Wzrost warstw komórek śródbłonka rogówki ludzi i owiec na błonach biomateriałowych

Podsumowanie

Ten protokół opisuje kluczowe kroki wymagane do założenia i wyhodowania hodowli komórek śródbłonka rogówki z eksplantatów tkanek ludzkich lub owczych. Przedstawiono również metodę subhodowli komórek śródbłonka rogówki na biomateriałach błoniastych.

Streszczenie

Hodowle komórek śródbłonka rogówki mają tendencję do przechodzenia przejścia z nabłonka do mezenchymalnego (EMT) po utracie kontaktu między komórkami. EMT jest szkodliwy dla komórek, ponieważ zmniejsza ich zdolność do tworzenia dojrzałej i funkcjonalnej warstwy. W tym miejscu przedstawiamy metodę zakładania i subkulturacji komórek śródbłonka rogówki ludzi i owiec, która minimalizuje utratę kontaktu między komórkami. Eksplantaty śródbłonka rogówki/błony Descemeta są pobierane z rogówki dawcy i umieszczane w hodowli tkankowej w warunkach, które umożliwiają komórkom wspólną migrację na powierzchnię hodowli. Po założeniu kultury eksplantaty są przenoszone na świeże talerze w celu zainicjowania nowych kultur. Lek Dispaza II służy do delikatnego usuwania grudek komórek z płytek do hodowli tkankowej w celu przeprowadzenia subhodowli. Hodowle komórek śródbłonka rogówki, które zostały ustalone przy użyciu tego protokołu, nadają się do przenoszenia do błon biomateriałowych w celu wytworzenia warstw komórek inżynierii tkankowej do przeszczepu w badaniach na zwierzętach. Opisano wykonane na zamówienie urządzenie do podtrzymywania błon biomateriałowych podczas hodowli tkankowej oraz przedstawiono przykład przeszczepu inżynierii tkankowej składającego się z warstwy komórek śródbłonka rogówki i warstwy komórek zrębu rogówki po obu stronach błony kolagenowej typu I.

Wprowadzenie

Rogówka to przezroczysta tkanka, która znajduje się z przodu oka. Składa się z trzech głównych warstw: warstwy nabłonkowej na zewnętrznej powierzchni, środkowej warstwy zrębu i warstwy wewnętrznej zwanej śródbłonkiem rogówki. Śródbłonek rogówki jest monowarstwą komórek, która znajduje się na błonie podstawnej zwanej błoną Descemeta i utrzymuje przezroczystość rogówki poprzez regulację ilości płynu, który dostaje się do zrębu z leżącej poniżej cieczy wodnistej. Zbyt duża ilość płynu w zrębie powoduje obrzęk rogówki, zmętnienie i utratę wzroku. Śródbłonek jest zatem niezbędny do utrzymania wzroku.

Śródbłonek rogówki może stać się dysfunkcyjny z wielu powodów, w tym starzenia się, chorób i urazów, a jedynym obecnym sposobem leczenia jest operacja przeszczepu. Podczas tej operacji śródbłonek i błona Descemeta są usuwane z rogówki pacjenta i zastępowane przeszczepem śródbłonka i błoną Descemeta uzyskaną z rogówki dawcy. Wiele przeszczepów śródbłonka zawiera również cienką warstwę tkanki zrębu, która ułatwia przenoszenie i przyczepianie do rogówki gospodarza¹.

Na całym świecie zapotrzebowanie na tkanki dawcy rogówki do operacji transplantacyjnych jest większe niż ilość, którą mogą dostarczyć banki oczu². W związku z tym podjęto działania mające na celu opracowanie przeszczepów śródbłonka rogówki metodą inżynierii tkankowej, które mogłyby być wykorzystane do zniwelowania tego niedoboru³. Uzasadnieniem tego jest fakt, że obecnie śródbłonek z pojedynczej rogówki może być przeniesiony tylko do jednego pacjenta, jednak jeśli komórki śródbłonka rogówki zostaną najpierw namnażone i wyhodowane na rusztowaniach biomateriałowych w hodowli tkankowej, mogą być stosowane w leczeniu wielu pacjentów.

