Artykuł metodologiczny

Podejście oparte na mikroskopii przyżyciowej do oceny przepuszczalności jelit i wydajności wydalania komórek nabłonkowych

5.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60790

⸱

3 grudnia 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Medical Clinic 1, University of Erlangen-Nuremberg, University Hospital of Erlangen, 2Norwich Medical School, University of East Anglia, Norwich Research Park

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Korzystając z mikroskopii przyżyciowej, przedstawiona tutaj metoda umożliwia wizualizację w czasie rzeczywistym wydalania komórek nabłonka jelitowego u żywych zwierząt. W związku z tym miejscowo wybarwiona błona śluzowa jelit (akryflawina i rodamina B-dekstran) znieczulonych myszy jest obrazowana do rozdzielczości pojedynczej komórki za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Streszczenie

Mikroskopia przyżyciowych jelit za pomocą obrazowania konfokalnego pozwala na obserwację w czasie rzeczywistym złuszczania komórek nabłonkowych i przeciekania bariery u żywych zwierząt. Dlatego błona śluzowa jelit znieczulonych myszy jest miejscowo barwiona niespecyficznym barwnikiem (akryflawina) i znacznikiem fluorescencyjnym (dekstran rodaminy-B), zamontowana na płytce płukanej roztworem soli fizjologicznej i bezpośrednio obrazowana za pomocą mikroskopu konfokalnego. Technika ta może uzupełniać inne nieinwazyjne techniki identyfikacji nieszczelności przepuszczalności jelit, takie jak przezśluzówkowe znaczniki podawane doustnie. Poza tym przedstawione tutaj podejście pozwala na bezpośrednią obserwację zdarzeń wydalania komórek w czasie rzeczywistym. W połączeniu z odpowiednimi fluorescencyjnymi myszami reporterowymi, podejście to nadaje się do rzucania światła na mechanizmy komórkowe i molekularne kontrolujące wytłaczanie komórek nabłonka jelitowego, a także na inne procesy biologiczne. W ostatnich dziesięcioleciach interesujące badania z wykorzystaniem mikroskopii przyżyciowej przyczyniły się do poszerzenia wiedzy na temat m.in. przepuszczalności śródbłonka, naprowadzania jelit komórek odpornościowych, komunikacji immunologiczno-nabłonkowej i inwazji składników świetlnych. Przedstawiony tutaj protokół nie tylko pomógłby lepiej zrozumieć mechanizmy kontrolujące wytłaczanie komórek nabłonka, ale mógłby również stanowić podstawę do opracowania innych podejść, które mogłyby być wykorzystywane jako instrumenty do wizualizacji innych wysoce dynamicznych procesów komórkowych, nawet w innych tkankach. Wśród ograniczeń technicznych, właściwości optyczne konkretnej tkanki, a także wybrana technologia obrazowania i konfiguracja mikroskopu, decydowałyby z kolei o odległości roboczej obrazowania i rozdzielczości pozyskiwanych obrazów.

Wprowadzenie

Jelito jest wysoce wyspecjalizowanym organem o ściśle regulowanej funkcji, umożliwiającej sprzeczne procesy, a mianowicie odżywianie i ochronę przed szkodliwymi substancjami świetlnymi. Nabłonek jelitowy, znajdujący się pomiędzy ludzkim ciałem a środowiskiem, działa jako bariera fizyczna i immunologiczna oraz przyczynia się do utrzymania homeostazy błony śluzowej w jelitach1,2. Utrata integralności nabłonka i zwiększona przepuszczalność połączeń ścisłych jest dobrze znana jako związana z nieswoistym zapaleniem jelit (IBD)3,4,5,6. Zmiany nabłonkowe są następnie uważane za przyczyny i wtórne wzmacniacze przewlekłego zapalenia jelit w IBD. W związku z tym lepsze zrozumienie wczesnych zmian nabłonkowych w jelitach pacjentów z IBD miałoby ogromną wartość dla opracowania nowych strategii przywracania integralności nabłonka w celu wiarygodnego przewidywania i późniejszego zapobiegania nawrotom IBD.

