Artykuł metodologiczny

Opracowanie modelu zakażenia larw danio pręgowanego w kierunku Clostridioides difficile

DOI:

10.3791/60793

⸱

14 lutego 2020

 ,  ,  ,  , 
1Division of Cellular and Molecular Neurobiology, Zoological Institute, Technische Universität Braunschweig, 2Department of Molecular Biotechnology, Turkish-German University, 3Institut für Mikrobiologie, Technische Universität Braunschweig, 4Braunschweig Integrated Centre of Systems Biology, 5Helmholtz Centre for Infection Research

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiona tutaj jest bezpieczna i skuteczna metoda infekowania larw danio pręgowanego fluorescencyjnie znakowanym beztlenowym C. difficile za pomocą mikroiniekcji i nieinwazyjnego mikrozgłębnika.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zakażenie Clostridioides difficile (CDI) jest uważane za jedną z najczęstszych infekcji żołądkowo-jelitowych związanych z opieką zdrowotną w Stanach Zjednoczonych. Opisano wrodzoną odpowiedź immunologiczną przeciwko C. difficile, ale dokładna rola neutrofili i makrofagów w CDI jest mniej poznana. W obecnym badaniu larwy danio pręgowanego wykorzystano do ustanowienia modelu infekcji C. difficile do obrazowania zachowania i współpracy tych wrodzonych komórek odpornościowych in vivo. W celu monitorowania C. difficile ustalono protokół znakowania przy użyciu barwnika fluorescencyjnego. Miejscową infekcję uzyskuje się poprzez mikrowstrzyknięcie znakowanego C. difficile, który aktywnie rośnie w przewodzie pokarmowym danio pręgowanego i naśladuje uszkodzenie nabłonka jelitowego w CDI. Jednak ten protokół bezpośredniej infekcji jest inwazyjny i powoduje mikroskopijne rany, które mogą wpływać na wyniki eksperymentalne. W związku z tym opisano tutaj bardziej nieinwazyjny protokół mikrozgłębnika. Metoda polega na dostarczeniu komórek C. difficile bezpośrednio do jelita larw danio pręgowanego poprzez intubację przez otwarte usta. Ta metoda infekcji ściśle naśladuje naturalną drogę infekcji C. difficile.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C. difficile to Gram-dodatnia, tworząca przetrwalniki, beztlenowa i wytwarzająca toksyny pałeczka, która jest główną przyczyną ciężkich infekcji w przewodzie pokarmowym1. Typowe objawy CDI obejmują biegunkę, ból brzucha i śmiertelne rzekomobłoniaste zapalenie jelita grubego, które czasami może prowadzić do śmierci1,2. Dowody wykazały, że odpowiedzi immunologiczne gospodarza odgrywają kluczową rolę zarówno w postępie, jak i wyniku tej choroby3. Oprócz odpowiedzi immunologicznej, rodzima mikrobiota jelitowa ma kluczowe znaczenie dla wystąpienia i patogenezy CDI4. W ciągu ostatniej dekady zarówno liczba przypadków, jak i śmiertelność CDI znacznie wzrosły z powodu pojawienia się hiperwirulentnego szczepu C. difficile (BI/NAP1/027)5,6. Lepsze zrozumienie mechanizmów immunologicznych leżących u podstaw i roli mikrobioty podczas CDI pomoże w opracowaniu nowych rozwiązań terapeutycznych i postępów, umożliwiając lepszą kontrolę nad tą epidemią.

Kilka modeli zwierzęcych, takich jak chomik i mysz, zostało opracowanych, aby zapewnić wgląd w obronę immunologiczną przed C. difficile7,8. Jednak rola wrodzonych komórek odpornościowych jest nadal słabo poznana, zwłaszcza że zachowanie wrodzonych komórek odpornościowych wynika głównie z analizy histologicznej lub hodowli komórek in vitro. W związku z tym ustanowienie przezroczystego modelu danio pręgowanego w celu ujawnienia wrodzonej odpowiedzi immunologicznej na C. difficile wewnątrz żywego organizmu kręgowca ułatwi takie badania. Larwy danio pręgowanego mają funkcjonalny wrodzony układ odpornościowy, ale brakuje im adaptacyjnego układu odpornościowego do 4–6 tygodni po zapłodnieniu9. Ta unikalna cecha sprawia, że larwy danio pręgowanego są doskonałym modelem do badania izolowanej odpowiedzi i funkcji wrodzonych komórek odpornościowych w CDI.

