Artykuł metodologiczny

Znakowanie i wychwyt dekstranu w żywych i funkcjonalnych mysich komórkach rzęsatych ślimaka

DOI:

10.3791/60769

⸱

8 lutego 2020

 , 
1Molecular Physiology and Biophysics Section, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy metodę wizualizacji wychwytu 3 kDa Texas Red-labeled dextranu w słuchowych komórkach rzęsatych z funkcjonalnymi kanałami mechanotransdukcji. Ponadto dektrans o stężeniu 3–10 kDa może być stosowany do badania endocytozy we włosach i komórkach podporowych narządu Cortiego.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kanał mechanotransdukcji komórek rzęsatych (MET) odgrywa ważną rolę w słyszeniu. Jednak tożsamość molekularna i informacje strukturalne MET pozostają nieznane. Badania elektrofizjologiczne komórek rzęsatych wykazały, że kanał MET ma dużą przewodność i jest przepuszczalny dla stosunkowo dużych fluorescencyjnych cząsteczek kationowych, w tym niektórych barwników styrylowych i antybiotyków aminoglikozydowych znakowanych na czerwono w Teksasie. W tym protokole opisujemy metodę wizualizacji i oceny wychwytu dektransu fluorescencyjnego w komórkach rzęsatych narządu eksplantatów Cortiego, którą można wykorzystać do oznaczenia funkcjonalnych kanałów MET. Odkryliśmy, że 3 kDa Texas znakowany na czerwono dekstran specyficznie znakuje funkcjonalne słuchowe komórki rzęsate po 1-2 godzinach inkubacji. W szczególności dekstran o masie 3 kDa znakuje dwa krótsze rzędy stereorzęsek i gromadzi się w ciele komórki w postaci rozproszonej, gdy obecne są funkcjonalne kanały MET. Dodatkowy pęcherzykowaty wzór znakowania zaobserwowano w ciele komórkowym komórek rzęsatych i otaczających komórkach podporowych. Nasze dane sugerują, że dekstran Texas-Red o stężeniu 3 kDa może być wykorzystany do wizualizacji i badania dwóch szlaków wychwytu barwnika komórkowego; specyficzna dla komórek rzęsatych droga wejściowa przez funkcjonalne kanały MET i endocytozę, wzór dostępny również dla większego dekstranu.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki rzęsate ucha wewnętrznego to komórki czuciowe, które wykrywają dźwięk i ukrywają bodźce mechaniczne w sygnałach elektrycznych, które ostatecznie są interpretowane przez nasz mózg. Komórki te mają wiązkę w kształcie schodów składającą się z trzech rzędów włókien na bazie aktyny, znanych jako stereocilia, które wystają z ich obszaru wierzchołkowego1,2. Bodźce mechaniczne odchylają włókna stereocilii w kierunku najdłuższego rzędu i powodują otwarcie kanałów mechanotransdukcji (MET)3. Otwarcie kanałów MET prowadzi do napływu kationów, które depolaryzują komórkę, a w konsekwencji sygnalizują uwolnienie pęcherzyków synapsowych w obszarze podstawy komórki rzęsatego.