Nabłonek jelitowy podlega złożonemu i ściśle regulowanemu procesowi obrotu. Z dna krypty terminalnie zróżnicowane komórki nabłonka jelitowego (IEC) pochodzące z pluripotencjalnych komórek macierzystych migrują w górę do końca kosmków, gdzie stare/uszkodzone komórki są zrzucane do lumen7. Równowaga między podziałem a ekstruzją komórek umożliwia utrzymanie liczby komórek nabłonka jelitowego, unikając tworzenia się luk i wycieków, a także akumulacji komórek nabłonkowych, co może prowadzić do powstania mas komórkowych i nowotworzenia8,9,10. Pomimo kluczowej roli złuszczania komórek nabłonkowych w fizjologicznej odnowie nabłonka jelitowego, wiedza na temat mechanizmów molekularnych kierujących ekstruzją komórek na końcu kosmków jest ograniczona. W związku z tym istnieje potrzeba badań podstawowych zapewniających precyzyjny opis sekwencji zdarzeń molekularnych związanych z złuszczaniem komórek nabłonkowych.

Złożone interakcje między różnymi typami komórek w błonie śluzowej jelit są kluczowe dla zrozumienia molekularnych mechanizmów regulujących obrót nabłonkowy i homeostazę jelit. W związku z tym badania in vivo oferują w tym kontekście duże korzyści w porównaniu z podejściami in vitro i ex vivo. Co więcej, techniki obrazowania w czasie rzeczywistym pozwalają na opisanie sekwencji zdarzeń sterujących określonymi zjawiskami. W tym kontekście badanie wysoce dynamicznych procesów wymaga zastosowania zoptymalizowanych technik o wysokiej rozdzielczości do bezpośredniej obserwacji tkanki. Techniki obrazowania przyżyciowego wydają się być wyjątkowymi odpowiednimi narzędziami do badania złuszczania komórek nabłonkowych w jelitach.

Termin "mikroskopia przyżyciowe" odnosi się do podejść eksperymentalnych wykorzystujących techniki obrazowania o wysokiej rozdzielczości (mikroskopia wielofotonowa lub konfokalna) do bezpośredniej wizualizacji komórek i tkanek w ich naturalnym otoczeniu w obrębie żywego zwierzęcia11. Umożliwia pozyskiwanie informacji in vivo w czasie rzeczywistym do rozdzielczości pojedynczej komórki i zapewnia wyraźną przewagę nad metodami statycznymi lub o niskiej rozdzielczości. Mikroskopia przyżyciowa dostarcza informacji uzupełniających i pozwala przezwyciężyć pewne ograniczenia wynikające z technik klasycznych i/lub zaawansowanych technik, takich jak artefakty wynikające z przetwarzania tkanek. Natomiast głównym ograniczeniem mikroskopii przyżyciowej jest to, że tkanka powinna być bezpośrednio wystawiona na działanie mikroskopu, co w większości przypadków wymaga operacji. Chociaż wyrafinowane podejścia zachowują witalność i minimalizują wpływ obrazowanej tkanki (komory fałdów skórnych i okna obrazowania)12,13, w większości przypadków wykonuje się proste nacięcie skóry w celu eksternalizacji tkanki (płaty skóry)14. W ciągu ostatniej dekady podejścia te dostarczyły kluczowych dowodów na istnienie wysoce dynamicznych procesów, które wcześniej były nieodgadnione. Pod względem translacyjnym obrazowanie w czasie rzeczywistym dostarczyło nowych informacji biologicznych na temat komórek macierzystych i leukocytów homing15, a także rozprzestrzeniania się raka i tworzenia przerzutów13,16. W kontekście klinicznym endomikroskopia jest obecnie wykorzystywana jako narzędzie diagnostyczne raka17 oraz chorób przewodu pokarmowego, takich jak IBD18,19; podczas gdy konfokalna mikroskopia mozaikowa stała się szybkim narzędziem patologii podczas operacji20. Mikroskopia przyżyciowa stała się ostatnio cennym i wszechstronnym narzędziem do badań biomedycznych i przyszłego zastosowania w klinice.

