Artykuł metodologiczny

Wysoka dokładność korekcji przesunięć chromatycznych 3D w erze obrazowania biologicznego o wysokiej rozdzielczości przy użyciu Chromagnon

DOI:

10.3791/60800

⸱

16 czerwca 2020

 ,  ,  ,  , 
1Advanced ICT Research Institute Kobe, National Institute of Information and Communications Technology, 2Graduate School of Frontier Biosciences, Osaka University, 3Micron Advanced Bioimaging Unit, Department of Biochemistry, University of Oxford

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Korekcja przesunięć chromatycznych w trójwymiarowych (3D) wielokolorowych obrazach mikroskopii fluorescencyjnej jest kluczowa dla ilościowych analiz danych. Protokół ten został opracowany w celu pomiaru i korygowania przesunięć chromatycznych w próbkach biologicznych poprzez pozyskiwanie odpowiednich obrazów referencyjnych i przetwarzanie za pomocą oprogramowania open source Chromagnon.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ilościowa wielobarwna mikroskopia fluorescencyjna opiera się na starannym przestrzennym dopasowaniu kanałów kolorów uzyskanych na różnych długościach fal. Ze względu na aberrację chromatyczną i niedoskonałe wyrównanie kamer, obrazy uzyskane w każdym kanale mogą być przesuwane i powiększane, a także obracane względem siebie w dowolnym z trzech wymiarów. W przypadku klasycznej metody kalibracji przesunięcia chromatyczne są mierzone za pomocą wielokolorowych koralików przymocowanych do powierzchni szkiełka nakrywkowego, a dostępnych jest wiele programów do pomiaru przesunięć chromatycznych z takich próbek kalibracyjnych. Jednak aberracja chromatyczna może zmieniać się wraz z głębokością, zmieniać się w zależności od warunków obserwacji i być indukowana przez samą próbkę biologiczną, utrudniając w ten sposób określenie rzeczywistej wielkości przesunięcia chromatycznego w próbce będącej przedmiotem zainteresowania i w całej objętości. Korekcja przesunięć chromatycznych z większą dokładnością jest szczególnie istotna w przypadku mikroskopii superrozdzielczej, gdzie tylko niewielkie przesunięcia chromatyczne mogą wpływać na analizy ilościowe i zmieniać interpretację obrazów wielokolorowych. Opracowaliśmy oprogramowanie typu open source Chromagnon i towarzyszące mu metody pomiaru i korygowania przesunięć chromatycznych 3D w próbkach biologicznych. W tym miejscu udostępniamy szczegółowy protokół aplikacji, który zawiera specjalne wymagania dotyczące przygotowania próbki, akwizycji danych i przetwarzania oprogramowania w celu pomiaru przesunięć chromatycznych w próbkach biologicznych będących przedmiotem zainteresowania.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obrazowanie wielokolorowe jest jednym z podstawowych aspektów biologicznej mikroskopii fluorescencyjnej, w przypadkach, gdy relacje przestrzenne różnych cząsteczek lub struktur są szczególnie interesujące. Aberracja chromatyczna, aberracja optyczna światła polichromatycznego spowodowana dyspersją, zmienia pozorne położenie kolorowych obiektów zainteresowania. Podobnie mikroskopy wyposażone w wiele kamer poświęconych rejestrowaniu każdego koloru mają bardziej złożone przesunięcia chromatyczne spowodowane różnicami w elementach optycznych i niedoskonałym wyrównaniem kanałów. W związku z tym takie przesunięcia chromatyczne mogą prowadzić do błędnych wniosków, chyba że zostaną wyraźnie skorygowane przez użytkownika. Chociaż przesunięcia chromatyczne nie stanowią większego problemu, dopóki rozdzielczość mikroskopii jest ograniczona przez klasyczny limit rozdzielczości, niedawny rozwój mikroskopii superrozdzielczej1 spowodował potrzebę dokładniejszej korekcji przesunięć chromatycznych.

Powszechną praktyką jest mierzenie przesunięć chromatycznych systemów mikroskopowych za pomocą wielokolorowego szkiełka do kalibracji koralików2. Metoda kalibracji opartej na koralikach jest odpowiednia do pomiaru przesunięć chromatycznych od całej optyki mikroskopu w kierunku powierzchni szkiełka nakrywkowego2. Metoda ta nie jest jednak w stanie zmierzyć przesunięć chromatycznych w próbkach biologicznych będących przedmiotem zainteresowania. Należy zauważyć, że wiele próbek biologicznych jest trójwymiarowych (3D), a przesunięcia chromatyczne takich próbek różnią się od tych na powierzchni szkiełka nakrywkowego. Co więcej, przesunięcia chromatyczne zmieniają się wraz z warunkami obrazowania2,3. Zmierzyliśmy przesunięcia chromatyczne w próbkach biologicznych 3D i stwierdziliśmy, że niepewność przesunięć chromatycznych wynosiła często nawet 350 nm przy użyciu klasycznej metody kalibracji wielokolorowych koralików3. W związku z tym przesunięcia chromatyczne muszą być mierzone w próbkach biologicznych na głębokości zainteresowania i w stosowanych warunkach obrazowania.

Tutaj opisujemy procedury pomiaru przesunięć chromatycznych w próbkach biologicznych i korygowania tych przesunięć za pomocą naszego oprogramowania, Chromagnon3. Aby zmierzyć przesunięcia chromatyczne w próbkach biologicznych, nasza metoda wykorzystuje dwa rodzaje zestawów danych: obraz "docelowy" i obraz "referencyjny". Obraz "docelowy" to wielokolorowy obraz będący przedmiotem zainteresowania, na przykład obrazy barwione pod kątem DNA, otoczki jądrowej i mikrotubul. Często niemożliwe jest zmierzenie przesunięć chromatycznych na takim obrazie. W związku z tym potrzebujemy obrazu "referencyjnego", który jest dedykowany do pomiaru przesunięć chromatycznych w próbce. Jedyną definicją obrazu "referencyjnego" jest wielokolorowy obraz tego samego obiektu. W tym sensie wielokolorowy obraz koralików jest również rodzajem obrazu referencyjnego. W tym miejscu opisujemy trzy różne typy obrazów referencyjnych, które są używane do pomiaru przesunięć chromatycznych w próbkach biologicznych: "obrazy referencyjne przesłuchów", "obrazy referencyjne jasnego pola" i "obrazy referencyjne kalibracji biologicznej". Rodzaj obrazu referencyjnego zależy od typu używanego mikroskopu lub wymaganej dokładności korekcji, jak podsumowano w tabeli 1.

CrosstalkJasne poleKalibracja biologiczna (na innym slajdzie)Kalibracja biologiczna (na tym samym szkiełku)
Precyzjaa++++++b+++
prostota+++++++++
Stosowana mikroskopiaSzerokie pole widzeniaSzerokie pole widzeniacałycały
Dostępność lokalnego wyrównania++-c-c
a: Liczba znaków "+" oznacza rosnącą ocenę. Pojedynczy plus to około 50 nm, a trzy plus to około 15 nm w 3D.
b: Dokładność zależy od tego, jak bardzo zmienne warunki obrazowania są utrzymywane na stałym poziomie.
c: Kalibracja lokalna mierzona za pomocą próbek wielokolorowych ściegów może być łączona zgodnie z opisem w sekcji 4 protokołu.

Tabela 1: Parametry przy wyborze typu obrazów referencyjnych.