Biofizyczne właściwości kanału MET, niezbędnego do słyszenia, zostały szczegółowo scharakteryzowane. Wśród innych właściwości, kanały te są selektywne kationowo i mają stosunkowo dużą przewodność (150–300 pS przy niskim Ca2+)4,5,6,7,8,9,10. Co ciekawe, duże cząsteczki fluorescencyjne, takie jak FM1-43 i aminoglikozydy znakowane Texas Red, są permodalnymi blokerami kanału MET, co powoduje ich akumulację w ciele komórki włosa, co można uwidocznić za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej11,12,13,14. I odwrotnie, tożsamość molekularna i struktura kanału MET oraz jego szlaku przenikania pozostały nieuchwytne. Coraz więcej dowodów eksperymentalnych wskazuje, że białko kanału transbłonopodobnego 1 (TMC1) jest składnikiem kanału MET w dojrzałych komórkach rzęsatych15,16,17,18,19. Mutacje w transbłonopodobnym kanale 1 (TMC1) zmieniają właściwości kanału MET19,20,21,22 i powodują głuchotę. Ponadto TMC1 lokalizuje się w miejscu kanału MET18,23 i wchodzi w interakcję z ogniwem końcówki odpowiedzialnym za przesyłanie siły mechanicznej do kanału MET24,25. Co więcej, niedawna analiza bioinformatyczna zidentyfikowała białka TMC jako ewolucyjnie związane z mechanowrażliwymi kanałami białek TMEM63/OSCA i białkami TMEM16, rodziną kanałów chlorkowych aktywowanych wapniem i scramblazów lipidowych26,27,28. Model strukturalny TMC1 oparty na relacji między tymi białkami ujawnił obecność dużej wnęki na granicy faz białko-lipid27. Ta jama jest siedliskiem dwóch mutacji TMC1, które powodują autosomalny dominujący ubytek słuchu (DFNA36)27,29,30,31,32, oraz selektywna modyfikacja mutantów cysteiny pod kątem reszt w jamie zmienia właściwości kanału MET28, co wskazuje, że może on funkcjonować jako szlak przenikania kanału MET. Duży rozmiar tej przewidywanej wnęki w białkach TMC może wyjaśniać zdolność dużych cząsteczek do przenikania przez kanał MET. Aby przetestować przewidywanie, że kanał MET zawiera niezwykle duży szlak przenikania i przesunąć granice wielkości ubytku obserwowanego w TMC1, opracowaliśmy protokół przeprowadzania eksperymentów wychwytu w narządzie eksplantatów Cortiego z większą cząsteczką, dekstranem 3 kDa fluorescencyjnie znakowanym czerwienią teksańską.

Dekstran to złożony, rozgałęziony polisacharyd złożony z wielu cząsteczek D-glukozy połączonych wiązaniami alfa-1,6 glikozydowymi. Jego wysoka rozpuszczalność w wodzie, niska toksyczność komórek i bioobojętność sprawiają, że jest to wszechstronne narzędzie do badania kilku procesów komórkowych. Ponadto dekstran jest dostępny w szerokiej gamie rozmiarów i znakowany fluorescencyjnie fluoroforami w kilku kolorach. Znakowane fluorescencyjnie dektransy są powszechnie stosowane w badaniach przepuszczalności komórek i tkanek33,34, do badania endocytozy w wielu układach komórkowych35,36, oraz do śledzenia neuronów37,38. W dziedzinie słuchu cząsteczki dekstranu zostały również wykorzystane do oceny przerwania połączenia komórka-komórka i utraty integralności nabłonka czuciowego słuchowego po ekspozycji na intensywny hałas w narządzie szynszyli Corti39,40.

W tej pracy wykorzystaliśmy właściwości niektórych z najmniejszych (3 i 10 kDa) fluorescencyjnego dektransu, aby przeprowadzić eksperymenty z wychwytem w mysich komórkach rzęsatych ucha wewnętrznego i zbadać wielkość szlaku przenikania kanału MET komórek rzęsatych ucha wewnętrznego. Ponadto użyliśmy laserowo-skaningowego mikroskopu konfokalnego (LSM) 880 wyposażonego w detektor Airyscan do wizualizacji i lokalizacji fluorescencyjnego dekstranu w stereorzęskach i ciele komórkowym słuchowych komórek rzęsatych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Procedury opieki nad zwierzętami i eksperymentów zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi dotyczącymi opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych, które zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Narodowego Instytutu Zaburzeń Neurologicznych i Udaru (Protokół dla zwierząt #1336 do KJS).

1. Myszy

  1. Ustaw kilka par hodowlanych typu dzikiego C57BL/6J do rozmnażania w obiekcie dla zwierząt, aby kontrolować datę narodzin miotów i śledzić wiek szczeniąt.

