Artykuł metodologiczny

Synteza enzymatyczna i immobilizacja spolimeryzowanego białka za pośrednictwem OaAEP1 do spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek

DOI:

10.3791/60774

⸱

5 lutego 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Coordination Chemistry, School of Chemistry and Chemical Engineering, Nanjing University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół koniugacji monomeru białkowego za pomocą enzymów tworzących polimer białkowy o kontrolowanej sekwencji i unieruchamiania go na powierzchni w celu badań spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Techniki chemiczne i bio-koniugacji zostały szybko rozwinięte w ostatnich latach i pozwalają na budowę polimerów białkowych. Jednak kontrolowany proces polimeryzacji białek jest zawsze wyzwaniem. W tym miejscu opracowaliśmy enzymatyczną metodologię konstruowania spolimeryzowanego białka krok po kroku w racjonalnie kontrolowanej sekwencji. W tej metodzie C-końcem monomeru białkowego jest NGL do koniugacji białek przy użyciu OaAEP1 (Oldenlandia affinis asparaginyl endopeptidazy) 1), podczas gdy N-koniec był rozszczepialnym miejscem rozszczepienia TEV (wirusa wytrawienia tytoniu) plus L (ENLYFQ / GL) do tymczasowej ochrony N-końca. W związku z tym OaAEP1 był w stanie dodać tylko jeden monomer białka na raz, a następnie proteaza TEV rozszczepiła N-koniec między Q i G, aby odsłonić NH 2-Gly-Leu. Następnie urządzenie jest gotowe do następnego podwiązania OaAEP1. Zmodyfikowana poliproteina jest badana poprzez rozwijanie pojedynczej domeny białkowej za pomocą spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek opartej na mikroskopii sił atomowych (AFM-SMFS). Dlatego badanie to dostarcza użytecznej strategii inżynierii poliproteinowej i immobilizacji.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W porównaniu z syntetycznymi polimerami, naturalne białka wielodomenowe mają jednolitą strukturę z dobrze kontrolowaną liczbą i typem subdomen1. Ta cecha zwykle prowadzi do poprawy funkcji biologicznych i stabilności2,3. Wiele podejść, takich jak sprzęganie wiązań dwusiarczkowych na bazie cysteiny i technologia rekombinacji DNA, zostało opracowanych w celu zbudowania takiego spolimeryzowanego białka z wieloma domenami4,5,6,7. Jednak pierwsza metoda zawsze prowadzi do losowej i niekontrolowanej sekwencji, a druga prowadzi do innych problemów, w tym trudności z nadekspresją toksycznych i dużych białek oraz oczyszczania złożonych białek za pomocą kofaktora i innych delikatnych enzymów.

Aby sprostać temu wyzwaniu, opracowujemy metodę enzymatyczną, która łączy monomer białka w polimer/polibiałko w sposób krokowy, używając ligazy białkowej OaAEP1 w połączeniu z proteazą TEV8,9. OaAEP1 jest ściśle i skuteczną endopeptydazą. Dwa białka mogą być kowalencyjnie połączone jako sekwencja Asn-Gly-Leu (NGL) przez dwa końce za pomocą OaAEP1 w czasie krótszym niż 30 minut, jeśli N-koniec to reszty Gly-Leu (GL), a drugi z których C-koniec to reszty NGL10. Jednak zastosowanie OaAEP1 tylko do łączenia monomeru białkowego prowadzi do powstania polimeru białkowego o niekontrolowanej sekwencji, takiej jak metoda sprzęgania oparta na cysteinie. Dlatego projektujemy N-koniec jednostki białkowej z usuwalnym miejscem proteazy TEV oraz resztą leucyny jako ENLYFQ / G-L-POI. Przed rozszczepieniem TEV N-koniec nie uczestniczyłby w podwiązaniu OaAEP1. A następnie reszty GL na N-końcu, które są zgodne z dalszym podwiązaniem OaAEP1, są odsłaniane po rozszczepieniu TEV. W ten sposób uzyskaliśmy sekwencyjną metodę biosyntezy enzymatycznej poliproteiny o stosunkowo dobrze kontrolowanej sekwencji.

