Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ocena funkcji pamięci u myszy z padaczką indukowaną pilokarpiną

7.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60751

⸱

4 czerwca 2020

 ,  ,  , 
1Department of Pharmacology, Department of Biomedicine & Health Sciences, Catholic Neuroscience Institute, Institute of Aging and Metabolic Diseases, College of Medicine, The Catholic University of Korea

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł przedstawia eksperymentalne procedury oceny zaburzeń pamięci u myszy z padaczką wywołaną pilokarpiną. Protokół ten może być wykorzystany do badania patofizjologicznych mechanizmów spadku funkcji poznawczych związanego z padaczką, który jest jedną z najczęstszych chorób współistniejących w padaczce.

Streszczenie

Upośledzenie funkcji poznawczych jest jedną z najczęstszych chorób współistniejących w padaczce skroniowej. Aby podsumować spadek funkcji poznawczych związany z padaczką w zwierzęcym modelu padaczki, wygenerowaliśmy myszy z przewlekłą padaczką leczoną pilokarpiną. Przedstawiamy protokół trzech różnych testów behawioralnych z użyciem tych myszy padaczkowych: testy lokalizacji nowych obiektów (NL), rozpoznawania nowych obiektów (NO) i separacji wzorców (PS) w celu oceny uczenia się i pamięci odpowiednio dla miejsc, obiektów i kontekstów. Wyjaśniamy, jak ustawić aparat behawioralny i zapewniamy procedury eksperymentalne dla testów NL, NO i PS po teście w otwartym polu, który mierzy podstawową aktywność lokomotoryczną zwierząt. Opisujemy również zalety techniczne testów NL, NO i PS w odniesieniu do innych testów behawioralnych do oceny funkcji pamięci u myszy z padaczką. Na koniec omawiamy możliwe przyczyny i rozwiązania dla myszy padaczkowych, które nie nawiązują 30 sekund dobrego kontaktu z obiektami podczas sesji zapoznawczych, co jest krytycznym krokiem dla udanych testów pamięci. W związku z tym protokół ten dostarcza szczegółowych informacji na temat tego, jak ocenić zaburzenia pamięci związane z padaczką za pomocą myszy. Testy NL, NO i PS są prostymi, skutecznymi testami, które są odpowiednie do oceny różnych rodzajów pamięci u myszy z padaczką.

Wprowadzenie

Padaczka jest przewlekłym zaburzeniem charakteryzującym się spontanicznymi, nawracającymi napadami1,2,3. Ponieważ powtarzające się napady mogą powodować nieprawidłowości strukturalne i funkcjonalne w mózgu1,2,3, nieprawidłowa aktywność napadowa może przyczyniać się do dysfunkcji poznawczych, które są jedną z najczęstszych chorób współistniejących związanych z padaczką4,5,6. W przeciwieństwie do przewlekłych napadów padaczkowych, które są przemijające i chwilowe, zaburzenia poznawcze mogą utrzymywać się przez całe życie pacjentów z padaczką, pogarszając jakość ich życia. Dlatego ważne jest, aby zrozumieć patofizjologiczne mechanizmy pogorszenia funkcji poznawczych związanego z padaczką.

Różne eksperymentalne modele zwierzęce epilepsji zostały użyte do zademonstrowania deficytów uczenia się i pamięci związanych z przewlekłą padaczką7,8,9,10,11,12. Na przykład labirynt wodny Morrisa, kontekstowe warunkowanie strachu, tablica otworów, nowa lokalizacja obiektu (NL) i testy rozpoznawania nowych obiektów (NO) były często wykorzystywane do oceny dysfunkcji pamięci w padaczce skroniowej (TLE). Ponieważ hipokamp jest jednym z podstawowych regionów, w których TLE wykazuje patologię, testy behawioralne, które mogą ocenić funkcję pamięci zależną od hipokampa, są często wybierane preferencyjnie. Biorąc jednak pod uwagę, że napady mogą indukować nieprawidłową neurogenezę hipokampa i przyczyniać się do pogorszenia funkcji poznawczych związanego z padaczką10, paradygmaty behawioralne do testowania funkcji neuronów u noworodków (tj. separacji wzorców przestrzennych, PS)8,13 mogą również dostarczyć cennych informacji na temat komórkowych mechanizmów zaburzeń pamięci w padaczce.

W tym artykule prezentujemy zestaw testów pamięciowych, NL, NO i PS, dla myszy z padaczką. Testy są proste i łatwo dostępne i nie wymagają skomplikowanego systemu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Komisję Etyczną Katolickiego Uniwersytetu Korei i przeprowadzono je zgodnie z wytycznymi National Institutes of Health dotyczącymi opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych (NIH Publications No. 80-23).