2. Rozwarstwienie ślimaka

  1. Ustaw czystą przestrzeń w pobliżu mikroskopu stereoskopowego, aby przeprowadzić sekcje (Rysunek 1A). Użyj 70% etanolu do oczyszczenia przestrzeni i otoczenia i umieść czystą podkładkę na ławkę. Do wyrzucenia zwłok zwierzęcych wymagana byłaby plastikowa torba na medyczne odpady patologiczne (MPW).
  2. Przygotuj kilka potraw 35 mm z niektórymi mediami L15 firmy Leibovitz.
    UWAGA: Pożywka komórkowa L-15 firmy Leibovitz zawiera 1–2 mM Ca2+, która jest niezbędna do utrzymania integralności połączeń końcówkowych i zawiera niezbędne aminokwasy, witaminy i pirogronian sodu w celu poprawy zdrowia i przeżycia komórek. Surowicę wykluczono, aby uniknąć zmienności eksperymentalnej ze względu na jej słabo określony skład i potencjalną interferencję z dekstranem.
  3. Eutanazja myszy po porodzie 6 (P6) przez dekapitację.
    UWAGA: 6-dniowe myszy są nieco odporne na wziewne środki znieczulające. Chociaż do eutanazji można stosować izofluran lub przedłużone narażenie na CO2 (do 50 minut), zaleca się stosowanie wtórnej metody fizycznej w celu zapewnienia śmierci.
  4. Użyj nożyczek chirurgicznych, aby usunąć skórę czaszki, wykonując powierzchowne cięcie od przodu do tylnego końca i w poprzek zewnętrznych kanałów słuchowych.
  5. Złóż skórę w kierunku nosa, aby odsłonić czaszkę (Rysunek 2B).
  6. Wykonaj nacięcie od tyłu do przodu czaszki i w poprzek linii oczu (Ryc. 2B-C).
  7. Podziel czaszkę na dwie połowy i usuń mózg za pomocą małej szpatułki, aby odsłonić kości skroniowe (Ryc. 2 C-D).
  8. Małymi nożyczkami przetnij kości skroniowe i wytnij tkankę.
  9. Umieść obie kości skroniowe w naczyniu o średnicy 35 mm i upewnij się, że są pokryte podłożem L15 (Rysunek 2E).
    UWAGA: Poniższe czynności są wykonywane pod mikroskopem stereoskopowym. Czarne tło zwykle pomaga uwidocznić tkankę podczas drobnych etapów sekcji.
  10. Pod mikroskopem stereoskopowym wyposażonym w okular szerokokątny (10-krotne powiększenie (WF10X) i zewnętrzne halogenowe źródło światła prądu przemiennego (AC)) usuń otaczającą tkankę ślimaka, kanały półkoliste i narządy przedsionkowe za pomocą kleszczy chirurgicznych (Rysunek 2F).
  11. Aby dekstran i pożywka L15 mogły dostać się do przewodu ślimakowego, wykonaj dwie granice nakłucia na wypreparowanym ślimaku, jedną na okrągłym okienku, a drugą w wierzchołkowej okolicy ślimaka.
  12. Dodać 300 ml pożywki L15 firmy Leibovitz do każdej studzienki z 9-dołkowej szklanej płytki wgłębieniowej.
  13. Umieść co najmniej trzy wypreparowane ślimaki na każdej studzience.

3. Etykietowanie dekstranu

  1. Rozpuść dekstran w zrównoważonym roztworze soli Hanksa bez Ca2+ i Mg2+ (HBSS-CFM) w końcowym stężeniu 10 mg/ml. Roztwór podstawowy musi być umieszczony w nieprzezroczystych czarnych probówkach (chronionych przed światłem) i przechowywany w temperaturze -30 °C do momentu użycia><. UWAGA: Stosowanie dekstranu utrwalanego lizyną ma kluczowe znaczenie dla pomyślnego wyniku tego protokołu.
  2. Przygotować każdy dekstran w końcowym stężeniu 2 mg/ml w 500 ml pożywki L15 firmy Leibovitz.
  3. Usunąć pożywkę ze ślimaka i dodać pożywkę L15 Leibovitz zawierającą interesujący nas dekstran w końcowym stężeniu 2 mg/ml.
    UWAGA: Chociaż część kanałów MET jest otwarta w spoczynku41,42, inkubację dekstranu przeprowadzono z delikatnym potrząsaniem eksplantatów, aby zwiększyć prawdopodobieństwo otwarcia kanału MET.
  4. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 godziny z delikatnym wytrząsaniem (25 obr./min) przy użyciu 3-wymiarowej wytrząsarki o kącie nachylenia 25°.
    UWAGA: Dekstran znakowany fluorescencyjnie musi być w miarę możliwości chroniony przed światłem. Aby chronić dekstran podczas 2-godzinnej inkubacji, umieść 9-dołkową szklaną płytkę w naczyniu P150 do hodowli komórkowej owiniętym folią aluminiową.

