Artykuł metodologiczny

Wykazanie liniowej zależności między czynnikiem wzrostu śródbłonka naczyń krwionośnych a hormonem luteinizującym w ekstraktach z kory nerkowej

DOI:

10.3791/60785

⸱

22 stycznia 2020

 ,  , 
1Zietchick Research Institute

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentowany tutaj jest protokół wykorzystania preparatu z ekstraktu z kory nerkowej i normalizacji białka całkowitego w celu wykazania korelacji między czynnikiem wzrostu śródbłonka naczyniowego a hormonem luteinizującym w nerkach ssaków.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Czynnik wzrostu śródbłonka naczyń krwionośnych (VEGF) pomaga kontrolować angiogenezę i przepuszczalność naczyń w nerkach. Zaburzenia nerek, takie jak nefropatia cukrzycowa, są związane z rozregulowaniem VEGF w nerkach. Czynniki, które rządzą VEGF w warunkach fizjologicznych w nerkach, nie są dobrze poznane. Hormon luteinizujący (LH), hormon proangiogenny, pomaga regulować fizjologiczną ekspresję VEGF w narządach rozrodczych. Biorąc pod uwagę, że receptory LH znajdują się w nerkach, my w Instytucie Badawczym Zietchick postawiliśmy hipotezę, że LH pomaga również regulować ekspresję VEGF w nerkach. Aby dostarczyć dowodów, naszym celem było wykazanie, że poziomy LH są w stanie przewidzieć poziomy VEGF w nerkach ssaków. W większości badań związanych z VEGF dotyczących nerek jako modeli wykorzystywano ssaki niższego rzędu (tj. gryzonie i króliki). Aby przełożyć tę pracę na ludzkie ciało, zdecydowano się zbadać związek między VEGF i LH u ssaków wyższego rzędu (tj. modeli bydlęcych i wieprzowych). Protokół ten wykorzystuje całkowity lizat białka z kory nerkowej. Kluczem do sukcesu tej metody jest pobranie nerek od zwierząt rzeźnych bezpośrednio po śmierci, a także normalizacja poziomu analitu (w ekstrakcie nerkowym) przez białko całkowite. Badanie to z powodzeniem wykazało istotną liniową zależność między LH i VEGF zarówno w nerkach bydła, jak i świń. Wyniki są powtarzalne u dwóch różnych gatunków. Badanie dostarcza dowodów potwierdzających, że stosowanie ekstraktów nerkowych od krów i świń jest doskonałym, ekonomicznym i obfitym źródłem do badania fizjologii nerek, w szczególności do badania korelacji między VEGF a innymi analitami.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Czynnik wzrostu śródbłonka naczyń krwionośnych A (VEGF-A), pomaga regulować angiogenezę i przepuszczalność naczyń w nerkach i innych narządach1,2 (dalej VEGF-A będzie określany jako VEGF). Poziom VEGF w nerkach jest pod ścisłą kontrolą homeostatyczną. Gdy poziom VEGF w nerkach jest podwyższony lub obniżony, nerki mogą działać nieprawidłowo. Na przykład w ciągu 3 tygodni po urodzeniu myszy z heterozygotycznością specyficzną dla podocytów dla VEGF rozwijają śródbłonek i bezkrwiste kłębuszki nerkowe (tj. zmiany w nerkach obserwowane w ludzkim stanie przedrzucawkowym), a schyłkowa niewydolność nerek występuje u tych heterozygot w wieku 3 miesięcy. Homozygotyczne nokauty specyficzne dla podocytów umierają z powodu wodniaka i niewydolności nerek w ciągu 1 dnia od urodzenia3,4.

Z drugiej strony, nadekspresja nerkowego VEGF powoduje białkomocz i przerost kłębuszków nerkowych3,4. Na przykład transgeniczne króliki, które wykazują nadekspresję VEGF, wykazują postępujący białkomocz ze zwiększonymi wskaźnikami filtracji kłębuszkowej we wczesnych stadiach nefropatii, a następnie zmniejszonymi wskaźnikami filtracji kłębuszkowej w późniejszych stadiach3. Nefropatia cukrzycowa, główna przyczyna schyłkowej niewydolności nerek u dorosłych chorych na cukrzycę, jest silnie związana z rozregulowaniem VEGF2,5. Dużo uwagi poświęcono roli hipoksji w indukowaniu ekspresji VEGF w warunkach patologicznych5. Jednak czynniki rządzące VEGF w warunkach fizjologicznych (zarówno w nerkach, jak i innych narządach) nie są dobrze poznane2,6. Zidentyfikowanie tych czynników (z wyjątkiem tlenu), które są zaangażowane w fizjologiczną i patologiczną regulację VEGF, jest ważnym przedsięwzięciem.