Tutaj nasza metoda krokowej syntezy enzymatycznej może być stosowana w przygotowywaniu próbek poliprotein, w tym kontrolowanych sekwencyjnie i niekontrolowanych, a także immobilizacji białek do badań pojedynczych molekuł, szczególnie dla złożonych układów, takich jak metaloproteiny.

Ponadto, eksperymenty SMFS oparte na AFM pozwalają nam potwierdzić budowę i stabilność polimeru białkowego na poziomie pojedynczej cząsteczki. Spektroskopia sił pojedynczych cząsteczek, w tym AFM, pęseta optyczna i pęseta magnetyczna, jest ogólnym narzędziem w nanotechnologii do mechanicznego manipulowania biomolekułami i mierzenia ich stabilności11,12,13,14,15,16,17,18,19,20. Jednocząsteczkowy AFM jest szeroko stosowany w badaniach nad (nie)fałdowaniem białek21,22,23,24,25, pomiar siły interakcji receptor-ligand26,27,28,29,30,31,32,33,34,35, nieorganiczne wiązanie chemiczne20,36,37,38,39,40,41,42,43 i wiązanie metal-ligand w metaloproteinie44,45,46,47,48,49,50. W tym przypadku jednocząsteczkowy AFM służy do weryfikacji zsyntetyzowanej sekwencji poliproteinowej w oparciu o odpowiedni sygnał rozwijania białka.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Produkcja białka

  1. Klon genu
    1. Zakup genów kodujących białko będące przedmiotem zainteresowania (POI): ubikwityna, rubredoksyna (RD)51, moduł wiążący celulozę (CBM), domena dokeryny X (XDoc) i kohezja z Ruminococcus flavefacience, proteaza wirusa wytrawiania tytoniu (TEV), polipeptydy podobne do elastyny (ELP).
    2. Przeprowadź reakcję łańcuchową polimerazy i użyj układu enzymatycznego trawienia z trzema ograniczeniami BamH I-Bgl II-KpnI do rekombinacji genu z różnych fragmentów białka.
    3. Potwierdź wszystkie geny za pomocą bezpośredniego sekwencjonowania DNA.
  2. Ekspresja i produkcja białek
    1. Przekształć E. coli BL21(DE3) za pomocą plazmidu pQE80L-POI lub pET28a-POI w celu ekspresji.
    2. Wybierz jedną pojedynczą kolonię do 15 ml pożywki LB z odpowiednimi antybiotykami (np. 100 μg/ml soli sodowej ampicyliny lub 50 μg/ml kanamycyny). Potrząsać kulturami z prędkością 200 obr./min w temperaturze 37 °C przez 16-20 godzin.
    3. Rozcieńczyć nocne kultury w 800 ml pożywki LB (rozcieńczenie 1:50). W przypadku rubredoksyny odwirować kulturę przy 1 800 x g, a następnie ponownie zawiesić w 15 ml pożywki M9 (uzupełnionej 0,4% glukozy, 0,1 mM CaCl2, 2 mMMgSO4), a następnie rozcieńczyć ją do 800 ml pożywki M9.
    4. Inkubować kulturę w temperaturze 37 °C, wytrząsając z prędkością 200 obr./min, aż kultura osiągnie gęstość optyczną 0,6 przy długości fali 600 nm (OD600). Zachowaj 100 μl próbki kultury jako kontrolę przed indukcją do badania ekspresji białka.
    5. Indukować ekspresję białka przez dodanie IPTG do końcowego stężenia 1 mM i wstrząsać kulturą w temperaturze 37 °C przez 4 godziny przy 200 obr./min. Zarezerwować 100 μl próbki kultury jako kontrolę po indukcji do badania ekspresji białek.
    6. Odwirować kulturę w temperaturze 13 000 x g przez 25 minut w temperaturze 4 °C i przechowywać w temperaturze -80 °C przed oczyszczeniem.
      UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać.
  3. Oczyszczanie białka będącego przedmiotem zainteresowania
    1. Ponownie zawiesić komórki w 25 ml buforu do lizy (50 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7,4 zawierające DNazę, RNazę, PMSF) i użyć sonikatora (amplituda 15%) do lizy przez 30 minut na lodzie.
    2. Klarować lizat komórkowy w temperaturze 19 000 x g przez 40 minut w temperaturze 4 °C.
    3. Spakować 1 ml (objętość złoża) kolumny powinowactwa Co-NTA lub Ni-NTA i przemyć kolumnę 10 objętościami kolumny (CV) ultraczystej wody, a następnie 10 CV buforu do przemywania (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 2 mM imidazol, pH 7,4) za pomocą przepływu grawitacyjnego.
    4. Przepuścić supernatant białkowy przez kolumnę za pomocą przepływu grawitacyjnego trzy razy.
    5. Wlać bufor do przemywania na kolumnę z 50 CV, aby usunąć białka zanieczyszczające.
    6. Eluować związane białko za pomocą 3 CV lodowatego buforu elucyjnego (20 mM Tris, 400 mM NaCl, 250 mM imidazol, pH 7,4). Jeśli chodzi o białka rubredoksyny, konieczne jest dalsze oczyszczanie anionitamiczne za pomocą kolumny anionowymiennej o pH 8,5 w temperaturze 4 °C.
    7. Przeanalizuj próbkę za pomocą SDS-PAGE.