4. Przygotowanie próbki do obrazowania

  1. Po inkubacji z dekstranem przemywać tkankę przez 2 minuty dwa razy pożywką i raz HBSS.
  2. Inkubować tkankę w temperaturze pokojowej przez 30 minut z 4% paraformaldehydem w zrównoważonym roztworze soli Hanksa (HBSS).
    UWAGA: Narażenie na formaldehyd może działać drażniąco na oczy, nos i górne drogi oddechowe. U niektórych osób powtarzające się narażenie skóry na formaldehyd może powodować uczulenie, które może prowadzić do alergicznego zapalenia skóry. Formaldehyd jest znanym czynnikiem rakotwórczym dla ludzi i podejrzewa się, że stanowi zagrożenie dla rozrodczości.
  3. Szybko i delikatnie umyj utrwaloną chusteczkę dwukrotnie HBSS, aby usunąć paraformaldehyd.
    UWAGA: Odwapnienie kości skroniowych nie jest konieczne na tym etapie rozwoju ślimaka.
  4. Usuń więzadło spiralne i błonę tektorialną za pomocą kleszczyków z cienką końcówką, aby wypreparować narząd Cortiego (Rysunek 2G).
  5. Usuń wszystkie małe kawałki chusteczki i umyj chusteczkę HBSS.
  6. Przepuszczalność tkanki w 0,5% Triton X-100 w PBS zawierającym znakowaną fluorescencyjnie falloidynę (sprzężoną z kolorem zielonym lub czerwonym podczas testowania wychwytu odpowiednio dekstranu znakowanego TR lub FITC) w rozcieńczeniu 1:200 przez 30 minut, aby oznaczyć F-aktynę i uwidocznić stereocilię opartą na aktynie.
  7. Płukać tkankę 2-3 razy przez 2 minuty za każdym razem buforem HBSS w celu usunięcia nadmiaru trytonu i falloidyny oraz raz PBS w celu usunięcia soli.
  8. Zamontuj narząd tkanek Cortiego na szkiełku mikroskopowym i przykryj go pożywką montażową.
    UWAGA: Podczas zakładania chusteczki upewnij się, że strona tkanki, w której znajduje się stereocilia komórek rzęsatych, jest skierowana w stronę szkiełka nakrywkowego.
  9. Usunąć wszelkie potencjalne pęcherzyki powstałe podczas dodawania podłoża montażowego i zapobiec powstawaniu nowych pęcherzyków podczas umieszczania szkiełka nakrywkowego.
    UWAGA: Odessać pipetą wszelkie pęcherzyki powstałe podczas dodawania podłoża mocującego. Aby zapobiec uwięzieniu pęcherzyków powietrza pod szkiełkiem nakrywkowym, umieść krawędź szkiełka nakrywkowego blisko próbki i ostrożnie, powoli opuść szkiełko nakrywkowe na tkankę za pomocą kleszczyków lub końcówki pipety.
  10. Przykryj chusteczkę w podłożu montażowym szklanym szkiełkiem nakrywkowym (Rysunek 2H).
    UWAGA: Obiektywy z aperturą numeryczną powyżej 0,4 są przystosowane do stosowania szkiełek nakrywkowych #1,5 (grubość 0,17 mm). Użycie niewłaściwego szkiełka nakrywkowego może mieć poważne konsekwencje dla intensywności i jakości obrazów.
  11. Inkubować zamontowaną tkankę przez noc w temperaturze pokojowej, aby podłoże montażowe wyschło, a następnie przechowywać szkiełka w temperaturze 4 °C do czasu obrazowania.

5. Akwizycja i przetwarzanie obrazu

UWAGA: Obrazy konfokalne zostały wykonane za pomocą mikroskopu konfokalnego LSM 880 wyposażonego w 32-kanałowy detektor Airyscan w trybie super-resolution (SR) 43 i obiektywem 63x.

