Artykuł metodologiczny

Transformacja niedojrzałych zarodków opornych linii wsobnych kukurydzy za pośrednictwem Agrobacterium przy użyciu genów morfogennych

26.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60782

⸱

14 lutego 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Agronomy, Iowa State University, 2Department of Applied Science and Technology, Corteva Agriscience, 3Crop Bioengineering Center, Iowa State University, 4Interdepartmental Plant Biology Major, Iowa State University, 5Interdepartmental Genetics and Genomics Major, Iowa State University

W tym artykule

Podsumowanie

Geny morfogeniczne roślin mogą być wykorzystane do poprawy genetycznej transformacji opornych genotypów. Opisano tutaj protokół transformacji genetycznej za pośrednictwem Agrobacterium (QuickCorn) dla trzech ważnych publicznych linii wsobnych kukurydzy.

Streszczenie

Tu zademonstrowano szczegółowy protokół genetycznej transformacji linii wsobnych kukurydzy za pośrednictwem Agrobacterium przy użyciu genów morfogenicznych Baby boom (Bbm) i Wuschel2 (Wus2). Bbm jest regulowany przez promotor genu transferazy fosfolipidowej kukurydzy (Pltp), a Wus2 jest pod kontrolą promotora indukowanego auksyną kukurydzy (Axig1). Szczep Agrobacterium przenoszący te morfogenne geny na transfer DNA (T-DNA) i dodatkowe kopie genów wirulencji Agrobacterium (vir) są wykorzystywane do infekowania niedojrzałych eksplantatów zarodków kukurydzy. Zarodki somatyczne tworzą się na tarczce zakażonych zarodków i mogą być selekcjonowane pod kątem odporności na herbicydy i kiełkować w rośliny. Aktywowany termicznie system rekombinacji cre/loxP wbudowany w konstrukt DNA pozwala na usunięcie genów morfogennych z genomu kukurydzy na wczesnym etapie procesu transformacji. Przy użyciu tego protokołu można osiągnąć częstości transformacji wynoszące około 14%, 4% i 4% (liczba niezależnych zdarzeń transgenicznych na 100 zakażonych zarodków) odpowiednio dla W22, B73 i Mo17.

Wprowadzenie

Transformacja jest podstawowym narzędziem do oceny ekspresji obcych genów w kukurydzy i produkcji genetycznie modyfikowanych linii kukurydzy zarówno do celów badawczych, jak i komercyjnych. Dostęp do transformacji o wysokiej przepustowości może ułatwić zwiększone zapotrzebowanie na badania biologii molekularnej i komórkowej kukurydzy1. Zdolność do genetycznego przekształcania gatunków roślin uprawnych ma kluczowe znaczenie zarówno dla publicznych, jak i prywatnych laboratoriów. Pozwala to zarówno na podstawowe zrozumienie mechanizmów regulacji genów, jak i na ulepszanie upraw w skali globalnej w celu wspierania stale rosnącej populacji.

Odkrycie, że niedojrzałe zarodki z kukurydzy mogą być używane do produkcji modzelu regeneracyjnego, pochodzi z 1975 roku2. Od czasu tego odkrycia większość skalowalnych protokołów transformacji kukurydzy wymagała tworzenia i selekcji kalusa przed regeneracją3. Podczas procesu transformacji genetycznej niedojrzałe zarodki zakażone Agrobacterium lub bombardowane biologicznie są hodowane na pożywkach w celu indukcji zarodkowego kalusa. Indukowane kalusy są następnie hodowane na selektywnych pożywkach (np. zawierających herbicyd), tak aby tylko przekształcone kawałki kalusa były w stanie przetrwać. Te odporne na herbicydy domniemane transgeniczne kalie są nabierane i regenerowane w rośliny. Chociaż ta metoda jest skuteczna, proces jest długi i pracochłonny, a jego ukończenie może zająć nawet 3 miesiące4. Co ważniejsze, konwencjonalne protokoły transformacji kukurydzy mają znacznie większe ograniczenie, to znaczy, że tylko ograniczona liczba genotypów kukurydzy może zostać przekształcona5,6.

Lowe et al.7,8 wcześniej opisywało metodę transformacji "QuickCorn", która nie tylko znacznie skróciła czas trwania procesu transformacji, ale także rozszerzyła listę genotypów zdolnych do transformacji. Metoda QuickCorn wykorzystuje ortologi kukurydzy (Zm-Bbm i Zm-Wus2) czynników transkrypcyjnych Arabidopsis BABY BOOM (BBM)9 i WUSCHEL (WUS)10. Po włączeniu do systemu wektorów transformacji, geny te działają synergistycznie, stymulując wzrost embrionalny7.

Protokół QuickCorn opisany w tej pracy był oparty na protokole w Jones et al11, który był dalszym ulepszeniem metody zgłoszonej przez Lowe et al7,8. W niniejszym badaniu do transformacji użyto szczepu Agrobacterium LBA4404(Thy-) zawierającego binarny konstrukt wektorowy PHP81430 (ryc. 1) i dodatkowy plazmid PHP7153912. T-DNA PHP81430 zawiera następujące składniki molekularne. (1) Kaseta ekspresji genu markera selektywnego transformacji Hra. Gen Hra (Zm-Hra) kukurydzy jest zmodyfikowanym genem syntazy acetolaktazy (ALS), który jest tolerancyjny na herbicydy hamujące ALS, takie jak pochodne sulfonylomocznika i imidazolinony13,14. Gen Zm-Hra jest regulowany przez promotor sorggo ALS8 i terminator inhibitora proteinazy ziemniaczanej II (pinII)15. T-DNA zawiera również (2) kasetę ekspresyjną posiadającą gen markera transformacji ZsGreen. Ten gen białka zielonej fluorescencji ZsGreen z Zoanthus sp. reef coral16 jest regulowany przez promotor ubikwityny sorgo / intron i terminator ubikwityny ryżowej.

Dodatkowo, T-DNA zawiera (3) kasetę ekspresji genu morfogenicznego Bbm. Bbm jest czynnikiem transkrypcyjnym związanym z rozwojem zarodka9,17. Bbm jest regulowany przez promotor białka fosfolipidazy transferazy kukurydzianej (Pltp) 8 i terminator T28 ryżu 18. Zm-Pltp jest genem o silnej ekspresji w nabłonku tarczki zarodka, włoskach jedwabiu i komórkach pomocniczych liści (flankujących komórki ochronne), niskiej ekspresji w narządach rozrodczych i braku ekspresji w roots8. Zawiera również (4) morfogenną kasetę ekspresji genu Wus2. Wus2 to kolejny czynnik transkrypcyjny związany z utrzymaniem merystemu wierzchołkowego19. Zm-Wus2 znajduje się pod kontrolą promotora indukowanego auksyną kukurydzy (Zm-Axig1)20 i kukurydzy In2-1 terminator21. Wreszcie, T-DNA zawiera (5) system rekombinacji cre-loxP. Gen rekombinazy cre < klasa sup = "xref">22 jest pod kontrolą białka szoku cieplnego kukurydzy 17.7 (Hsp17.7)23 promotor i terminator pinII ziemniaka. Dwa miejsca loxP (w tej samej orientacji)24 flankują cztery kasety ekspresji genów, w tym ZsGreen, cre, Bbm i Wus2.