1. Test nowej lokalizacji obiektu (NL)

  1. Przygotować myszy z epilepsją szczepu C57BL/6 lub myszy transgeniczne 4–6 tygodni po wstrzyknięciu pilocarpyny.
    UWAGA: Napady drgawek wywołano poprzez doprzewnowłyskową (IP) iniekcję pilocarpyny, zgodnie z protokołem szczegółowo opisanym w naszym poprzednim raporcie14.
  2. Przenieść myszy z epilepsją z pomieszczenia hodowlanego do pomieszczenia behawioralnego na jeden dzień przed rozpoczęciem testów behawioralnych. Pozostawić myszy na co najmniej 12 h w celu habituacji przez noc.
  3. W pomieszczeniu behawioralnym rozdzielić poszczególne myszy do nowych klatek w celu indywidualnego utrzymania. Zapisać informacje o każdym zwierzęciu na karcie klatki i utrzymywać zwierzęta w tych samych klatkach przez cały czas trwania testów behawioralnych. Kilka klatek można przenieść jednocześnie za pomocą wózka.
  4. Następnego dnia, wczesnym rankiem, rozpocząć 3-dniowe sesje habituacji (H1–H3). Aklimatyzować zwierzęta do niskiego natężenia światła w ich klatkach macierzystych przez co najmniej 30 min.
  5. Przygotować aparat do testu otwartego pola (open field) o wymiarach zewnętrznych 44 x 44 x 31 cm i wymiarach wewnętrznych 43 x 43 x 30,5 cm. Pierwszego dnia habituacji (H1) umieścić luksometr w centrum aparatu i ustawić natężenie oświetlenia na 60 lux.
  6. Spryskać podłogę i ściany aparatu 70% etanolem i przetrzeć czystym ręcznikiem papierowym, aby usunąć ewentualne wskazówki zapachowe. Następnie odczekać co najmniej 1 min, aż pozostały alkohol całkowicie odparuje.
  7. Ocenić aktywność lokomotoryczną każdej myszy, przeprowadzając test otwartego pola.
    1. Do rejestracji i śledzenia zachowania każdej myszy eksperymentalnej należy użyć oprogramowania do wideotrackingowej analizy zachowania zwierząt (patrz Tabela materiałów).
    2. Po uruchomieniu oprogramowania do wideotrackingowego skalibrować rozmiar aparatu open field. Następnie wyznaczyć strefę śledzenia. Ustawić 3 s czasu opóźnienia (latency) i 15 min czasu akwizycji, aby uniknąć śledzenia rąk eksperymentatora. Wprowadzić informacje o każdej myszy eksperymentalnej (grupa, płeć, wiek itp.).
    3. Następnie delikatnie umieścić mysz eksperymentalną w aparacie open field twarzą do ściany. Należy to zrobić, kładąc zwierzę na wieczku klatki, aby zminimalizować stres i lęk związany z manipulacją. Następnie wypuścić mysz przy ścianie aparatu, która znajduje się najdalej od miejsca, w którym znajdą się obiekty podczas sesji zapoznawczej (krok 1.9.3.).
      UWAGA: Gdy mysz znajdzie się w aparacie open field, oprogramowanie do śledzenia automatycznie ją wykryje i rozpocznie rejestrację. Dla optymalnego śledzenia eksploracji kamera może być umieszczona bezpośrednio nad aparatem.
    4. Po 15 min rejestracji zwrócić zwierzę do klatki macierzystej, kładąc je na wieczku klatki. Przed kolejnymi próbami oczyścić aparat open field sprayem z 70% etanolem i przetrzeć czystym ręcznikiem papierowym. Przywrócić jasne światło i zmierzyć całkowity dystans pokonany przez zwierzę za pomocą oprogramowania do wideotrackingowego zgodnie z instrukcjami producenta.
      1. Otworzyć oprogramowanie do wideotrackingowego i klipy wideo. Następnie kliknąć Analysis, aby obliczyć całkowity przebyty dystans na podstawie kalibracji rozmiaru aparatu open field.
  8. Drugiego i trzeciego dnia przeprowadzić sesje habituacji (H2, H3), powtarzając kroki od 1.3 do 1.7.
  9. Czwartego dnia przeprowadzić sesję zapoznawczą (F1).