  1. Nałóż niewielką kroplę olejku immersyjnego na obiektyw.
  2. Umieść szkiełko mikroskopowe zawierające zamontowaną próbkę tkanki w stoliku mikroskopowym tak, aby szkiełko nakrywkowe było skierowane w stronę olejku immersyjnego.
  3. Skoncentruj się na próbce i ustaw parametry obrazowania za pomocą oprogramowania do akwizycji obrazu.
  4. Używaj identycznych ustawień akwizycji obrazu i optymalnych parametrów dla rozdzielczości x, y i z dla każdego niezależnego eksperymentu. Piezosterowany system ustawiania ostrości jest wymagany do szybkiego i precyzyjnego przesuwania obiektywu podczas rejestrowania z-stosu obrazów.
    UWAGA: Aby zobrazować cały obszar wierzchołkowy komórek rzęsatych, zbierz stos obrazów z od stereocilii do wierzchołkowej połowy ciała komórki rzęsatej przy użyciu optymalnych ustawień. Bardzo ważne jest, aby zebrać duży stos Z wzdłuż komórki rzęsatego, aby zapewnić obrazowanie cząstek przypominających pęcherzyki.
  5. Użyj oprogramowania do akwizycji obrazu, aby przetworzyć surowe obrazy konfokalne za pomocą algorytmu rekonstrukcji Airyscan 3D z automatycznymi domyślnymi ustawieniami filtra dekonwolucyjnego.
  6. Otwórz obrazy konfokalne w oprogramowaniu do przetwarzania obrazu, aby dostosować jasność i kontrast, dodać pasek skali i wyeksportować obrazy dla ostatecznych figur.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zaobserwowaliśmy solidne i specyficzne znakowanie komórek rzęsatych po 2-godzinnej inkubacji narządu eksplantatów Cortiego od myszy typu dzikiego po porodzie 6 (P6) z dekstranem 3 kDa fluorescencyjnie znakowanym Texas Red (dextran-TR) (Rysunek 2A-B). Znakowanie dekstranu zaobserwowano zarówno w wewnętrznych, jak i zewnętrznych komórkach rzęsatych (IHC i OHC) w podstawnych, środkowych i wierzchołkowych obszarach narządu Cortiego (Ryc. 2B).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten opisuje, jak przeprowadzać eksperymenty z wychwytem w mysim narządzie eksplantatów Cortiego z dekstranem 3 kDa Texas Red. Celem tej metody jest sprawdzenie, czy cząsteczki większe niż inne wcześniej testowane były również w stanie specyficznie znakować słuchowe komórki rzęsate i przenikać przez kanał MET. Podobne protokoły eksperymentalne były wcześniej stosowane do oceny przepuszczalności komórek rzęsatych dla innych barwników fluorescencyjnych, takich jak FM1-43 (0,56 kDa)12,19,20 i aminoglikozydy znakowan...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Vincentowi Schramowi z centrum mikroskopii i obrazowania NICHD za pomoc w akwizycji obrazu konfokalnego, oraz Tsg-Hui Chang za nieocenioną pomoc w zarządzaniu koloniami i opiece nad myszami. Badania te były wspierane przez Intramural Research Program NINDS, NIH, Bethesda, MD, do K.J.S. A.B. były wspierane przez Intramural Research Program NINDS, NIH oraz przez stypendium podoktorskie Roberta Wentholda z intramural research program NIDCD.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
#1.5 szkiełka nakrywkowe 18mmWarner Instruments64-0714
Alexa Fluor 488 PhalloidinThermoFisherA12379
Alexa Fluor 594 PhalloidinThermoFisherA12381
alpha Plan-Apochromat 63X/1.4 Oil Corr M27Carl Zeiss420780-9970-000
Chlorowodorek amiloryduEMD MILIPOR
Benchwaver 3-wymiarowy RockerBenchmarks naukowyB3D5000
myszy typu dzikiego C57BL/6J000664Komórka
Jacksona nieprzepuszczalna Sól tetrapotasowa BAPTAThermoFisherB1204
Dekstran, Fluoresceina, 10 000 MW, Anionowa, Lizyna Utrwalana ThermoFisherD1820
Dekstran, czerwień teksana, 10 000 MW, lizyna utrwalanaThermoFisherD1863
Dextran, czerwień teksacka, 3000 MW, utrwalana lizynaThermoFisherD3328
Roztwór wodny formaldehydu klasy EMMikroskopia elektronowa15710
HBSS, wapń, magnez, bez czerwieni fenolowejThermoFisher14025
HBSS, bez wapnia, bez magnezu, bez czerwieni fenolowejThermoFisher14170
Image J lub FIJINIHa href="http://fiji.sc/" target="_blank">http://fiji.sc/
Immersol 518F media immersyjne z olejemCarl Zeiss444970-9000-000
Leibovitz's L-15 Medium, suplement GlutaMAXThermoFisher31415029
hydrat soli trisiarczanu neomycynySigmaN6386
PBS (10X), pH 7,4ThermoFisher70011069
Phalloidin-CF405MBiotium00034
ProLong Diamentowe media montażowe zapobiegające blaknięciuThermoFisherP36970
superfrost plus szkiełko mikroskopoweFisherbrand22-037-246
Triton X-100SigmaT8787
Oprogramowanie Zen Black 2.3 SP1Carl Zeisshttps://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html
obiektyw 129876Szczeplaboratoryjna<