Hormon luteinizujący (LH), hormon pro-angiogenny, pomaga regulować fizjologiczną ekspresję VEGF w narządach rozrodczych, takich jak jajnik i jądra7,8. Wcześniejsze badania dostarczyły dowodów na to, że LH pomaga również regulować VEGF w narządach nierozrodczych, takich jak oczy6,9,10. Receptory LH znajdują się w rdzeniu i korze nerki11,12. Warto zauważyć, że komórki nabłonka kanalików nerkowych, a także receptor LH, wyrażają VEGF11,12,13,14. Biorąc pod uwagę te dwie obserwacje, postawiliśmy hipotezę, że LH pomaga również regulować ekspresję VEGF w nerkach13,14. Aby dostarczyć dowodów na ten związek LH/VEGF, przedstawiony protokół ma na celu wykazanie, że poziomy LH są w stanie przewidzieć poziom VEGF w nerkach. Wiele wcześniejszych badań związanych z VEGF dotyczących nerek wykorzystywało modele ssaków niższego rzędu (tj. gryzoni i królików)2. Aby przełożyć tę pracę na ludzkie ciało, w badaniu zbadano związek między VEGF i LH u ssaków wyższego rzędu (w tym przypadku modele bydlęce i wieprzowe). Aby zrealizować ten cel, przygotowano całkowity lizat białkowy z obszaru kory nerek bydła i świni.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Do tego badania nie użyto żadnych żywych ani doświadczalnych zwierząt.

1. Obchodzenie się z tkankami

  1. Nerki bydła i świń należy pozyskiwać w całości bezpośrednio po uboju z rzeźni. Transport na lodzie do laboratorium.
  2. Po przybyciu do laboratorium przepłucz nerki 50 ml lodowatej soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Powtórz ten krok 2 razy, aby całkowicie usunąć krew.
  3. Nerki należy przechowywać na lodzie (lub w lodówce) do czasu dalszej ekstrakcji.

2. Rozwarstwienie nerek

  1. Użyj sterylnych nożyczek, kleszczy, noża i szalek Petriego, aby wyciąć nerki i wyciąć wymaganą część tkanki.
  2. Przygotować bufor do lizy RIPA przed rozwarstwieniem nerki. Rozpuść 5 mM NaCl, 0,5 M EDTA, 1 M Tris (pH = 8,0), NP-40 (ID + GEPAL CA-630), 10% deoksycholanu sodu i 10% SDS w podwójnie destylowanej wodzie, a następnie dokładnie wymieszaj. Bufor do lizy RIPA należy przechowywać w lodówce, gdy nie jest używany.
  3. Delikatnie przeciąć nerkę na pół (płaszczyzna strzałkowa) i wyciąć kawałek tkanki (50-70 mm2) z obszaru kory w środku nerki (o wadze 80-100 mg mokrej masy).
  4. Zmiel blok tkanki na małe kawałki nożem, aby wspomóc proces homogenizacji.
  5. Po zmieleniu tkanek przenieś je do probówki do mikrofuge z 1 ml lodowatego buforu do ekstrakcji lizy 1x RIPA. Umieść probówki w lodzie do czasu dalszej ekstrakcji.

3. Homogenizacja tkanek

  1. Oznacz probówki do mikrofiltrów szczegółami próbki do pobrania supernatantu tkankowego.
  2. Za pomocą ręcznego homogenizatora ze sterylną sondą homogenizuj tkanki przez 1-2 minuty w niskich temperaturach (próbki na wiadrze z lodem), aż nie będą widoczne żadne kawałki tkanek.
  3. Ekstrakty tkankowe należy natychmiast poddać do odwirowania w wirówce z chłodzeniem o stężeniu 9 600 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  4. Wyjmij probówki z wirówki i umieść je w pojemniku na lód.
  5. Zebrać supernatant do nowej, oznakowanej probówki do mikrofuge i przechowywać na lodzie. Wyrzuć granulkę.
  6. Przygotować oddzielne podwielokrotności supernatantów odpowiednio do testów immunoenzymatycznych LH i VEGF-A (ELISA) i analizy białka całkowitego, aby uniknąć cykli zamrażania i rozmrażania.