    1. W przygaszonym świetle umieścić każdą mysz w pustym polu otwartym na 3 min. Po tej krótkiej rehabituacji zwrócić zwierzę do klatki macierzystej.
    2. Podczas habituacji dokładnie oczyścić obiekty 70% etanolem i przetrzeć je ręcznikiem papierowym. Odczekać co najmniej 1 min do całkowitego odparowania alkoholu.
    3. Umieścić dwa identyczne obiekty (gumowe lalki, obiekt A) w arenie open field w odległości 5 cm od przylegających ścian. Przymocować obiekty dwustronną taśmą klejącą. Wprowadzić mysz eksperymentalną do aparatu open field twarzą do ściany najdalej oddalonej od obiektów.
    4. Pozwolić na swobodną eksplorację przez 20 min i ręcznie zmierzyć czas spędzony na badaniu obu obiektów za pomocą dwóch stoperów. Gdy mysz osiągnie minimalny czas eksploracji (30 s) dla obu obiektów, zakończyć sesję F1 i przenieść zwierzę do klatki macierzystej. Jeśli mysz nie zbada obiektów przez 30 s w ciągu 20 min, usunąć ją z aparatu open field i wykluczyć z dalszych sesji.
    5. Po usunięciu zwierzęcia z aparatu open field dokładnie oczyścić podłogę i ściany aparatu sprayem z 70% etanolem i przetrzeć je ręcznikiem papierowym.
      UWAGA: Mierzyć czas, w którym mysz dotyka obiektów wibrysami, pyszczkiem lub przednimi łapami. Nie traktować jako czasu eksploracyjnego zachowań, w których pyszczek zwierzęcia nie jest skierowany w stronę obiektu, takich jak siedzenie na obiekcie, przechodzenie obok obiektu lub spoczywanie z tyłem skierowanym do obiektu.
  10. Piątego dnia przeprowadzić sesję testową NL.
    1. Przenieść mysz z klatki macierzystej do obszaru open field w celu rehabituacji przez 3 min. Następnie zwrócić zwierzę do klatki macierzystej.
    2. Podczas habituacji dokładnie oczyścić obiekty 70% etanolem i przetrzeć je ręcznikiem papierowym. Odczekać co najmniej 1 min do całkowitego odparowania alkoholu.
    3. Przesunąć jeden obiekt (gumowa lalka, obiekt A) w pozycję przekątną, 5 cm od przylegających ścian. Przymocować obiekt dwustronną taśmą klejącą. Przenieść mysz eksperymentalną na wieczku klatki do obszaru open field i umieścić ją twarzą do ściany aparatu.
      UWAGA: Zrównoważyć lokalizację przesuniętego obiektu, aby zredukować potencjalną wrodzoną preferencję do określonego kierunku. Na przykład, dla połowy zwierząt eksperymentalnych zmienić położenie obiektu preferowanego podczas sesji zapoznawczej, a dla pozostałych zwierząt przesunąć obiekt mniej preferowany podczas sesji zapoznawczej.
    4. Pozwolić na 10 min swobodnej eksploracji i zarejestrować ją systemem wideotrackingowym. Zmierzyć czas spędzony na badaniu każdego obiektu za pomocą dwóch stoperów i obliczyć współczynnik dyskryminacji zgodnie z wzorem:
      Wzór na współczynnik dyskryminacji, równanie do oceny różnic w czasie eksploracji obiektów w eksperymentach.
      UWAGA: Mierzyć czas, w którym mysz dotyka obiektów wibrysami, pyszczkiem lub przednimi łapami. Nie traktować jako czasu eksploracyjnego zachowań, w których pyszczek zwierzęcia nie jest skierowany w stronę obiektu, takich jak siedzenie na obiekcie, przechodzenie obok obiektu lub spoczywanie z tyłem skierowanym do obiektu.
    5. Chwycić mysz eksperymentalną za ogon i położyć ją na wieczku klatki w celu przeniesienia do klatki macierzystej. Przez 3 dni (dni 6–8) pozostawić mysz w spoczynku z wolnym dostępem do pokarmu i wody.
    6. Po usunięciu zwierzęcia z aparatu open field dokładnie oczyścić podłogę i ściany aparatu sprayem z 70% etanolem i przetrzeć ręcznikiem papierowym.