Główne wyzwania, które muszą zostać rozwiązane, zanim przeszczepy śródbłonka rogówki za pomocą inżynierii tkankowej staną się realną opcją dla chirurgów, obejmują: (1) ustanowienie technik rozszerzania komórek śródbłonka rogówki o wysokiej jakości oraz wytwarzania dojrzałych i funkcjonalnych warstw komórek śródbłonka rogówki in vitro, oraz (2) ustanowienie technik hodowli komórek na rusztowaniach z biomateriału w celu wytworzenia przeszczepów inżynierii tkankowej, które są równe, lub lepiej niż obecnie stosowane przeszczepy pochodzące z rogówki dawcy.

Komórki śródbłonka rogówki mają bardzo niski potencjał proliferacyjny in vivo, ale mogą być stymulowane do podziału in vitro⁴. Niemniej jednak mają silną tendencję do przechodzenia in vitro przejścia nabłonkowego do mezenchymalnego (EMT), co zmniejsza ich zdolność do tworzenia dojrzałej, funkcjonalnej warstwy śródbłonka. Znane czynniki wyzwalające EMT w komórkach śródbłonka rogówki obejmują narażenie na niektóre czynniki wzrostu i utratę kontaktu między komórkami⁵. Jest zatem prawie nieuniknione, że hodowle komórek śródbłonka rogówki, które są enzymatycznie dysocjowane podczas subhodowli, ulegną zmianom związanym z EMT. W tym miejscu przedstawiamy metodę hodowli komórkowej komórek śródbłonka rogówki ludzkiej lub owczej, która ma na celu zminimalizowanie zakłóceń kontaktów międzykomórkowych podczas etapów izolacji, ekspansji i subhodowli, w celu zmniejszenia potencjału EMT. Ponadto pokazujemy, w jaki sposób przeszczepy inżynierii tkankowej, które przypominają przeszczepy śródbłonka / błony Descemeta / tkanki zrębu pochodzące z rogówki dawcy, mogą być wytwarzane przez hodowanie warstw komórek hodowlanych po obu stronach błony biomateriałowej w specjalnie zaprojektowanym urządzeniu montażowym.

Protokół

Ludzkie rogówki za zgodą dawcy do badań zostały uzyskane z Queensland Eye Bank i użyte za zgodą etyczną Komitetu Etyki Badań Naukowych Metro South Hospital and Health Service (HREC/07/QPAH/048). Rogówki owiec zostały pozyskane od zwierząt poddanych eutanazji w Herston Medical Research Facility na Uniwersytecie Queensland w ramach umowy o podziale tkanek.

1. Przygotowanie narzędzi do preparacji

1. Wysterylizuj dwie pary kleszczyków zegarmistrzowskich numer 4, mocząc je w roztworze 70% etanolu przez 5 minut lub autoklawując.

2. Przygotowanie podłoża hodowlanego i płytek do hodowli tkankowych

1. Przygotuj 100 ml pożywki hodowlanej zawierającej Opti-MEM 1 (1x) + GlutaMAX-1, 5% płodowej surowicy bydlęcej i 100 U/ml Pen/Strep. Ta pożywka hodowlana jest odpowiednia dla hodowli komórek śródbłonka rogówki owiec, jednak w przypadku hodowli ludzkich komórek śródbłonka rogówki pożywkę należy uzupełnić 50 μg/ml ekstraktu przysadki bydlęcej, 0,08% siarczanu chondroityny, 200 μg/ml chlorku wapnia i 0,3 mM 2-fosforanu L-askorbinowego. Pożywkę hodowlaną można przechowywać w ciemności w temperaturze 4 °C przez dwa tygodnie.
2. Pokryj studzienki 6-dołkowej płytki do hodowli tkankowej współczynnikiem przyłączenia zgodnie z instrukcjami producenta, a następnie dodaj 1 ml pożywki hodowlanej do każdej powlekanej studzienki. Przygotuj jedną studzienkę na każdą rogówkę.