Ten raport opisuje nowe metody wykorzystujące larwy danio pręgowanego do badania interakcji między C. difficile a wrodzonymi komórkami odpornościowymi, takimi jak makrofagi i neutrofile. Najpierw przedstawiono miejscowy protokół mikroiniekcji, który obejmuje inokulum C. difficile i barwienie. Za pomocą konfokalnego obrazowania poklatkowego in vivo rejestruje się odpowiedź neutrofili i makrofagów w kierunku miejsca zakażenia oraz obserwuje się fagocytozę bakterii przez neutrofile i makrofagi. Doniesiono jednak, że samo wstrzyknięcie powoduje uszkodzenie tkanek i prowadzi do rekrutacji leukocytów niezależnie od bakterii10. W związku z tym opisano nieinwazyjny protokół mikrozgłębnika mający na celu dostarczenie C. difficile do jelita larw danio pręgowanego. Wcześniejsze badania wykazały, że rodzima mikrobiota przewodu pokarmowego chroni gospodarza przed kolonizacją C. difficile11. Dlatego gnotobiotyczne larwy danio pręgowanego są również wykorzystywane do predyspozycji danio pręgowanego, które są zakażone 12. Następnie przeprowadza się sekcję jelit w celu odzyskania żywotnych C. difficile i sprawdzenia czasu ich obecności w przewodzie pokarmowym danio pręgowanego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie opisane tutaj prace ze zwierzętami zostały wykonane zgodnie z przepisami prawa (Dyrektywa UE 2010/63, licencja AZ 325.1.53/56.1-TUBS i licencja AZ 33.9-42502-04-14/1418).

1. Przygotowanie niskotopliwej agarozy, płytki żelowej i igieł do mikroiniekcji/mikrogłębników

  1. Rozpuścić 0,08 g niskotopliwej agarozy (tabela materiałów, agaroza A2576) w 10 ml 30% pożywki Danieau (0,12 mMMgSO4, 0,18 mM Ca [NO3]2), 0,21 mM KCl, 1,5 mM HEPES (pH = 7,2) i 17,4 mM NaCl, przechowywanych w temperaturze pokojowej (RT), aby uzyskać 0,8% roztwór.
    UWAGA: Można stosować wyższe lub niższe stężenia agarozy. Jednak wymagany czas krzepnięcia różni się w zależności od marki agarozy, nawet przy tym samym stężeniu.
  2. Przygotować igły do mikroiniekcji i mikrogłębników ze szklanych naczyń włosowatych (tabela materiałów).
    1. Użyj ściągacza do mikropipet z następującymi ustawieniami (należy pamiętać, że jednostki są specyficzne dla używanego tutaj ściągacza; patrz Tabela materiałów): igły do mikroiniekcji (ciśnienie powietrza = 500; ciepło = 400; pociągnięcie = 125; prędkość = 75; czas = 150); oraz igły do mikrogłębków (ciśnienie powietrza = 500; ciepło = 400; pociągnięcie = 100; prędkość = 75; czas = 150). Użyj końcówki do mikroładowarki, aby załadować 3 μl wolnego od nukleazH2Odo wyciągniętej igły.
    2. Wprowadzić igłę do wstrzykiwacza i prawidłowo ją zamocować. Ustawić igłę pod odpowiednim kątem do wstrzyknięcia. Ustawić ciśnienie iniekcji w zakresie 600–900 hPa dla igły do mikroiniekcji i 200–300 hPa dla igły do wstrzykiwania.
    3. Umieść kroplę oleju mineralnego na czarnym okręgu szkiełka kalibracyjnego. Użyj cienkich kleszczyków, aby przyciąć końcówkę igły. Wstrzyknąć jedną kroplę do oleju mineralnego, aby zmierzyć wielkość kropli.
    4. W przypadku mikroiniekcji należy dostosować czas iniekcji, aby uzyskać kroplę o średnicy 0,10–0,12 mm, co odpowiada objętości 0,5–1,0 nL. W przypadku mikrozgłębnika uzyskaj kroplę o średnicy 0,18–0,20 mm, co odpowiada objętości 3–5 nL.
  3. Przygotuj 1,5 % talerz agarozy z agarozą (Tabela materiałów, 8050) na 10 cm szalce Petriego w 30% pożywce Danieau, używając plastikowej formy jako formy do mikrozgłębków. Przechowywać w temperaturze 4 °C, aby zapobiec wysuszeniu do czasu, gdy będzie potrzebna. Ogrzać do temperatury pokojowej lub 28 °C przed eksperymentem.