2. Test rozpoznawania nowych obiektów (NO)

  1. W dniu 9. przeprowadź 15-minutową sesję habituacji, powtarzając kroki 1.2–1.7.
  2. W dniu 10. przeprowadź sesję zapoznania (F1).
    1. W słabym oświetleniu umieść mysz w pustym otwartym polu na 3 min. Po ponownej habituacji myszy do obszaru otwartego pola, czasowo przenieś ją z powrotem do klatki domowej.
    2. Podczas habituacji dokładnie oczyść obiekty 70% etanolem i przetrzyj ręcznikiem papierowym. Odczekaj co najmniej 1 min, aż pozostały alkohol całkowicie odparuje.
    3. Umieść dwa identyczne obiekty (plastikowe probówki 50 mL wypełnione 40 mL wody, obiekt B) w otwartym polu, w odległości 5 cm od przylegających ścian. Przymocuj obiekty dwustronną taśmą klejącą. Wprowadź mysz eksperymentalną do skrzynki z otwartym polem, ustawiając ją przodem do ściany najdalej oddalonej od obiektów.
    4. Ponieważ w teście NO zwierzę jest eksponowane na dwa różne obiekty (plastikowa probówka 50 mL wypełniona 40 mL wody, obiekt B; szklany słoik Coplina, obiekt C), zastosuj kontrbalansowanie obiektów podczas sesji F1. Na przykład połowie zwierząt w grupie zaprezentuj dwa identyczne obiekty (szklane słoiki Coplina, obiekt C).
    5. Pozostaw zwierzę na 20 min do swobodnej eksploracji i ręcznie zmierz czas spędzony na badaniu obu obiektów, używając dwóch stoperów. Gdy mysz osiągnie minimalny czas eksploracji (30 s) dla obu obiektów, zakończ sesję F1 i przenieś zwierzę do klatki domowej. Jeśli mysz nie zbada obiektów przez 30 s w ciągu 20 min, usuń ją ze skrzynki z otwartym polem i wyklucz z dalszych sesji.
    6. Po usunięciu zwierzęcia ze skrzynki z otwartym polem dokładnie oczyść dno i ściany skrzynki za pomocą sprayu z 70% etanolem i przetrzyj je ręcznikiem papierowym.
      UWAGA: Mierz czas, w którym mysz dotyka obiektów wibrysami, pyszczkiem lub przednimi łapami. Nie zaliczaj do czasu eksploracji zachowań, w których pyszczek zwierzęcia nie jest skierowany w stronę obiektu, takich jak siedzenie na obiekcie, przechodzenie obok obiektu lub spoczywanie z tyłem skierowanym w stronę obiektu.
  3. Następnego dnia (dzień 11.) przeprowadź sesję testową NO.
    1. Przenieś mysz z klatki domowej do otwartego pola w celu ponownej habituacji na 3 min, a następnie przenieś zwierzę z powrotem do klatki domowej.
    2. Podczas habituacji dokładnie oczyść obiekty 70% etanolem i przetrzyj ręcznikiem papierowym. Odczekaj co najmniej 1 min, aż pozostały alkohol całkowicie odparuje.
    3. Zastąp jeden obiekt (plastikowa probówka 50 mL wypełniona 40 mL wody, obiekt B) innym obiektem (szklany słoik Coplina, obiekt C) w odległości 5 cm od przylegających ścian. Przymocuj obiekty dwustronną taśmą klejącą. Przenieś mysz eksperymentalną na pokrywie klatki do otwartego pola i ustaw ją przodem do ściany. Zastosuj kontrbalansowanie obiektów prezentowanych razem podczas testu NO. Na przykład, w przypadku myszy eksponowanych na dwa szklane słoiki Coplina (obiekt C) podczas sesji zapoznania, zastąp jeden szklany słoik Coplina (obiekt C) plastikową probówką 50 mL wypełnioną 40 mL wody (obiekt B).
      UWAGA: W celu ograniczenia potencjalnej wrodzonej preferencji do określonego kierunku można również przeprowadzić kontrbalansowanie lokalizacji zastąpionego obiektu. Na przykład, dla każdej kohorty zwierząt eksponowanych na zestaw dwóch obiektów (obiekt B lub obiekt C), zmień preferowany obiekt z sesji zapoznania dla połowy zwierząt eksperymentalnych, a u pozostałych zwierząt zastąp obiekt mniej preferowany w sesji zapoznania.
    4. Pozostaw zwierzę na 10 min do swobodnej eksploracji i zarejestruj ją za pomocą systemu wideotrakingu. Zmierz czas spędzony na badaniu każdego obiektu za pomocą dwóch stoperów i oblicz współczynnik dyskryminacji.
      UWAGA: Mierz czas, w którym mysz dotyka obiektów wibrysami, pyszczkiem lub przednimi łapami. Nie zaliczaj do czasu eksploracji zachowań, w których pyszczek zwierzęcia nie jest skierowany w stronę obiektu, takich jak siedzenie na obiekcie, przechodzenie obok obiektu lub spoczywanie z tyłem skierowanym w stronę obiektu.
    5. Chwyć mysz eksperymentalną za ogon i umieść ją na pokrywie klatki w celu przeniesienia do klatki domowej. Przez 3 dni (dni 12–14) pozostaw mysz do odpoczynku z wolnym dostępem do pożywienia i wody.
    6. Po usunięciu zwierzęcia ze skrzynki z otwartym polem dokładnie oczyść dno i ściany skrzynki z otwartym polem za pomocą sprayu z 70% etanolem i przetrzyj je ręcznikiem papierowym.