Mikroskopia przyżyciowe jest tutaj zaimplementowana do wizualizacji w czasie rzeczywistym przecieku nabłonka jelitowego i obserwacji zdarzeń złuszczania komórek nabłonkowych. Nieszczelność przepuszczalności jelit można zidentyfikować za pomocą innych nieinwazyjnych technik in vivo, takich jak kwantyfikacja doustnego podawania znaczników fluorescencyjnych w surowicy21. Jednak technika ta nie pozwala na bezpośrednią obserwację wydajności linienia ani na segregację między przepuszczalnością para- i transkomórkową. Połączenie standardowych eksperymentów ze znacznikami i mikroskopii przyżyciowej stanowi odpowiednie podejście do: i) identyfikacji zaburzeń przepuszczalności jelit oraz ii) segregacji między przepuszczalnością nabłonka przy- i transkomórkowego. Oprócz wydalania komórek, mikroskopia przyżyteczna w połączeniu ze znakowaniem fluorescencyjnym in vivo umożliwia badanie innych mechanizmów komórkowych i molekularnych (np. redystrybucja połączeń ścisłych podczas wydalania komórek przy użyciu fluorescencyjnych myszy reporterowych22 lub interakcje między IEC a innymi komórkami w błonie śluzowej jelit23).

Przedstawiona tutaj metoda stanowi adaptację mikroskopii przyżyciowej do obserwacji błony śluzowej jelit w czasie rzeczywistym, przy użyciu konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej (CLSM). Dlatego używamy myszy z warunkowym nokautem GGTazy (geranylgeranylotransferazy) w komórkach nabłonka jelitowego (IEC) u myszy (Pggt1biΔIEC), ponieważ cierpią one na ciężką chorobę jelit i zwiększoną przepuszczalność nabłonka24. Opisano chirurgiczne przygotowanie myszy i barwienie błony śluzowej jelit, a także odpowiednie ustawienia stosowane do akwizycji obrazowej i analizy po nabyciu. Protokół ten może umożliwić przyszłe badania przyczyniające się do poszerzenia obecnej wiedzy na temat dynamiki i kinetyki złuszczania komórek nabłonka jelitowego. Co więcej, protokół może służyć jako podstawa do różnych adaptacji do badania innych zjawisk zachodzących na powierzchni błony śluzowej jelit, a nawet w innych tkankach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Następujący protokół został zatwierdzony przez odpowiednie władze lokalne w Erlangen (Regierung von Unterfranken, Würzburg, Niemcy). Myszy trzymano w określonych warunkach wolnych od patogenów.

UWAGA: Hamowanie prenylacji za pośrednictwem GGTazy w obrębie IEC powoduje poważną zmianę przepuszczalności jelit u myszy Pggt1biΔIEC24. Dlatego ten mysi model został wykorzystany do zademonstrowania, w jaki sposób protokół może być przydatny do badania wad bariery jelitowej. Jednak protokół ten może być wykorzystany do badania dowolnej innej linii myszy.

1. Przygotowanie chirurgiczne i barwienie błony śluzowej jelit myszy

UWAGA: Przygotowanie chirurgiczne opiera się na wcześniej opisanych protokołach25. Podczas przygotowania chirurgicznego trzymaj znieczuloną mysz pod czerwoną lampą, aby uniknąć spadku temperatury ciała.

  1. Znieczulić mysz przez dootrzewnowe wstrzyknięcie ketaminy/ksylazyny (96 mg/kg ketaminy i 12,8 mg/kg ksylazyny). Sprawdź znieczulenie, sprawdzając, czy nie ma odruchu powiekowego.
  2. Nałóż krem ochronny pod oczy za pomocą wacika.
  3. Wykonaj nacięcie (1 cm) w lewej okolicy brzusznej za pomocą standardowych kleszczy i prostych cienkich nożyczek.
  4. Zewnętrznij odcinek jelita (około 5-7 cm).
  5. Otworzyć zewnętrzny odcinek jelita wzdłużnie przez elektrokauteryzację po stronie antykrezkowej.
  6. Odsłoń błonę śluzową i krótko spłucz roztworem soli fizjologicznej, aby usunąć zawartość kału.
    UWAGA: Opcjonalnie nałóż ksylazynę bezpośrednio na jelito, aby uniknąć artefaktów ruchowych spowodowanych perystaltyką.
  7. Zabarwić powierzchnię błony śluzowej jelit akryflawiną i dekstranem rodaminy-B (10 kDa).
    1. Nanieść 1 mg/ml roztworu akryflawiny (100 μl), pipetując kropla po kropli na błonę śluzową i inkubować przez 3 minuty. Wypłukać pozostały roztwór za pomocą PBS.
    2. Nanieść roztwór 2 mg/ml rodaminy i dekstranu (100 μl), pipetując kropla po kropli, na błonę śluzową i inkubować przez 3 minuty. Wypłukać pozostały roztwór za pomocą PBS.
      UWAGA: Opcjonalnie należy usunąć krew z preparatu za pomocą aseptycznej bawełny.
  8. Umieścić znieczuloną mysz na wznak na szkiełku nakrywkowym zamontowanym w komorze przepłukanej wstępnie podgrzanym roztworem soli fizjologicznej (37 °C).
    UWAGA: Otwarty segment jelita jest następnie umieszczany powierzchnią światła w dół, na szkiełku nakrywkowym.
  9. Umieść preparat (znieczuloną mysz w komorze) na odwróconym stoliku mikroskopowym.
  10. Przykryj zwierzę podkładką izotermiczną (ok. 37 °C).
  11. Natychmiast należy przystąpić do mikroskopii przyżyciowej.
    UWAGA: Preparat chirurgiczny należy przepłukać wstępnie podgrzanym roztworem soli fizjologicznej, aby uniknąć odwodnienia tkanki i śmierci komórek.