2. Przygotowanie i znakowanie C. difficile i zarodników barwnikiem fluorescencyjnym

  1. Przygotować 1 mM roztwór podstawowy barwnika fluorescencyjnego (tabela materiałów). Ponieważ barwnik jest sprzedawany w porcjach 50 μg proszku, dodaj 69 μl DMSO do fiolki, aby uzyskać stężenie podstawowe 1 mM.
  2. Przygotować 100 μM roztwór roboczy barwnika fluorescencyjnego, dodając 2 μl 1 mM roztworu podstawowego do 18 μL DMSO w probówce wirówkowej i dobrze wymieszać.
  3. Kultura C. difficile (R20291, szczep rybotyp 027) poprzez inokulację 10 ml płynnej pożywki BHIS dwiema do trzech kolonii z płytki w kapturze beztlenowym bez wytrząsania przez noc. BHIS to BHI uzupełniony 0,5% (w/v) ekstraktem drożdżowym i 0,1% (w/v) L-cysteiną. Rozpuścić 1 g L-cysteiny w 10 ml ddH2O i wysterylizować przez filtrację, a następnie dodać do autoklawowanej pożywki do uzyskania końcowego stężenia 1 g/l. Płytki przygotowuje się przez dodanie 15 g/l agar-agaru do pożywki przed autoklawowaniem. Selektywna hodowla C. difficile odbywa się przy użyciu płytek chromID C. difficile (tabela materiałów).
  4. Barwienie C. difficile barwnikiem fluorescencyjnym
    1. Zebrać C. difficile przy OD600 1,0-1,2 i przemyć 1x 1 ml 1x PBS (5,000 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej). Zawiesić w 1 ml 1 x PBS.
    2. Dodać 3 μl roztworu roboczego barwnika fluorescencyjnego do 1 ml zawiesiny bakteryjnej. Inkubować próbkę przez 15 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Umyj poplamiony C. difficile raz 1 ml PBS, aby usunąć resztki barwnika i ponownie zawiesić w 1x PBS do OD600 1,0 (1,0 OD600 jest w przybliżeniu równoważne 10-8 jtk/ml).

3. Wstrzykiwanie barwionego C. difficile do larw danio pręgowanego

  1. Znieczulić 20–30 larw danio pręgowanego po 5 dniach od zapłodnienia (określanych tutaj jako 5 dpf) 0,02%–0,04% trikainy (proszek trikainy rozpuszcza się w wodzie podwójnie destylowanej i dostosowuje do pH = 7 za pomocą 1 M roztworu Tris-HCL) w 30% pożywce Danieau ~10 min przed wstrzyknięciem. Przenieś znieczulone larwy na świeżą 10 cm szalkę Petriego i usuń nadmiar 30% pożywki Danieau.
  2. Umieść kroplę 0,8% niskotopliwej agarozy na larwach danio pręgowanego, aby się przykryć. Delikatnie ustaw larwy w pozycji bocznej. Umieść szalkę Petriego na lodzie na 30–60 sekund, aby niskotopliwa agaroza zastygła. Dodaj 30% pożywki Danieau zawierającej 0,02%–0,04% trikainy, aby pokryć agarozę.
  3. Przygotować roztwór do wstrzykiwań. Dodaj 1 μl 0,5% czerwieni fenolowej w roztworze PBS do 9 μl barwionego barwnikiem inokulum C. difficile, aby uwidocznić proces wstrzykiwania.
  4. Załadować skalibrowaną igłę do mikroiniekcji roztworem do wstrzykiwań za pomocą mikroładowarki. Zamontuj załadowaną igłę na mikromanipulatorze i umieść ją pod mikroskopem stereoskopowym.
  5. Wyreguluj ciśnienie wtrysku w zakresie 600–900 hPa. Ustawić czas wstrzykiwania na 0,1–0,3 s, aby uzyskać 0,5–1,0 nL. Ustaw igłę w mikromanipulatorze pod kątem ~45° skierowaną w stronę osadzonych larw.
  6. Umieść końcówkę igły nad przewodem pokarmowym w pobliżu porów moczowo-płciowych. Przebić przez agarozę, a następnie mięsień końcówką igły, a następnie wprowadzić go do światła jelita i wstrzyknąć 0,5–1,0 nL C. difficile. Użyj mikroskopu fluorescencyjnego, aby monitorować wstrzyknięte larwy i pobrać prawidłowo wstrzyknięte larwy do obrazowania konfokalnego.