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Furness, D. N., Hackney, C. M. The Structure and Composition of the Stereociliary Bundle of Vertebrate Hair Cells. , Springer. New York. (2006).
  2. Barr-Gillespie, P. G. Assembly of hair bundles, an amazing problem for cell biology. Molecular Biology of the Cell. 26 (15), 2727-2732 (2015).
  3. Shotwell, S. L., Jacobs, R., Hudspeth, A. J. Directional sensitivity of individual vertebrate hair cells to controlled deflection of their hair bundles. Annals of the New York Academy of Sciences. 374, 1-10 (1981).
  4. Fettiplace, R., Kim, K. X. The physiology of mechanoelectrical transduction channels in hearing. Physiological Reviews. 94 (3), 951-986 (2014).
  5. Fettiplace, R. Hair Cell Transduction, Tuning, and Synaptic Transmission in the Mammalian Cochlea. Comprehensive Physiology. 7 (4), 1197-1227 (2017).
  6. Corey, D. P., Hudspeth, A. J. Ionic basis of the receptor potential in a vertebrate hair cell. Nature. 281 (5733), 675-677 (1979).
  7. Beurg, M., Evans, M. G., Hackney, C. M., Fettiplace, R. A large-conductance calcium-selective mechanotransducer channel in mammalian cochlear hair cells. The Journal of Neuroscience. 26 (43), 10992-11000 (2006).
  8. Geleoc, G. S., Lennan, G. W., Richardson, G. P., Kros, C. J. A quantitative comparison of mechanoelectrical transduction in vestibular and auditory hair cells of neonatal mice. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 264 (1381), 611-621 (1997).
  9. Kros, C. J., Rusch, A., Richardson, G. P. Mechano-electrical transducer currents in hair cells of the cultured neonatal mouse cochlea. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 249 (1325), 185-193 (1992).
  10. Ohmori, H. Mechano-electrical transduction currents in isolated vestibular hair cells of the chick. The Journal of Physiology. 359, 189-217 (1985).
  11. Gale, J. E., Marcotti, W., Kennedy, H. J., Kros, C. J., Richardson, G. P. FM1-43 dye behaves as a permeant blocker of the hair-cell mechanotransducer channel. The Journal of Neuroscience. 21 (18), 7013-7025 (2001).
  12. Lelli, A., Asai, Y., Forge, A., Holt, J. R., Geleoc, G. S. Tonotopic gradient in the developmental acquisition of sensory transduction in outer hair cells of the mouse cochlea. Journal of Neurophysiology. 101 (6), 2961-2973 (2009).
  13. Alharazneh, A., et al. Functional hair cell mechanotransducer channels are required for aminoglycoside ototoxicity. PLoS One. 6 (7), 22347(2011).
  14. Marcotti, W., van Netten, S. M., Kros, C. J. The aminoglycoside antibiotic dihydrostreptomycin rapidly enters mouse outer hair cells through the mechano-electrical transducer channels. The Journal of Physiology. 567, Pt 2 505-521 (2005).
  15. Corns, L. F., Jeng, J. Y., Richardson, G. P., Kros, C. J., Marcotti, W. TMC2 Modifies Permeation Properties of the Mechanoelectrical Transducer Channel in Early Postnatal Mouse Cochlear Outer Hair Cells. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 326(2017).
  16. Kawashima, Y., Kurima, K., Pan, B., Griffith, A. J., Holt, J. R. Transmembrane channel-like (TMC) genes are required for auditory and vestibular mechanosensation. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 467 (1), 85-94 (2015).
  17. Kim, K. X., Fettiplace, R. Developmental changes in the cochlear hair cell mechanotransducer channel and their regulation by transmembrane channel-like proteins. The Journal of General Physiology. 141 (1), 141-148 (2013).
  18. Kurima, K., et al. TMC1 and TMC2 Localize at the Site of Mechanotransduction in Mammalian Inner Ear Hair Cell Stereocilia. Cell Reports. 12 (10), 1606-1617 (2015).
  19. Pan, B., et al. TMC1 and TMC2 are components of the mechanotransduction channel in hair cells of the mammalian inner ear. Neuron. 79 (3), 504-515 (2013).
  20. Kawashima, Y., et al. Mechanotransduction in mouse inner ear hair cells requires transmembrane channel-like genes. Journal of Clinical Investigation. 121 (12), 4796-4809 (2011).
