Kwantyfikacja poziomów etanolu w zarodkach danio pręgowanego za pomocą chromatografii gazowej w przestrzeni głowy

Summary

Ta praca opisuje protokół ilościowego oznaczania poziomu etanolu w zarodku danio pręgowanego za pomocą chromatografii gazowej w przestrzeni głowy, od właściwych metod ekspozycji do przetwarzania zarodków i analizy etanolu.

Abstract

Alkoholowe Zaburzenia Płodowe (FASD) opisują bardzo zmienne kontinuum wad rozwojowych wywołanych etanolem, w tym dysmorfologii twarzy i zaburzeń neurologicznych. Ze złożoną patologią FASD dotyka około 1 na 100 dzieci urodzonych w Stanach Zjednoczonych każdego roku. Ze względu na bardzo zmienny charakter FASD, modele zwierzęce okazały się kluczowe w naszym obecnym mechanistycznym rozumieniu wad rozwojowych wywołanych etanolem. Coraz więcej laboratoriów koncentruje się na wykorzystaniu danio pręgowanego do badania wad rozwojowych wywołanych etanolem. Danio pręgowany wytwarza dużą liczbę zewnętrznie zapłodnionych, genetycznie podatnych, półprzezroczystych zarodków. Pozwala to naukowcom precyzyjnie kontrolować czas i dawkę ekspozycji na etanol w wielu kontekstach genetycznych oraz określić ilościowo wpływ ekspozycji na etanol w zarodku za pomocą technik obrazowania na żywo. To, w połączeniu z wysokim stopniem zachowania zarówno genetyki, jak i rozwoju z ludźmi, dowiodło, że danio pręgowany jest potężnym modelem do badania mechanistycznych podstaw teratogenności etanolu. Jednak schematy ekspozycji na etanol różniły się w różnych badaniach nad danio pręgowanym, co zakłóciło interpretację danych z danio pręgowanego w tych badaniach. Oto protokół ilościowego oznaczania stężeń etanolu w zarodkach danio pręgowanego za pomocą chromatografii gazowej w przestrzeni głowy.

Introduction

Alkoholowe Zaburzenia Płodowe (FASD) opisują szeroki wachlarz zaburzeń neurologicznych i dysmorfologii twarzoczaszki związanych z ekspozycją na embrionalny etanol¹. Wiele czynników, w tym czas i dawka ekspozycji na etanol oraz tło genetyczne, przyczynia się do zmienności FASD^2,3. U ludzi złożony związek tych zmiennych sprawia, że badanie i zrozumienie etiologii FASD jest trudne. Modele zwierzęce okazały się kluczowe dla pogłębienia naszej wiedzy na temat mechanistycznych podstaw teratogenności etanolu. Do badania wielu aspektów FASD wykorzystano szeroką gamę systemów modeli zwierzęcych, a wyniki były niezwykle zgodne z tym, co stwierdzono w ekspozycji u ludzi⁴. Systemy modeli gryzoni są używane do badania wielu aspektów FASD, przy czym myszy są najczęstsze^5,6,7. Większość tej pracy skupiała się na wadach rozwojowych spowodowanych wczesną ekspozycją na etanol⁸, chociaż wykazano, że późniejsze narażenie na etanol również powoduje anomalie rozwojowe⁹. Co więcej, genetyczne zdolności myszy znacznie pomogły nam w badaniu genetycznych podstaw FASD^10,11. Te badania na myszach silnie sugerują, że istnieją interakcje gen-etanol ze szlakiem sonic hedgehog, sygnalizacją kwasu retinowego, dysmutazą ponadtlenkową, syntazą tlenku azotu I, Aldh2 i Fancd2^{8,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21}. Badania te pokazują, że modele zwierzęce mają kluczowe znaczenie dla pogłębienia naszej wiedzy na temat FASD i jego mechanizmów leżących u podstaw.