Ponieważ obecność genów morfogenicznych nie jest pożądana dla dojrzałości roślin i późniejszego potomstwa, indukowany ciepłem system rekombinacji cre-loxP został wbudowany w T-DNA w celu usunięcia genów morfogenicznych z genomu kukurydzy, aby umożliwić normalną regenerację kalusa i rozwój roślin. Po obróbce cieplnej ekspresja białka CRE usuwa wszystkie transgeny z wyjątkiem genu selekcyjnego Hra. Udane transformanty powinny być odporne na herbicydy, ale ZsGreen-ujemne. Aby jeszcze bardziej zwiększyć częstotliwość transformacji, szczep Agrobacterium zawiera również dodatkowy dodatkowy plazmid (PHP71539), który ma dodatkowe kopie genów wirulencji Agrobacterium (vir) 12.

Metoda QuickCorn różni się od konwencjonalnych protokołów transformacji kukurydzy, ponieważ nie obejmuje etapu indukcji kalusa podczas transformacji. W pierwszym tygodniu po zakażeniu Agrobacterium na nabłonku tarczki zakażonych niedojrzałych zarodków rozwijają się zarodki somatyczne. Zarodki są następnie przenoszone do pożywki z hormonami, które pobudzają dojrzewanie zarodków i tworzenie pędów. Szybkie przeniesienie zarodków somatycznych na pożywkę do dojrzewania/tworzenia pędów pomija tradycyjne stadium kalusa używane wcześniej do transformacji kukurydzy i pozwala na bezpośrednie generowanie roślin T08. W porównaniu z poprzednio opublikowanymi metodami transformacji kukurydzy6, metoda QuickCorn jest szybsza, bardziej wydajna i mniej zależna od genotypu. Korzystając z tej metody, ukorzenione rośliny są zazwyczaj gotowe do przeniesienia do gleby w ciągu zaledwie 5-7 tygodni, a nie trzech lub więcej miesięcy wymaganych przez tradycyjne protokoły. Celem tego artykułu jest przedstawienie dogłębnego opisu i demonstracji metody, co pozwoli na łatwiejszą replikację w warunkach laboratoryjnych typowych dla większości instytucji akademickich.

Protokół

1. Przygotowanie podłoża wzrostowego

  1. Aby zapoznać się z dokładnymi przepisami na pożywki wzrostowe dla tego protokołu, zapoznaj się z Tabelą 1.
  2. Aby przygotować 1 l podłoża, umieść 2 l zlewki na talerzu do mieszania i umieść w nim mieszadło.
  3. Napełnij zlewkę 900 ml wody destylowanej i włącz płytkę mieszającą. Mieszadło powinno wirować ze średnią prędkością.
  4. Zważ wszystkie sproszkowane składniki i rozpuść je w zlewce.
  5. Odmierz wszystkie płynne składniki, jeśli występują, i dodaj do zlewki.
  6. Doprowadzić ostateczną objętość do 1 l za pomocą wody destylowanej.
  7. Zmierz pH i dostosuj do specyfikacji receptury.
  8. W przypadku formułowania płynnej pożywki wzrostowej nie dodaje się agaru. Podłącz sterylizator filtracyjny do pompy próżniowej i wlej płynną pożywkę wzrostową przez filtr. Włącz pompę i poczekaj, aż cała ciecz zostanie przeciągnięta. Umieść nakrętkę na pojemniku i przyklej etykietę.
  9. W przypadku formułowania stałej pożywki wzrostowej, po dostosowaniu pH, dodaj agar bezpośrednio do butelki lub kolby.
  10. Wlać 1 l płynnej pożywki wzrostowej do 2 l kolby Erlenmeyera lub podzielić ją na dwie 1 l butelki autoklawowalne (500 ml każda). Jeśli używane są dwie butelki, podziel agar i dodaj bezpośrednio do butelek.
  11. Przykryj kolbę oddychającą osłoną, taką jak dwie warstwy folii aluminiowej, aby umożliwić ucieczkę pary. Jeśli używasz butelki, luźno zakręć zakrętkę na górze.
  12. Autoklaw w temperaturze 121 °C przez 25 min.
  13. Po sterylizacji w autoklawie należy wyjąć pożywkę wzrostową z autoklawu i schłodzić do temperatury 55-60 °C (kąpiel wodna ustawiona na 55 °C może to ułatwić). Utrzymuj podłoże wzrostowe w stanie płynnym przez kilka godzin, aż będzie wygodnie wlać talerze.
  14. Po schłodzeniu dodać wszystkie dodatki posterylizacyjne (patrz Tabela 1) i dokładnie wymieszać.
  15. Po dodaniu wszystkich składników wlej wyznaczoną objętość do wybranego pojemnika w okapie z przepływem laminarnym.
  16. Pożywkę wzrostową można wlać do żądanych szalek Petriego ręcznie lub za pomocą urządzenia do dozowania płynów. W przypadku nalewania ręcznego zaleca się przeniesienie dużej objętości autoklawizowanego podłoża do mniejszej sterylnej zlewki (500 ml) w celu ułatwienia obsługi.
  17. Pozwól pożywce wzrostowej ostygnąć i zestalać się.
  18. Pożywka wzrostowa będzie dostępna do użycia po zestaleniu się i najlepiej stosować ją następnego dnia po lekkim wysuszeniu przez noc w sterylnym kapturze przepływowym w postaci stosów płytek z pokrywką. Po wyschnięciu przez noc przenieś płytki do plastikowych rękawów, złóż luźny koniec i przytrzymaj go na miejscu za pomocą odrobiny taśmy. Zapobiega to nadmiernemu wysuszeniu. Pożywka może być przechowywana w chłodnym, ciemnym i czystym środowisku (4-16 °C) do 1 miesiąca.