  21. Beurg, M., Goldring, A. C., Fettiplace, R. The effects of Tmc1 Beethoven mutation on mechanotransducer channel function in cochlear hair cells. The Journal of General Physiology. 146 (3), 233-243 (2015).
  22. Corns, L. F., Johnson, S. L., Kros, C. J., Marcotti, W. Tmc1 Point Mutation Affects Ca2+ Sensitivity and Block by Dihydrostreptomycin of the Mechanoelectrical Transducer Current of Mouse Outer Hair Cells. The Journal of Neuroscience. 36 (2), 336-349 (2016).
  23. Beurg, M., Fettiplace, R., Nam, J. H., Ricci, A. J. Localization of inner hair cell mechanotransducer channels using high-speed calcium imaging. Nature Neuroscience. 12 (5), 553-558 (2009).
  24. Maeda, R., et al. Tip-link protein protocadherin 15 interacts with transmembrane channel-like proteins TMC1 and TMC2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (35), 12907-12912 (2014).
  25. Assad, J. A., Shepherd, G. M., Corey, D. P. Tip-link integrity and mechanical transduction in vertebrate hair cells. Neuron. 7 (6), 985-994 (1991).
  26. Medrano-Soto, A., et al. Bioinformatic characterization of the Anoctamin Superfamily of Ca2+-activated ion channels and lipid scramblases. PLoS One. 13 (3), 0192851(2018).
  27. Ballesteros, A., Fenollar-Ferrer, C., Swartz, K. J. Structural relationship between the putative hair cell mechanotransduction channel TMC1 and TMEM16 proteins. Elife. 7, (2018).
  28. Pan, B., et al. TMC1 Forms the Pore of Mechanosensory Transduction Channels in Vertebrate Inner Ear Hair Cells. Neuron. 99 (4), 736-753 (2018).
  29. Kitajiri, S., Makishima, T., Friedman, T. B., Griffith, A. J. A novel mutation at the DFNA36 hearing loss locus reveals a critical function and potential genotype-phenotype correlation for amino acid-572 of TMC1. Clinical Genetics. 71 (2), 148-152 (2007).
  30. Makishima, T., Kurima, K., Brewer, C. C., Griffith, A. J. Early onset and rapid progression of dominant nonsyndromic DFNA36 hearing loss. Otology & Neurotology. 25 (5), 714-719 (2004).
  31. Noguchi, Y., et al. Multiple quantitative trait loci modify cochlear hair cell degeneration in the Beethoven (Tmc1Bth) mouse model of progressive hearing loss DFNA36. Genetics. 173 (4), 2111-2119 (2006).
  32. Vreugde, S., et al. Beethoven, a mouse model for dominant, progressive hearing loss DFNA36. Nature Genetics. 30 (3), 257-258 (2002).
  33. Hulstrom, D., Svensjo, E. Intravital and electron microscopic study of bradykinin-induced vascular permeability changes using FITC-dextran as a tracer. The Journal of Pathology. 129 (3), 125-133 (1979).
  34. Mayhan, W. G., Heistad, D. D. Permeability of blood-brain barrier to various sized molecules. American Journal of Physiology. 248 (5), Pt 2 712-718 (1985).
  35. Makarow, M. Endocytosis in Saccharomyces cerevisiae: internalization of alpha-amylase and fluorescent dextran into cells. The EMBO Journal. 4 (7), 1861-1866 (1985).
  36. Clayton, E. L., Cousin, M. A. Quantitative monitoring of activity-dependent bulk endocytosis of synaptic vesicle membrane by fluorescent dextran imaging. Journal of Neuroscience Methods. 185 (1), 76-81 (2009).
  37. Allman, B. L., Keniston, L. P., Meredith, M. A. Adult deafness induces somatosensory conversion of ferret auditory cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (14), 5925-5930 (2009).
  38. Warr, W. B., Boche, J. B., Neely, S. T. Efferent innervation of the inner hair cell region: origins and terminations of two lateral olivocochlear systems. Hearing Research. 108 (1-2), 89-111 (1997).
  39. Hu, B. H., Zheng, G. L. Membrane disruption: an early event of hair cell apoptosis induced by exposure to intense noise. Brain Research. 1239, 107-118 (2008).
  40. Zheng, G., Hu, B. H. Cell-cell junctions: a target of acoustic overstimulation in the sensory epithelium of the cochlea. BMC Neuroscience. 13, 71(2012).