"Crosstalk reference images" mają najwyższą dokładność korekcji i są stosunkowo proste do osiągnięcia3,4 (Tabela 1). Wadą jest ich ograniczenie w zastosowaniach mikroskopowych ze względu na niemożność pomiaru przesunięć chromatycznych w ścieżkach wzbudzenia. Ponadto, aby uzyskać takie obrazy, mikroskop powinien być wyposażony w wielopasmowe zwierciadła dichroiczne oraz filtry emisyjne, które są niezależnie sterowane od filtrów wzbudzenia lub źródeł światła. Odpowiednia mikroskopia obejmuje konwencjonalną mikroskopię szerokokątną, mikroskopię lokalizacyjną pojedynczych cząsteczek (SMLM), taką jak mikroskopia lokalizacyjna aktywowana światłem/stochastyczna mikroskopia rekonstrukcyjna optyczna (PALM/STORM)5,6 i mikroskopia ekspansywna7 obserwowane za pomocą mikroskopii szerokokątnej. Obraz referencyjny przesłuchu jest uzyskiwany z samej próbki docelowej. Jest to obraz przesłuchu (przebijającego) fluorescencji barwnika uzyskany we wszystkich wymaganych kanałach. Emisja fluorescencji zawsze rozszerza się w kierunku dłuższych fal, dlatego barwniki o najkrótszej długości fali emisji są wzbudzane w celu uzyskania fluorescencji przesłuchu w kanałach o dłuższych falach. Na przykład, gdy próbka jest barwiona na niebiesko, zielono i czerwono, wzbudzany jest tylko niebieski barwnik, a światło emisyjne uzyskuje się w kanałach niebieskim, zielonym i czerwonym. W tym protokole DNA barwione 4′,6-diamidyn-2-fenyloindolem (DAPI) wykorzystano w celu uzyskania fluorescencji przesłuchu.

"Obrazy referencyjne jasnego pola" są łatwiejszą i mniej fototoksyczną alternatywą dla "obrazów referencyjnych przesłuchów", ale są najmniej dokładne3 (Tabela 1). Są to obrazy jasnego pola próbki docelowej, uzyskane we wszystkich kanałach kolorów użytych na obrazie docelowym.

"Obrazy referencyjne kalibracji biologicznej" mają tę zaletę, że można je zastosować do każdego rodzaju mikroskopii, ze względu na ich zdolność do pomiaru przesunięć chromatycznych zarówno w ścieżce wzbudzenia, jak i emisji3,8 (Tabela 1). Odpowiednia mikroskopia obejmuje mikroskopię szerokokątną, mikroskopię konfokalną, mikroskopię arkuszy świetlnych, wymuszone zubożenie emisji (STED)9, mikroskopię oświetlenia strukturalnego (SIM)10, Airyscan/SORA11,12, SMLM obserwowany w trybie całkowitej fluorescencji wewnętrznego odbicia (TIRF), Olympus super resolution (OSR)13i tak dalej. Obraz referencyjny kalibracji biologicznej uzyskuje się z próbki kalibracyjnej podobnie przygotowanej jak próbka docelowa, ale z barwieniem pojedynczej struktury wieloma kolorami. Dokładność korekcji przewyższa rozdzielczość większości mikroskopii superrozdzielczych, a przygotowanie biologicznej próbki kalibracyjnej może być stosunkowo proste. Kolejną zaletą jest możliwość "uśrednienia" wielu obrazów referencyjnych. W związku z tym, nawet jeśli poszczególne obrazy zawierają słabe informacje do pomiaru przesunięć chromatycznych, zawartość informacji można zwiększyć, uśredniając wiele obrazów. Dokładność zależy od tego, jak bardzo warunki obrazowania są utrzymywane na stałym poziomie. Pod tym względem najlepszą wydajność uzyskuje się, gdy zarówno próbka docelowa, jak i próbka referencyjna znajdują się na tym samym szkiełku, przy użyciu np. 8-dołkowych szkieł nakrywkowych (tabela 1, skrajnie po prawej). W tym protokole aktyna barwiona trzema kolorami falloidyny została użyta jako kalibracja biologiczna.

Po uzyskaniu obrazu referencyjnego, przesunięcie chromatyczne jest mierzone i korygowane przez nasze oprogramowanie Chromagnon. Nie ma ograniczeń co do liczby kanałów, sekcji Z i ram czasowych, dla których Chromagnon może mierzyć i korygować przesunięcia chromatyczne. Chromagnon mierzy przesunięcia chromatyczne w dwóch etapach. Pierwszy krok polega na uzyskaniu parametrów wyrównania "globalnego" lub "afinicznego" translacji w osiach X, Y, Z, powiększenia wzdłuż osi X, Y, Z i obrotu wokół osi Z. Dokładność obliczeń globalnego wyrównania wynosi ~16 nm w 3D i ~8 nm w 2D. Drugim krokiem jest opcjonalne iteracyjne "lokalne wyrównanie" 2D na wyświetlanych obrazach w celu uzyskania większej dokładności. W procesie wyrównywania lokalnego obrazy są dzielone na wiele regionów i mierzone są przesunięcia chromatyczne w tych regionach lokalnych. Następnie regiony są dalej dzielone, a przesunięcia chromatyczne w podregionach są mierzone iteracyjnie, aż liczba pikseli w regionie osiągnie minimalną liczbę pikseli (zwykle 60 x 60 pikseli). Wynikowa lokalna mapa wyrównania jest łączona z globalnym parametrem wyrównania i jest stosowana do obrazu docelowego przez transformację sprężystą. Po tym kroku dokładność obliczeń poprawia się do ~14 nm w 3D i ~6 nm w 2D. Dopasowanie lokalne nie jest odpowiednie dla obrazów referencyjnych kalibracji biologicznej, ponieważ struktura biologiczna w odniesieniu różni się od struktury w obiekcie docelowym (tabela 1). W związku z tym dla obrazów referencyjnych kalibracji biologicznej używane jest tylko wyrównanie globalne.

Lokalne przesunięcia chromatyczne pochodzą z dwóch źródeł; instrumentalnego zniekształcenia lokalnego mikroskopu i biologicznej niejednorodności strukturalnej. Ponieważ zniekształcenia miejscowe instrumentalne mikroskopu są stałe, można je zmierzyć na podstawie próbki referencyjnej wielokolorowych kulek i skorygować jako stały parametr. Chromagnon może łączyć instrumentalną mapę lokalnych zniekształceń mikroskopowych z globalnymi parametrami wyrównania z kalibracji biologicznych (Tabela 1). Stosując tę metodę, oczekuje się, że średnia dokładność kalibracji biologicznej zostanie poprawiona o dodatkowe 1−2 nm.