2. Funkcjonalizacja szkiełek nakrywkowych i powierzchni wspornikowej

  1. Funkcjonalne przygotowanie powierzchni szkiełka nakrywkowego
    1. Rozpuść 20 g chromianu potasu w 40 ml ultraczystej wody. Powoli dodać 360 ml stężonego kwasu siarkowego do roztworu chromianu potasu za pomocą szklanej pałeczki, delikatnie wymieszać i przygotować kwas chromowy.
      UWAGA: Zastosowana tutaj substancja chemiczna i końcowy kwas chromowy są silnie i kwaśne. Pracuj z odpowiednim sprzętem ochronnym. Roztwór uwalnia ciepło po dodaniu stężonego kwasu siarkowego, co oznacza powolne dodawanie i odpowiednią przerwę na schłodzenie.
    2. Oczyścić i aktywować szklane szkiełko nakrywkowe w temperaturze 80 °C przez 30 minut poprzez obróbkę kwasem chromowym. Całkowicie zanurzyć szkiełka nakrywkowe w 1% (v/v) roztworze toluenu APTES na 1 godzinę w temperaturze pokojowej, chroniąc je przed światłem.
    3. Umyć szkiełko nakrywkowe toluenem i bezwzględnym alkoholem etylowym i osuszyć szkiełko nakrywkowe strumieniem azotu.
    4. Inkubować szkiełko nakrywkowe w temperaturze 80 °C przez 15 minut, a następnie schłodzić do temperatury pokojowej.
    5. Dodać 200 μl sulfo-SMCC (1 mg/ml) w roztworze dimetylosulfotlenku (DMSO) między dwoma unieruchomionymi szkiełkami nakrywkowymi i inkubować przez 1 godzinę chroniąc przed światłem.
    6. Najpierw umyj szkiełko nakrywkowe DMSO, a następnie bezwzględnym alkoholem etylowym w celu usunięcia pozostałości sulfo-SMCC.
    7. Wysuszyć szkiełko nakrywkowe pod strumieniem azotu.
    8. Odpipetować 60 μl 200 μM GL-ELP50nm-C roztworu białkowego na funkcjonalizowane szkiełko nakrywkowe i inkubować przez około 3 godziny.
    9. Umyj szkiełko nakrywkowe ultraczystą wodą, aby usunąć nieprzereagowany GL-ELP50nm-C.
      UWAGA: Funkcjonalizowane szkiełka nakrywkowe są zdolne do przechowywania przez około dwa tygodnie w temperaturze 4 °C.
  2. Funkcjonalizowane przygotowanie powierzchni wspornikowej
    1. Wsporniki czyścić w temperaturze 80 °C przez 10 minut poprzez obróbkę kwasem chromowym.
    2. Funkcjonalizować wspornik przez aminosilanizację 1% (v/v) roztworem toluenu APTES, a następnie piec wspornik w temperaturze 80 °C przez 15 minut przed sprzężeniem do sulfo-SMCC.
    3. Połącz C-ELP50nm-NGL z powierzchnią za pomocą grupy maleimidowej sulfo-SMCC przez 1,5 godziny.
    4. Nieprzereagowany C-ELP50nm-NGL z szkiełka nakrywkowego zmyć ultraczystą wodą.
    5. Zanurzyć funkcjonalizowany wspornik w 200 μl 50 μM ROZTWORU BIAŁKA GL-CBM-XDoc zawierającego 200 nM OaAEP1 w temperaturze 25 °C na 20-30 minut. Następnie użyj buforu AFM (100 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 7,4), aby zmyć nieprzereagowane białko.
      UWAGA: Skład chemiczny powierzchni wsporników i szkiełka nakrywkowego jest podobny.