2. Mikroskopia przyżyciowa

UWAGA: Wykonaj krok 2.1 przed rozpoczęciem przygotowań chirurgicznych, aby uniknąć długiego czasu oczekiwania między znieczuleniem, operacją i akwizycją obrazu. W razie potrzeby zwierzętom przygotowanym chirurgicznie można podać dodatkowe dawki środków znieczulających, aby utrzymać je w znieczuleniu do eksperymentów obrazowych.

  1. Skonfiguruj mikroskop CLSM.
    1. Uruchom mikroskop CLSM, włączając podstawę mikroskopu i skrzynkę skanera. Włącz komputer, naciskając przycisk Start.
    2. Uruchom oprogramowanie do akwizycji obrazu (np. LAS X), klikając dwukrotnie ikonę. Wybierz odpowiednią konfigurację (Konfiguracja: maszyna; Mikroskop: DMI6000) i kliknij przycisk OK.
      1. Zdefiniuj odpowiednią rozdzielczość. Przejdź do punktu menu Konfiguracja | Sprzęt komputerowy | Rezolucja | Głębia bitowa. Wybierz pozycję 12.
    3. Przejdź do menu Pozyskiwanie. Wybierz xyzt jako tryb akwizycji obrazu z menu rozwijanego. Wybierz obiektyw z menu rozwijanego (20x lub 40x).
    4. Projektowanie ustawienia akwizycji sekwencyjnej. Kliknij Sekwencja. Dodaj drugą sekwencję, klikając przycisk dodawania (+). Wybierz opcję Między klatkami.
      1. Konfiguracja Sekwencja 1 (wykrywanie akryflawiny; wzbudzenie 416 nm; emisja 514 nm). Włącz widoczną skrzynkę laserową. Aktywuj PMT1 (WŁ.). Określ okno długości fali emisji (490-550 nm).
      2. Konfiguracja Sekwencja 2 (wykrywanie rodaminy B-dekstran; wzbudzenie 570 nm; 590 nm, emisja). Włącz widoczną skrzynkę laserową. Aktywuj PMT2 (WŁ.). Zdefiniuj okno długości fali emisji (550-760).
    5. Aktywuj odpowiednie lasery (488 i 552). Przejdź do punktu menu Konfiguracja | Lasery. Aktywuj lasery 488 i 552 nm (włącz).
  2. Dostosuj ustawienie do konkretnych funkcji bieżącego eksperymentu.
    1. Włącz źródło światła (naciśnij przycisk zasilania). Umieścić preparat (znieczuloną mysz w komorze) na stoliku mikroskopowym i zmieniać pozycję xy, aż oś oświetlenia skupi się na preparacie tkankowym.
    2. Wybierz pole zainteresowania za pomocą standardowego źródła światła i okularów.
      1. Wybierz kostkę filtrującą (I3). Otwórz migawkę. Skoncentruj się na powierzchni błony śluzowej jelit za pomocą makro- i mikrokoła. Wyszukaj obszar, w którym można zwizualizować kilka kosmków w polu widzenia, zmieniając pozycję XY.
    3. Sprawdź, czy zabarwienie rodaminą i dekstranem jest również widoczne w tym obszarze. Wymień kostkę filtra (N2.1). Sprawdź obraz przez okulary.
    4. Rozpocznij pobieranie obrazu CLSM z oprogramowania. Zoptymalizuj ustawienia dla dwóch sekwencji.
      1. Wybierz opcję Sekwencja 1. Dostosuj moc, wzmocnienie i przesunięcie lasera dla sekwencji 1.
      2. Wybierz opcję Sekwencja 2. Dostosuj moc, wzmocnienie i przesunięcie lasera dla sekwencji 2.
    5. Zdefiniuj zakres stosu z.
      1. Otwórz menu rozwijane Z-stack. Skoncentruj się na powierzchni błony śluzowej za pomocą elementu sterującego osią z. Naciśnij przycisk Start.
      2. Skoncentruj się na dolnej granicy, w której sygnał jest nadal wykrywalny. Naciśnij przycisk End.
      3. Określ liczbę stosów z (10). Unikaj upływów czasu dłuższych niż 2 minuty przez dwa kolejne punkty czasowe.
    6. Zdefiniuj ustawienia czasu. Przejdź do menu Czas. Kliknij przycisk Minimalizuj. Wybierz opcję Pobieraj do momentu zatrzymania.
    7. Zdefiniuj średnią liniową. Wybierz pozycję Sekwencja 1. Wybierz opcję Średnia liniowa 2. Wybierz pozycję Sekwencja 2. Wybierz opcję Średnia liniowa 2.
  3. Uzyskaj odpowiednie obrazy.
    1. Wybierz Format (1024 x 1024) i Szybkość (400). Naciśnij przycisk Start.
    2. Naciśnij przycisk Stop po żądanym czasie pobierania obrazu.
  4. Zapisz plik. Przejdź do pozycji Project. Kliknij prawym przyciskiem myszy odpowiedni plik. Naciśnij Zapisz jako.
    1. Nazwij plik odpowiednio. Wybierz odpowiedni folder. Naciśnij Zapisz.
  5. Poddaj zwierzę eutanazji (zwichnięcie szyjki macicy) i w razie potrzeby pobierz tkanki do dalszej analizy.