Tutaj opisujemy protokół do korygowania przesunięć chromatycznych obrazów fluorescencyjnych 3D za pomocą naszego oprogramowania Chromagnon, od najłatwiejszego dołu do najwyższej dokładności. Jako przykład używamy barwienia immunologicznego komórek HeLa i obserwowaliśmy je za pomocą mikroskopii szerokokątnej 3D i 3D-SIM. W pierwszej części opisujemy, jak przygotować próbki docelowe i próbki do kalibracji biologicznej. Ta część protokołu powinna być zoptymalizowana pod kątem konkretnych celów badania. W drugiej części opisujemy metody pozyskiwania trzech rodzajów obrazów referencyjnych za pomocą mikroskopów. Założeniem było uzyskanie kanałów niebieskiego, zielonego i czerwonego, ale skład kanałów powinien być modyfikowany w zależności od konkretnych celów badań i ustawień mikroskopu. Nie ma znaczenia, czy mikroskop jest wyposażony w pojedynczą kamerę, czy w wiele kamer. W trzeciej części opisujemy, w jaki sposób można wykorzystać nasze oprogramowanie do pomiaru i korygowania przesunięć chromatycznych obrazu docelowego za pomocą obrazów referencyjnych. Wreszcie, w czwartej sekcji, opisujemy metodę uzupełniania obrazów referencyjnych kalibracji biologicznej przy użyciu instrumentalnej kalibracji lokalnej mikroskopu.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie próbki

  1. Przygotowanie próbki docelowej
    1. Wysiewaj 2,5 x 105 komórek HeLa na 35-milimetrowym naczyniu ze szklanym dnem i hoduj je w 2 ml pożywki wzrostowej (zmodyfikowana pożywka orła firmy Dulbecco z L-glutaminą i pirogronianem sodu uzupełniona 10% płodową surowicą bydlęcą [FBS]) w temperaturze 37 °C i stężeniu CO2 5%. Alternatywnie, wysiewa 6 x 104 komórek HeLa na 8-dołkowym szkle nakrywkowym i hoduje je w 0,5 ml pożywki wzrostowej w temperaturze 37 °C i stężeniu CO2 %. Użyj szkła nakrywkowego #1.5 (o grubości 0.170 mm) do mikroskopii o wysokiej rozdzielczości.
      UWAGA: Do dalszych czynności należy użyć 1/4 objętości dla szkła nakrywkowego z 8-dołkową komorą, z wyjątkiem etapów 1.1.5, 1.1.6, 1.1.8, 1.1.11 i 1.2.5, gdzie objętość wynosi 100 μl, niezależnie od rodzaju pojemnika.
    2. Po około 24 godzinach inkubacji zastąp roztwór 2 ml 3,7% formaldehydu w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Po delikatnym wymieszaniu kontynuuj utrwalanie komórek przez 15 minut w temperaturze pokojowej (RT) na platformie obrotowej.
      UWAGA: Pracować w dygestorium.
    3. Umyj komórki 2 ml PBS, po 3 razy przez 5-10 minut na platformie rotacyjnej.
      UWAGA: Postępuj zgodnie z lokalnymi przepisami, aby utylizować odpady formaldehydu.
    4. Przepuszczalność komórek za pomocą 2 ml 0,1% Triton X-100 w PBS przez 5 minut na platformie rotacyjnej, a następnie trzy płukania 2 ml PBS, każde przez 5-10 minut na platformie rotacyjnej.
    5. Inkubować komórki w 100 μl 1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w PBS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej na platformie rotacyjnej.
    6. Zastąpić roztwór 100 μl mieszaniny przeciwciał pierwszorzędowych (przeciwciało poliklonalne anty-emeryny14 i przeciwciało monoklonalne antytubuliny15) w 1% BSA w PBS w odpowiednich rozcieńczeniach (1/500 dla antyemeryny i 1/100 dla antytubuliny) i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
    7. Umyj komórki 2 ml PBS, 3−5x każda przez 10 minut na platformie rotacyjnej.
    8. Zastąp roztwór 100 μl mieszaniny przeciwciał drugorzędowych (anty-królicze IgG z Alexa Fluor 488 i anty-mysie IgG z Alexa Fluor 555) w 1% BSA w PBS w rozcieńczeniu 1/500 i inkubuj przez 3-4 godziny w RT.
    9. Myj komórki 2 ml PBS, 3−4x każda przez 5 minut na platformie rotacyjnej.
    10. Zastąp roztwór 2 ml 0,5 μg/ml DAPI w PBS, aby wybarwić DNA przez 30 minut w temperaturze pokojowej na platformie rotacyjnej.
      UWAGA: Zamiast DAPI można również użyć Hoechst 33342 w tym samym stężeniu.
    11. Zastąp roztwór ~100 μL medium montażowego (Tabela materiałów).
  2. Przygotowanie biologicznej próbki kalibracyjnej
    1. Przygotuj stałe komórki zgodnie z opisem w krokach 1.1.1−1.1.4.
      UWAGA: Zaleca się, aby próbki były przygotowywane na komorze na szkle nakrywkowym, aby umieścić zarówno próbkę docelową, jak i referencyjną w oddzielnych komorach na tym samym szkiełku nakrywkowym (tabela 1, po prawej stronie). To przygotowanie jest preferowane, gdy eksperyment wymaga najwyższej dokładności korekcji. Gdy próbka musi być przygotowana na zwykłym szkiełku nakrywkowym, należy użyć precyzyjnych szkiełek nakrywkowych o małej zmienności grubości ("nr 1,5H"), aby zapewnić powtarzalność.
    2. Przygotować roztwór podstawowy falloidyny sprzężonej z barwnikiem fluorescencyjnym w 1,5 ml metanolu i przechowywać w temperaturze -20 °C. Wymieszać roztwór podstawowy falloidyny w PBS w następującym rozcieńczeniu: 1/100 dla falloidyny z Alexa Fluor 405, 1/1000 dla falloidyny z Alexa Fluor 488 i 1/200 dla falloidyny z Alexa Fluor 594.
    3. Zastąpić roztwór 1 ml mieszaniny falloidyny przygotowanej w kroku 1.2.2 i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej na platformie rotacyjnej.
    4. Umyj komórki 2 ml PBS, 3−5x każda przez 10 minut na platformie rotacyjnej.
    5. Zastąp roztwór ~100 μL medium montażowego.
      UWAGA: Próbki kalibracyjne można przechowywać w temperaturze 4 °C lub -20 °C do wielokrotnego użytku.