Danio pręgowany stał się potężnym modelowym systemem do badania wielu aspektów teratogenezy etanolu^22,23. Ze względu na ich zewnętrzne zapłodnienie, wysoką płodność, podatność genetyczną i możliwości obrazowania na żywo, danio pręgowany idealnie nadaje się do badania takich czynników, jak czas, dawkowanie i genetyka teratogenezy etanolu. Etanol może być podawany do precyzyjnie zaawansowanych zarodków, a zarodki mogą być następnie obrazowane w celu zbadania bezpośredniego wpływu etanolu na procesy rozwojowe. Ta praca może być bezpośrednio związana z ludźmi, ponieważ genetyczne programy rozwoju są wysoce konserwatywne między danio pręgowanym a ludźmi i dlatego mogą pomóc w prowadzeniu badań FASD na ludziach²⁴. Podczas gdy danio pręgowany był używany do badania teratogenezy etanolu, brak konsensusu w raportowaniu embrionalnych stężeń etanolu utrudnia porównanie z ludźmi²⁵. W układach ssaków poziom alkoholu we krwi koreluje bezpośrednio z poziomem etanolu w tkankach²⁶. Wiele badań nad danio pręgowanym traktuje zarodki przed całkowitym utworzeniem ich układu krążenia. Ponieważ nie ma próbki matki do zbadania, wymagany jest proces oceny stężeń etanolu w celu ilościowego określenia poziomu etanolu w zarodku. W tym miejscu opisujemy proces ilościowego określania stężeń etanolu w rozwijającym się zarodku danio pręgowanego za pomocą chromatografii gazowej w przestrzeni głowowej.

Protocol

Wszystkie zarodki danio pręgowanego użyte w tej procedurze zostały wyhodowane i wyhodowane zgodnie z ustalonymi protokołami IACUC²⁷. Protokoły te zostały zatwierdzone przez University of Texas w Austin i University of Louisville.

UWAGA: Linia danio pręgowanego Tg(fli1:EGFP)^y1 została użyta w tym badaniu²⁸. Cała woda używana w tej procedurze to sterylna woda z odwróconej osmozy. Wszystkie analizy statystyczne zostały wykonane przy użyciu Graphpad Prism v8.2.1.

1. Wytwarzanie pożywki dla embrionów

1. Aby przygotować 20-krotny zapas pożywki dla zarodków, rozpuść 17,5 g NaCl, 0,75 g KCl, 2,9 g CaCl₂, 0,41 g K₂HPO₄, 0,142 g NA₂HPO₄ i 4,9 g MgSO₄·7H₂O w 1 l wody. Zignoruj biały osad, który się tworzy; Nie będzie to miało wpływu na media. Przefiltrować, wysterylizować roztwór podstawowy i przechowywać w temperaturze 4 °C.
2. Aby utworzyć roztwór roboczej pożywki dla zarodków, rozpuść 1,2 g NaHCO₃ w 1 litrze 20 pożywek dla zarodków i dodaj 19 l wody. Roztwór roboczej pożywki dla zarodków należy utrzymywać w temperaturze 28 °C.

2. Pomiar objętości embrionalnej za pomocą wyporności wody

UWAGA: W tym protokole używane są zarodki po 24 godzinach po zapłodnieniu (hpf) (Rysunek 1). Zarodki użyte do pomiarów objętości nie są wykorzystane w analizie etanolu.