3. Sekcja eksplantacji i procedura hodowli komórkowej

1. Umieść rogówkę, śródbłonkiem do góry, na sterylnej szalce Petriego na stoliku mikroskopu preparacyjnego. Dostosuj oświetlenie tak, aby powierzchnia rogówki była dobrze oświetlona z wystarczającym kontrastem, aby uwydatnić warstwę śródbłonka. Dostosuj powiększenie tak, aby krawędź i część środkowego śródbłonka rogówki były widoczne.
2. Użyj wysterylizowanych kleszczyków zegarmistrzowskich, aby delikatnie podnieść i oderwać błonę Descemeta od leżącego poniżej zrębu (Rysunek 1). Membrana odczepia się od zrębu jako pasek, który natychmiast się zwija. Umieść pasek w jednym dołku 6-dołkowej płytki do hodowli tkankowej, która została pokryta czynnikiem przyłączającym i zawiera 1 ml pożywki hodowlanej. Pokrywka płytki do hodowli tkankowej powinna być założona przez cały czas, z wyjątkiem sytuacji, gdy dodaje się do niej eksplantaty, aby zmniejszyć ryzyko zanieczyszczenia.
3. Najpierw usuń paski błony Descemeta ze skrajnego obrzeża śródbłonka, a następnie z obszarów centralnych. Umieść wszystkie paski z jednej rogówki w jednym dołku w 6-dołkowej płytce.
4. Inkubować eksplantaty w nawilżonym inkubatorze do hodowli komórkowych przy temperaturze 5%_CO2 i temperaturze 37 °C. Pozostawić kulturę w spokoju przez 2 dni, aby eksplantaty mogły się osiąść i przymocować do powierzchni płytki. Zazwyczaj do jednej trzeciej eksplantatów nie udaje się przymocować do płytki.
5. Po 4 dniach usuń pożywkę i wszelkie nieprzyłączone eksplantaty z kultury i delikatnie dodaj 2 ml świeżej pożywki hodowlanej, uważając, aby nie naruszyć dołączonych eksplantatów. Pożywkę hodowlaną należy zmieniać dwa razy w tygodniu.

4. Ciągła produkcja komórek śródbłonka rogówki poprzez seryjną hodowlę eksplantatów

UWAGA: Eksplantaty mogą być przeniesione na świeże płytki hodowli tkankowych po 10 dniach, aby stworzyć dodatkowe hodowle komórek śródbłonka rogówki.

1. Umieść kulturę eksplantatów na stoliku mikroskopu preparacyjnego i dostosuj oświetlenie i powiększenie tak, aby eksplantaty były widoczne.
2. Używając wysterylizowanych kleszczyków zegarmistrzowskich, delikatnie zerwij każdy eksplant z płytki hodowlanej i przenieś go do świeżej studzienki 6-dołkowej płytki do hodowli tkankowej, która została pokryta współczynnikiem przyłączenia i zawiera 1 ml pożywki hodowlanej.
3. Pozwól eksplantatom osiąść na powierzchni nowej płytki przez 4 dni przed zastąpieniem pożywki hodowlanej 2 ml świeżej pożywki hodowlanej. Zmieniaj pożywkę zmienianą dwa razy w tygodniu.

5. Hodowla komórek śródbłonka rogówki na szklanych szkiełkach nakrywkowych do analiz immunofluorescencyjnych

UWAGA: Hodowle komórkowe, które są przeznaczone do analizy za pomocą immunofluorescencji, powinny być zakładane na szklanych szkiełkach nakrywkowych, które mogą być zamontowane na szklanych szkiełkach mikroskopowych po procedurze barwienia.