3. Test separacji wzorców (PS)

  1. W dniu 15. przeprowadź pierwszą sesję zapoznawczą (F1) dla testu PS.
    1. Przenieś mysz z klatki domowej do obszaru otwartego pola w celu ponownej habituacji na 3 min, a następnie zwróć ją do klatki domowej.
    2. Podczas habituacji dokładnie oczyść obiekty oraz kratowaną płytę podłogową 70% etanolem i przetrzyj ręcznikiem papierowym. Odczekaj co najmniej 1 min, aż pozostały alkohol całkowicie odparuje.
    3. Umieść płytę podłogową (42,5 x 42,5 x 0,5 cm) z szeroką kratą (5,5 x 5,5 cm) w pudełku z otwartym polem i ustaw dwa identyczne obiekty (plastikowe kolby T wypełnione 50 mL wody, obiekt D) w otwartym polu w odległości 5 cm od przylegających ścian. Przymocuj obiekty dwustronną taśmą. Wprowadź mysz eksperymentalną do pudełka z otwartym polem, ustawiając ją przodem do ściany najdalej oddalonej od obiektów.
    4. Ponieważ w teście PS zwierzę jest eksponowane na dwa różne obiekty (plastikowa kolba T wypełniona 50 mL wody, obiekt D; szklana butelka, obiekt E), zastosuj kontrbalansowanie obiektów podczas sesji F1 i F2. Na przykład dla połowy zwierząt w grupie przedstaw dwa identyczne obiekty (szklane butelki, obiekt E) na podłodze z szeroką kratą.
    5. Pozwól na swobodną eksplorację przez 20 min i ręcznie zmierz czas spędzony na eksploracji obu obiektów, używając dwóch stoperów. Gdy mysz osiągnie minimalny łączny czas eksploracji (30 s) dla obu obiektów, zakończ sesję F1 i przenieś zwierzę do klatki domowej. Jeśli mysz nie eksploruje obiektów przez 30 s w ciągu 20 min, usuń ją z pudełka z otwartym polem i wyklucz z dalszych sesji.
      UWAGA: Mierz czas, gdy mysz dotyka obiektów wibrysami, pyszczkiem lub przednimi łapami. Nie zaliczaj do czasu eksploracji zachowań, w których pyszczek zwierzęcia nie jest skierowany w stronę obiektu, takich jak siedzenie na obiekcie, przechodzenie obok obiektu lub spoczynek z tyłem skierowanym w stronę obiektu.
    6. Po zakończeniu pierwszej sesji zapoznawczej (F1) dokładnie oczyść obiekty i płytę podłogową sprayem z 70% etanolem i usuń je z pudełka z otwartym polem.
  2. Następnego dnia (dzień 16.) przeprowadź drugą sesję zapoznawczą (F2) dla testu PS.
    1. Przenieś mysz z klatki domowej do obszaru otwartego pola w celu ponownej habituacji na 3 min, a następnie zwróć zwierzę do klatki domowej.
    2. Podczas habituacji dokładnie oczyść obiekty i kratowaną płytę podłogową 70% etanolem i przetrzyj ręcznikiem papierowym. Odczekaj co najmniej 1 min, aż pozostały alkohol całkowicie odparuje.
    3. Umieść płytę podłogową (42,5 x 42,5 x 0,5 cm) z wąską kratą (2,75 x 2,75 cm) w pudełku z otwartym polem i ustaw dwa identyczne obiekty (szklane butelki, obiekt E) w otwartym polu w odległości 5 cm od przylegających ścian. Przymocuj obiekty dwustronną taśmą. Wprowadź mysz eksperymentalną do pudełka z otwartym polem, ustawiając ją przodem do ściany najdalej oddalonej od obiektów.
    4. W celu kontrbalansowania przedstaw dwa identyczne obiekty (plastikowe kolby T wypełnione 50 mL wody, obiekt D) na podłodze z wąską kratą.
    5. Pozwól na swobodną eksplorację przez 20 min i ręcznie zmierz czas spędzony na eksploracji obu obiektów, używając dwóch stoperów. Gdy mysz osiągnie minimalny łączny czas eksploracji (30 s) dla obu obiektów, zakończ sesję F2 i przenieś zwierzę do klatki domowej. Jeśli mysz nie eksploruje obiektów przez 30 s w ciągu 20 min, usuń ją z pudełka z otwartym polem i wyklucz z dalszych sesji.
      UWAGA: Mierz czas, gdy mysz dotyka obiektów wibrysami, pyszczkiem lub przednimi łapami. Nie zaliczaj do czasu eksploracji zachowań, w których pyszczek zwierzęcia nie jest skierowany w stronę obiektu, takich jak siedzenie na obiekcie, przechodzenie obok obiektu lub spoczynek z tyłem skierowanym w stronę obiektu.
    6. Po zakończeniu drugiej sesji zapoznawczej (F2) dokładnie oczyść obiekty i płytę podłogową sprayem z 70% etanolem i usuń je z pudełka z otwartym polem.
  3. Następnego dnia (dzień 17.) przeprowadź sesję testową PS.
    1. Przenieś mysz z klatki domowej do obszaru otwartego pola w celu ponownej habituacji na 3 min, a następnie zwróć ją do klatki domowej.
    2. Podczas habituacji dokładnie oczyść obiekty i kratowaną płytę podłogową 70% etanolem i przetrzyj ręcznikiem papierowym. Odczekaj co najmniej 1 min, aż pozostały alkohol całkowicie odparuje.
    3. Umieść płytę podłogową z wąską kratą (2,75 x 2,75 cm) w pudełku z otwartym polem i ustaw dwa różne obiekty (plastikowa kolba T wypełniona 50 mL wody, obiekt D; szklana butelka, obiekt E) na płycie podłogowej w odległości 5 cm od przylegających ścian. Przymocuj obiekty dwustronną taśmą. Przenieś mysz eksperymentalną na pokrywie klatki do obszaru otwartego pola i ustaw ją przodem do ściany.
    4. Zastosuj kontrbalansowanie obiektów prezentowanych wspólnie podczas testu PS. Na przykład umieść każdy obiekt (obiekt D, obiekt E) na podłodze z wąską kratą, aby obiekt E stał się w tym kontekście obiektem nowym. Można również przeprowadzić kontrbalansowanie lokalizacji obiektu D lub obiektu E (obiektu nowego na wzorze podłogi z wąską kratą), aby zredukować potencjalną wrodzoną preferencję do określonego kierunku. Na przykład dla połowy zwierząt eksperymentalnych zamień miejscami obiekt preferowany podczas drugiej sesji zapoznawczej, a dla pozostałych zwierząt zamień miejscami obiekt mniej preferowany z drugiej sesji zapoznawczej.
    5. Pozwól na 10 min swobodnej eksploracji i zarejestruj ją za pomocą systemu śledzenia wideo. Zmierz czas spędzony na eksploracji każdego obiektu za pomocą dwóch stoperów i oblicz współczynnik dyskryminacji.
      UWAGA: Mierz czas, gdy mysz dotyka obiektów wibrysami, pyszczkiem lub przednimi łapami. Nie zaliczaj do czasu eksploracji zachowań, w których pyszczek zwierzęcia nie jest skierowany w stronę obiektu, takich jak siedzenie na obiekcie, przechodzenie obok obiektu lub spoczynek z tyłem skierowanym w stronę obiektu.
    6. Chwyć mysz eksperymentalną za ogon i umieść ją na pokrywie klatki w celu przeniesienia do klatki domowej.

