiewu replik. Dlatego populacje należy rozcieńczyć przed posiewem i replikacją.

Jedną z największych zalet naszego podejścia jest to, że można je łatwo odtworzyć bez konieczności użycia ciężkiego sprzętu. Ponadto kolejną zaletą posiewu replik w celu śledzenia genów markerowych jest to, że oceniane są tylko żywe komórki, w przeciwieństwie do cytometrii przepływowej lub qPCR, w których martwe komórki mogą być oceniane jako żywe. W związku z tym posiewanie replik wprowadza mniejsze odchylenie do liczenia komórek przenoszących plazmid. Niemniej jednak jednym z ograniczeń posiewu replik może być wielkość populacji (tj. liczba komórek), którą można ocenić w jednym cyklu eksperymentalnym.

Korzystając z naszego podejścia, wykazaliśmy niedawno, że ewolucja stabilności plazmidu nasila trwałość genów oporności na antybiotyki u bakterii. W związku z tym opracowaliśmy podejście jako narzędzie do śledzenia trwałości oporności za pośrednictwem plazmidu, które ma duże znaczenie dla śledzenia oporności w czasie, zwłaszcza w warunkach bez obecności antybiotyków.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Płytki głębokoprzepuszczalne	96 Starlab
96-dołkowe	Roth	EN07.1	2 ml, kwadratowe
płytki 96-dołkowe (krio)	Starlab	E1702-8400	System probówek do mikrorozcieńczania
Licznik kolonijny	Stuart	SC6 +
Draperia		z aksamitu bawełnianego	wymagana
100 % bawełnyKomora do elektroforezy	BioRad		Elektroforeza w żelu agarozowym
Zasilanie do elektroforezy	BioRad	1645070	Elektroforeza w żelu agarozowym
Kuwety do elektroporacji	BioRad	1652089	0,1 cm
Elektroporator	BioRad	1652660
GeneJet Gel Zestaw ekstrakcyjny	Thermo Fisher Scientific	K0832	PCR Oczyszczanie fragmentów
GeneJet Plasmid Miniprep kit	Thermo Fisher Scientific	K0503	Zestaw do ekstrakcji plazmidu
Gibson Assembly	New England Biolabs	E2611S
Inkubator	Thermo Fisher Scientific	50125852
(wytrząsarka płytkowa)	Inkubator Heidolph	1000
(shaker)	New Brunswick Scientific	Innova 44
Pętle inokulacyjne	Sigma-Aldrich
Pipety wielokanałowe	Eppendorf	3125000052, 3125000028
Pipety wielokanałowe	Capp	ME8-1250R
NanoDrop 2000/2000c	Thermo Fisher Scientific	ND2000
Oligonukleotydy	Eurofines
Szalki Petriego	Sigma-Aldrich
Phusion Polimeraza	Thermo Fisher Scientific	F533S
Pipety	Eppendorf	3123000012, 3123000098, 3123000055, 3123000063,
PlasmidSafe enzym	Epicentrum	10059400
Probówki reakcyjne	Eppendorf	30125150
Replika bloku i metalowego pierścienia	VWR	601-3401	Butla PVC 69 mm; pierścień 102cm
Enzymy resctriction	New England Biolabs
Termocykler	BioRad	T100