2. Uprawa roślin dawcy i zbieranie niedojrzałych kłosów

  1. Uprawiaj dowolną publicznie dostępną kukurydzę wsobną (tj. B73, Mo17 lub W22) w szklarni w doniczkach o pojemności 1.5 galona (5.9 l) zawierających podłoże bezglebowe. Użyj okresu fotograficznego 16/8 (dzień/noc), ze średnią temperaturą 25,5 °C w dzień i 20 °C w nocy.
  2. Rośliny są podlewane w razie potrzeby i nawożone nawozem o kontrolowanym uwalnianiu (N-P-K z 15-9-12), który można włączyć do mieszanki glebowej lub dodać na powierzchnię po posadzeniu.
  3. Zwykle potrzeba około 70-90 dni po wykiełkowaniu nasion, aby pojawiły się kłosy. Gdy pojawią się pędy kłosów, przykryj je torbą na pędy, aby zapobiec niekontrolowanemu zapyleniu.
  4. Około 2-3 dni po pojawieniu się jedwabiu i jeśli pyłek będzie dostępny następnego dnia, przetnij jedwabie nożyczkami, które zostały wysterylizowane w 70% etanolu. Przetnij jedwabie i obierz je z łupiny około 2,5 cm poniżej końca liści łuski, gdzie wyłaniają się jedwabie. Zapylanie można przeprowadzić następnego dnia. Pamiętaj, aby ponownie wysterylizować nożyczki między każdym uchem.
  5. Gdy pylniki wyjdą z frędzla, przykryj frędzl torbą z frędzlami i antypoślizgowym spinaczem do papieru u podstawy torby wokół łodygi.
  6. Następnego ranka delikatnie zegnij roślinę i postukaj w torebkę, aby zachęcić do uwolnienia pyłku.
  7. Wyjmij worek z frędzlami i złóż górną część worka, aby zapobiec wydostawaniu się pyłków. Generalnie najlepiej jest zapakować frędzl na 1 dzień przed jego użyciem (aby uniknąć gromadzenia się martwego pyłku i zrzucania pylników). Świeży pyłek można zbierać z frędzli przez około 3-5 dni. Kiedy pylniki wyłaniają się z wewnętrznych różyczek u podstawy frędzla, frędzel ten prawdopodobnie nie wytworzy żywego pyłku następnego dnia.
  8. Użyj pyłku z tej samej rośliny (samodzielność) lub z innej rośliny o tym samym chobnym (sibbing).
  9. Zdejmij worek na uszy lub odetnij koniec torby, aby odsłonić jedwabie, a następnie szybko wylej pyłek z torebki z frędzlami na jedwabie.
  10. Natychmiast zakryj ucho torbą z frędzlami i zszyj podstawę torby wokół łodygi, aby ją zabezpieczyć. Pomocne może być fizyczne odizolowanie rośliny od roślin kwitnących o różnych genotypach podczas zapylania, aby zapobiec zapyleniu krzyżowemu. Pozostaw torbę z frędzlami na uchu, aż niedojrzałe ucho będzie gotowe do zbioru.
  11. 9-12 dni po zapyleniu przebadaj uszy pod kątem wielkości zarodka. Wsuń worek do zapylania w górę łodygi, aby odsłonić ucho. Delikatnie pociągnij łuskę w dół, aby odsłonić ziarna na około jednej trzeciej do jednej czwartej obwodu ucha i około jednej trzeciej odległości w dół ucha. Ziarna w pobliżu wierzchołka nie będą reprezentatywne dla średniej wielkości zarodka.
  12. Za pomocą skalpela odetnij kapelusz pojedynczego ziarna, które wydaje się podobne do większości innych ziaren pod względem wielkości i koloru.
  13. Użyj szpatułki (z linijką), aby usunąć zarodek zgodnie z opisem w kroku 4.6. Zmierz długość zarodka za pomocą wbudowanej linijki na szpatułce lub suwmiarki cyfrowej. Jeśli zarodek ma od 1,5 do 2,0 mm, zbierz ucho. Jeśli wynosi ~1,3 mm, kłos może być gotowy do zbioru później w ciągu dnia i można go ponownie sprawdzić za około 7-8 godzin.

3. Przygotowanie kultury zawiesinowej Agrobacterium do infekcji

UWAGA: Szczep Agrobacterium LBA4404(Thy-) zawierający PHP81430 (Rysunek 1) i PHP7153912 jest przechowywany jako zapas glicerolu w temperaturze -80 °C. Materiały te można uzyskać od Corteva Agriscience na podstawie Umowy o Przekazaniu Materiałów. LBA4404(Thy-) to szczep auksotroficzny, który potrzebuje tymidyny dostarczanej w pożywce wzrostowej. Podstawowym zastosowaniem szczepu Agro auksotrofu jest hermetyzacja biologiczna. Ma dodatkową zaletę w postaci zmniejszenia przerostu Agro. Auksotroficzny szczep Agro nie rośnie bez suplementu tymidyny. Niemniej jednak tymidyna może (prawdopodobnie) być dostarczana przez umierającą tkankę roślinną w kulturze. Dlatego nadal istnieje potrzeba zapewnienia antybiotyku w pożywce, aby całkowicie kontrolować auksotroficzny Agro. Jednak łatwiej będzie go kontrolować ze względu na upośledzony wzrost szczepu auksotroficznego przy braku tymidyny.

  1. Cztery dni przed datą zakażenia należy zainicjować "macierzystą" płytkę z glicerolu, nakładając na bakterię YP smugi z 50 mg / l tymidyny, 50 mg / l gentamycyny i 50 mg / l spektynomycyny (Tabela 1). Inkubować "matkę" w inkubatorze o temperaturze 20 °C przez 3 dni.
  2. Na dzień przed eksperymentem z infekcją przygotuj "roboczą" płytkę, wybierając od jednej do pięciu kolonii z płytki "matki" i przenosząc bakterie z płytki "matki" na nową płytkę YP (z tymidyną, gentamycyną i spektynomycyną; Tabela 1).
  3. Przesuwaj codzienną "roboczą" płytkę w sekwencyjnych kwadrantach i przeprowadź pętlę 1x przez obszar z właśnie smugami do kolejnego kwadrantu, powtarzając się, aby utworzyć ćwiartki, które zostały seryjnie rozcieńczone. Inkubować "roboczą" płytkę przez noc w inkubatorze o temperaturze 27 °C.
  4. Po zakończeniu sekcji zarodków (krok 4.8) użyj pętli lub podobnego narzędzia, aby zebrać Agrobacterium z obszaru "roboczej" płytki, w którym wzrost bakterii jest widoczny jako cienkie smugi kolonii.
    UWAGA: Unikaj obszarów talerza z gęstym trawnikiem, na którym rozwijają się bakterie. Wzrost Agrobacterium prawdopodobnie zaczął już spadać na obszarach gęsto zaludnionych, podczas gdy na obszarach z widocznymi koloniami bakterie są w odpowiedniej fazie wzrostu do infekcji.
  5. Zebrane bakterie zawiesić w probówce o pojemności 50 ml zawierającej 10 ml płynnego podłoża o natężeniu 700 A (tabela 1). Wir, aby całkowicie zawiesić kulturę bakterii.
  6. Zmierzyć gęstość optyczną przy długości fali 550 nm. Dostosuj głośność, aż średnica zewnętrzna będzie mieścić się w przedziale 0.35-0.45, przy czym 0.4 to optymalna wartość.
    UWAGA: Jeśli średnica zewnętrzna jest wyższa niż 0,45, dodaj więcej płynnego medium 700A. Jeśli OD jest niższy niż 0,35, zaszczepić więcej kolonii Agro w kulturze zawiesinowej.