3. Stopniowe przygotowanie poliprotein z kontrolowanymi sekwencjami

  1. Połączyć jednostkę ligacyjną Coh-tev-L-POI-NGL z GL-ELP50nm unieruchomionym na powierzchni szkiełka nakrywkowego przez OaAEP1 na 30 minut.
  2. Użyj 15-20 ml buforu AFM (100 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 7,4), aby zmyć wszelkie nieprzereagowane białka.
  3. Dodać 100 μl proteazy TEV (0,5 mM EDTA, 75 mM NaCl, 25 mM Tris-HCl 10% [v/v] glicerolu, pH 8,0) w celu rozszczepienia jednostki białkowej w miejscu rozpoznania TEV przez 1 godzinę w temperaturze 25 °C.
  4. Użyj 15-20 ml buforu AFM, aby zmyć resztki białek.
  5. Połącz jednostkę ligacyjną Coh-tev-L-POI-NGL ze szkłem GL-Ub-NGL-Glass za pomocą OaAEP1 na 30 minut.
  6. Powtórz kroki od 3,3 do 3,5 N-1 razy, aby zbudować konstrukt białkowy GL-(Ub)n-NGL na powierzchni szkła. Pomiń ostatnią reakcję rozszczepienia TEV w celu zarezerwowania kohezyny na białku-polimerze jako Coh-tev-L-(Ub)n-NGL-Glass.