4. Wytwarzanie gnotobiotycznych larw danio pręgowanego

  1. Skorzystaj z dobrze znanej naturalnej metody hodowli do generowania gnotobiotycznych zarodków grybo, w tym: zapłodnienie in vitro, mycie pożywką zawierającą antybiotyki (1 μg/ml amfoterycyny B, 10 μg/ml kanamycyny i 20 μg/ml ampicyliny), mycie 0,1% wag./obj. roztworem poliwinylopirolidonu jodu (PVP-I) i inkubacja zarodków w kapturze do hodowli komórkowych12.
  2. Utrzymuj wszystkie gnotobiotyczne larwy danio pręgowanego w warunkach gnotobiotycznych do 5 dpf lub tuż przed zgłębnikiem. Po zgłębniku larwy danio pręgowanego zostaną przeniesione do standardowego inkubatora, ale ze sterylnym 30% podłożem Danieau.

5. Zgłębnik larw danio pręgowanego

  1. Skalibrować igłębnik do mikrozgłębnika zgodnie z opisem w kroku 1.2.
  2. Zmierz średnicę końcówki igły, umieszczając igłę na szkiełku kalibracyjnym z jedną kroplą oleju mineralnego. Upewnij się, że końcówka ma średnicę 30–40 μm, jest i gładka. Wyrzuć ostre lub szorstkie igły.
    UWAGA: Ostre krawędzie igieł mogą zostać stępione przez szybkie spalanie.
  3. Przygotować roztwór do zgłębnika zgodnie z opisem w kroku 3.3.
  4. Załadować igłę i zamontować ją na mikromanipulatorze zgodnie z opisem w kroku 3.4. Wyreguluj mikromanipulator tak, aby ustawić igłę pod kątem 45°.
  5. Znieczulić larwy danio pręgowanego, o których mowa w kroku 3.1. Kiedy larwy przestaną się poruszać, przenieś je do rowka formy do mikrozgłębnika za pomocą pipety Pasteura.
  6. Umieść kroplę 0,8% niskotopliwej agarozy na larwach danio pręgowanego, aby się przykryć. Delikatnie wyreguluj larwy z głowami skierowanymi do góry pod kątem 45° w rowku i ogonami przy ścianie rowka. Upewnij się, że kąty główek są w przybliżeniu takie same, tak aby były wyrównane z kątem igieł do zgłębnika. Umieść formę do mikrozgłębnika na lodzie na 30–60 s, pozwalając niskotopliwej agarozie zestalić się w celu ustabilizowania pozycji larw.
  7. Wyreguluj ciśnienie wtrysku w zakresie 200–300 hPa. Ustawić czas wstrzyknięcia na 0,1–0,3 s, aby uzyskać objętość wstrzyknięcia wynoszącą 3–5 nL C. difficile.
  8. Delikatnie przeprowadź igłę przez agarozę, a następnie do pyska larw danio pręgowanego, przez przełyk. Gdy końcówka igły znajdzie się w opuszki jelita przedniego, naciśnij pedał iniekcji, aby uwolnić bakterie. Wypełnij światło jelita dostarczoną objętością. Nie pozwól, aby z przełyku lub kloaki. Delikatnie wyjmij igłę z pyska danio pręgowanego.
  9. Po zgłębniku uratuj zainfekowane larwy danio pręgowanego przed agarozą za pomocą elastycznej końcówki mikroładowarki, najpierw odcinając agarozę, a następnie podnosząc larwy. Przenieś te larwy do sterylnego 30% podłoża Danieau. Dwukrotnie opłucz larwy w sterylnym podłożu. Przenieś larwy na świeżą 10 cm szalkę Petriego. Larwy będą utrzymywane do 11 dpf.