1. Umieść 10 zarodków i płyn pozaembrionalny w probówce mikrowirówki o pojemności 1,5 ml oznaczonej objętością 250 μl (Rysunek 2A). Dodaj wodę do linii napełniania 250 μl (patrz próbka z barwioną wodą w Rysunek 2B).
2. Powtórz krok 2.1, aby ustawić pojemniki dla zarodków, z których usunięto kosmówkę.
   1. Aby usunąć kosmówkę, umieść zarodki w ich kosmówce na 100-milimetrowej szalce Petriego z 2 mg/ml koktajlu proteazy w pożywce dla zarodków w temperaturze pokojowej (RT) przez 10 minut. Co kilka minut delikatnie obracaj zarodki, aby przerwać kosmówkę.
   2. Gdy wszystkie zarodki są wolne od kosmówki, usunąć zarodki pozbawione kosmówki z koktajlu proteazy/pożywki zarodkowej i umieścić na nowej szalce Petriego o średnicy 100 mm ze świeżą pożywką zarodkową w celu umycia zarodków. Powtórz ten krok prania jeszcze 1 raz (w sumie 2 prania). Przenieś zarodki na świeżą szalkę Petriego o średnicy 100 mm.
3. Używając możliwie najmniejszej końcówki i bez uszkadzania zarodków, ostrożnie usuń cały płyn z okolic zarodków za pomocą mikropipetora p200 (Rysunek 2C) i zważ wodę na wadze z dokładnością <0,1 mg. Aby określić objętość próbki 10 zarodków, odejmij masę/objętość pobranej wody (1 ml wody = 1 g wody) od 250 μl. Aby określić objętość pojedynczego zarodka, podziel różnicę między 250 μl a masą usuniętej wody przez 10.

3. Leczenie embrionów etanolem

1. Zebrać zarodki ze zbiorników godowych i umieścić na standardowej szalce Petriego o średnicy 100 mm. Odliczyć nie więcej niż 100 zarodków na pojedynczą szalkę Petriego i inkubować w temperaturze 28,5 °C.
   UWAGA: Jeśli kosmówka ma zostać usunięta (krok 2.2), należy ją usunąć przed dodaniem etanolu.
2. Przy 6 hpf dodać do 100 zarodków na nową, standardową szalkę Petriego o średnicy 100 mm z pożywką dla zarodków lub pożywką dla zarodków + 1% etanolu (v/v). Przykryj, ale NIE uszczelniaj szalki Petriego. Umieścić zarodki w inkubatorze niskotemperaturowym ustawionym na temperaturę 28,5 °C na 18 godzin lub do momentu, gdy zarodki osiągną punkt czasowy rozwoju wynoszący 24 hpf.

4. Przygotowanie przepływu pracy przed przetwarzaniem zarodków do chromatografii gazowej w przestrzeni głowy

1. Przygotować roztwór 5 M NaCl w wodzie (potrzebne będzie 450 μl na probówkę z próbką), aby zdenaturować wszystkie białka i zapobiec metabolizmowi etanolu. Przygotować koktajl proteazy (tabela materiałów) w stężeniu 2 mg/ml w pożywce zarodkowej.
2. Oznaczyć 1,5 ml probówki mikrowirówkowej i fiolkę chromatografu gazowego o pojemności 2 ml dla każdej próbki. Oznaczyć dodatkowe fiolki do chromatografu gazowego o pojemności 2 ml dla wzorców etanolu opisanych poniżej, a także powietrze, wodę i ślepe próby koktajlu 5 M NaCl/proteazy.
3. Ustawić trzy mikropipety p200, dwie ustawione na 50 μl, a trzeci zestaw na 200 μl; mikropipetor p1000 ustawiony na 450 μl i mikropipetor p2 ustawiony na 2 μl. W przypadku szklanych pipet używanych do przenoszenia zarodków z szalek Petriego do probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml należy szybko przepuścić końcówkę pipety przez płomień, aby wygładzić krawędzie i nie uszkodzić zarodków podczas wciągania ich do pipety.

5. Przetwarzanie embrionów do chromatografii gazowej w przestrzeni głowy

UWAGA: Zarówno zarodki w ich kosmówce, jak i te wcześniej usunięte z ich kosmówek są traktowane tak samo dla spójności w obliczaniu współczynników rozcieńczenia.