  41. Beurg, M., Nam, J. H., Chen, Q., Fettiplace, R. Calcium balance and mechanotransduction in rat cochlear hair cells. Journal of Neurophysiology. 104 (1), 18-34 (2010).
  42. Johnson, S. L., Beurg, M., Marcotti, W., Fettiplace, R. Prestin-driven cochlear amplification is not limited by the outer hair cell membrane time constant. Neuron. 70 (6), 1143-1154 (2011).
  43. Korobchevskaya, K., Lagerholm, B. C., Colin-York, H., Fritzsche, M. Exploring the Potential of Airyscan Microscopy for Live Cell Imaging. Photonics. 4 (3), (2017).
  44. Gil-Loyzaga, P., Brownell, W. E. Wheat germ agglutinin and Helix pomatia agglutinin lectin binding on cochlear hair cells. Hearing Research. 34 (2), 149-155 (1988).
  45. Santi, P. A., Anderson, C. B. Alcian blue staining of cochlear hair cell stereocilia and other cochlear tissues. Hearing Research. 23 (2), 153-160 (1986).
  46. Slepecky, N., Chamberlain, S. C. The cell coat of inner ear sensory and supporting cells as demonstrated by ruthenium red. Hearing Research. 17 (3), 281-288 (1985).
  47. Rusch, A., Kros, C. J., Richardson, G. P. Block by amiloride and its derivatives of mechano-electrical transduction in outer hair cells of mouse cochlear cultures. The Journal of Physiology. 474 (1), 75-86 (1994).
  48. Zhao, Y., Yamoah, E. N., Gillespie, P. G. Regeneration of broken tip links and restoration of mechanical transduction in hair cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (26), 15469-15474 (1996).
  49. Indzhykulian, A. A., et al. Molecular remodeling of tip links underlies mechanosensory regeneration in auditory hair cells. PLoS Biol. 11 (6), 1001583(2013).
  50. Koivusalo, M., et al. Amiloride inhibits macropinocytosis by lowering submembranous pH and preventing Rac1 and Cdc42 signaling. Journal of Cell Biology. 188 (4), 547-563 (2010).
  51. West, M. A., Bretscher, M. S., Watts, C. Distinct endocytotic pathways in epidermal growth factor-stimulated human carcinoma A431 cells. Journal of Cell Biology. 109 (6), Pt 1 2731-2739 (1989).
  52. Park, S., et al. tmie Is required for gentamicin uptake by the hair cells of mice. Comp Med. 63 (2), 136-142 (2013).
  53. Meyers, J. R., et al. Lighting up the senses: FM1-43 loading of sensory cells through nonselective ion channels. The Journal of Neuroscience. 23 (10), 4054-4065 (2003).
  54. Waguespack, J., Salles, F. T., Kachar, B., Ricci, A. J. Stepwise morphological and functional maturation of mechanotransduction in rat outer hair cells. The Journal of Neuroscience. 27 (50), 13890-13902 (2007).
  55. Beurg, M., et al. Variable number of TMC1-dependent mechanotransducer channels underlie tonotopic conductance gradients in the cochlea. Nature Communications. 9 (1), 2185(2018).
  56. Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea. Journal of Visualized Experiments. (107), e53561(2016).
  57. Landegger, L. D., Dilwali, S., Stankovic, K. M. Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research. Journal of Visualized Experiments. (124), e55704(2017).
  58. May-Simera, H. Evaluation of Planar-Cell-Polarity Phenotypes in Ciliopathy Mouse Mutant Cochlea. Journal of Visualized Experiments. (108), e53559(2016).
  59. Ogier, J. M., Burt, R. A., Drury, H. R., Lim, R., Nayagam, B. A. Organotypic Culture of Neonatal Murine Inner Ear Explants. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 170(2019).
  60. Granath, K. A. Solution properties of branched dextrans. Journal of Colloid Science. 13 (4), 20(1958).
  61. Molecular Probes, I.D.T. Product information on Dextran Conjugates. , (2006).
  62. Korobchevskaya, K., Lagerholm, B. C., Colin-York, H., Fritzsche, M. Exploring the Potential of Airyscan Microscopy for Live Cell Imaging. Photonics. 4 (3), 41(2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Wch anianie przez kom rki rz skowekana mechanotransdukcyjnydekstran Texas Rednarz d Cortiegomikroskopia konfokalnafluorescencyjny dekstranznakowanie stereocili wszlak endocytozy

Powiązane artykuły