6. Analiza mikroskopii konfokalnej wstrzykniętych larw danio pręgowanego

  1. Znieczulić larwy danio pręgowanego, o których mowa w kroku 3.1. Wykonać otwór w dnie szalki Petriego o średnicy 35 mm z przymocowanym do otworu szklanym szkiełkiem, zwanym komorą obrazowania. Przenieść zarodki na dno komory obrazowania z odpowiednią ilością 30% pożywki Danieau.
  2. Dodaj 200–300 μl 1% niskotopliwej agarozy, aby przykryć znieczulone larwy. Ponieważ używany jest odwrócony mikroskop konfokalny, należy przyłożyć zainfekowany obszar larw do szkiełka tak blisko, jak to możliwe.
  3. Pozwól agarozie zestalić się na lodzie przez 30–60 s. Zanurz agarozę w 30% Danieau's zawierającym 0,02%-0,04% tricainy.
  4. Zobrazuj larwy za pomocą konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego (tabela materiałów).

7. Sekcja jelita larwalnego danio pręgowanego w celu odzyskania żywego C. difficile

  1. Odizoluj przewód pokarmowy od larw, aby przeanalizować obciążenie bakteryjne. Zacznij od eutanazji larw danio pręgowanego za pomocą 0,4% tricainy.
  2. Zegmunowany krótko opłucz sterylnym 1x PBS i przenieś je na świeżą płytkę agarozową.
  3. Sekcja danio pręgowanego
    1. Wbij igłę w grzbietowy pień larw danio pręgowanego w pobliżu głowy, aby unieruchomić danio pręgowanego. Usuń głowę za skrzelami za pomocą lancetu.
    2. Włóż drugą igłę w środek tułowia grzbietowego. Wbić trzecią igłę do brzucha danio pręgowanego i wyciągnąć jelito z jamy ciała.
      UWAGA: Konieczna jest szczególna ostrożność, aby wyizolować nienaruszone jelito. Jeśli jest to trudne, wykonaj dodatkowe pociągnięcia, aby oddzielić resztę jelita od pozostałych narządów wewnętrznych.
    3. Za pomocą igły do mikroiniekcji przenieś 10-15 jelit do probówki o pojemności 1,5 ml zawierającej 200 μl sterylnego 1x PBS.
    4. Homogenizuj jelita za pomocą tłuczka, aby rozbić tkankę i przygotować homogenaty. Upewnij się, że tłuczek dotrze do dna probówki, aby całkowicie rozbić wszystkie jelita.
  4. Inkubować homogenaty w pożywce hodowlanej C. difficile zawierającej D-cykloserynę i cefoksytynę, z taurocholanem (TCA, kiełkującym zarodnikiem C. difficile) lub bez niego w komorze beztlenowej.
  5. Inkubować płytkę beztlenowo przez 48 godzin w temperaturze 37 °C.
  6. Użyj kultury bakteryjnej do 16S rRNA-PCR.
    1. Zawiesić kolonię w 50 μlH2Oi gotować ją w temperaturze 95 °C przez 15 minut. Zdeponować zlizowane szczątki przez odwirowanie (14 000 obr./min przez 2 minuty w temperaturze pokojowej) i użyć 2 μl supernatantu jako matrycy w 25 μl reakcji PCR przy użyciu starterów specyficznych dla C. difficile (Cdiff16Sfw: 5' GTG AGC CAG TAC AGG 3'; Cdiff16Srev: 5' TTA AGG AGA TGT CAT TGG 3').