4. Pomiar i analiza danych w eksperymencie AFM

  1. Pomiary AFM
    1. Dodać 1 ml buforu AFM do komory z 10 mM CaCl2 i 5 mM kwasem askorbinowym.
    2. Wybierz końcówkę D funkcjonalizowanej sondy AFM do eksperymentu. Użyj twierdzenia o ekwipartycji, aby skalibrować wspornik w buforze AFM z dokładną wartością stałej sprężystości (k) przed każdym eksperymentem.
    3. Przymocuj końcówkę wspornika do powierzchni próbki, aby utworzyć parę Cohesin/Dockerin.
    4. Wycofać wspornik ze stałą prędkością 400 nm·s−1 od powierzchni. W międzyczasie zapisz krzywą siła-wydłużenie przy częstotliwości próbkowania 4000 Hz.
  2. analiza danych
    1. Użyj przetwarzania danych JPK, wybierz ślady wymuszenia-wydłużenia.
    2. Użyj oprogramowania do analizy śladów. Dopasuj krzywe do modelu elastyczności polimeru o łańcuchu ślimakowym (WLC) i uzyskaj przyrost siły rozwijania i długości konturu dla poszczególnych pików rozwijania białka.
    3. Dopasuj histogramy sił rozwijania do modelu Gaussa, aby uzyskać najbardziej prawdopodobne wartości siły rozwijania (u>) i przyrostu długości konturu (<ΔLc>).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Reszty NGL wprowadzone między sąsiednie białka przez ligację OaAEP1 nie wpłyną na stabilność monomeru białkowego w polimerze, ponieważ siła rozwijania (u>), a przyrost długości konturu (<ΔLc>) jest porównywalny z poprzednim badaniem (Rysunek 1). Wynik oczyszczania białka rubredoksyny jest pokazany na Rysunek 2. Aby udowodnić, że białko po rozszczepieniu TEV jest kompatybilne z następującą ligacją OaAEP1 w celu skonstruowania polimeru białkowego z sekwencją ko...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisaliśmy protokół enzymatycznej biosyntezy i immobilizacji poliproteiny oraz zweryfikowaliśmy projekt poliproteiny za pomocą SMFS opartego na AFM. Metodologia ta zapewnia nowatorskie podejście do budowy białka-polimeru w zaprojektowanej sekwencji, które uzupełnia poprzednie metody inżynierii poliproteinowej i immobilizacji 4,6,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61.<...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (Grant nr 21771103, 21977047), Fundację Nauk Przyrodniczych Prowincji Jiangsu (Grant No. BK20160639) i program Shuangchuang w prowincji Jiangsu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
chlorek żelaza (III) sześciowodnyEnergia chemiczna99%
ChlorekAlfa Aesar100,00%
hydrat chlorku wapniaAlfa Aesar99,9965% agregat krystaliczny
Kwas L-askorbinowy SigmaLife ScienceBio Xtra, ≥ 99,0%, krystaliczny
(3-aminopropylo)trietoksysilanSigma-Aldrich≥ 99%
sulfosuccinimidylo 4-(N-maleimidometylo)cykloheksano-1-karboksylanThermo Scientific90%
GlicerolMacklin99%
5,5'-ditiobis(kwas 2-nitrobenzoesowy)Alfa Aesar
Genscript
Sprzęt
Nanowizard 4 AFMJPK Niemcy
MLCT wspornikBruker Corp
Mono Q 5/50 GLGE Healthcare
AKTA System FPLCGE Healthcare
Szklane szkiełko nakrywkoweMarka
Żagiel Nanodrop 2000Thermo Scientific
Avanti JXN-30 WirówkaBeckman Coulter
Gel Image System Tanon