4. Barwienie fioletem krezylowym

  1. Po zakończeniu wszystkich testów behawioralnych znieczuli zwierzę, wstrzykując koktajl (4:0,5) ketaminy (50 mg/mL) i ksylazyny (23,3 mg/mL) rozpuszczony w soli fizjologicznej w dawce 110 mL/kg masy ciała (IP; strzykawka 1 mL; igła 26 G). Głębokość znieczulenia należy sprawdzić, oceniając brak reakcji na uszczypnięcie palca u stopy.
  2. Gdy zwierzę zostanie głęboko znieczulone, należy przeprowadzić perfuzję transkardialną 4% paraformaldehydem w celu utrwalenia mózgu15.
  3. Po zakończeniu perfuzji transkardialnej należy zdekapitować zwierzę za pomocą nożyczek15. Następnie, używając nożyczek irydowych, należy usunąć czaszkę, aby odsłonić mózg. Po wyizolowaniu mózgu należy poddać go postutrwalaniu w 4% paraformaldehydzie przez noc, a następnie krioprotekcji w 30% sacharozie w 0,01 M soli fosforanowej buforowanej (PBS).
  4. Za pomocą kriosztatu należy wykonać przekroje wieńcowe (30 μm) z błyskawicznie zamrożonego mózgu.
  5. Tkanki mózgowe należy zamocować na szkiełkach i przeprowadzić serię etapów nawadniania od 100% etanolu do wody z kranu poprzez sekwencyjne płukanie przez 3 min w 100%, 95%, 90%, 80% i 70% etanolu.
  6. Szkiełka z tkanką należy inkubować w 0,1% roztworze fioletu krezylowego przez 15 min.
  7. Nadmiar barwnika należy usunąć poprzez zanurzenie szkiełek z tkanką w 95% etanolu/0,1% lodowatego kwasu octowego, a następnie odwodnić tkanki za pomocą roztworów 100% etanolu, 50% etanolu/50% ksylenu oraz 100% ksylenu.
  8. Szkiełka z tkanką należy przykryć szkiełkiem dekrywacyjnym, używając dostępnego komercyjnie medium montażowego na bazie ksylenu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Ogólny harmonogram eksperymentalny i konfiguracja służąca do oceny funkcji poznawczych zostały przedstawione na Ryc. 1. Sześć tygodni po wywołaniu ostrych napadów za pomocą pilocarpiny, myszy poddano kolejno testom NL, NO i PS, z zachowaniem 3-dniowych okresów odpoczynku między testami (Ryc. 1A). W teście NL podczas sesji zapoznawczej (F1) w otwartym polu umieszczono dwa identyczne obiekty, a następnego dnia jeden z obiektów przeniesiono w nowe miejsce. W teście...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W pracy opisano eksperymentalne procedury oceny funkcji poznawczych u myszy z przewlekłą padaczką. Wiele różnych paradygmatów testów behawioralnych jest używanych do oceny funkcji uczenia się i pamięci u myszy18. Labirynt wodny Morrisa, labirynt ramion promieniowych, labirynt Y, kontekstowe warunkowanie strachu i testy oparte na obiektach są najczęściej stosowanymi testami behawioralnymi i zapewniają wiarygodne wyniki. Wśród nich testy NL, NO i PS są skutecznymi, prostymi metodami oceny uczenia si...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Dr. Jae-Min Lee za jego wsparcie techniczne. Prace te były wspierane przez granty Narodowej Fundacji Badawczej Korei (NRF) finansowane przez rząd koreański (NRF-2019R1A2C1003958, NRF-2019K2A9A2A08000167).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Strzykawka 1 mlSung-strzykawkaUżywaj z igłą o rozmiarze 26 lub 30
70% EtanolDuksanUN1170Spray do czyszczenia pudełka i przedmiotów
zasłonaAby uniknąć niepotrzebnych wskazówek wizualnych
Fiolet kresylowySigmaC5042barwienia fioletem krezylowym
LeicaE21040041Do tkanek sekcyjna
dwustronna taśmaDo stabilnego umieszczenia przedmiotów
Nośnik montażowy DPXSigma06522
DuksanUN1170Zrób 100%, 95%, 90%, 80%, 70% roztwory etanolu
płyta podłogowa z wąskimi wzorami siatkiLeehyo-bioSprzęt do eksperymentów behawioralnych, rozmiar płytki: 42,5 x 42,5 x 0,5 cm, rozmiar siatki: 2,75 x Płyta podłogowa 2,75 cm
z szerokimi wzorami siatkiLeehyo-bioSprzęt do eksperymentów behawioralnych, rozmiar płytki: 42,5 x 42,5 x 0,5 cm, rozmiar siatki: 5,5 x 5,5 cm
iluminometrTES Electrical Electronic Corp.1334ADo pomiaru oświetlenia pomieszczenia (60 luksów)
Oddział intensywnej terapiiThermocare#W-1
chlorowodorek ketaminyYuhan7003Służy do znieczulenia myszy do perfuzji przezsercowej
Lampa LEDLungoP13A-0422-WW-04Oświetlenie obiektów
w pomieszczeniu do testów behawioralnychGumowa lalka, plastikowa tuba 50 ml, szklany słoik Coplin, plastikowa kolba T, szklana butelka
otwarte pudełko poloweLeehyo-bioSprzęt do eksperymentów behawioralnych, rozmiar: 44 x 44 x 31 cm
ręcznik papierowyYuhan-Kimberly47201Służy do suszenia otwartego pudełka i przedmiotów
paraformaldehydMerck Millipore104005Przygotuj 4% roztwór
chlorowodorku pilokarpinySigmaP6503
linijkaSłuży do lokalizowania obiektów w otwartym polu
azotan metylu skopolaminySigmaS2250Make 10X stock
Smart system 3.0PanlabSystem śledzenia wideo
stoperJunsoJS-307Do pomiaru aktywności eksploracyjnej myszy
sacharozaSigmaS9378Do krioochrony skrawków tkanek
sól półsiarczanu terbutalinySigmaT2528Zrób 10X standardową
kamerę wideo (kamera CCD)WizjaVCE56HQ-12Umieść kamerę bezpośrednio nad głową pudełka na otwartym polu
ksylazyna (Rompun)Bayer koreaKR10381Służy do znieczulenia myszy do perfuzji przezsercowej
ksylenDuksanUN1307Dla Barwienie fioletem krezylowym
Do kriotomu klejąca seria etanolu pole