    2. W przypadku stosowania bakterii z płynnej hodowli należy zebrać 1 ml kultury i przemyć raz 1 ml PBS (14 000 obr./min przez 2 minuty w temperaturze pokojowej). Zawiesić osad w 100 μl H2Odd i postępować jak powyżej. Aby dokładniej scharakteryzować kolonie bakteryjne, należy narysować smugi na płytce BHIS lub chromID (Tabela materiałów).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C. difficile jest ściśle beztlenowy, ale chromofor białek fluorescencyjnych zwykle potrzebuje tlenu do dojrzewania. Aby przezwyciężyć ten problem, użyto barwnika fluorescencyjnego do barwienia żywych komórek C. difficile, które aktywnie rosły (R20291, szczep rybotyp 027; Rysunek 1A). Korzystając z systemu Gal4/UAS, stworzono stabilne transgeniczne linie danio pręgowanego do obrazowania na żywo, w których promotory mpeg1.1 lub lyZ napędzały ekspresję...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawione metody modyfikują i rozszerzają dotychczasowe podejście do infekowania larw danio pręgowanego poprzez wykonanie zarówno iniekcji, jak i mikrozgłębnika10,14. Zademonstrowano również podejście do badania patogenów beztlenowych z udziałem larw danio pręgowanego22. Ponadto protokół ułatwia analizę wrodzonych odpowiedzi komórek odpornościowych in vivo po CDI i po kolonizacji C. difficile u danio pręgowanego. Metoda jest p...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jesteśmy wdzięczni Timo Fritschowi za doskonałą opiekę nad zwierzętami. Dziękujemy członkom laboratoriów Köster i Steinert za wsparcie i pomocne dyskusje. Dziękujemy dr Dandanowi Hanowi za krytyczną lekturę manuskryptu. Wyrażamy wdzięczność za dofinansowanie ze strony kraju związkowego Dolna Saksonia, Niedersächsisches Vorab (VWZN2889).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AgarozaSigma-AldrichA2576Agaroza o bardzo niskiej zawartości żelowania
Agaroza niskotopliwa (LM)Pronadisa8050Jest stosowany w płytkach agarozowych
BacLight Red Bacterial StainThermo Fisher ScientificB35001Barwnik fluorescencyjny
Bulion naparowy mózgowo-sercowyCarl Roth GmbHX916.1
Mosiądz (typ dziki)niedobór syntezy melaniny, używany do generowania stabilnych linii transgenicznych
Azotan wapnia (Ca(NO3)2)Sigma-AldrichC1396
Szkło kapilarneAparat Harvarda30-0019Igły iniekcyjne
Clostridioides difficileR20291,, szczep rybotyp 027, produkcja TcdA+/TcdB+/CDT+ DMSO
Carl Roth GmbHA994
open sourceFIJIPrzetwarzanie obrazu
HEPESCarl Roth GmbH6763
Ściągacz igłowy poziomySutter instrument IncP-87
L-cysteinaSigma-Aldrich168149
Leica Application Suite X (LAS X)Przetwarzanie
Siarczan magnezu (MgSO4)Carl Roth GmbHP026
Mikrowtryskiwaczeppendorf5253000017
Formy do mikroiniekcjiAdaptacyjne narzędzia naukowe MikroskopTU1
Leica SP8Leica
Phenol RedSigma-AldrichP0290
Chlorek potasu (KCl)Carl Roth GmbH5346
Chlorek sodu (NaCl)Carl Roth GmbH9265
TaurocholateCarl Roth GmbH8149
Tg(lyZ: KalTA4)bz17/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3stabilna linia transgeniczna, w której promotory lyZ napędzają ekspresję białka fluorescencyjnego EGFP w neutrofilach
Tg(mpeg1.1: KalTA4)bz16/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3stabilna linia transgeniczna, w której mpeg1.1 steruje ekspresją białka fluorescencyjnego EGFP w makrofagach
Platforma obrazów Leica konfokalny Trikaine Sigma-Aldrich E10521 Ekstrakt drożdżowy BD Bacto 212750