1. Używając dwóch mikropipetorów p200 ustawionych na 50 μl, narysuj 50 μl roztworu koktajlu proteazy do jednego i wciągnij 50 μl wody do drugiego.
2. Za pomocą szklanej pipety i mikropipetora szybko umieść 10 zarodków (z kroku 3.2) w probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml i zamknij nakrętkę (zgodnie z opisem w Rysunek 2A). Powtórz tę czynność dla wszystkich próbek, które mają być badane, kontroli i zarodków poddanych działaniu etanolu.
3. Używając mikropipetora p200 ustawionego na 200 μl, szybko otwórz nakrętkę i usuń wszystkie resztki pożywki zarodkowej (zgodnie z opisem w Rysunek 2C). Szybko umieść pipetę zawierającą 50 μl wody w probówce i szybko, ale delikatnie (aby nie uszkodzić zarodków) dodaj, a następnie usuń wodę. Szybko dodaj 50 μl roztworu koktajlu proteazy z pipety oczekującej i zamknij nakrętkę probówki (Rysunek 2D).
   UWAGA: Wykonuj ten proces pojedynczo próbkę.
4. Pozostaw próbkę w temperaturze pokojowej przez 10 minut, aby koktajl proteazy mógł zdegradować kosmówkę. Następnie szybko dodaj 450 μl 5 M NaCl i zamknij nakrętkę probówki (Rysunek 2E). Wirować próbki przez 10 minut. Aby przyspieszyć proces, ustaw mieszalnik tak, aby wirował wiele próbek w tym samym czasie.
   UWAGA: Dodaj niewielką ilość (~100 μL) mieszanki kulek krzemionkowych (2 rozmiary, kulka 0,5 mm i 1 mm) do dowolnej probówki z zarodkami starszymi niż 24 hpf. U starszych zarodków struna grzbietowa pozostanie nienaruszona niezależnie od tego, jak długo są one homogenizowane.
5. Po homogenizacji przez 10 minut szybko usunąć 2 μl homogenizowanego supernatantu z zarodków i dodać do fiolki z chromatografem gazowym. Szybko zamknąć fiolkę nakrętką z politetrafluoroetylenu.

6. Przygotowanie pożywek i wzorców etanolu

1. Aby przygotować wzorce pożywki, należy rozcieńczyć pożywkę 10-krotnie roztworem koktajlu 5 M NaCl/proteaza. Dodać 2 μl każdej próbki do fiolki z chromatografem gazowym i zamknąć pokrywą z politetrafluoroetylenu.
2. Aby przygotować wzorce etanolu, należy utworzyć seryjne rozcieńczenie 100% etanolu w 5 M roztworze koktajlu NaCl/proteazy do następujących stężeń: 0,3125, 0,625, 1,25, 2,5, 5, 10, 20 i 40 mM. Dodać po 2 μl każdego wzorca do fiolki z chromatografem gazowym i zamknąć nasadką z politetrafluoroetylenu.

7. Przygotowanie chromatografu gazowego w przestrzeni głowy

UWAGA: Ta konfiguracja i protokół mogą wymagać zmiany w zależności od używanego chromatografu gazowego. Chromatografia gazowa w przestrzeni czołowej służy do ilościowego określania poziomów etanolu, a nie do separacji.

1. Ustaw grzałkę automatycznego podajnika próbek na 58 °C i włącz. Pozwól, aby grzałka osiągnęła temperaturę 58 °C i włącz przewody powietrza i wodoru gazowego zasilające chromatograf gazowy (do jonizacji płomieniowej używanej do ilościowego oznaczania etanolu).
   UWAGA: Psi powinno być ustawione tak, aby chromatograf działał prawidłowo zgodnie ze specyfikacjami producenta. Upewnij się, że przewód helu jest włączony i ustawiony na odpowiednie psi.
2. W przypadku przegrody należy upewnić się, że liczba wstrzykiwanych próbek nie wynosi >100. W przypadku włókna iniekcyjnego upewnij się, że liczba wstrzykniętych próbek nie wynosi >500.
   UWAGA: Jeśli którykolwiek z nich przekracza liczbę wstrzyknięć, należy je zmienić przed uruchomieniem próbek testowych.
3. Włącz oprogramowanie analityczne i upewnij się, że stacja robocza jest prawidłowo skonfigurowana. Przechowuj wszystkie dane zgodnie ze standardami laboratorium/działu. Utwórz nową listę próbek dla próbek, które mają zostać uruchomione.
4. Zainicjuj metodę uruchamiania i poczekaj, aż detektor płomieniowo-jonizacyjny ustabilizuje się przed uruchomieniem próbek. Po ustabilizowaniu uruchom metodę uruchamiania oprogramowania, aby wyczyścić światłowód.