Bibliografia

  1. Chang, B. S., Lowenstein, D. H. Mechanisms of disease - Epilepsy. New England Journal of Medicine. 349 (13), 1257-1266 (2003).
  2. Scharfman, H. E. The neurobiology of epilepsy. Current Neurology and Neuroscience Report. 7 (4), 348-354 (2007).
  3. Rakhade, S. N., Jensen, F. E. Epileptogenesis in the immature brain: emerging mechanisms. Nature Reviews in Neurology. 5 (7), 380-391 (2009).
  4. Breuer, L. E., et al. Cognitive deterioration in adult epilepsy: Does accelerated cognitive ageing exist. Neuroscience and Biobehavior Reviews. 64, 1-11 (2016).
  5. Leeman-Markowski, B. A., Schachter, S. C. Treatment of Cognitive Deficits in Epilepsy. Neurology Clinics. 34 (1), 183-204 (2016).
  6. Helmstaedter, C., Elger, C. E. Chronic temporal lobe epilepsy: a neurodevelopmental or progressively dementing disease. Brain. 132, Pt 10 2822-2830 (2009).
  7. Groticke, I., Hoffmann, K., Loscher, W. Behavioral alterations in the pilocarpine model of temporal lobe epilepsy in mice. Experimental Neurology. 207 (2), 329-349 (2007).
  8. Long, Q., et al. Intranasal MSC-derived A1-exosomes ease inflammation, and prevent abnormal neurogenesis and memory dysfunction after status epilepticus. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 114 (17), 3536-3545 (2017).
  9. Lima, I. V. A., et al. Postictal alterations induced by intrahippocampal injection of pilocarpine in C57BL/6 mice. Epilepsy & Behavior. 64, Pt A 83-89 (2016).
  10. Cho, K. O., et al. Aberrant hippocampal neurogenesis contributes to epilepsy and associated cognitive decline. Nature Communication. 6, 6606(2015).
  11. Zhou, Q., et al. Adenosine A1 Receptors Play an Important Protective Role Against Cognitive Impairment and Long-Term Potentiation Inhibition in a Pentylenetetrazol Mouse Model of Epilepsy. Molecular Neurobiology. 55 (4), 3316-3327 (2018).
  12. Jiang, Y., et al. Ketogenic diet attenuates spatial and item memory impairment in pentylenetetrazol-kindled rats. Brain Research. 1646, 451-458 (2016).
  13. Zhuo, J. M., et al. Young adult born neurons enhance hippocampal dependent performance via influences on bilateral networks. Elife. 5, 22429(2016).
  14. Kim, J. E., Cho, K. O. The Pilocarpine Model of Temporal Lobe Epilepsy and EEG Monitoring Using Radiotelemetry System in Mice. Journal of Visualized Experiments. (132), e56831(2018).
  15. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564(2012).
  16. Muller, C. J., Groticke, I., Bankstahl, M., Loscher, W. Behavioral and cognitive alterations, spontaneous seizures, and neuropathology developing after a pilocarpine-induced status epilepticus in C57BL/6 mice. Experimental Neurology. 219 (1), 284-297 (2009).
  17. Brandt, C., Gastens, A. M., Sun, M., Hausknecht, M., Loscher, W. Treatment with valproate after status epilepticus: effect on neuronal damage, epileptogenesis, and behavioral alterations in rats. Neuropharmacology. 51 (4), 789-804 (2006).
  18. Wolf, A., Bauer, B., Abner, E. L., Ashkenazy-Frolinger, T., Hartz, A. M. A Comprehensive Behavioral Test Battery to Assess Learning and Memory in 129S6/Tg2576 Mice. PLoS One. 11 (1), 0147733(2016).
  19. Lueptow, L. M. Novel Object Recognition Test for the Investigation of Learning and Memory in Mice. Journal of Visualized Experiments. (126), e55718(2017).
  20. Antunes, M., Biala, G. The novel object recognition memory: neurobiology, test procedure, and its modifications. Cognitive Processing. 13 (2), 93-110 (2012).
  21. van Goethem, N. P., van Hagen, B. T. J., Prickaerts, J. Assessing spatial pattern separation in rodents using the object pattern separation task. Nature Protocols. 13 (8), 1763-1792 (2018).
  22. Leger, M., et al. Object recognition test in mice. Nature Protocols. 8 (12), 2531-2537 (2013).
  23. Moscovitch, M., Cabeza, R., Winocur, G., Nadel, L. Episodic Memory and Beyond: The Hippocampus and Neocortex in Transformation. Annual Reviews in Psychology. 67, 105-134 (2016).
  24. Eichenbaum, H. A cortical-hippocampal system for declarative memory. Nature Reviews Neuroscience. 1 (1), 41-50 (2000).
  25. Brown, M. W., Aggleton, J. P. Recognition memory: What are the roles of the perirhinal cortex and hippocampus. Nature Reviews Neuroscience. 2 (1), 51-61 (2001).
  26. Winters, B. D., Forwood, S. E., Cowell, R. A., Saksida, L. M., Bussey, T. J. Double dissociation between the effects of peri-postrhinal cortex and hippocampal lesions on tests of object recognition and spatial memory: Heterogeneity of function within the temporal lobe. Journal of Neuroscience. 24 (26), 5901-5908 (2004).