4. Test ELISA bydła i trzody chlewnej

  1. Przechowywać wszystkie składniki testu ELISA zawarte w dostępnym w handlu zestawie ELISA hormonu luteinizującego (LH) (patrz tabela materiałów) w temperaturze 2-8 °C. Obejmuje to przeciwciało, koniugat HRP, płytkę testową (96 dołków), kalibratory, bufor do płukania (20x koncentrat), substrat A, substrat B i roztwór zatrzymujący. Przygotuj wszystkie odczynniki zgodnie z zaleceniami producenta.
  2. Przed rozpoczęciem testu doprowadzić wszystkie odczynniki i płytkę testową do temperatury pokojowej (RT). Do testu należy użyć wymaganej liczby studzienek, uszczelnić i przechowywać niewykorzystane studzienki w temperaturze 4 °C do momentu użycia.
  3. Rozcieńczyć bufor do przemywania (15 ml 20x koncentratu) do 300 ml wodą podwójnie destylowaną
  4. Ustaw puste studzienki bez żadnego rozwiązania.
  5. Dodać 50 μl wzorca lub próbki do każdej studzienki (n = 2), a następnie dodać kolejne 50 μl koniugatu peroksydazy chrzanowej (hrp) do każdej studzienki. Natychmiast dodaj kolejne 50 μl roztworu przeciwciał do każdej studzienki. Zamknąć płytkę, dobrze wymieszać i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
  6. Przemyć studzienki 1x buforem do płukania (200 μL/studzienkę) i powtórzyć 4x.
  7. Dodać 50 μl substratu A i 50 μl substratu B do każdej studzienki i dobrze wymieszać, delikatnie stukając płytką z boku. Szczelnie zamknąć płytkę i inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 °C w ciemności przez 15 minut.
  8. Dodać 50 μl roztworu zatrzymującego do każdej studzienki, delikatnie postukać w płytkę i odczytać płytkę za pomocą spektrofotometru ustawionego na długość fali 450 nm.
  9. Znormalizować stężenie LH u bydła i świń do białka całkowitego (patrz punkt 6).

5. Test ELISA VEGF-A dla bydła i trzody chlewnej

  1. Przechowuj wszystkie składniki testu ELISA zawarte w dostępnych na rynku zestawach ELISA z czynnikiem wzrostu śródbłonka naczyniowego A (patrz tabela materiałów) w temperaturze 2-8 °C. Obejmuje to przeciwciało, koniugat HRP, płytkę testową (96 dołków), kalibratory, bufor do płukania (20x koncentrat), substrat A, substrat B i roztwór zatrzymujący. Przygotuj wszystkie odczynniki zgodnie z zaleceniami producenta.
  2. Przed rozpoczęciem testu przynieś wszystkie odczynniki i płytkę testową do RT. Użyj wymaganej liczby studzienek do testu, uszczelnij i utrzymuj niewykorzystane studzienki w temperaturze 4 °C do czasu użycia.
  3. Rozcieńczyć bufor do przemywania (15 ml 20x koncentratu) do 300 ml wodą podwójnie destylowaną
  4. Dodać 100 μl wzorca lub próbki do każdego dołka (n = 2). Zamknąć płytkę, dobrze wymieszać i inkubować przez 2 godziny w temperaturze 37 °C.
  5. Usunąć ciecz z każdej studzienki i dodać 100 μl odczynnika wykrywającego A do każdej studzienki, uszczelnić płytkę i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
  6. Przemyć studzienki 1x buforem do płukania (400 μL/studzienkę) i powtórzyć 4x.
  7. Dodaj 100 μl odczynnika wykrywającego B do każdej studzienki i dobrze wymieszaj, delikatnie stukając w płytkę z boku. Uszczelnić płytkę i inkubować płytkę przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
  8. Przemyć studzienki 1x buforem do płukania (400 μL/studzienkę) i powtórzyć 4x.
  9. Dodać 90 μl roztworu substratu do każdej studzienki, delikatnie postukać w płytkę i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
  10. Dodać 50 μl roztworu zatrzymującego do każdej studzienki, delikatnie postukać w płytkę i odczytać płytkę za pomocą spektrofotometru ustawionego na długość fali 450 nm.
  11. Znormalizować poziom VEGF-A u bydła i świń do białka całkowitego (sekcja 6).