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rupnik, M., Wilcox, M. H., Gerding, D. N. Clostridium difficile infection: new developments in epidemiology and pathogenesis. Nature Reviews Microbiology. 7, 526-536 (2009).
  2. Yang, Z., et al. Mechanisms of protection against Clostridium difficile infection by the monoclonal antitoxin antibodies actoxumab and bezlotoxumab. Infection and Immunity. 83, 822-831 (2015).
  3. Kelly, C. P., Kyne, L. The host immune response to Clostridium difficile. Journal of Medical Microbiology. 60, 1070-1079 (2011).
  4. Britton, R. A., Young, V. B. Interaction between the intestinal microbiota and host in Clostridium difficile colonization resistance. Trends in Microbiology. 20, 313-319 (2012).
  5. Goorhuis, A., et al. Emergence of Clostridium difficile Infection Due to a New Hypervirulent Strain, Polymerase Chain Reaction Ribotype 078. Clinical Infectious Diseases. 47, 1162-1170 (2008).
  6. Pépin, J., et al. Emergence of fluoroquinolones as the predominant risk factor for Clostridium difficile-associated diarrhea: a cohort study during an epidemic in Quebec. Clinical Infectious Diseases. 41, 1254-1260 (2005).
  7. Merrigan, M. M., Sambol, S. P., Johnson, S., Gerding, D. N. Prevention of Fatal Clostridium difficile -Associated Disease during Continuous Administration of Clindamycin in Hamsters. The Journal of Infectious Diseases. 188, 1922-1927 (2003).
  8. Chen, X., et al. A Mouse Model of Clostridium difficile-Associated Disease. Gastroenterology. 135, 1984-1992 (2008).
  9. Page, D. M., et al. An evolutionarily conserved program of B-cell development and activation in zebrafish. Blood. 122, 1-12 (2014).
  10. Benard, E. L., et al. Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens. Journal of Visualized Experiments. (61), e3781(2012).
  11. Theriot, C. M., Young, V. B. Interactions Between the Gastrointestinal Microbiome and Clostridium difficile. Annual Review of Microbiology. 69, 445-461 (2015).
  12. Pham, L. N., Kanther, M., Semova, I., Rawls, J. F. Methods for generating and colonizing gnotobiotic zebrafish. Nature Protocols. 3, 1862-1875 (2008).
  13. Ransom, E. M., Ellermeier, C. D., Weiss, D. S. Use of mCherry red fluorescent protein for studies of protein localization and gene expression in Clostridium difficile. Applied and Environmental Microbiology. 81 (5), 1652-1660 (2015).
  14. Cocchiaro, J. L., Rawls, J. F. Microgavage of Zebrafish Larvae. Journal of Visualized Experiments. (72), e4434(2013).
  15. Chen, X., et al. A Mouse Model of Clostridium difficile-Associated Disease. Gastroenterology. 135 (6), 1984-1992 (2008).
  16. Hutton, M. L., Mackin, K. E., Chakravorty, A., Lyras, D. Small animal models for the study of Clostridium difficile disease pathogenesis. FEMS Microbiology Letters. 352, 140-149 (2014).
  17. Brugman, S. The zebrafish as a model to study intestinal inflammation. Developmental & Comparative Immunology. 64, 82-92 (2016).
  18. Goulding, D., et al. Distinctive profiles of infection and pathology in hamsters infected with Clostridium difficile strains 630 and B1. Infection and Immunity. 77, 5478-5485 (2009).
  19. Toh, M. C., et al. Colonizing the Embryonic Zebrafish Gut with Anaerobic Bacteria Derived from the Human Gastrointestinal Tract. Zebrafish. 10, 194-198 (2013).
  20. Bloemberg, G. V., et al. Comparison of static immersion and intravenous injection systems for exposure of zebrafish embryos to the natural pathogen Edwardsiella tarda. BMC Immunology. 12, 58(2011).
  21. Díaz-Pascual, F., Ortíz-Severín, J., Varas, M. A., Allende, M. L., Chávez, F. P. In vivo host-pathogen interaction as revealed by global proteomic profiling of zebrafish larvae. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 1-11 (2017).
  22. Valenzuela, M. J., et al. Evaluating the capacity of human gut microorganisms to colonize the zebrafish larvae (Danio rerio). Frontiers in Microbiology. 9, (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Larwy danio pr gowanegozaka enie C difficileprotok mikrogawa uznakowanie fluorescencyjneobrazowanie konfokalnewrodzona odpowied immunologicznabeztlenowa hodowla bakteriikolonizacja jelitowafagocytoza makrofag wrekrutacja neutrofili

Powiązane artykuły