2. Akwizycja obrazów referencyjnych

  1. Obrazy referencyjne przesłuchów
    1. Umieścić próbkę docelową przygotowaną w kroku 1.1 pod mikroskopem szerokokątnym.
    2. Uzyskaj obraz fluorescencyjny celu w kanałach niebieskim, zielonym i czerwonym.
      UWAGA: W przypadku obrazów 3D rozmiar kroku Z na obrazie referencyjnym może różnić się od rozmiaru na obrazie docelowym, o ile plik obrazu zawiera informacje o rozmiarze kroku. Rozmiar kroku Z dla obrazów referencyjnych i docelowych jest korzystnie mniejszy niż połowa rozdzielczości optycznej osi Z, która jest obliczana według wzoru figure-protocol-1 dla mikroskopii z ograniczoną dyfrakcją, gdzie λ jest długością fali w nanometrach, a NA jest aperturą numeryczną soczewki obiektywu. Na przykład, jeśli rozdzielczość osiowa wynosi 550 nm, należy użyć kroku Z mniejszego niż 275 nm. Dla obrazu referencyjnego nie są wymagane szeregi czasowe.
    3. Następnie, aby uzyskać obraz fluorescencyjny odniesienia, wybierz światło wzbudzenia tylko dla DAPI i wybierz akwizycję w kanałach niebieskim, zielonym i czerwonym. Obraz referencyjny należy uzyskać dokładnie w tym samym położeniu stołu montażowego i na tej samej wysokości Z, w przypadku stosu 3D.
      UWAGA: W przypadku dłuższych długości fal emisji wymagane będzie zwiększenie intensywności oświetlenia i czasu ekspozycji.
  2. Obrazy referencyjne w jasnym polu
    1. Umieścić próbkę docelową przygotowaną w kroku 1.1 pod mikroskopem szerokokątnym.
    2. Uzyskaj obraz fluorescencyjny celu w kanałach niebieskim, zielonym i czerwonym.
      UWAGA: Rozmiar kroku Z korzystnie spełnia kryterium Nyquista opisane w kroku 2.1.2.
    3. Uzyskaj obraz celu w jasnym polu w kanałach niebieskim, zielonym i czerwonym dokładnie w tej samej pozycji stolika, co w 2.2.2 i na tej samej wysokości Z w przypadku stosu 3D.
  3. Obrazy referencyjne kalibracji biologicznej
    1. Umieść próbkę docelową przygotowaną w kroku 1.1 pod mikroskopem 3D-SIM.
    2. Uzyskaj obraz fluorescencyjny celu w kanałach niebieskim, zielonym i czerwonym za pomocą 3D-SIM. Zrekonstruuj obraz w super rozdzielczości.
      UWAGA: Typ mikroskopu może być dowolnego typu, takiego jak 3D-SIM, konfokalny, STED itp. Rozmiar kroku Z korzystnie spełnia kryterium Nyquista, jak opisano w kroku 2.1.2.
    3. Uzyskanie wielu obrazów fluorescencyjnych wzorca przygotowanego w kroku 1.2 w różnych pozycjach etapu, podobnych do obrazu docelowego (krok 2.3.2) za pomocą 3D-SIM. Zrekonstruuj obrazy w super rozdzielczości.
      UWAGA: Całkowita liczba pikseli w XY musi być taka sama we wszystkich obrazach referencyjnych. Rozmiar kroku w Z musi być taki sam na wszystkich obrazach referencyjnych. Preferowana jest całkowita liczba sekcji Z, taka sama, jak na obrazie docelowym, ale nie jest to bezwzględny wymóg. Pozycja XY na stole montażowym dla tych obrazów referencyjnych nie ma znaczenia, ponieważ pozycja szkiełka nakrywkowego jest już inna niż pozycja próbki docelowej, a ponadto różnica w przesunięciu chromatycznym na pojedynczym szkiełku nakrywkowym jest mniejsza niż 15 nm3. Warunki obrazowania, w tym soczewka obiektywu, temperatura obserwacji, olej immersyjny, rozmiar otworu w mikroskopii konfokalnej i kąt nachylenia w mikroskopii z dużym nachyleniem oświetlenia16, powinny być zgodne z odniesieniem, aby uzyskać najlepszą wydajność. Jeśli mikroskop jest wyposażony w wiele kamer do jednoczesnej rejestracji wielu kanałów, obrazy referencyjne powinny być rejestrowane nawet raz w tygodniu, aby skorygować dryf instrumentu.

3. Korekta przesunięcia chromatycznego za pomocą oprogramowania Chromagnon

  1. Korzystając z przeglądarki internetowej, przejdź do https://github.com/macronucleus/Chromagnon/releases i pobierz najnowszą wersję binarną Chromagnon.
    UWAGA: Wersje binarne są dostępne dla systemów Windows, Mac i niektórych wersji systemu Linux.
  2. Rozpakuj program i umieść plik wykonywalny w dogodnej lokalizacji. W systemie Windows lub Mac kliknij dwukrotnie plik, aby go otworzyć, lub wykonaj plik binarny z wiersza poleceń w systemie Linux.
    UWAGA: Otworzy się graficzny interfejs użytkownika, jak w Rysunek 1. Otwarcie programu może zostać uniemożliwione przez dwukrotne kliknięcie po raz pierwszy ze względów bezpieczeństwa. W takim przypadku użyj metody zależnej od platformy, aby otworzyć program pobrany z Internetu.

figure-protocol-2
Rysunek 1: Zrzut ekranu przedstawiający graficzny interfejs użytkownika Chromagnon. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Przeciągnij i upuść pliki referencyjne w polu "Odwołanie" (Rysunek 1) lub kliknij Pliki referencyjne (Rysunek 1A), aby otworzyć okno dialogowe wyboru plików. W zależności od formatów plików, jeśli program poprosi o zainstalowanie zestawu Java Development Kit (JDK), naciśnij tak, a użytkownik zostanie przekierowany na stronę pobierania. Pobierz i zainstaluj JDK dla systemu operacyjnego zgodnie z instrukcjami. Chromagnon powinien być w stanie odczytać format pliku obrazu po ponownym uruchomieniu programu.
    UWAGA: Chromagnon może odczytywać większość formatów plików graficznych (wielostronicowe 'tif', 'czi', 'nd2', 'oib', 'lif', 'dv' itp.). Na tym etapie preferowany jest oryginalny format obrazu mikroskopu, ponieważ metadane mogą zostać utracone, gdy format obrazu jest konwertowany na wielostronicowy plik tif. Jeśli nazwa kanału jest wyświetlana jako 0, 1, 2 itd. zamiast długości fal, takich jak 528, 609 (Rysunek 2A, zielone pola), oznacza to, że Chromagnon nie zna tożsamości kanałów na obrazie. W takim przypadku należy się upewnić, że kolejność kanałów i rozmiar w pikselach w pliku odniesienia są zgodne z tymi w pliku docelowym. Na przykład, jeśli kolejność kanałów w odwołaniu jest zielona i czerwona, to kolejność kanałów w obiekcie docelowym również musi być zielona i czerwona, ale nie czerwona i zielona.