4. Sekcja zarodków, infekcja i współhodowla

  1. Wybierz odpowiednie kłosy do eksperymentów transformacyjnych; powinny one mieć dobry zestaw nasion i zarodki o rozmiarach od 1,5 do 2,0 mm. Zazwyczaj zbiera się je między 9-12 dniem po zapyleniu. Zebrane kłosy mogą być używane świeże lub przechowywane przez 1-4 dni w temperaturze 4 °C, chociaż jakość odpowiedzi prawdopodobnie będzie się stopniowo pogarszać przy dłuższym przechowywaniu po pierwszym dniu.
  2. Usuń łuski i jedwabie. Włóż uchwyt do podstawy lub górnej części ucha. Rękojeścią może być para kleszczyków, śrubokręt itp.
  3. Umieść uszy w dużym pojemniku (np. zlewka o pojemności 2 l z uchwytem do góry, napełnij pojemnik roztworem dezynfekującym. Roztwór do dezynfekcji to 1,8 l 20% komercyjnego wybielacza (1,65% podchlorynu sodu) i kilka kropli środka powierzchniowo czynnego Tween 20.
  4. Wysterylizuj uszy w ławce z przepływem laminarnym. Po 20 minutach opróżnij roztwór wybielacza i przepłucz uszy 3 razy (po 5 minut) dużą ilością sterylnej wody destylowanej. Usuń wodę i pozostaw uszy do wyschnięcia na kilka minut.
    UWAGA: Ważne jest, aby uszy były całkowicie zanurzone w roztworze wybielacza na 20 minut. Od czasu do czasu ostrożnie poruszaj uszami w roztworze wybielacza, aby usunąć pęcherzyki powietrza.
  5. Przygotuj probówkę do mikrowirówek o pojemności 2 ml wypełnioną płynnym podłożem o natężeniu 700 A. Probówka ta będzie używana do pobierania niedojrzałych zarodków.
  6. Weź ucho i za pomocą sterylnego skalpela usuń górne 1-2 mm koron jądra, aby odsłonić bielmo. Użyj mikroszpatułki, aby usunąć niedojrzały zarodek zygotyczny (IZE). IZE będzie znajdować się w jądrze, po stronie skierowanej w stronę czubka ucha i w pobliżu przyczepu do kolby. Za pomocą szpatułki włóż ją do bielma w owocni najbardziej oddalonej od zarodka, a następnie delikatnie przekręć w górę, aby usunąć bielmo i umożliwić usunięcie zarodka (Ryc. 2).
  7. Za pomocą szpatułki przenieś zarodek do probówki zawierającej płynne podłoże 700A. Kontynuuj to, aż zostanie pobranych do 100 zarodków. Można napełnić wiele probówek (~100 zarodków/probówkę) przed przejściem do następnego kroku. W tym momencie należy przygotować zawiesinę Agrobacterium (patrz krok 3.5).
  8. Usunąć płynną pożywkę 700 A z probówki zarodka za pomocą pipety o pojemności 1 ml. Dodaj świeżą pożywkę 700A, aby umyć zarodki, a następnie usuń również tę pożywkę.
  9. Dodaj 1 ml zawiesiny Agrobacterium i wiruj na małym ustawieniu (3/10) przez 30 s lub odwróć probówkę 12x-15x do wymieszania. Pozostaw tę rurkę poziomo na ławce przez 5 minut.
  10. Po 5 minutach przenieść całą probówkę z zarodkami i zawiesiną Agrobacterium na płytkę z podłożem do wspólnej hodowli 562 V (tabela 1). Można to osiągnąć, umieszczając talerz na stole i szybko wysypując zawartość tubki na talerz. Delikatnie zakręcić płytką, aby rozprowadzić zarodki i usunąć zawiesinę Agrobacterium za pomocą pipety o pojemności 1 ml.
  11. Upewnij się, że zarodki są umieszczone tarczką (okrągłą) stroną skierowaną do góry. W razie potrzeby użyj lupy lub lunety sekcyjnej. Umieścić płytki w plastikowych pojemnikach (19 cm x 28 cm x 5,1 cm) i inkubować płytki przez noc 16-18 godzin w temperaturze 21 °C w ciemności. Nie jest konieczne indywidualne owijanie płyt za pomocą folii parafinowej lub taśmy wentylacyjnej.
  12. Po całonocnej wspólnej hodowli przenieść zakażone zarodki, tarczką do góry, na podłoże spoczynkowe 605T (tab. 1). Umieść około 30 zarodków na płytce. Inkubować płytki w temperaturze 26-28 °C w ciemności.
  13. Inkubować przez 4-10 dni (preferowane 7 dni). W tym czasie rozwój zarodków somatycznych można zaobserwować na powierzchni tarczki jarzmowej (Ryc. 3).

5. Selekcja, obróbka cieplna i regeneracja

  1. Po okresie spoczynku zarodki poddawane są szokowi cieplnemu. Umieścić pudełko zawierające płytki z zarodkami w inkubatorze o temperaturze 45 °C i wilgotności względnej 70% na 2 godziny. Następnie wyjąć pudełko z inkubatora w temperaturze 45 °C i umieścić w ciemnym inkubatorze w temperaturze 26-28 °C na 1-2 godziny
    UWAGA: Jeśli nie możesz osiągnąć 70% wilgotności w inkubatorze, dodaj podwójną warstwę autoklawowanych ręczników papierowych na dno pudełka na talerze i namocz w autoklawowanej wodzie, aby utrzymać wilgotność w pudełku. Włóż talerze z powrotem do pudełka na ręcznikach papierowych i zamknij pokrywę przed umieszczeniem w temperaturze 45 °C. Użyj małego cyfrowego higrometru/termometru, aby monitorować temperaturę i wilgotność.
  2. Przenieść poddane obróbce cieplnej IZE z pożywki spoczynkowej do pożywki do pożywki do tworzenia pędów (13329A) zawierającej 0,05 mg/l imazapyru jako środek selektywny (Tabela 1). Podczas przenoszenia usuń koleoptyle, jeśli są obecne, za pomocą kleszczyków z cienką końcówką lub nożyczek chirurgicznych.
  3. Umieść 10-15 zarodków na płytce, aby uniknąć przepełnienia. Przechowywać zarodki w tym podłożu przez 2 tygodnie w ciemnym inkubatorze w temperaturze 26 °C.
  4. Przenieść zarodki na podłoże ukorzeniające (13158; Tabela 1) przez 1-2 tygodnie. Umieścić około ośmiu kawałków na płytce i inkubować w jasnym pomieszczeniu lub komorze świetlnej (16 dni/8 nocy, 20-150 μmol/m2/s) w temperaturze 27 °C.
  5. W miarę rozwoju sadzonek umieszczaj silniejsze sadzonki zawierające zarówno pędy, jak i silne korzenie na nowych płytkach podłoża ukorzeniającego, umieszczając jedną roślinę na talerzu. Pozwoli to na silniejszy wzrost sadzonek. Umieść płytki w pomieszczeniu świetlnym lub komorze świetlnej na kolejne 7-14 dni.
    UWAGA: Ostrożnie usuń wszelkie kawałki kalusa związane z sadzonką, aby upewnić się, że ma dobry kontakt z podłożem.
  6. Gdy roślina stanie się bardziej energiczna, usuń roślinę z podłoża ukorzeniającego i spłucz korzenie wodą z kranu, aby usunąć agar.
  7. Przesadzaj pojedyncze rośliny do doniczek 3 w2 (~19 cm2) zawierających wstępnie zwilżone podłoże bezglebowe. Umieść doniczki na tacy (27 cm x 54 cm) z otworami odpływowymi i przykryj mieszkanie plastikową kopułą do wilgotności. Ten etap aklimatyzacji można osiągnąć w komorze wzrostowej lub w szklarni z warunkami wzrostu opisanymi w sekcji 2 (krok 2.1) powyżej.