3. Analiza obrazu: Określ szybkość wydalania komórek i nabłonek jelitowy

  1. Szybkość zrzucania komórek
    1. Uruchom oprogramowanie do akwizycji obrazu.
    2. Przejdź do pozycji Otwarte projekty. Wybierz odpowiedni plik.
    3. Określ całkowity czas pozyskiwania obrazu.
      1. Wybierz ostatni pełny stos z. Wybierz ostatnią pozycję Z z poprzednio wybranego punktu czasu. Odczytaj czas w prawym dolnym rogu ekranu (całkowity czas akwizycji obrazu).
    4. Wybierz kosmki.
      1. Wybierz odpowiednią pozycję stosu Z (powierzchnia kosmków, ale wystarczająco głęboka, aby uniknąć interferencji z już zrzuconymi komórkami i innymi składnikami obecnymi w świetle światła).
      2. Zmierz długość błony podstawnej. Wybierz narzędzie linijki. Podziel kosmki na kilka linii, aby zakryć lub narysować cały obwód kosmków. Dodaj różne wartości (całkowita długość błony podstawnej). Usuń segmenty narzędzia Miarka.
    5. Policz liczbę zdarzeń występujących w ciągu całego czasu trwania akwizycji obrazu.
      1. Podziel kosmki na segmenty o odpowiedniej wielkości. Analizuj sekwencję zdarzeń/segmentu, przesuwając pasek przez różne punkty czasowe. Dodawanie adnotacji do zidentyfikowanych zdarzeń zrzucania komórek.
    6. Oblicz liczbę zdarzeń zrzucania/czas/długość błony podstawnej, która wskazuje szybkość zrzucania komórek. Policz do 5 kosmków / wideo i co najmniej dwa filmy / mysz. Oblicz średnią z tych 10 pomiarów.
  2. Wyciek
    1. Wybierz kosmki.
    2. Wybierz odpowiednią pozycję stosu Z (powierzchnia kosmków, ale wystarczająco głęboka, aby uniknąć interferencji z już zrzuconymi komórkami i innymi składnikami obecnymi w świetle światła). Policz całkowitą liczbę komórek nabłonka/kosmków.
    3. Policz liczbę punktów wycieku (parakomórkowa obecność dekstranu rodaminy. Zdarzenie to ma charakter przejściowy, co można potwierdzić sprawdzając wcześniejsze i później pozyskane zdjęcia).
    4. Oblicz liczbę przecieków/całkowitą liczbę komórek nabłonka. Przeanalizuj 10 różnych kosmków/próbek/wideo i oblicz średnią liczbę przecieków i przepuszczalnych komórek/kosmków.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przedstawiony tutaj protokół opisuje podejście oparte na mikroskopii intravitalnej w celu wizualizacji przecieków nabłonka jelitowego oraz obserwacji procesu złuszczania komórek w jelitach w czasie rzeczywistym. W skrócie, myszy są znieczulane i poddawane przygotowaniu chirurgicznemu w celu odsłonięcia powierzchni błony śluzowej jelita cienkiego. Następnie komórki nabłonka jelitowego (IECs) są barwione poprzez miejscowe zastosowanie akryflawiny, podczas gdy luminalny dekstran z rodamyną B...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Chociaż jest to wyzwanie techniczne, metodologia oparta na mikroskopii przyżyciowej stanowi unikalne eksperymentalne podejście do wizualizacji wysoce dynamicznych procesów komórkowych w czasie rzeczywistym, takich jak wydajność wydalania komórek. Jak dotąd nie ma alternatywnego podejścia eksperymentalnego do wizualizacji ekstruzji komórek in vivo. Wierzymy, że protokół ten może przyczynić się do opisu różnych procesów komórkowych odgrywających rolę w utrzymaniu homeostazy jelit.