figure-protocol-3
Rysunek 2: Przykładowy zrzut ekranu przedstawiający ładowanie wielu plików. (A) Przypadek, w którym wszystkie obrazy referencyjne mają odpowiadające im obrazy docelowe. Nazwy kanałów są poprawnie identyfikowane przez długości fal (oznaczone zielonym polem) w plikach graficznych użytych w tym przykładzie. (B) Przypadek, w którym pojedynczy obraz referencyjny jest używany do korygowania wielu obrazów docelowych. (C) Przypadek, w którym wiele obrazów referencyjnych (oznaczonych czerwoną ramką) jest uśrednianych, a uzyskany obraz referencyjny po uśrednieniu jest używany do korygowania wielu obrazów docelowych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Przeciągnij i upuść pliki docelowe w polu "Cel" (Rysunek 1) lub kliknij Pliki docelowe (Rysunek 1B), aby otworzyć okno dialogowe wyboru plików.
    UWAGA: Jeśli istnieje wiele obrazów docelowych i każdy z nich ma odpowiadające im obrazy referencyjne, odpowiadający im obraz referencyjny i obraz docelowy muszą znajdować się w tym samym wierszu w odpowiednich polach odniesienia i celu (Rysunek 2A). Pojedynczy obraz referencyjny może być również użyty do wyrównania wielu obrazów docelowych (Rysunek 2B).
  2. Zaznacz pole wyboru marginesów kadrowania, jeśli nie jest zaznaczone (Rysunek 1C).
    UWAGA: Jeśli to pole wyboru jest zaznaczone, marginesy wynikające z wyrównania są przycinane. Zaznacz tę opcję do ogólnego użytku, ale odznacz, jeśli wymagane jest porównanie obrazów na poziomie pikseli przed i po wyrównaniu.
  3. Wybierz format obrazu wyjściowego z listy wyboru (Rysunek 1D).
    UWAGA: Dostępne formaty to 'tif' (ImageJ17 format), 'dv' i 'ome.tif'; format "ome.tif" jest dostępny tylko po zainstalowaniu JDK.
  4. Określ sufiks nazwy pliku wyjściowego (Rysunek 1E, wartość domyślna to '_ALN'), która jest dodawana do nazwy pliku docelowego.
  5. W przypadku obrazów referencyjnych przesłuchów o wysokim stosunku sygnału do szumu użyj wyrównania lokalnego z listy wyboru Wyrównanie lokalne (Rysunek 1F), wybierz Projekcja, aby użyć wyrównania lokalnego i Brak, aby je wyłączyć. Użyj minimalnego rozmiaru okna 60 (Rysunek 1G).
    UWAGA: W przypadku korzystania z wyrównania lokalnego, wszystkie obrazy docelowe muszą mieć odpowiadające im obrazy referencyjne (Rysunek 2A). Wyrównanie lokalne nie jest zalecane w przypadku obrazów referencyjnych kalibracji biologicznej, ponieważ lokalne przesunięcia chromatyczne różnią się w zależności od próbki (Tabela 1). Z tego samego powodu pojedyncze lokalne wyrównanie nie może być zastosowane do wielu obrazów docelowych (Rysunek 2B). W drodze wyjątku można go zastosować, gdy próbka będąca przedmiotem zainteresowania znajduje się tylko na powierzchni szkiełka nakrywkowego, a pole widzenia jest wypełnione jasnymi obiektami, podobnie jak w przypadku próbek wielokolorowych koralików fluorescencyjnych.
  6. W przypadku wielu obrazów referencyjnych kalibracji biologicznej należy sprawdzić opcję średnich odniesień (Rysunek 1H), aby zmierzyć pojedynczy parametr wyrównania z uśrednionego obrazu, a następnie pojedynczy parametr wyrównania jest stosowany do wszystkich obrazów docelowych (Rysunek 2C). Wybierz Brak dla wyrównania lokalnego (Rysunek 1F).
  7. Kliknij Uruchom wszystko (Rysunek 1I), aby rozpocząć pomiary; parametry wyrównania są stosowane do obrazów docelowych.
    UWAGA: Po zmierzeniu przesunięć chromatycznych z plików referencyjnych, program tworzy pliki z rozszerzeniem "chromagnon.csv" lub "chromagnon.tif". Typ pliku wyjściowego zależy od tego, czy obowiązuje wyrównanie lokalne (Rysunek 1F). Jeśli wyrównanie jest wykonywane bez wyrównania lokalnego, wynikiem jest "chromagnon.csv", natomiast jeśli używane jest wyrównanie lokalne, wyjściem jest "chromagnon.tif". Nazwy plików są takie same jak w pliku referencyjnym, z wyjątkiem określonego sufiksu (Rysunek 1J, wartość domyślna to bez sufiksu) i rozszerzenia ("chromagnon.csv" lub "chromagnon.tif"). Szczegółowy opis procesu wyrównywania znajduje się w pliku "Chromagnon.log" utworzonym w tym samym folderze.
  8. Poczekaj, aż poprawiony obraz pojawi się w przeglądarce (Rysunek 3).
    UWAGA: Przeciągnięcie obrazu za pomocą myszy przesuwa obraz, a przesunięcie kółka myszy zmienia powiększenie. Przesuń suwak (Rysunek 3A), aby zmienić sekcję Z (i/lub T, jeśli dotyczy) do wyświetlenia. Jeśli przeglądarka działa zbyt wolno, aby odświeżyć obraz, kliknij przycisk Załaduj całe dane do pamięci (Rysunek 3B), aby zatrzymać dostęp do danych na dysku twardym. Przeciągnięcie lewej lub prawej krawędzi kolorowych pól (Rysunek 3C) może kontrolować minimalne lub maksymalne wartości wyświetlania. Kliknięcie przycisku dla każdego kanału (Rysunek 3D) przełącza między pokazywaniem lub ukrywaniem wybranego kanału w przeglądarce. Kliknięcie prawym przyciskiem myszy na pole koloru (Rysunek 3D) umożliwia użytkownikom wybór kolorów do wyświetlenia lub zmianę opcji wyświetlania paska kolorów, a także pozwala użytkownikom określić dokładne minimalne i maksymalne wartości skalowania wyświetlacza, wybierając "skaluj do...". Kliknięcie przycisku Widok ortogonalny (Rysunek 3E) powoduje wyświetlenie obrazów widoków ZY i XZ. Przesunięcie linii poprzecznych powoduje zmianę położenia, które ma być wyświetlane w widokach bocznych.

figure-protocol-4
Rysunek 3: Zrzut ekranu przeglądarki obrazów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Aby sprawdzić, czy pomiar został wykonany poprawnie, przeciągnij i upuść obrazy referencyjne do "Pole referencyjne" i "Pole docelowe". Uruchom program i sprawdź, czy obrazy idealnie na siebie nakładają się.
    UWAGA: Jeśli są dostępne, pliki "chromagnon.csv" lub "chromagnon.tif" mogą być używane jako odniesienia w celu pominięcia pomiarów. Jeśli przesunięcie chromatyczne obrazu pozostaje nieskorygowane, wypróbuj rozwiązania podsumowane w Tabeli 2.
  2. Aby uzyskać dostęp do parametrów wyrównania w próbce lub gdy parametry wyrównania muszą być edytowane ręcznie, otwórz pliki "chromagnon.csv" bezpośrednio w dowolnym edytorze tekstu lub oprogramowaniu do arkuszy kalkulacyjnych. Po edycji zapisz go jako "csv".
    UWAGA: Wartości są podane w pikselach dla "tz", "ty", "tx" i w stopniach dla "r" oraz we współczynnikach powiększenia dla "mz", "my" i "mx".
    1. Możesz też załadować plik "chromagnon.csv" lub "chromagnon.tif" do pola referencyjnego lub docelowego Chromagnona (Rysunek 1), a następnie kliknąć go dwukrotnie, aby otworzyć edytor wyrównania (Rysunek 4).
    2. Aby zobaczyć, jak bardzo kanał jest przesuwany podczas edycji parametrów, przeciągnij i upuść plik obrazu referencyjnego na dolny obszar (Rysunek 4A), aby otworzyć obraz w edytorze. Po edycji wartości w tabeli (Rysunek 4B) i naciśnięciu enter/return, obserwuj, jak obraz odpowiedniego kanału porusza się wraz ze zmianą wartości. Po edycji kliknij zapisz jako... (Rysunek 4C), aby zapisać zmiany.

figure-protocol-5
Rysunek 4: Zrzut ekranu przedstawiający edytor parametrów wyrównania. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Aby sprawdzić lokalną mapę wyrównania, załaduj "chromagnon.tif" za pomocą pola Odniesienie lub Cel Chromagnon (Rysunek 1) i kliknij go dwukrotnie, aby otworzyć edytor wyrównania (Rysunek 4). Kliknij view (Rysunek 4D), aby wyświetlić lokalne przesunięcie oznaczone liniami, których długości są powiększone przez współczynnik określony na liście wyboru powiększenia (Rysunek 4E).
    UWAGA: Określając "oryginalny plik obrazu" (Rysunek 4F), przesunięcia są odwzorowywane wraz z oryginalnym obrazem.