6. Przesadzanie do szklarni i produkcja nasion T1

  1. Sprawdzaj rośliny 2x dziennie. Woda w razie potrzeby. Upewnij się, że rośliny nie są ani wysuszone, ani nadmiernie podlewane. Utrzymywanie lekko suchego podłoża sprzyja wzrostowi korzeni.
    UWAGA: Kopułę wilgotności można usunąć 4-7 dni po przesadzeniu. Rośliny powinny być uprawiane w tych małych doniczkach, dopóki nie zregenerują się w widoczny sposób po stresie związanym z przeszczepem do gleby. Powinno to zająć około 9-14 dni.
  2. Przeszczep całą bezglebową wtyczkę i sadzonkę do doniczki o pojemności 1,5 galona (5,9 l). Utrzymuj w szklarni i podlewaj, gdy gleba jest sucha w dotyku.
  3. Do doniczki dodać nawóz o kontrolowanym uwalnianiu z N-P-K w proporcji 15-9-12, który można włączyć do mieszanki substratów lub nałożyć na powierzchnię.
  4. Kiedy pędy kłosów zaczną wyłaniać się z rośliny, użyj torby na pędy, aby przykryć pędy uszu. Pamiętaj, aby użyć torby, która jest półprzezroczysta, aby można było obserwować pojawiające się jedwabie bez zdejmowania torby. Worek na pędy pozwala na kontrolowane zapylenie. Ważne jest, aby zawsze pakować transgeniczne frędzle.
  5. Po pojawieniu się jedwabi (1-2 dni) przytnij powstałe jedwabie do jednolitej długości. Będzie to około 2,5 cm poniżej wierzchołka liści łuski. Użyj czystych nożyczek, które zostały wysterylizowane w 70% etanolu. Poprzez przycinanie jedwabi następnego dnia rozwija się jednolita kępka, aby mogło nastąpić zapylenie.
  6. Dla większości genotypów kukurydzy optymalny czas na zapylenie to 2-3 dni po wzejściu frędzli lub jedwabiu.
  7. Zebrać pyłek z tej samej rośliny (jeśli jest samopylna) lub z dzikiego typu o tym samym wsobnym (w przypadku krzyżowania lub krzyżowania).
  8. Zbierz pyłek do worka z frędzlami i nałóż go na kępkę jedwabiu rośliny T0. Jeśli pyłek pochodzi z rośliny typu dzikiego (nietransgenicznej), umieść pyłek w zwykłej brązowej torbie z frędzlami. Jeśli pyłek pochodzi z rośliny transgenicznej, umieść pyłek w torbie w zielone paski, aby wskazać, że pyłek jest transgeniczny.
  9. Wykonaj kroki 2.5-2.10, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat zapylania.
  10. Około 2 tygodnie po zapyleniu usuń woreczki z frędzlami z uszu i pozwól im wyschnąć. Aby pomóc wyschnąć, przestań podlewać roślinę 21-25 dni po zapyleniu. Możesz również odciągnąć liście łuski, aby odsłonić nasiona. Ta praktyka pomaga również zapobiegać pleśni.
  11. Około 45 dni po zapyleniu zebrać nasiona i przechowywać w chłodni w temperaturze 4-12 °C.

Wyniki

Przedstawiono tutaj szczegółowy protokół transformacji genetycznej trzech publicznych linii inbrednych kukurydzy (B73, Mo17 i W22), które odgrywają istotną rolę w dziedzinie genetyki kukurydzy, przeprowadzonej za pośrednictwem Agrobacterium. Transformacji tych trzech linii inbrednych nie udało się przeprowadzić przy użyciu konwencjonalnych protokołów transformacji kukurydzy5. Na Rysunku 1 oraz Rysunku 2 przedstawiono odpowiednio konstrukt i materiały wyjściowe użyte w tej procedurze. Kolby są zazwyczaj zbierane 9–12 dni po zapyleniu. Najlepszymi eksplantami do transformacji w tym protokole są IZE o długości od 1,5 do 2,0 mm (Rysunek 2).

Osiem dni po infekcji embriony somatyczne wykazujące ekspresję ZsGreen zwizualizowano w kanale GFP mikroskopu fluorescencyjnego (Rysunek 3). Zainfekowane IZE poddano obróbce termicznej 8 dni po infekcji (kroki 5.1 i 5.2). Zabieg ten indukował ekspresję rekombinazy CRE, która wycięła kasety ekspresyjne Bbm, Wus2, cre oraz ZsGreen flankowane dwoma miejscami loxP (Rysunek 1). Tkanki poddane obróbce termicznej hodowano następnie na pożywce do regeneracji pędów zawierającej herbicyd imazapyr w celu selekcji tkanki transformowanej po usunięciu genów morfogennych.

Tkanki proliferujące z dojrzewającymi embrionami lub pąkami pędów wykazujące oporność na imazapyr zaobserwowano około 3-4 tygodnie po infekcji (Rycina 4). Niektóre tkanki odporne na imazapyr były negatywne pod kątem ZsGreen, co sugeruje, że w tkankach tych prawdopodobnie doszło do wycięcia zapośredniczonego przez cre (Rycina 4). Po przeniesieniu tkanek na pożywkę do ukorzeniania i inkubacji w świetle rozpoczęły się rozwijać pędy (Rycina 5). Zebrano zdrowe i intensywnie rosnące pędy z dobrze rozwiniętym systemem korzeniowym (Rycina 5). W niektórych tkankach zaobserwowano obecność wielu pędów (Rycina 5E,F,G). Ten typ regenerantów o wyglądzie „trawiastym” może wynikać z identycznych wzorców integracji transgenów w roślinach klonalnych. Do genotypowania tych roślin wymagana jest analiza biologii molekularnej.

Wszystkie trzy publiczne linie inbredowe dobrze zareagowały na zastosowanie tego protokołu, jak również na konstrukt użyty w niniejszej pracy. Linia W22 wykazała najwyższą częstotliwość powstawania pędów odpornych na imazapyr, która wyniosła około 14% (około 14 pędów transgenicznych na 100 zainfekowanych niedojrzałych embrionów). Zarówno B73, jak i Mo17 wytworzyły około 4% pędów transgenicznych. Częstotliwości te obejmują wszystkie pędy transgeniczne, w tym zarówno rośliny posiadające geny morfogenne, jak i rośliny, w których gen morfogenny został usunięty w drodze ekscyzji pośredniczonej przez CRE.

Schemat wektora do edycji genów, PHP81430, przedstawiający komponenty transformacji, T-DNA i szkielet wektora.
Rysunek 1: Schematyczne przedstawienie regionu T-DNA binarnego plazmidu PHP81430. RB = prawa granica T-DNA; loxP = miejsce docelowe rekombinazy CRE; Axig1pro:Wus2 = indukowany auksyną promotor kukurydzy (Zm-Axig1) + Zm-Wus2 + terminator In2-1 kukurydzy; Pltppro:Zm-Bbm = promotor fosfolipidotransferazy kukurydzy (Zm-Pltp) + Zm-Bbm + terminator T28 ryżu (Os-T28); Hsppro:cre = promotor białka szoku cieplnego 17.7 kukurydzy (Zm-Hsp17.7) + gen rekombinazy cre + terminator inhibitora proteinazy II (pinII) ziemniaka; Ubipro:ZsGreen = promotor/intron ubikwityny sorga (Sb-Ubi) + gen zielonego białka fluorescencyjnego ZsGreen + terminator ubikwityny ryżu (Os-Ubi); kaseta Hra = promotor syntazy acetolaktatowej sorga (Sb-Als) + gen Hra kukurydzy (Zm-Hra) + terminator pinII; LB = lewa granica T-DNA; colE1, miejsce inicjacji replikacji plazmidu ColE125; SpecR = gen oporności na spektynomycynę aadA1 z Tn21 do selekcji bakterii26; Rep A,B,C = miejsce inicjacji replikacji z pRiA4 Agrobacterium rhizogenes27. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Etapy rozwoju kolby kukurydzy; mikroskopia nasion; botanika eksperymentalna; analiza wzrostu kukurydzy.
Rycina 2: Materiały wyjściowe. Kolby B73 zebrane 12 dni po zapyleniu (A). Niedojrzałe embriony B73 (B), Mo17 (C) oraz W22 (D). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Mikroskopia fluorescencyjna tkanek roślinnych, ujawniająca struktury komórkowe; paski skali wskazują rozmiar.
Rysunek 3: Rozwój tkanki na medium spoczynkowym 1 tydzień po infekcji. Zarodki (8 dni po infekcji) pod mikroskopem fluorescencyjnym (filtr GFP) wykazujące ekspresję GFP w zarodkach somatycznych Mo17 (A) i W22 (B). Rozwijająca się tkanka (B73) w świetle przechodzącym (C) oraz z filtrem GFP (D). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Eksperyment z kulturą tkanek roślinnych z kalusem embriogennym; analiza mikroskopowa i fluorescencyjna GFP.
Rysunek 4: Rozwój tkanek na pożywce do dojrzewania z selekcją. Płytka do dojrzewania W22 (A). Rozwijająca się tkanka (Mo17, 15 dni po infekcji) w świetle przechodzącym (B) i z filtrem GFP (C). Rozwijająca się tkanka (Mo17, 28 dni po infekcji) w świetle przechodzącym (D) i z filtrem GFP (E). Strzałki wskazują regenerujące się tkanki, w których brakuje ekspresji GFP, co sugeruje wycięcie genu ZsGreen pomiędzy miejscami loxP po indukowanej ciepłem aktywności białka CRE. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Kultura roślin in vitro, etapy propagacji; schematy szalek Petriego; analiza wzrostu kultur tkankowych.
Rysunek 5: Rozwój tkanek na podłożu ukorzeniającym. Pędy W22 (A), B73 (B) i Mo17 (C,D). Zdarzenia z wielokrotnymi pędami (regeneranty trawiaste) B73 (E) i W22 (F,G). Pędy z korzeniami B73 (H) i W22 (I). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Tabela 1: Składy pożywek do transformacji kukurydzy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić tę tabelę (kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać).