Prezentowana m...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Podziękowania

Badania prowadzące do tych wyników otrzymały finansowanie z Programu Ludzie (działania Marie Curie) w ramach umowy o grant REA nr 302170 Siódmego Programu Ramowego Unii Europejskiej (FP7/2007-2013); Interdyscyplinarnego Centrum Badań Klinicznych (IZKF) Uniwersytetu Erlangen-Norymberga; Centrum Badań Klinicznych TRR241 i Grupy Badań Klinicznych KFO257 Niemieckiej Rady ds. Badań Naukowych (DFG); oraz DFG.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Chlorowodorek akryflawinySigma AldrichA82511 mg/ml roztwór w podkładce
izotermicznej PBS DeltaphaseBrainTreeB-DP-PAD-Gemini
System kauteryzacjiBrainTreeB-GEM-5917-Ketamin
WDT9089.01.00
LAS XLeica--
LSM mikroskop SP8Leica--
PBSBiochromL182
Rodamina B dekstranInvitrogenD182410 000 kDa MW; roztwór 2 mg / ml
Standardowe kleszcze (Dumont SS)Fine Science Tools11203-23-Proste
drobne nożyczkiFine Science Tools14060-10-Tamoksyfen
Sigma AldrichT564850 mg / ml w etanol
XylazinBayer1320422