4. Generowanie lokalnej mapy wyrównania specyficznej dla mikroskopu

  1. Rozcieńczyć 2 μl wielokolorowych kulek fluorescencyjnych o średnicy 200 nm w 18 μl etanolu.
  2. Zmieszać roztwór i umieścić 10 μl roztworu kulek na środku naczynia ze szklanym dnem. Upewnij się, że używasz szkła nakrywkowego #1.5 (o grubości 0.170 mm) do mikroskopii o wysokiej rozdzielczości.
  3. Pozostaw naczynie w temperaturze RT na 1 godzinę do całkowitego wyschnięcia.
  4. Umieść naczynie pod mikroskopem, który ma być skalibrowany i skup się na koralikach fluorescencyjnych.
  5. Uzyskaj obrazy 2D lub 3D za pomocą mikroskopu, który ma być kalibrowany. Uzyskujesz wiele obrazów, zmieniając położenie stołu montażowego.
  6. Otwórz graficzny interfejs użytkownika Chromagnon.
  7. Przeciągnij i upuść pliki obrazów koralików w polu "Odniesienie" (Rysunek 1) lub kliknij Pliki referencyjne (Rysunek 1A), aby otworzyć okno dialogowe wyboru plików.
  8. Sprawdź opcję średnich referencji (Rysunek 1H). Z listy wyboru Wyrównanie lokalne (Rysunek 1F) wybierz Projekcja. Użyj minimalnego rozmiaru okna 60 (Rysunek 1G). Kliknij Uruchom wszystko (Rysunek 1I), aby rozpocząć pomiary.
    UWAGA: Tworzony jest plik ".chromagnon.tif", w którym przechowywana jest lokalna mapa wyrównania mikroskopu.
  9. Po pomiarze kliknij Dodatkowe parametry (Rysunek 1K). W polu Lokalne zniekształcenie instrumentu mikroskopowego kliknij listę wyboru i wybierz opcję Nowy..., aby otworzyć okno dialogowe. Przeciągnij i upuść plik "chromagnon.tif" wygenerowany w kroku 4.8 do pola nazwy pliku lub kliknij przycisk wyboru pliku, aby otworzyć okno dialogowe wyboru plików. Wprowadź nazwę mikroskopu i kliknij przycisk OK.
  10. Podczas pomiaru przesunięć chromatycznych na podstawie przesłuchów lub obrazów referencyjnych kalibracji biologicznej kliknij opcję Dodatkowe parametry (Rysunek 1K). Z pola Lokalne zniekształcenie mikroskopu wybierz nazwę mikroskopu określoną w kroku 4.9. Kliknij przycisk OK.
    UWAGA: Wybór opcji "Lokalne zniekształcenia mikroskopu" nie jest zapisywany po wyłączeniu programu.
  11. Przejdź do korekcji chromatycznej bez lokalnego wyrównania, jak w sekcji 3.
    UWAGA: Oprócz kalibracji mikroskopu możliwe jest również użycie lokalnego wyrównania. W takim przypadku wyrównanie lokalne rozpoczyna się od kalibracji mikroskopu.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przykład korekcji przesunięcia chromatycznego za pomocą obrazu referencyjnego przesłuchu jest pokazany w Rysunek 5. Obraz uzyskano za pomocą mikroskopu szerokokątnego wyposażonego w pojedynczą kamerę. Emisja fluorescencji z DAPI została wykorzystana jako odniesienie (Rysunek 5A,B) w celu skorygowania kanałów niebieskiego, zielonego i czerwonego. Obraz składa się z 3 kanałów po 60 plasterków Z, z których każdy składa się z 256 x 256 pikseli. Obrazy zostały zdekonwolucjonowane przed pomiarem przesunięć chromatycznych. Pomiar lokalnych przesunięć chromatycznych za pomocą Chromagnon trwał 51 s na komputerze Mac z procesorem Intel Core i7 (czterordzeniowym, 8-wątkowym, 2,7 GHz), 16 GB pamięci RAM i 1 TB pamięci flash. Parametr alignment został zastosowany do obrazu docelowego (Rysunek 5C,D), który ma dokładnie taką samą liczbę wokseli jak obraz referencyjny. Przygotowanie wyrównanego pliku zajęło 3 sekundy. W wyniku przycięcia pikseli krawędzi podczas procesu wyrównywania (pole wyboru marginesów kadrowania w Rysunek 1C), liczba wokseli została zmniejszona po wyrównaniu (Rysunek 5B, 51 plasterków Z, 252 x 251 pikseli). DNA w mostku anafazowym (oznaczonym grotami strzałek) jest nieprawidłowo widziane na zewnątrz otoczki jądrowej przed wyrównaniem (Rysunek 5C, oczywisty w dolnym panelu pokazującym widok XZ), ale zgodnie z oczekiwaniami wewnątrz otoczki po wyrównaniu ( Rysunek 5D).

Przykład korekcji przesunięcia chromatycznego przy użyciu obrazu referencyjnego kalibracji biologicznej jest pokazany w Rysunek 6. Obrazy uzyskano za pomocą mikroskopu SIM wyposażonego w trzy kamery. Uśredniono trzy obrazy komórek HeLa barwionych falloidynami sprzężonymi z niebieskimi, zielonymi i czerwonymi barwnikami (Figura 6A). Obraz referencyjny składa się z 3 kanałów po 76 wycinków Z, z których każdy składa się z 1 024 x 1 024 pikseli. Pomiar przesunięć chromatycznych przy użyciu Chromagnon bez lokalnego wyrównania wymagał 194 s w opisanym powyżej systemie Mac. Parametr został zastosowany do obrazu docelowego składającego się z 3 kanałów po 73 wycinki Z, z których każdy składa się z 1,024 x 1,024 pikseli. Wygenerowanie wyrównanego pliku zajęło 25 sekund. Widok XZ pokazuje nieprawidłowe pozycje kanałów wzdłuż Z i nieznacznie wzdłuż kierunków X (Rysunek 6A,C), ale ta błędna rejestracja została poprawiona po wyrównaniu (Rysunek 6B,D).