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rief, M., Gautel, M., Oesterhelt, F., Fernandez, J. M., Gaub, H. E. Reversible unfolding of individual titin immunoglobulin domains by AFM. Science. 276 (5315), 1109-1112 (1997).
  2. Yang, Y. J., Holmberg, A. L., Olsen, B. D. Artificially Engineered Protein Polymers. Annual Review of Chemical and Biomolecular Engineering. 8 (1), 549-575 (2017).
  3. Yang, J., et al. Polyprotein strategy for stoichiometric assembly of nitrogen fixation components for synthetic biology. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (36), 8509-8517 (2018).
  4. Dietz, H., et al. Cysteine engineering of polyproteins for single-molecule force spectroscopy. Nature Protocols. 1 (1), 80-84 (2006).
  5. Carrion-Vazquez, M., et al. Mechanical and chemical unfolding of a single protein: A comparison. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (7), 3694-3699 (1999).
  6. Hoffmann, T., et al. Rapid and Robust Polyprotein Production Facilitates Single-Molecule Mechanical Characterization of beta-Barrel Assembly Machinery Polypeptide Transport Associated Domains. ACS Nano. 9 (9), 8811-8821 (2015).
  7. Hoffmann, T., Dougan, L. Single molecule force spectroscopy using polyproteins. Chemical Society Reviews. 41 (14), 4781-4796 (2012).
  8. Deng, Y., et al. Enzymatic biosynthesis and immobilization of polyprotein verified at the single-molecule level. Nature Communications. 10 (1), 2775(2019).
  9. Yuan, G., et al. Single-Molecule Force Spectroscopy Reveals that Iron-Ligand Bonds Modulate Proteins in Different Modes. The Journal of Physical Chemistry Letters. 10 (18), 5428-5433 (2019).
  10. Yang, R., et al. Engineering a Catalytically Efficient Recombinant Protein Ligase. Journal of the American Chemical Society. 139 (15), 5351-5358 (2017).
  11. Woodside, M. T., Block, S. M. Reconstructing Folding Energy Landscapes by Single-Molecule Force Spectroscopy. Annual Review of Biophysics. 43, 19-39 (2014).
  12. Sen Mojumdar, S., et al. Partially native intermediates mediate misfolding of SOD1 in single-molecule folding trajectories. Nature Communications. 8 (1), 1881(2017).
  13. Singh, D., Ha, T. Understanding the Molecular Mechanisms of the CRISPR Toolbox Using Single Molecule Approaches. ACS Chemical Biology. 13 (3), 516-526 (2018).
  14. You, H., Le, S., Chen, H., Qin, L., Yan, J. Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers. Journal of Visualized Experiments. (127), e56328(2017).
  15. Suren, T., et al. Single-molecule force spectroscopy reveals folding steps associated with hormone binding and activation of the glucocorticoid receptor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (46), 11688-11693 (2018).
  16. Tapia-Rojo, R., Eckels, E. C., Fernández, J. M. Ephemeral states in protein folding under force captured with a magnetic tweezers design. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (16), 7873-7878 (2019).
  17. Chen, H., et al. Dynamics of Equilibrium Folding and Unfolding Transitions of Titin Immunoglobulin Domain under Constant Forces. Journal of the American Chemical Society. 137 (10), 3540-3546 (2015).
  18. Fu, L., Wang, H., Li, H. Harvesting Mechanical Work From Folding-Based Protein Engines: From Single-Molecule Mechanochemical Cycles to Macroscopic Devices. Chinese Chemical Society. 1 (1), 138-147 (2019).
  19. Scholl, Z. N., Li, Q., Josephs, E., Apostolidou, D., Marszalek, P. E. Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope. Journal of Visualized Experiments. (144), e55989(2019).
  20. Zhang, S., et al. Towards Unveiling the Exact Molecular Structure of Amorphous Red Phosphorus by Single-Molecule Studies. Angewandte Chemie International Edition. 58 (6), 1659-1663 (2019).
  21. Yu, H., Siewny, M. G., Edwards, D. T., Sanders, A. W., Perkins, T. T. Hidden dynamics in the unfolding of individual bacteriorhodopsin proteins. Science. 355 (6328), 945-950 (2017).