Bibliografia

  1. Buhner, S., et al. Genetic basis for increased intestinal permeability in families with Crohn's disease: role of CARD15 3020insC mutation? Gut. 55 (3), 342-347 (2006).
  2. Pastorelli, L., De Salvo, C., Mercado, J. R., Vecchi, M., Pizarro, T. T. Central Role of the Gut Epithelial Barrier in the Pathogenesis of Chronic Intestinal Inflammation: Lessons Learned from Animal Models and Human Genetics. Frontiers in Immunology. 4, 280(2013).
  3. Kiesslich, R., et al. Local barrier dysfunction identified by confocal laser endomicroscopy predicts relapse in inflammatory bowel disease. Gut. 61 (8), 1146-1153 (2012).
  4. Dourmashkin, R. R., et al. Epithelial patchy necrosis in Crohn's disease. Human Pathology. 14 (7), 643-648 (1983).
  5. Soderholm, J. D., et al. Augmented increase in tight junction permeability by luminal stimuli in the non-inflamed ileum of Crohn's disease. Gut. 50 (3), 307-313 (2002).
  6. Wittkopf, N., Neurath, M. F., Becker, C. Immune-epithelial crosstalk at the intestinal surface. American Journal of Gastroenterology. 49 (3), 375-387 (2014).
  7. van der Flier, L. G., Clevers, H. Stem cells, self-renewal, and differentiation in the intestinal epithelium. Annual Review of Physiology. 71, 241-260 (2009).
  8. Fan, Y., Bergmann, A. Apoptosis-induced compensatory proliferation. The Cell is dead. Long live the Cell! Trends in Cell Biology. 18 (10), 467-473 (2008).
  9. Ryoo, H. D., Gorenc, T., Steller, H. Apoptotic cells can induce compensatory cell proliferation through the JNK and the Wingless signaling pathways. Developmental Cell. 7 (4), 491-501 (2004).
  10. Rosenblatt, J., Raff, M. C., Cramer, L. P. An epithelial cell destined for apoptosis signals its neighbors to extrude it by an actin- and myosin-dependent mechanism. Current Biology. 11 (23), 1847-1857 (2001).
  11. Coste, A., Oktay, M. H., Condeelis, J. S., Entenberg, D. Intravital Imaging Techniques for Biomedical and Clinical Research. Cytometry A. , (2019).
  12. Sorg, H., Krueger, C., Vollmar, B. Intravital insights in skin wound healing using the mouse dorsal skin fold chamber. Journal of Anatomy. 211 (6), 810-818 (2007).
  13. Ritsma, L., et al. Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis. Science Translational Medicine. 4 (158), 158ra145(2012).
  14. Nakasone, E. S., et al. Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance. Cancer Cell. 21 (4), 488-503 (2012).
  15. Sipkins, D. A., et al. In vivo imaging of specialized bone marrow endothelial microdomains for tumour engraftment. Nature. 435 (7044), 969-973 (2005).
  16. Kienast, Y., et al. Real-time imaging reveals the single steps of brain metastasis formation. Nature Medicine. 16 (1), 116-122 (2010).
  17. Nguyen, V. X., Nguyen, C. C., De Petris, G., Sharma, V. K., Das, A. Confocal endomicroscopy (CEM) improves efficiency of Barrett surveillance. Journal of Interventional Gastroenterology. 2 (2), 61-65 (2012).
  18. Kiesslich, R., Goetz, M., Neurath, M. F. Confocal laser endomicroscopy for gastrointestinal diseases. Gastrointestinal Endoscopy Clinics of North America. 18 (3), 451-466 (2008).
  19. Kiesslich, R., et al. Chromoscopy-guided endomicroscopy increases the diagnostic yield of intraepithelial neoplasia in ulcerative colitis. Gastroenterology. 132 (3), 874-882 (2007).
  20. Krishnamurthy, S., et al. Confocal Fluorescence Microscopy Platform Suitable for Rapid Evaluation of Small Fragments of Tissue in Surgical Pathology Practice. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 143 (3), 305-313 (2019).
  21. Li, B. R., et al. In vitro and In vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability. Journal of Visualized Experiments. (140), (2018).
  22. Marchiando, A. M., et al. The epithelial barrier is maintained by in vivo tight junction expansion during pathologic intestinal epithelial shedding. Gastroenterology. 140 (4), 1208-1218 (2011).
  23. Hoytema van Konijnenburg, D. P., et al. Intestinal Epithelial and Intraepithelial T Cell Crosstalk Mediates a Dynamic Response to Infection. Cell. 171 (4), 783-794 (2017).
  24. Lopez-Posadas, R., et al. Rho-A prenylation and signaling link epithelial homeostasis to intestinal inflammation. Journal of Clinical Investigation. 126 (2), 611-626 (2016).
  25. Duckworth, C. A., Watson, A. J. Analysis of epithelial cell shedding and gaps in the intestinal epithelium. Methods in Molecular Biology. 763, 105-114 (2011).
  26. Watson, A. J., et al. Epithelial barrier function in vivo is sustained despite gaps in epithelial layers. Gastroenterology. 129 (3), 902-912 (2005).
  27. Haep, L., et al. Interferon Gamma Counteracts the Angiogenic Switch and Induces Vascular Permeability in Dextran Sulfate Sodium Colitis in Mice. Inflammatory Bowel Diseases. 21 (10), 2360-2371 (2015).
  28. Lopez-Posadas, R., et al. Inhibiting PGGT1B Disrupts Function of RHOA, Resulting in T-cell Expression of Integrin alpha4beta7 and Development of Colitis in Mice. Gastroenterology. , (2019).
  29. Fischer, A., et al. Differential effects of alpha4beta7 and GPR15 on homing of effector and regulatory T cells from patients with UC to the inflamed gut in vivo. Gut. 65 (10), 1642-1664 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Obrazowanie konfokalneznacznik fluorescencyjnybarwienie akryflawindekstran rodamanowyakwizycja serii Z Z stackmyszy z niedoborem GGTazyanaliza cytoszkieletu

Powiązane artykuły