  27. Winters, B. D., Bussey, T. J. Transient inactivation of perirhinal cortex disrupts encoding, retrieval, and consolidation of object recognition memory. Journal of Neuroscience. 25 (1), 52-61 (2005).
  28. Bermudez-Rattoni, F., Okuda, S., Roozendaal, B., McGaugh, J. L. Insular cortex is involved in consolidation of object recognition memory. Learning & Memory. 12 (5), 447-449 (2005).
  29. Akirav, I., Maroun, M. Ventromedial prefrontal cortex is obligatory for consolidation and reconsolidation of object recognition memory. Cerebral Cortex. 16 (12), 1759-1765 (2006).
  30. Cohen, S. J., Stackman, R. W. Assessing rodent hippocampal involvement in the novel object recognition task. A review. Behavior Brain Research. 285, 105-117 (2015).
  31. Cohen, S. J., et al. The Rodent Hippocampus Is Essential for Nonspatial Object Memory. Current Biology. 23 (17), 1685-1690 (2013).
  32. Broadbent, N. J., Gaskin, S., Squire, L. R., Clark, R. E. Object recognition memory and the rodent hippocampus. Learning and Memory. 17 (1), 5-11 (2010).
  33. Tuscher, J. J., Taxier, L. R., Fortress, A. M., Frick, K. M. Chemogenetic inactivation of the dorsal hippocampus and medial prefrontal cortex, individually and concurrently, impairs object recognition and spatial memory consolidation in female mice. Neurobiology of Learning and Memory. 156, 103-116 (2018).
  34. de Lima, M. N., Luft, T., Roesler, R., Schroder, N. Temporary inactivation reveals an essential role of the dorsal hippocampus in consolidation of object recognition memory. Neuroscience Letters. 405 (1-2), 142-146 (2006).
  35. Hammond, R. S., Tull, L. E., Stackman, R. W. On the delay-dependent involvement of the hippocampus in object recognition memory. Neurobiology of Learning and Memory. 82 (1), 26-34 (2004).
  36. Clark, R. E., Zola, S. M., Squire, L. R. Impaired recognition memory in rats after damage to the hippocampus. Journal of Neuroscience. 20 (23), 8853-8860 (2000).
  37. Stackman, R. W., Cohen, S. J., Lora, J. C., Rios, L. M. Temporary inactivation reveals that the CA1 region of the mouse dorsal hippocampus plays an equivalent role in the retrieval of long-term object memory and spatial memory. Neurobiology of Learning and Memory. 133, 118-128 (2016).
  38. Mumby, D. G., Gaskin, S., Glenn, M. J., Schramek, T. E., Lehmann, H. Hippocampal damage and exploratory preferences in rats: memory for objects, places, and contexts. Learning & Memory. 9 (2), 49-57 (2002).
  39. Jeong, K. H., Lee, K. E., Kim, S. Y., Cho, K. O. Upregulation of Kruppel-Like Factor 6 in the Mouse Hippocampus after Pilocarpine-Induced Status Epilepticus. Neuroscience. 186, 170-178 (2011).
  40. Kim, J. E., Cho, K. O. The Pilocarpine Model of Temporal Lobe Epilepsy and EEG Monitoring Using Radiotelemetry System in Mice. Journal of Visualized Experiments. (132), e56831(2018).
  41. Jiang, Y., et al. Abnormal hippocampal functional network and related memory impairment in pilocarpine-treated rats. Epilepsia. 59 (9), 1785-1795 (2018).
  42. Wang, L., Liu, Y. H., Huang, Y. G., Chen, L. W. Time-course of neuronal death in the mouse pilocarpine model of chronic epilepsy using Fluoro-Jade C staining. Brain Research. 1241, 157-167 (2008).
  43. Detour, J., Schroeder, H., Desor, D., Nehlig, A. A 5-month period of epilepsy impairs spatial memory, decreases anxiety, but spares object recognition in the lithium-pilocarpine model in adult rats. Epilepsia. 46 (4), 499-508 (2005).
  44. Benini, R., Longo, D., Biagini, G., Avoli, M. Perirhinal Cortex Hyperexcitability in Pilocarpine-Treated Epileptic Rats. Hippocampus. 21 (7), 702-713 (2011).
  45. Yassa, M. A., Stark, C. E. Pattern separation in the hippocampus. Trends in Neurosciences. 34 (10), 515-525 (2011).
  46. Goncalves, J. T., Schafer, S. T., Gage, F. H. Adult Neurogenesis in the Hippocampus: From Stem Cells to Behavior. Cell. 167 (4), 897-914 (2016).
  47. Sahay, A., et al. Increasing adult hippocampal neurogenesis is sufficient to improve pattern separation. Nature. 472 (7344), 466-539 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Ocena funkcji pami cimodel myszy z epilepsjtest nowej lokalizacji obiektutest rozpoznawania nowego obiektutest separacji wzorc wtest otwartego polawideotoracking behawioralnysesje habituacjisesja zapoznaniaobliczanie wsp czynnika dyskryminacji
Ocena funkcji pamięci u myszy z padaczką indukowaną pilokarpiną
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.