1. Wysterylizuj paczkę okrągłych szklanych szkiełek nakrywkowych o średnicy 13 mm w autoklawie lub mocząc w 70% etanolu przez 15 minut, a następnie trzykrotnie przepłucz w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
2. Umieść pojedyncze szkiełka nakrywkowe w dołkach 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej, pokryj je współczynnikiem przyłączenia, a następnie dodaj 0,5 ml pożywki hodowlanej do każdego dołka.
3. Za pomocą wysterylizowanych kleszczyków zegarmistrzowskich usuń eksplantaty z ich płytek hodowlanych i przenieś je do studzienek zawierających szkiełka nakrywkowe. Pozwól eksplantatom osiąść na szkiełkach nakrywkowych przez 4 dni przed zmianą podłoża.
4. Po wymaganym okresie inkubacji utrwalić i wybarwić kultury szkiełek nakrywkowych w ich studzienkach hodowlanych. Zamontuj poplamione szkiełka nakrywkowe na szklanych szkiełkach mikroskopowych w celu analizy pod mikroskopem fluorescencyjnym.

6. Subkultura komórek śródbłonka rogówki za pomocą Dispase II

UWAGA: Duże komórki fibroblastyczne mogą być selektywnie usuwane z kultur eksplantacji na płytkach 6-dołkowych przed subkulturacją przy użyciu tej procedury. Jeśli wszystkie komórki mają być podhodowlane, nie należy wykonywać kroków od 6.2 do 6.4. Celem tej procedury jest przeniesienie komórek na świeże płytki przy jednoczesnym zachowaniu ich kontaktów międzykomórkowych w jak największym stopniu. Z komórkami należy obchodzić się delikatnie. Studzienki całkowicie zlewające się powinny być przepuszczane w stosunku 1:2, podczas gdy studnie subkonfluentne powinny być przepuszczane w stosunku 1:1 lub mniejszym.

1. Usuń pożywkę z kultury i krótko spłucz DPBS.
2. Dodaj 1 ml Versene. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 s.
3. Usuń Versene i dodaj 1 ml TrypLE. Inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli tkankowych przez 3 minuty.
4. Obserwuj kulturę za pomocą mikroskopu z kontrastem fazowym. Delikatnie postukaj w kulturę, aby usunąć komórki z płytki. Jak tylko duże komórki fibroblastyczne oderwą się od płytki, usuń je i TrypLE za pomocą pipety o pojemności 1 ml. Zmyj resztki TrypLE z pozostałych komórek, spłukując dwukrotnie 2 ml DPBS.
5. Dodać 1 ml 1 mg/ml leku Dispaza II do kultury i inkubować w inkubatorze do hodowli tkankowych przez 1 do 2 godzin lub do momentu, gdy wszystkie komórki oderwą się od płytki. Komórki powinny stopniowo odchodzić od płytki w kępkach.
6. Zebrać komórki za pomocą pipety o pojemności 1 ml i przenieść do 20 ml DPBS w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml. Wirować przez 5 minut przy 300 x g w temperaturze pokojowej.
7. Usunąć supernatant i delikatnie zawiesić osad komórkowy przez rozcieranie pipetą o pojemności 1 ml w 1 ml pożywki hodowlanej. Przenieść zawiesinę komórek do jednego lub dwóch dołków na płytce 6-dołkowej, do przejścia w stosunku odpowiednio 1:1 lub 1:2.
8. Uzupełnić pożywkę w każdym dołku, aby uzyskać 2 ml i umieścić kultury w inkubatorze do hodowli tkankowych. Zastąp pożywkę 2 ml świeżej pożywki dwa razy w tygodniu.

7. Wzrost warstw komórek śródbłonka rogówki na błonach biomateriału

UWAGA: Poniższa procedura opisuje kroki związane z montażem błoniastego biomateriału w specjalnie przygotowanym urządzeniu montażowym - zwanym mikrokomorą Boydena - do hodowli komórek. Zapoznaj się z naszą najnowszą publikacją⁶, aby uzyskać więcej informacji na temat urządzenia i szczegółów zakupu.