8. Pomiary próbek za pomocą chromatografii gazowej w przestrzeni głowy

1. Po zakończeniu metody uruchamiania utwórz 1 nowy wiersz na próbkę na liście próbek. Z menu metod w oprogramowaniu do analizy załaduj 436 Prąd spme etanol 2013 3min absorbować 2_5min rg bieg. METH dla każdej próbki z listy próbek.
   1. Wypełnij listę próbek, zaczynając od powietrza, wody, 5 M półfabrykatów koktajlu NaCl/proteazy. Następnie wprowadź normy w kolejności, od 0,3125 do 40 mM. Postępuj zgodnie z normami z drugą rundą półfabrykatów koktajlowych powietrze, woda i 5 M NaCl/proteaza.
   2. Wprowadzić wszystkie homogenizowane próbki supernatantu zarodka do badania, od najniższego do najwyższego przewidywanego stężenia etanolu. Zakończ wchodząc w trzecią i ostatnią rundę półfabrykatów koktajlu powietrza, wody i 5 M NaCl/proteazy.
2. Dodać fiolki z chromatografem gazowym do automatycznego podajnika próbek w kolejności, w jakiej próbki zostały wprowadzone. Pozostaw próbki do ogrzania przez 10–15 minut. Uruchom przykładowe przebiegi w oprogramowaniu.
3. Po uruchomieniu wszystkich próbek i końcowych półfabrykatów aktywuj metodę zamykania w oprogramowaniu, dodając końcową próbkę do listy próbek i uruchamiając tryb wstrzymania. MET H. Utwórz kopię zapasową wszystkich danych uzyskanych podczas próbnych przebiegów. Wyłącz urządzenie w następującej kolejności: grzałka automatycznego podajnika próbek, zbiornik wodoru i dopiero gdy temperatura chromatografu osiągnie 30 °C, zbiornik powietrza. Pozostaw zbiornik helu włączony, aby zachować kolumnę wosku.

9. Integracja piku etanolu w próbce i analiza stężenia próbki

UWAGA: Wszystkie wartości od 9.3 zostały obliczone w pliku Excel, który zawierał wszystkie równania.

1. Po zakończeniu metody wyłączania kliknij Otwórz chromatogram. Otwórz folder zawierający wyniki. Próbki są automatycznie integrowane z tym programem.
2. W wynikach upewnij się, że zostały zintegrowane właściwe piki (piki etanolu od 2 do 2,5). Po potwierdzeniu wszystkich próbek wydrukuj lub wyeksportuj wyniki.
3. Wykreślić na wykresie wysokość piku wzorców etanolu. Obliczyć nachylenie, punkt przecięcia z osią Y i wartości R² dla wzorców etanolu (R² powinien wynosić >0,99).
   UWAGA: Wartości te zostaną wykorzystane do określenia stężenia etanolu na podstawie wysokości piku próbki.
4. Dla każdej próbki należy odjąć wysokość piku próbki od punktu przecięcia Y wzorców etanolu. Podzielić tę wartość przez nachylenie wzorców etanolu, aby uzyskać wartość etanolu dla każdej próbki w fiolkach GC.

5. Aby obliczyć stężenie etanolu w zarodkach, należy najpierw obliczyć współczynnik rozcieńczenia dla każdej próbki. Weź pomiar objętości obliczony w kroku 2.3 niniejszego protokołu i podziel go przez pomiar objętości plus 500 μl. Odpowiada to 5 M roztworowi koktajlu NaCl/proteazy dodawanemu do każdej próbki podczas przetwarzania zarodków (kroki 5.3 i 5.4).

6. Stosując ten współczynnik rozcieńczenia próbki, pomnożyć przez wartość etanolu w próbce dla każdej próbki. Wyniki będą w stężeniu mM. Obliczyć próbki referencyjne podłoża, mnożąc wartość alkoholu etylowego w pożywce przez współczynnik rozcieńczenia równy 10.