  22. Thoma, J., Sapra, K. T., Müller, D. J. Single-Molecule Force Spectroscopy of Transmembrane β-Barrel Proteins. Annual Review of Analytical Chemistry. 11 (1), 375-395 (2018).
  23. Chen, Y., Radford, S. E., Brockwell, D. J. Force-induced remodelling of proteins and their complexes. Current Opinion in Structural Biology. 30, 89-99 (2015).
  24. Takahashi, H., Rico, F., Chipot, C., Scheuring, S. alpha-Helix Unwinding as Force Buffer in Spectrins. ACS Nano. 12 (3), 2719-2727 (2018).
  25. Borgia, A., Williams, P. M., Clarke, J. Single-molecule studies of protein folding. Annu. Rev. Biochem. 77, 101-125 (2008).
  26. Florin, E., Moy, V., Gaub, H. Adhesion forces between individual ligand-receptor pairs. Science. 264 (5157), 415-417 (1994).
  27. Zakeri, B., et al. Peptide tag forming a rapid covalent bond to a protein, through engineering a bacterial adhesin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (12), 690-697 (2012).
  28. Ott, W., Jobst, M. A., Schoeler, C., Gaub, H. E., Nash, M. A. Single-molecule force spectroscopy on polyproteins and receptor-ligand complexes: The current toolbox. Journal of Structural Biology. 197 (1), 3-12 (2017).
  29. Stahl, S. W., et al. Single-molecule dissection of the high-affinity cohesin-dockerin complex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (50), 20431-20436 (2012).
  30. Oh, Y. J., et al. Ultra-Sensitive and Label-Free Probing of Binding Affinity Using Recognition Imaging. Nano Letters. 19 (1), 612-617 (2019).
  31. Vera Andrés, M., Carrion-Vazquez, M. Direct Identification of Protein-Protein Interactions by Single-Molecule Force Spectroscopy. Angewandte Chemie International Edition. 55 (45), 13970-13973 (2016).
  32. Yu, H., Heenan, P. R., Edwards, D. T., Uyetake, L., Perkins, T. T. Quantifying the Initial Unfolding of Bacteriorhodopsin Reveals Retinal Stabilization. Angewandte Chemie International Edition. 58 (6), 1710-1713 (2019).
  33. Jobst, M. A., Schoeler, C., Malinowska, K., Nash, M. A. Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy. Journal of Visualized Experiments. (82), e50950(2013).
  34. Stetter, F. W. S., Kienle, S., Krysiak, S., Hugel, T. Investigating Single Molecule Adhesion by Atomic Force Spectroscopy. Journal of Visualized Experiments. (96), e52456(2015).
  35. Nadler, H., et al. Deciphering the Mechanical Properties of Type III Secretion System EspA Protein by Single Molecule Force Spectroscopy. Langmuir. , (2018).
  36. Giganti, D., Yan, K., Badilla, C. L., Fernandez, J. M., Alegre-Cebollada, J. Disulfide isomerization reactions in titin immunoglobulin domains enable a mode of protein elasticity. Nature Communications. 9 (1), 185(2018).
  37. Huang, W., et al. Maleimide-thiol adducts stabilized through stretching. Nature Chemistry. 11 (4), 310-319 (2019).
  38. Li, Y. R., et al. Single-Molecule Mechanics of Catechol-Iron Coordination Bonds. ACS Biomaterials Science, Engineering. 3 (6), 979-989 (2017).
  39. Popa, I., et al. Nanomechanics of HaloTag Tethers. Journal of the American Chemical Society. 135 (34), 12762-12771 (2013).
  40. Xue, Y., Li, X., Li, H., Zhang, W. Quantifying thiol-gold interactions towards the efficient strength control. Nature Communications. 5, 4348(2014).
  41. Wiita, A. P., Ainavarapu, S. R. K., Huang, H. H., Fernandez, J. M. Force-dependent chemical kinetics of disulfide bond reduction observed with single-molecule techniques. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (19), 7222-7227 (2006).
  42. Pill, M. F., East, A. L. L., Marx, D., Beyer, M. K., Clausen-Schaumann, H. Mechanical Activation Drastically Accelerates Amide Bond Hydrolysis, Matching Enzyme Activity. Angewandte Chemie International Edition. 58 (29), 9787-9790 (2019).
  43. Conti, M., Falini, G., Samori, B. How strong is the coordination bond between a histidine tag and Ni-nitrilotriacetate? An experiment of mechanochemistry on single molecules. Angew. Chem. Int. Ed. 39 (1), 215-218 (2000).