1. Zamontuj górną komorę komory mikro-Boydena, umieszczając czerwony O-ring w jej środku.
2. Użyj trepanacji o średnicy 18 mm, aby wyciąć krążek z arkusza biomateriału na desce do krojenia z politetrafluoroetylenu (PTFE). Umieść ten dysk na czerwonym O-ringu w górnej komorze komory mikro-Boydena.
3. Przykręć dolną komorę do górnej komory, zabezpieczając krążek z biomateriału pomiędzy nimi.
4. Namocz zmontowaną komorę mikro-Boydena w 70% etanolu na 1 godzinę, aby ją wysterylizować.
5. Całkowicie zanurz zmontowaną komorę micro-Boydena w sterylnym HBSS na 10 minut, aby usunąć etanol. Powtórz ten krok prania dwukrotnie. Wykonać ostatni etap płukania przez 10 minut w nieuzupełnionej pożywce hodowlanej.
6. Przenieś wysterylizowaną komorę mikro-Boydena na pożywkę hodowlaną w dołku 6-dołkowej płytki, upewniając się, że górna komora znajduje się najwyżej. Dostosuj poziom pożywki hodowlanej tak, aby stykała się z dolną powierzchnią błony biomateriału, ale nie wpływała do górnej komory.
7. Przygotować zawiesinę komórek śródbłonka rogówki, stosując procedurę opisaną w punkcie 6. Gęstość komórek w zawiesinie powinna być osiągnięta, aby umożliwić gęstość wysiewu co najmniej 100 000 komórek na^cm2 na membranie w komorze mikro-Boydena. Powierzchnia hodowli w komorze mikro-Boydena wynosi 0,5^cm2 i może pomieścić objętość 100 μl. Dlatego należy przygotować zawiesinę zawierającą 500 000 komórek/ml.
8. Odpipetować 100 μl zawiesiny komórek (50 000 komórek) na membranę w komorze mikro-Boydena. Inkubować w inkubatorze do hodowli tkankowych przez 4 godziny, a następnie uzupełnić pożywkę, aby całkowicie zanurzyć komorę. Inkubuj kulturę przez wymagany okres czasu, wymieniając pożywkę dwa razy w tygodniu.
   UWAGA: Gdy komórki śródbłonka rogówki przyczepią się do górnej powierzchni błony biomateriału, komorę mikro-Boydena można odwrócić w dołku hodowli, tak aby dolna komora znalazła się najwyżej. Następnie do komory można dodać więcej komórek, aby zainicjować hodowle komórkowe na drugiej powierzchni błony. Na przykład komórki zrębu rogówki można łatwo zastosować do alternatywnej powierzchni, naśladując w ten sposób względną lokalizację typów komórek rogówki, jak widać w tylnej części rogówki.

Wyniki

Metoda izolacji i namnażania komórek endotelialnych rogówki z rogówek ludzkich lub owczych została przedstawiona w Rysunku 1 oraz Rysunku 2. Większość eksplantów pochodzących z rogówek owiec w wieku od 1 do 2 lat lub dawców ludzkich poniżej 30 roku życia przytwierdza się do płytek hodowlanych pokrytych czynnikiem adhezyjnym (Attachment Factor) w ciągu tygodnia, jednak nie jest rzadkością, że do jednej trzeciej eksplantów nie udaje się przytwierdzić w tym czasie....