6. Oszacowanie białka całkowitego

  1. Oszacować zawartość białka całkowitego w ekstraktach z nerek bydlęcych i świńskich za pomocą standardowego testu albuminy surowicy bydlęcej (BSA) przy użyciu zestawu handlowego (patrz tabela materiałów) zgodnie z zaleceniami producenta.

7. Analiza statystyczna

  1. Obliczyć średnią, medianę i odchylenie standardowe każdego analitu.
  2. Przetestuj rozbieżność rozkładu próbki od normalnej, korzystając z testu Kołmogorowa-Smirnowa, aby zdecydować, po użyciu, między parametrycznymi i nieparametrycznymi testami statystycznymi. Jeśli dane mają rozkład normalny, należy przeprowadzić testy statystyczne za pomocą testów parametrycznych.
  3. W odpowiednich okolicznościach (takich jak normalny rozkład danych) wykorzystaj modele regresji do zbadania liniowej zależności między LH i VEGF-A.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Średnie i mediany poziomów LH i VEGF według typu zwierzęcia i płci są pokazane w Tabeli 1. Po zweryfikowaniu normalności danych za pomocą testów normalności Kołmogorowa-Smirnowa, wykorzystano modele regresji liniowej do zbadania zależności między LH i VEGF. Stwierdzono, że LH jest silnym i istotnym predyktorem VEGF zarówno w nerkach bydła, jak i świń (model nerki bydła: n = 7, R2 = 0,86, p = 0,002; model nerki świni: n = 7; R2 = 0,66, p = 0,025).

...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pozyskanie nerek z rzeźni natychmiast po śmierci zwierzęcia jest kluczem do sukcesu w tej metodologii. Jest to główna zaleta wykorzystywania narządów od krów i świń zamiast ludzkich zwłok. Zwykle od momentu śmierci do pozyskania narządów ze zwłok ludzkich występuje co najmniej 12-24 godzinne opóźnienie. Ze względu na to, że skład chemiczny narządów ciała zmienia się znacząco w ciągu 2 godzin po sekcji zwłok 15,16, badania VEGF na nerkach ludzkich zwłok mogą nie o...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zietchick Research Institute (ZRI) jest prywatnym (nastawionym na zysk) instytutem badawczym, a dr Tammy Movsas (założycielka i dyrektor ZRI) ma oczekujące zgłoszenia patentowe i zatwierdzone patenty na stosowanie antagonistów gonadotropin w leczeniu chorób oczu i cukrzycy. Poza tym, że jest pracownikiem (biochemikiem) w ZRI, dr A. Muthusamy nie ma żadnych innych konfliktów finansowych do zgłoszenia. A. Arivalagan (letni stażysta w ZRI, student studiów licencjackich na Uniwersytecie Michigan) nie ma innych konfliktów finansowych do zgłoszenia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują Scholl's Slaughterhouse (Blissfield, MI) za dostarczenie nerek bydlęcych i wieprzowych. Na to badanie nie wykorzystano żadnych dotacji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Bydlęcy zestaw LH ELISAMyBiosource, San Diego, Kalifornia.
Bydlęcy zestaw VEGF-A ELISAMyBiosource, San Diego, Kalifornia.
Zestaw do oznaczania białek Micro BCAThermoFisher Scientific Inc, Columbus, OH.23235
Zestaw ELISA dla świń LHMyBiosource, San Diego, Kalifornia.
Świnia VEGF-A ELISARay Biotech, Norcross, GA.ELP-VEGFA-1
RIPA Bufor do lizy i ekstrakcjiThermoFisher Scientific Inc, Columbus, OH.Numer katalogowy: 89901
MBS700951MBS2887434MBS009739