Dyskusja

Tradycyjne protokoły transformacji kukurydzy są zgodne z paradygmatem izolowania niedojrzałych zarodków zygotycznych w celu wytworzenia transgenicznej tkanki kalusa, która jest regenerowana w płodne rośliny 4,6. Chociaż jest to skuteczne, protokoły oparte na kalusach mogą być czasochłonne, a proces hodowli tkankowej często trwa do 3 miesięcy, aby wytworzyć rośliny. To, co czyni przedstawioną tutaj metodę istotną, to fakt, że jest ona wolna od modzeli, wydajna, szybka i pozwala na regenerację roślin T0 w mniej więcej o połowę krótszym czasie. Wydaje się również, że jest mniej zależny od genotypu i dlatego może być skuteczny dla większości publicznie dostępnych inbredów 8,11.

Chociaż wszystkie kroki powinny być skutecznie przestrzegane, konieczne jest prawidłowe przygotowanie podłoża wzrostowego. Składniki pożywek wzrostowych muszą być dodawane na odpowiednich etapach, zarówno przed, jak i po autoklawie, aby zapewnić, że materiał roślinny otrzyma odpowiednie stężenie chemikaliów. Zapewni to, że wrażliwe związki, takie jak antybiotyki, nie ulegną rozkładowi. Ważne jest również, aby materiał roślinny był umieszczany na odpowiednim podłożu wzrostowym na każdym etapie, jak wskazano w protokole. Nieumieszczenie materiału na odpowiednim podłożu wzrostowym może spowodować śmierć materiału. Ponadto należy unikać umieszczania na płytkach zbyt wielu zarodków lub rozwijających się tkanek. Podczas gdy umieszczenie dwukrotnie większej liczby kawałków tkanek może zaoszczędzić na kosztach chemikaliów i szalek Petriego (a nawet miejsca w inkubatorze), wzrost tkanki w przepełnionych płytkach może zostać poważnie zahamowany. Podczas wykonywania infekcji należy upewnić się, że gęstość optyczna zawiesiny Agrobacterium jest odpowiednia. Jeśli gęstość zawiesiny bakteryjnej jest zbyt niska, prawidłowa infekcja może nie wystąpić.

Jakość materiałów wyjściowych ma zasadnicze znaczenie dla sukcesu w protokołach transformacji. Uszy używane do sekcji zarodków muszą być zdrowe, co oznacza, że roślina, która je produkuje, jest zdrowa. Muszą również posiadać odpowiedni zestaw nasion i być wolne od szkodników i chorób. Nie należy również używać starego Agrobacterium . Talerz "matka" nie powinien mieć więcej niż 2 tygodnie. Po tym momencie należy nałożyć nową "matkę" na płytkę, aby rozpocząć nowe eksperymenty.

Chociaż wykazano, że metoda ta jest mniej zależna od genotypu, nie można zakładać, że wszystkie linie będą równie skuteczne. Nadal mogą występować różnice między liniami, a także różnice w sukcesie w zależności od używanej konstrukcji. Zmienność między uchami jest również nieunikniona podczas pracy z niedojrzałymi zarodkami, więc idealnie byłoby, gdyby eksperymenty wykorzystywały wiele uszu, aby to uwzględnić. W tej pracy najlepiej wypadł wsobny W22, z ponad ~14% częstotliwością transformacji, a następnie B73 i Mo17 (~4% każdy). Lowe i wsp.8 poinformowali o użyciu protokołu QuickCorn do transformacji B73 i Mo17. W tej pracy częstości transformacji wahały się od 9%-50% dla B73 i 15%-35% dla Mo17.

Jedną z możliwości niższych częstotliwości przemian dla B73 i Mo17 zaobserwowanych w tej pracy można przypisać sezonowym wahaniom jakości ucha. Kolejną różnicą między tą pracą a pracą Lowe'a i wsp.8 jest to, że użyto tu różnych konstrukcji wektorowych. W pracy Lowe'a geny morfogenne nie zostały usunięte z przekształconych roślin, ale raczej wyciszone rozwojowo w późniejszych stadiach. W tej pracy geny morfogenne zostały usunięte 8 dni po zakażeniu. Możliwe, że witaminy B73 i Mo17 mogą potrzebować dłuższej obecności Bbm/Wus2 do rozwoju zarodków somatycznych.

Za pomocą tej metody istnieje możliwość uzyskania nietransgenicznych roślin ucieczkowych, insercji multimerycznych i niewyciętych transgenów. Rośliny te nie będą miały zauważalnie różniącego się fenotypu, więc wykrywanie za pomocą PCR jest wymagane w celu ustalenia, czy roślina jest transgeniczna. Aby to osiągnąć, można zastosować startery PCR w obszarze wyciętym i startery flankujące wycięty obszar. Wiele niezależnych przemian może również wytwarzać rośliny z tego samego niedojrzałego zarodka, co utrudnia określenie całkowitego współczynnika odzysku niezależnego transformantu. Naszym standardem było obliczenie współczynnika przemian na podstawie pobrania próbki z jednej rośliny z każdego niedojrzałego zarodka, który wytworzył rośliny, i podzielenia tego przez liczbę zainfekowanych zarodków. Ta metoda prawie na pewno zaniża rzeczywistą liczbę niezależnych zdarzeń odzyskanych jako sadzonki. Dyskryminacja między niezależnymi zdarzeniami z tego samego zarodka wymaga sekwencjonowania regionów granicznych wokół transgenów, a to będzie zbyt kosztowne i czasochłonne w przypadku większości zastosowań; Chociaż mogą wystąpić przypadki, w których te dane są przydatne.

Ta metoda transformacji kultur tkankowych okazała się bardzo skuteczna, ale nadal mogą wystąpić problemy. Jeśli materiał roślinny nie reaguje, możliwe, że występuje problem z konkretną linią wsobną, co sugeruje, że zmienne, takie jak skład podłoża wzrostowego i czas podhodowli, wymagają dostosowania. Kolejną zmienną jest prawidłowy projekt wektora i dokładna konstrukcja wektora, jeśli oryginalny wektor zostanie zmieniony. Mogą również wystąpić problemy z wrażliwością imazapyru, ponieważ niektóre linie są bardziej wrażliwe niż inne, a stężenie imazapyru może wymagać dostosowania, aby uzyskać pomyślnie przekształcone rośliny.