  44. Beedle, A. E. M., Lezamiz, A., Stirnemann, G., Garcia-Manyes, S. The mechanochemistry of copper reports on the directionality of unfolding in model cupredoxin proteins. Nature Communications. 6, 7894(2015).
  45. Li, H., Zheng, P. Single molecule force spectroscopy: a new tool for bioinorganic chemistry. Current Opinion in Chemical Biology. 43, 58-67 (2018).
  46. Zheng, P., Takayama, S. iJ., Mauk, A. G., Li, H. Hydrogen bond strength modulates the mechanical strength of ferric-thiolate bonds in rubredoxin. Journal of the American Chemical Society. 134 (9), 4124-4131 (2012).
  47. Lei, H., et al. Reversible Unfolding and Folding of the Metalloprotein Ferredoxin Revealed by Single-Molecule Atomic Force Microscopy. Journal of the American Chemical Society. 139 (4), 1538-1544 (2017).
  48. Yuan, G., et al. Multistep Protein Unfolding Scenarios from the Rupture of a Complex Metal Cluster Cd3S9. Scientific Reports. 9 (1), 10518(2019).
  49. Zheng, P., Arantes, G. M., Field, M. J., Li, H. Force-induced chemical reactions on the metal centre in a single metalloprotein molecule. Nature Communications. 6, 7569(2015).
  50. Arantes, G. M., Bhattacharjee, A., Field, M. J. Homolytic cleavage of Fe-S bonds in rubredoxin under mechanical stress. Angewandte Chemie International Edition. 52 (31), 8144-8146 (2013).
  51. Blake, P. R., et al. Determinants of protein hyperthermostability: purification and amino acid sequence of rubredoxin from the hyperthermophilic archaebacterium Pyrococcus furiosus and secondary structure of the zinc adduct by NMR. Biochemistry. 30 (45), 10885-10895 (1991).
  52. Ott, W., Durner, E., Mediated Gaub, H. E. Enzyme-Mediated, Site-Specific Protein Coupling Strategies for Surface-Based Binding Assays. Angewandte Chemie International Edition. 57 (39), 12666-12669 (2018).
  53. Garg, S., Singaraju, G. S., Yengkhom, S., Rakshit, S. Tailored Polyproteins Using Sequential Staple and Cut. Bioconjugate Chemistry. 29 (5), 1714-1719 (2018).
  54. Veggiani, G., et al. Programmable Polyproteams Built Using Twin Peptide Superglues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (5), 1202-1207 (2016).
  55. Pelegri-O'Day, E. M., Maynard, H. D. Controlled Radical Polymerization as an Enabling Approach for the Next Generation of Protein-Polymer Conjugates. Accounts of Chemical Research. 49 (9), 1777-1785 (2016).
  56. Zheng, P., Cao, Y., Li, H. Facile method of constructing polyproteins for single-molecule force spectroscopy studies. Langmuir. 27 (10), 5713-5718 (2011).
  57. Zimmermann, J. L., Nicolaus, T., Neuert, G., Blank, K. Thiol-based, site-specific and covalent immobilization of biomolecules for single-molecule experiments. Nature Protocols. 5 (6), 975-985 (2010).
  58. Becke, T. D., et al. Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy. Journal of Visualized Experiments. (138), e58167(2018).
  59. Liu, H. P., Ta, D. T., Nash, M. A. Mechanical polyprotein assembly using sfp and sortase-mediated domain oligomerization for single-molecule studies. Small Methods. 2 (6), (2018).
  60. Zhang, Y., Park, K. Y., Suazo, K. F., Distefano, M. D. Recent progress in enzymatic protein labelling techniques and their applications. Chemical Society Reviews. 47 (24), 9106-9136 (2018).
  61. Luo, Q., Hou, C., Bai, Y., Wang, R., Liu, J. Protein Assembly: Versatile Approaches to Construct Highly Ordered Nanostructures. Chemical Reviews. 116 (22), 13571-13632 (2016).
  62. Valle-Orero, J., Rivas-Pardo, J. A., Popa, I. Multidomain proteins under force. Nanotechnology. 28 (17), 174003(2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Synteza enzymatyczna OaAEP1polimeryzacja bia ekmikroskopia si atomowychci cie proteaz TEVfunkcjonalizacja Sulfo SMCCparowanie kohezyny z dockerynkalibracja buforu AFMin ynieria polibia ekligacja enzymatyczna

Powiązane artykuły