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Advani, A., et al. Role of VEGF in maintaining renal structure and function under normotensive and hypertensive conditions. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 104 (36), 14448-14453 (2007).
  2. Majumder, S., Advani, A. VEGF and the diabetic kidney: More than too much of a good thing. Journal of Diabetes and its Complications. 31 (1), 273-279 (2017).
  3. Liu, E., et al. Increased expression of vascular endothelial growth factor in kidney leads to progressive impairment of glomerular functions. Journal of the American Society of Nephrology. 18 (7), 2094-2104 (2007).
  4. Eremina, V., et al. Glomerular-specific alterations of VEGF-A expression lead to distinct congenital and acquired renal diseases. Journal of Clinical Investigation. 111 (5), 707-716 (2003).
  5. Ferrara, N. Vascular endothelial growth factor: basic science and clinical progress. Endocrine Reviews. 25 (4), 581-611 (2004).
  6. Movsas, T. Z., Sigler, R., Muthusamy, A. Vitreous Levels of Luteinizing Hormone and VEGF are Strongly Correlated in Healthy Mammalian Eyes. Current Eye Research. 43 (8), 1041-1044 (2018).
  7. Babitha, V., et al. Luteinizing hormone, insulin like growth factor-1, and epidermal growth factor stimulate vascular endothelial growth factor production in cultured bubaline granulosa cells. General and Comparative Endocrinology. 198, 1-12 (2014).
  8. Trau, H. A., Davis, J. S., Duffy, D. M. Angiogenesis in the Primate Ovulatory Follicle Is Stimulated by Luteinizing Hormone via Prostaglandin E2. Biology of Reproduction. 92 (1), 15(2015).
  9. Movsas, T. Z., et al. Confirmation of Luteinizing Hormone (LH) in Living Human Vitreous and the Effect of LH Receptor Reduction on Murine Electroretinogram. Neuroscience. 385, 1-10 (2018).
  10. Movsas, T. Z., Sigler, R., Muthusamy, A. Elimination of Signaling by the Luteinizing Hormone Receptor Reduces Ocular VEGF and Retinal Vascularization during Mouse Eye Development. Current Eye Research. 43 (10), 1286-1289 (2018).
  11. Hipkin, R. W., Sanchez-Yague, J., Ascoli, M. Identification and characterization of a luteinizing hormone/chorionic gonadotropin (LH/CG) receptor precursor in a human kidney cell line stably transfected with the rat luteal LH/CG receptor complementary DNA. Molecular Endocrinology. 6 (12), 2210-2218 (1992).
  12. Lei, Z. M., et al. Targeted disruption of luteinizing hormone/human chorionic gonadotropin receptor gene. Molecular Endocrinology. 15 (1), 184-200 (2001).
  13. Schrijvers, B. F., Flyvbjerg, A., De Vriese, A. S. The role of vascular endothelial growth factor (VEGF) in renal pathophysiology. Kidney International. 65 (6), 2003-2017 (2004).
  14. Apaja, P. M., Aatsinki, J. T., Rajaniemim, H. J., Petaja-Repo, U. E. Expression of the mature luteinizing hormone receptor in rodent urogenital and adrenal tissues is developmentally regulated at a posttranslational level. Endocrinology. 146 (8), 3224-3232 (2005).
  15. Ondruschka, B., et al. Post-mortem in situ stability of serum markers of cerebral damage and acute phase response. International Journal of Legal Medicine. 133 (3), 871-881 (2019).
  16. Swain, R., et al. Estimation of post-mortem interval: A comparison between cerebrospinal fluid and vitreous humour chemistry. Journal of Forensic and Legal Medicine. 36, 144-148 (2015).
  17. Thompson, C. S., Traynor, I. M., Fodey, T. L., Faulkner, D. V., Crooks, S. R. H. Screening method for the detection of residues of amphenicol antibiotics in bovine, ovine and porcine kidney by optical biosensor. Talanta. 172, 120-125 (2017).
  18. Konstantinou, G. N. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA). Methods in Molecular Biology. 1592, 79-94 (2017).
  19. Levesque, B. M., et al. Low urine vascular endothelial growth factor levels are associated with mechanical ventilation, bronchopulmonary dysplasia and retinopathy of prematurity. Neonatology. 104 (1), 56-64 (2013).
  20. Leviton, A., et al. Antecedents and early correlates of high and low concentrations of angiogenic proteins in extremely preterm newborns. Clinica Chimica Acta. 471, 1-5 (2017).
  21. Simo-Servat, O., Hernandez, C., Simo, R. Usefulness of the vitreous fluid analysis in the translational research of diabetic retinopathy. Mediators of Inflammation. , 872978(2012).
  22. Sharma, R. K., Rowe-Rendleman, C. L. Validation of molecular and genomic biomarkers of retinal drug efficacy: use of ocular fluid sampling to evaluate VEGF. Neurochemical Research. 36 (4), 655-667 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Analiza zale no ci liniowejmodele bydl ce i wi skienormalizacja ca kowitego bia kaprotok analizy ELISAmetoda sekcji tkanekodczyt spektrofotometrycznybadanie fizjologii nerek

Powiązane artykuły