W ciągu ostatnich 30 lat protokoły hodowli tkankowej i transformacji kukurydzy zmieniły się i rozwinęły; Uważa się, że ten skrócony protokół przyczyni się do dalszego postępu. Ta metoda jest skuteczna w środowisku akademickim, ponieważ jest mniej czasochłonna niż tradycyjne metody. Ponadto nie wymaga wysoko wykwalifikowanych operatorów, co czyni ją bardziej podatną na powszechną dystrybucję w porównaniu z tradycyjnymi metodami. W przyszłości metoda ta może być łączona z nowymi technologiami, takimi jak inżynieria genomu.

Oświadczenia

Alicia Masters, William Gordon-Kamm i Todd Jones są pracownikami firmy Corteva Agriscience, która dostarczyła protokół i kłosy kukurydzy B73, Mo17 i W22 użyte w tym artykule. Autorzy Minjeong Kang, Morgan McCaw, Jacob Zobrist i Kan Wang nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy zespołowi szklarni Corteva za dostarczenie niedojrzałych kłosów kukurydzy, laboratorium przygotowania podłoża Corteva za pomoc w tworzeniu mediów, Ning Wangowi z Cortevy za pomoc przy budowie Agrobacterium oraz Keunsub Lee z Uniwersytetu Stanowego Iowa za pomoc. Projekt ten był częściowo wspierany przez National Science Foundation Plant Genome Research Program Grant 1725122 i 1917138 dla K.W., przez Predictive Plant Phenomics Research Traineeship Program (National Science Foundation Grant DGE-1545453) dla J.Z., przez projekt USDA NIFA Hatch #IOW04341, przez fundusze stanu Iowa oraz przez Centrum Bioinżynierii Upraw Uniwersytetu Stanowego Iowa.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2,4-DMillipore SigmaD7299
6-Benzylaminopurine (BAP)Millipore SigmaB3408
AcetosyringoneMillipore SigmaD134406
AgarMillipore SigmaA7921
Foliaaluminiowa Do przykrycia kolby
Siarczan amonuMillipore SigmaA4418
WagaDo ważenia małych ilości chemikaliów
AutocalvePrimus (Omaha, NE)PSS5-KDo autoklawowania pożywek i narzędzi Pętla
hodowli bakteryjnych (10 µ l)Fisher scientific22-363-597Zbiera Agrobacterium z płytki w celu przeniesienia do płynu
BactoagarBD bioscience214030
Zlewki (1 L, 2 L, 4 L)Do mieszania chemikaliów do pożywki
BenomylMillipore Sigma# 45339
Wybielacz (8,25% podchloryn sodu)CloroxDo sterylizacji nasion
Kwas borowyMillipore SigmaB6768
Dwuwodny chlorek wapniaMillipore SigmaC7902
KarbenicylinaMilipora SigmaC3416
Hydrolizat kazeinyPhytotechC184
CefotaksymPhytotechC380
Rurka stożkowa (50 ml)Fisher scientific06-443-19Zawierają płynne podłoże i zawiesinę Agro
Kuweta (półmikro)Fisher scientific14955127Do przechowywania cieczy do pomiaru OD
DicambaPhytotechD159
HigrometrSprawdzanie temperatury i wilgotności do obróbki cieplnej
EDTA, sól disodowa, dihydratMillipore Sigma324503
probówka Eppendorfa (2.0 mL)ThermoFischer ScientificAM12475
Eriksson's VitaminsPhytotechE3301000x w płynnym
etanolu (70%)Narzędzia i powierzchnie do sterylizacji
Nawóz siarczanu żelazawego heptahydratMillipore SigmaF8263
, Osmocote Plus 15-9-12Nawozy specjalistyczne ICL (Dublin, OH)A903206Kolba nawozowa
(2 l)Pyrex10-090EDo autoklawowania mediów i narzędzi
Mieszkania (Standard 1020, otwarte z otworami, 11 "szer. x 21,37" dł. x 2,44 "gł.)Hummert International (Earth City, Mo)11300000Taca do przechowywania ziemi i wkładu doniczkowego, pasuje do kleszczyków Humidome
(z cienką końcówką i dużych)Dobra do przenoszenia zarodków; większa do dużych materiałów roślinnych i używana jako uchwyty
na uszyGentamycynaGold BiotechnologiesG-400
Butelka szklana (1 L)Pyrex06-414-1DDo autoklawowania podłoża
Cylinderpodziałką Do regulacji objętości pożywki
Inkubator ImazapyrMillipore Sigma37877,
20 ° CPercivalScientific Model I-36NLDo uprawy płytki matki i inkubacji zarodków podczas inkubatora infekcji agro,
27 &; CPercival ScientificModel I-36NLDo uprawy płytki do wspólnej uprawy i hodowli zarodków kukurydzy
Inkubator, 45 & CObróbka szokiem cieplnym
Wkładka TO Standard, doniczkiHummert International (Earth City, Mo)11030000Do przesadzania roślin od ukorzenienia do gleby, pasuje do płaskiego i Humidome
OkapUtrzymuje sterylne warunki
L-prolinaPhytotechP698
Siarczan magnezu siedmiowodnyMillipore SigmaM1880
Nasiona wsobne kukurydzy B73U.S National Plant Germplasmid=47638
Nasiona wsobne kukurydzy Mo17U.S National PlantGermplasm id=15785
Nasiona wsobne kukurydzy W22U.S National Plant Germplasmid=61755
Monohydrat siarczanu manganuMillipore SigmaM7899
Systemy oczyszczaniawody Milli-QMillipore sigmaMILLIQDo wody klasy hodowli tkankowej
MS Basal MediumMillipore SigmaM5519
MS Mieszanina soli bazalnejMillipore SigmaM5524
N6 Mieszanka soli bazowejMillipore SigmaC1416
Spinacze do papieru, antypoślizgoweTrzymanie na torbach z frędzlami
PeptoneBD bioscience211677
szalka Petriego (100x15 mm)Fisher scientificFB0875713Do podłoża do hodowli bakterii
szalka Petriego (100x25 mm)Fisher scientificFB0875711Do pożywki do hodowli tkanek roślinnych
pH-metrFisher scientificAB150Do regulacji pH pożywki
Pipeta (1 ml)ThermoFischer Scientific4641100N
Pudełka plastikoweMagazyn kontenerowy10048430Do przechowywania i inkubacji kultur tkankowych
Plastikowa kopuła wilgotna (Humi-Dome)Hummert International (Earth City, Mo)14385100Plastikowa osłona do płaskiej gleby
Jodek potasuMillipore Sigma793582
Azotan potasuMillipore SigmaP8291
Fosforan potasu MonobasicMillipore Waga SigmaP5655
Do ważenia chemikaliów do mediów
Witamina Hildebrandt (S& H witamina)PhytotechS826100x proszek
NożyczkiCięcie pędów uszu
Torba na pędy (Płótno półprzezroczyste)Seedburo (Des Plaines, IL)S26Półprzezroczysta torba do zakrywania pędów uszu
Azotan srebraMillipore SigmaS7276
Molibdenian sodu dwuwodnyMillipore SigmaM1651
Podłoże bezsobowe LC1SunGro Horticulture (Agawam, Ma)#521Do uprawy roślin kukurydzy
Szpatułka (dwustronna mikrostożkowa)Fischer Scientific2140110Wycinanie zarodków z ziaren
Szpatułka (z łyżką)Fisher scientific14-375-10Do pomiaru chemikaliów do pożywek
SpectinomycinMillipore SigmaS4014
Spektrofotometr (Genesys 10S UV-Vis)Thermo Scientific840-300000Pomiar OD zawiesiny Agro
MieszadłoFisher scientific14-513-67Do mieszania mediów
Mieszanie płyt grzejnychDo mieszania mediów
Strzykawka (bez igły, 60 mL)Fisher scientific14-823-43Do sterylizacji filtra
Filtr strzykawkowy (0,22 &mikro; m)Fisher scientific09-720-004Do sterylizacji filtrów
Worek z frędzlami (Płótno brązowe)Seedburo (Des Plaines, IL)T514Worek do przykrywania frędzli roślin nietransgenicznych
Worek z frędzlami (Płótno w zielony pasek)Seedburo (Des Plaines, IL)T514GWorek do zakrywania frędzli roślin transgenicznych
Tiamina HClPhytotechT390
ThidiazuronPhytotechT888
ThymidineMillipore SigmaT1895
TimentinPhytotechT869
Tween 20Fisher ScientificCas #9005-64-5środek powierzchniowo czynny
Vortex Genie 2Scientific IndustriesSI0236Homogenizuje ciecze (zawiesina Agro)
Kąpiel wodna (duża - model precyzyjny 186)Fisher scientifickażdy, który może zmieścić 4+ kolby 2L i osiągnąć 55 ° CUtrzymuje autoklawowane media w optymalnej temperaturze
Naczynie do ważeniaFisher scientific08-732-112Do pomiaru chemikaliów do mediów
Papier wagowyFisher scientific09-898-12ADo pomiaru chemikaliów do mediów
Ekstrakt drożdżowyFisher ScientificBP14222
ZeatinMillipore SigmaZ0164
analityczna cyfrowy z z przepływem laminarnym Ostrze skalpela (nr 11, 4 cm)Thermo Scientific 3120030 usunąć górną część koron ziaren w celu wypreparowania zarodków Rękojeść skalpela Trzymanie ostrzy skalpela Schenk &