figure-results-1
Rysunek 5: Przykład wyrównania z obrazem referencyjnym przesłuchu. Komórki HeLa barwiono DAPI dla DNA (pokazane w kolorze magenta), Alexa Fluor 488 (pokazane na żółto) dla otoczki jądrowej i Alexa Fluor 555 (pokazane na niebiesko) dla mikrotubul. Obrazy uzyskano za pomocą mikroskopii szerokokątnej 3D za pomocą jednej kamery i zdekonwoluowano. Panie przewodniczący, panie i panowie! Reprezentatywny obraz referencyjny przesłuchu wykorzystujący emisję DAPI, przed i po wyrównaniu przez Chromagnon. Trzy kanały kolorów są wyświetlane jako nałożone. (C,D) Przekrój optyczny stosu 3D w trzech kanałach przed i po wyrównaniu. Osiowa aberracja chromatyczna jest oczywista na mostku anafazowym pokazanym przez groty strzałek. Podziałka w panelu A wskazuje 5 μm dla wszystkich paneli. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 6: Przykład dopasowania do obrazu referencyjnego kalibracji biologicznej Zdjęcia zostały wykonane za pomocą karty 3D-SIM wyposażonej w trzy kamery. Panie przewodniczący, panie i panowie! Obraz referencyjny uśredniony z trzech obrazów przed (A) i po (B) wyrównaniu. Komórki HeLa barwiono falloidyną sprzężoną z Alexa Fluor 405, 488 lub 594. (C,D) Obraz docelowy przed (C) i po wyrównaniu (D). Komórki HeLa barwiono DAPI dla DNA (pokazane w kolorze magenta), Alexa Fluor 488 (pokazane na żółto) dla otoczki jądrowej i Alexa Fluor 594 (pokazane na niebiesko) dla mikrotubul. Podziałka w panelu A wskazuje 5 μm dla wszystkich paneli. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Procedura korekcji chromatycznej to kompromis między dokładnością a wysiłkiem. Aby zaoszczędzić niepotrzebnych wysiłków, lepiej wiedzieć, jaka dokładność jest wymagana do twojego badania. Najwyższa dokładność może nie być wymagana w przypadku konwencjonalnego obrazowania szerokokątnego (na żywo), a zatem obrazy referencyjne w jasnym polu są często wystarczające do skorygowania przesunięcia chromatycznego. Podobnie, gdy warunki obrazowania i środowisko są stałe, wielokrotne stosowanie kalibracji biologicznej pozwoli zaoszczędzić czas. Z drugiej strony, jeśli pożądana jest bardzo dokładna rejestracja, konieczne są wysokiej jakości przesłuchy lub obrazy referencyjne kalibracji biologicznej. Aby uzyskać najlepszą wydajność, obrazy referencyjne powinny być uzyskiwane w jak najbardziej zbliżonych warunkach i czasie do obrazów docelowych. Tak długo, jak zarówno obrazy referencyjne, jak i docelowe są uzyskiwane za pomocą tej samej mikroskopii, wyższa rozdzielczość przestrzenna poprawi dokładność korekcji. Jeśli dekonwolucja jest dostępna zarówno dla obrazów referencyjnych, jak i docelowych, implementacja jej przed korekcją może poprawić dokładność korekcji. Ponadto, aby uzyskać najlepszą wydajność, twierdzenie o próbkowaniu dla osi optycznej (Z) powinno być spełnione zarówno w pliku referencyjnym, jak i docelowym w celu precyzyjnej interpolacji subpikseli (krok 2.1.3 protokołu).

Brak korekty przesunięcia chromatycznego prowadzi do błędnych wniosków. Co więcej, użycie niewłaściwej kalibracji może nawet pogorszyć przesunięcia chromatyczne, zamiast je korygować, dlatego należy tego unikać. W tabeli 2 podsumowaliśmy możliwe przyczyny awarii i ich najczęstsze rozwiązania. Aby zbadać przyczynę awarii, w pierwszej kolejności należy wizualnie sprawdzić, czy przesunięcie chromatyczne w obrazie referencyjnym jest precyzyjnie skorygowane (krok 3.12 protokołu). Większość awarii wynika z jakości obrazów referencyjnych i można je łatwo usunąć zgodnie z opisami w tabeli 2. Jeśli chodzi o jakość obrazów referencyjnych, należy zauważyć, że dokładność globalnego wyrównania zmniejsza się, jeśli całe pole widzenia nie jest wypełnione próbką (Rysunek 7, Tabela 2). W porównaniu z dobrym przykładem pokazanym na rysunku 7A, zły przykład pokazany na rysunku 7B zawiera tylko trzy otoczki jądrowe w lewym górnym obszarze, a Chromagnon nie zdołał wyrównać części tego obrazu. Dzieje się tak, ponieważ metoda globalnego wyrównania Chromagnona dzieli pole widzenia na cztery obszary (rysunek 7C) w celu zmierzenia różnic w rotacji i powiększeniu z dużą dokładnością3. Ta metoda, jeśli jest stosowana prawidłowo, jest o jeden rząd dokładniejsza niż inne metody liniowe, takie jak transformacja logarytmiczna biegunowa i metody sympleksowe3. Jeśli którykolwiek z czterech regionów jest niedostępny, Chromagnon przełączy się na mniej efektywne metody liniowe. W związku z tym, aby uzyskać najlepszą wydajność, przykłady pokazane na rysunku 7B i rysunku 7C są niepożądane, a cztery obszary powinny być wypełnione obiektami. Użytkownicy mogą sprawdzić, czy któryś z kwadratowych obszarów pola widzenia jest niedostępny do pomiaru, patrząc na plik dziennika ("Chromagnon.log"; patrz krok 3.10 protokołu). Na szczęście problem ten można łatwo rozwiązać, uśredniając wiele obrazów kalibracji biologicznej lub stosując lokalne wyrównanie dla przesłuchów lub obrazów referencyjnych jasnego pola (Tabela 2). W przeciwieństwie do przypadku braku korekty obrazów referencyjnych, brak korekty obrazów docelowych jest trudniejszy do zidentyfikowania. Ponieważ takie awarie wynikają z różnic w formatach plików, warunkach obrazowania, czasie obrazowania, metodach obrazowania/wyrównywania między obrazem referencyjnym a docelowym (Tabela 2), użytkownicy powinni zawsze zachować ostrożność podczas korzystania z obrazów referencyjnych, które są uzyskiwane w różnych warunkach/czasie od obrazów docelowych. Niektóre przykładowe obrazy są dostępne do testowania (https://github.com/macronucleus/Chromagnon) w celu uzyskania konkretnego wyobrażenia o dobrych i złych przykładowych obrazach.