Dyskusja

Istotnym wyzwaniem technicznym związanym z tworzeniem i namnażaniem ludzkich komórek śródbłonka rogówki jest zapobieganie występowaniu EMT w hodowlach. EMT może być wyzwalany w komórkach śródbłonka rogówki przez utratę kontaktu między komórkami, jednak większość protokołów hodowli komórkowych dla tych komórek obejmuje dysocjację enzymatyczną do pojedynczych komórek podczas izolacji i subhodowli¹⁰. W tym miejscu przedstawiamy alternatywny protokół hodowli komórkowych komórek śródbłonka rogówki, któ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Czynnik przyłączenia	Gibco	S006100	1X sterylny roztwór zawierający żelatynę, który służy do powlekania powierzchni kultur tkankowych. Przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.
Ekstrakt z przysadki bydlęcej	Gibco	13028014	Pojedyncza fiolka zawiera 25 mg. Zamrażać w porcjach.
Chlorek wapnia	Merck	C5670	Rozpuścić w HBSS, aby uzyskać 1 mM roztwór podstawowy. Sterylizacja filtra.
Probówka wirówkowa, 50 ml	Labtek	650.550.050
Siarczan chondroityny	LKT Laboratories	C2960	To jest siarczan chondroityny bydlęcej. Rozpuścić w HBSS, aby uzyskać roztwór podstawowy o stężeniu 0,08 g/ml. Przefiltrować, wysterylizować i zamrozić w porcjach.
Dispase II	Gibco	17105-041	Rozpuścić w DPBS, aby uzyskać roztwór podstawowy o stężeniu 2 mg/ml. Przefiltrować, wysterylizować i zamrozić w porcjach.
Etanol	Labtek	EA043	100% niedenaturowany etanol należy rozcieńczyć do 70% w wodzie dejonizowanej do sterylizacji narzędzi i powierzchni.
Surowica bydlęca płodu	GE Healthcare Australia Pty Ltd	SH30084.03	Jest to marka HyClone płodowej surowicy bydlęcej.
Szkło nakrywkowe nr 1, i Oslash; 13 mm	Proscitech	G401-13	Wysterylizowane szkiełka nakrywkowe należy umieścić w 24-dołkowych płytkach do hodowli tkankowej.
HBSS	Gibco	14025-092	Zbilansowany roztwór soli Hanka, 1X, zawierający chlorek wapnia i chlorek magnezu.
2-fosforan kwasu L-askorbinowego	Merck	A8960	Rozpuścić w HBSS, aby uzyskać 150 mM roztwór podstawowy. Sterylizacja filtra.
Komora Micro-Boydena	CNC Components Pty. Ltd.	Pierścień górny: QUT-0002-0006, Pierścień podstawowy: QUT-0002-0007	Oba elementy są wykonane z politetrafluoroetelinu (PTFE).
O-ring do komory mikro-Boydena	Ludowici Sealing Solutions	RSB012	Składa się z gumy silikonowej.
Opti-MEM 1 (1X) + GlutaMAX-1	Gibco	51985-034	Zredukowana pożywka surowicowa zawierająca glutaminę.
DPBS	Gibco	14190-144	Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco, 1X, bez chlorku wapnia i chlorku magnezu.
Pen Strep	Gibco	15140-122	Roztwór antybiotyku 100X zawierający 10 000 jednostek/ml penicyliny i 10 000 &mikro; g/ml streptomycyny.
Szalka Petriego	Sarstedt	82.14473.001	Sterylna szalka Petriego, 92 X 16 mm, do preparowania tkanek.
Płytka do hodowli tkankowej, 24-dołkowa	Corning Incorporated	Costar 3524	Płytka zawierająca 24 studzienki, każda o powierzchni 2 cm2.
Płytka do hodowli tkankowej, 6-dołkowa	Corning Incorporated	Costar 3516	Płytka zawierająca 6 studzienek, każdy o powierzchni 9 cm2.
TrypLE Select	Gibco	12563-011	Roztwór enzymatyczny 1X do dysocjacji komórek.
Versene	Gibco	15040-066	Roztwór 1X EDTA do dysocjacji komórek.
Kleszcze zegarmistrzowskie	Labtek	BWMF4	Number 4 dobrze sprawdzają się przy usuwaniu pasków błony śródbłonka/Descemeta z rogówki.

Kleszczyki zegarmistrzowskie