Bibliografia

  1. Zhao, Z. Y., et al. High throughput genetic transformation mediated by Agrobacterium tumefaciens in maize. Molecular Breeding. 8 (4), 323-333 (2002).
  2. Green, C. E., Phillips, R. L. Plant regeneration from tissue cultures of maize. Crop Science. 15 (3), 417-421 (1975).
  3. Ji, Q., Xu, X., Wang, K. Genetic transformation of major cereal crops. International Journal of Developmental Biology. 57, 495-508 (2013).
  4. Frame, B., Warnberg, K., Main, M., Wang, K. Maize (Zea mays, L). Agrobacterium Protocols. Wang, K. , 3rd edition, Springer, USA. 101-117 (2015).
  5. Frame, B., et al. Improved Agrobacterium-mediated transformation of three maize inbred lines using MS salts. Plant Cell Reports. 25 (1), 1024-1034 (2006).
  6. Que, Q., et al. Maize transformation technology development for commercial event generation. Frontiers in Plant Science. 5 (379), (2014).
  7. Lowe, K. S., et al. Morphogenic regulators Baby boom and Wuschel improve monocot transformation. The Plant Cell. 28 (9), 1998-2015 (2016).
  8. Lowe, K. S., et al. Rapid genotypes independent maize transformation via direct somatic embryogenesis. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Plant. 54 (3), 240-252 (2018).
  9. Boutilier, K., et al. Ectopic expression of BABY BOOM triggers a conversion from vegetative to embryonic growth. The Plant Cell. 14 (8), 1737-1749 (2002).
  10. Zuo, J., Niu, Q. W., Frugis, G., Chua, N. H. The WUSCHEL gene promotes vegetative-to-embryonic transition in Arabidopsis. The Plant Journal. 30 (3), 349-359 (2002).
  11. Jones, T. J., et al. Maize transformation using the morphogenic genes Baby Boom and Wuschel2. Transgenic Plants. Kumar, S., Barone, P., Smith, M. , 81-93 (2019).
  12. Anand, A., et al. An improved ternary vector system for Agrobacterium-mediated rapid maize transformation. Plant Molecular Biology. 97 (1-2), 187-200 (2018).
  13. Ray, K., et al. Mutant acetolactate synthase gene is an efficient in vitro selectable marker for the genetic transformation of Brassica juncea (Oilseed Mustard). Journal of Plant Physiology. 161 (9), 1079-1083 (2004).
  14. Green, J. M., Hale, T., Pagano, M. A., Andreassi, J. L. II, Gutteridge, S. A. Response of 98140 corn with gat4621 and hra transgenes to glyphosate and ALS-inhibiting herbicides. Weed Science. 57 (2), 142-148 (2009).
  15. An, G., et al. Functional analysis of the 3' control region of the potato wound-inducible proteinase inhibitor II gene. The Plant Cell. 1 (1), 115-122 (1989).
  16. Matz, M. V., et al. Fluorescent proteins from nonbioluminescent Anthozoa species. Nature Biotechnology. 17 (10), 969-973 (1999).
  17. Passarinho, P., et al. Target Genes Provide Diverse Entry Points into Cell Proliferation and Cell Growth Pathways. Plant Molecular Biology. 68 (3), 225-237 (2008).
  18. Bhyri, P., Khrishnamurthy, N., Narayanan, E., Nott, A., Sarangi, R. R. Novel plant terminator sequences. Patent Number US2014/0130205. , (2014).
  19. Laux, T., Mayer, K. F., Berger, J., Jürgens, G. The WUSCHEL gene is required for shoot and floral meristem integrity in Arabidopsis. Development. 122 (1), 87-96 (1996).
  20. Garnaat, C., Lowe, K., Roth, B. Zm-AXIG1-specific polynucleotides and methods of use. Patent Number WO2002006499. , (2002).
  21. Hershey, H. P., Stoner, T. D. Isolation and characterization of cDNA clones for RNA species induced by substituted benzenesulfonamides in corn. Plant Molecular Biology. 17 (4), 679-690 (1991).
  22. Abremski, K., Hoess, R. Bacteriophage P1 site-specific recombination. Purification and properties of the Cre recombinase protein. Journal of Biological Chemistry. 259 (3), 1509-1514 (1984).
  23. Sun, A. Q., et al. Cloning and Function Analysis of Small Heat Shock Protein Gene ZmHSP17.7 from Maize. ACTA Agronomica Sinica. 41 (3), 414(2015).
  24. Sauer, B., Henderson, N. Site-specific DNA recombination in mammalian cells by the Cre recombinase of bacteriophage P1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (14), 5166-5170 (1988).
  25. Hershfield, V., Boyer, H. W., Yanofsky, C., Lovett, M. A., Helinski, D. R. Plasmid ColEl as a molecular vehicle for cloning and amplification of DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (9), 3455-3459 (1974).
  26. Liebert, C. A., Hall, R. M., Summers, A. O. Transposon Tn21, flagship of the floating genome. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 63 (3), 507-522 (1999).
  27. Nishiguchi, R., Takanami, M., Oka, A. Characterization and sequence determination of the replicator region in the hairy-root-inducing plasmid pRiA 4b. Molecular and General Genetics. 206 (1), 1-8 (1987).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

transformacja za pomoc Agrobacteriumniedojrza y embrion kukurydzyrekombinacja Cre loxProzw j embrion w somatycznychselekcja na oporno na herbicydyprotok transformacji genetycznejanaliza z wykorzystaniem mikroskopii fluorescencyjnejpo ywka do kultur tkankowychregeneracja ro lin
Transformacja niedojrzałych zarodków opornych linii wsobnych kukurydzy za pośrednictwem Agrobacterium przy użyciu genów morfogennych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.