Results

Nie można określić poziomu etanolu we krwi u wczesno-embrionalnej danio pręgowanej, ponieważ nie mają one w pełni ukształtowanego układu krążenia. Aby określić poziom stężenia etanolu w zarodkach danio pręgowanego, poziomy etanolu mierzy się bezpośrednio z homogenizowanej tkanki embrionalnej. Aby prawidłowo zmierzyć stężenie etanolu w zarodku, należy wziąć pod uwagę objętość zarodka. Zarodek (przyczepione żółtko) znajduje się wewnątrz kosmówki (skorupki jaja) otoczony płynem pozaembrionalnym (Ryc. 1)....

Discussion

Jako system modelowy danio pręgowany idealnie nadaje się do badania wpływu czynników środowiskowych na rozwój. Produkują one dużą liczbę zapłodnionych zewnętrznie zarodków, co pozwala na precyzyjne określenie czasu i dawkowania w badaniach nad etanolem. To, w połączeniu z możliwościami obrazowania na żywo oraz ochroną genetyczną i rozwojową u ludzi, sprawia, że danio pręgowany jest potężnym systemem modelowym do badań teratologicznych. Opisano protokół pomiaru embrionalnych stężeń etanolu w rozwijających się zarodkach da...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Powietrze			dostarczane na podstawie umowy z uniwersytetem
Waga analityczna	VWR	10204-962
AutoSampler, CP-8400 Autosampler	chromatografu gazowego	Varian
Chlorek wapnia	VWR	97062-590
Etanol	Decon Labs	2701
Fiolka do chromatografu gazowego z przegrodą politetrafluoroetylenową/silikonową i plastikową nasadką 2 ml	Agilent	8010-0198	Można ponownie użyć fiolek po oczyszczeniu, ale nie nakrętek/przegród
Chromatograf gazowy, CP-3800	Varian
Helium			Dostarczony na podstawie umowy z uniwersytetem
Kolumna kapilarna HP Innowax	Agilent	19095N-123I	30 m x 0,53 mm x 1,0 μ m gruba folia
Hyrdogen			Dostarczony na podstawie umowy z uniwersytetem
Siarczan magnezu (heptahydrat)	Fisher Scientific	M63-500
Probówka do mikrowirówek 1,5 ml	Fisher Scientific	2682002
Końcówki do mikropipet 10 i mu; L	Fisher Scientific	13611106
Końcówki do mikropipet 1000 μ L	Fisher Scientific	13611127
Końcówki do mikropipet 200 μ L	Fisher Scientific	13611112
szalki Petriego 100 mm	Fisher Scientific	FB012924
Pipetman L p1000L Mikropipeta	Gilson	FA10006M
Pipetman L p200L Mikropipeta	Gilson	FA10005M
Pipetman L p2L Mikropipeta	Gilson	FA10001M
Przegroda politetrafluoroetylenowa/silikonowa oraz plastikowa nasadka	Agilent	5190-7021	Wymienne nakrętki/przegrody do fiolek do chromatografu gazowego
Chlorek potasu	Fisher Scientific	P217-500
Fosforan potasu (dwuzasadowy)	VWR	BDH9266-500G
Pronase	VWR	97062-916
Koraliki krzemionkowe 5 mm	Produkty Biospec	11079105z
Koraliki krzemionkowe 1,0 mm	Biospec Products	11079110z
Wodorowęglan sodu	VWR	BDH9280-500G
Chlorek sodu	Fisher Scientific	S271-500
Fosforan sodu (dwuzasadowy)	Fisher Scientific	S374-500
Zespół włókien do mikroekstrakcji do fazy stałej Karboksen/Polidimetylosiloksan	Millipore Sigma	57343-U	Włókna zamienne
Stacja robocza do chromatografii gwiaździstej	Oprogramowanie do chromatografii	varianowej
Thermogreen Low Bleed (LB-2) Septa	Millipore Sigma	23154	Wymienna przegroda wlotowa