ProblemPrzyczynaRozwiązanie
Nie udało się poprawić obrazu referencyjnegoNiski kontrastJeśli to możliwe, uzyskaj obraz o wyższym kontraście. Jeśli używany jest obraz referencyjny w jasnym polu, ponownie uzyskaj obraz w roztworze na bazie wody, aby uzyskać wyższy kontrast komórki. Możesz też spróbować zastosować obliczeniową redukcję szumów (np. filtrowanie gaussowskie). Wyłącz wyrównanie lokalne, które jest bardziej wrażliwe na szumy.
Zanieczyszczenie niepowiązanych obrazówJeśli to możliwe, usuń źródło niepowiązanych obrazów w próbce. W przypadku obrazów referencyjnych przesłuchów sprawdź widma wzbudzenia barwników użytych do obrazów docelowych. Jeśli barwniki są wzbudzane podczas pozyskiwania obrazu przesłuchu (np. Alexa Fluor 568 lub 594), rozważ inne barwniki (np. Alexa Fluor 555). Jeśli kurz na chipie aparatu tworzy wyraźną różnicę kanałów, wyczyść chip kamery lub użyj obliczeniowej metody płaskiego pola.
Niezwykle jasna plama wytworzona przez promieniowanie kosmiczneJeśli to możliwe, uzyskaj obraz ponownie. Możesz też spróbować zastosować obliczeniową redukcję szumów (np. filtrowanie mediany lub gaussa).
Artefakty dekonwolucyjne (sztuczne sygnały na krawędziach osiowych i bocznych)Przytnij piksele krawędzi lub sekcje Z po dekonwolucji. Jeśli jedna strona jest przycinana, druga strona również powinna być przycinana, aby zachować środek obrazu.
Zbyt rzadki rozmiar kroku ZStos Z powinien zostać uzyskany, aby spełnić kryterium Nyquista, jak zapisano w protokole 2.1.3.
Aberracja optycznaAberracja sferyczna to główna aberracja powodowana przez użytkowników. Wybierz odpowiednią soczewkę obiektywową do próbki i użyj szkiełka nakrywkowego o grubości 170 μm. Jeśli soczewka obiektywu jest wyposażona w pierścień korekcyjny, wyreguluj go, aby znaleźć pozycję, w której uzyskuje się największą liczbę fluorescencji z ostrości. W przypadku obiektywu immersyjnego z olejkiem bez pierścienia korekcyjnego należy wyregulować współczynnik załamania światła olejku immersyjnego, który zwiększa liczbę fluorescencji w ognisku.
Pole widzenia jest niewypełnione (rys. 7)W przypadku obrazów referencyjnych kalibracji biologicznej należy uśrednić wiele obrazów. W przypadku przesłuchów lub obrazów referencyjnych w jasnym polu należy użyć wyrównania lokalnego.
Niezidentyfikowany błąd w oprogramowaniuZgłoś problem za pośrednictwem usługi GitHub (https://github.com/macronucleus/Chromagnon/issues)
Nie udało się poprawić obrazu docelowegoMetadane pliku obrazu zostaną utraconeUżyj oryginalnego formatu pliku mikroskopu, który zawiera pełne metadane, i unikaj konwertowania na wielostronicowy plik tiff przed przetworzeniem. Używaj tej samej kolejności kanałów, jaka została zapisana w protokole 3.3.
Niewłaściwe metody wyrównania dla danej mikroskopiiNie należy stosować metody wyrównania lokalnego podczas pomiaru z obrazów referencyjnych kalibracji biologicznej do obrazów docelowych. Nie należy używać obrazów referencyjnych przesłuchów innych niż mikroskopia szerokokątna.
Różnice w warunkach obrazowaniaUtrzymuj stałe warunki obrazowania między obrazem odniesienia a obrazem docelowym, jak zapisano w protokole 2.3.3.
Różnice w próbce (w tym szkiełko nakrywkowe)Zawsze używaj tego samego medium mocującego, szkiełka nakrywkowego (np. nr 1.5H) i podobnej głębokości ostrości.
Przesunięcie mikroskopu od czasu ostatniej kalibracjiKalibrację należy wykonywać nawet co dwa tygodnie. Utrzymuj stałą temperaturę i używaj ruchomego stołu, aby uniknąć dryfu sprzętowego mikroskopu.

Tabela 2: Rozwiązywanie problemów z korekcją chromatyczną.

figure-discussion-1
Rysunek 7: Przykłady obrazów referencyjnych. Otoczka jądrowa w rozszczepionych komórkach drożdży znakowana GFP i mCherry. Obrazy uzyskano za pomocą konwencjonalnej mikroskopii szerokokątnej. Przesunięcia chromatyczne zostały skorygowane za pomocą Chromagnon bez lokalnego wyrównania, przy użyciu samych obrazów jako obrazów referencyjnych. Obrazy zostały następnie zdekonwolucjonowane, aby pokazać szczegóły. (A) Dobry przykład z wieloma obiektami w polu widzenia. (B) Zły przykład z obiektami tylko w lewym górnym rogu. Niewspółosiowość jest oczywista w pewnym obszarze obrazu. (C) Niepożądany przykład kiedy jedna z czworościanek (oddzielona przerywanymi liniami krzyżowymi) jest pusta. Podziałka liniowa w panelu A wskazuje 5 μm dla widoku pełnego pola i 1,25 μm dla widoku powiększonego i ma zastosowanie do wszystkich paneli. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

W niniejszym protokole opisaliśmy trzy różne typy referencji (Tabela 1). Wśród nich obrazy referencyjne przesłuchów i obrazy referencyjne kalibracji biologicznej wymagają dalszego, starannego omówienia. W przypadku obrazów referencyjnych przesłuchów próbki wybarwione DAPI lub Hoechst 33342 i zamontowane w glicerolu lub komercyjnych nośnikach montażowych mogą być skutecznie wykorzystane do wyrównania kanałów niebieskiego, zielonego i czerwonego. Podobnie Alexa Fluor 488 może być używana do wyrównania kanałów zielonego i czerwonego. Jednak uzyskanie fluorescencji przesłuchu jest często trudne, ponieważ wiele niebieskich barwników, z wyjątkiem DAPI i Hoechst, jest ciemniejszych i rozpada się szybciej niż większość zielonych i czerwonych barwników. Co więcej, widma emisyjne współczesnych barwników są węższe, co sprawia, że wyrównanie więcej niż trzech kanałów tą metodą jest trudne. Należy również zwrócić uwagę na niektóre popularne czerwone barwniki (np. Alexa Flour 568 i 594, ale nie Alexa Fluor 555), które mogą być wzbudzane przez światło fioletowe, co uniemożliwia uzyskanie obrazów przesłuchów o wysokim kontraście z niebieskich barwników. Inną wadą jest to, że metoda ta nie może mierzyć aberracji chromatycznej ścieżek światła wzbudzenia w wzbudzeniu wielokolorowym, ponieważ do wzbudzenia używana jest tylko jedna długość fali wzbudzenia (tabela 1). Ponieważ większość zaawansowanych mikroskopów wykorzystuje zmienioną optykę oświetleniową, zastosowanie tej metody jest ograniczone. Mimo to jego wyższa dokładność korekcji jest na tyle korzystna, że można go opisać w niniejszym protokole. Ogólnie rzecz biorąc, obraz przesłuchu powinien być wykonywany po obrazie docelowym, aby zapobiec wybielaniu lub efektom fototoksycznym. W przypadku SMLM obserwowanego w trybie szerokiego pola, obraz referencyjny powinien zostać uzyskany przed uzyskaniem obrazu docelowego, ponieważ barwniki fluorescencyjne mogą być wybielane podczas obrazowania.

Obrazy referencyjne kalibracji biologicznej umożliwiają użytkownikom łatwe wyrównanie dowolnej liczby kanałów kosztem dodatkowego przygotowania próbki. Kolejną zaletą obrazów referencyjnych kalibracji biologicznej jest możliwość "uśredniania" wielu odniesień, co pomaga wypełnić wszystkie pola widzenia. W przypadku tej metody mogą występować różnice w warunkach obrazowania, jeśli próbka kalibracyjna jest przygotowywana na innym szkiełku. Większość tego problemu można rozwiązać, jeśli zarówno cele, jak i odniesienia są przygotowywane na tym samym szkiełku przy użyciu komercyjnych komór nakrywkowych (Tabela 1), a inne warunki obrazowania są utrzymywane na stałym poziomie, jak w kroku 2.3.3 protokołu. W takim przypadku można oczekiwać dokładności korekcji podobnej do tych, które występują w przypadku obrazów referencyjnychprzesłuchów 3. Protokół stosowania falloidyny, jak pokazano tutaj, jest jednym z najłatwiejszych sposobów barwienia pojedynczej struktury komórkowej wieloma kolorami. Istnieje wiele możliwych scenariuszy przygotowania biologicznych próbek kalibracyjnych. W przypadku barwienia immunologicznego próbkę można znakować pojedynczym przeciwciałem pierwszorzędowym, a następnie barwić przeciwciałami drugorzędowymi o wielu kolorach. W ten sposób pojedyncza struktura docelowa może być oznaczona wieloma kolorami. Alternatywnie, 5-etynylo-2'-deoksyurydyna, wykryta przez "klik" znakuje chemią nowo zsyntetyzowane DNA w wielu kolorach przy dużej gęstości, jak opisano szczegółowo wcześniej8. W przypadku żywych komórek przydatne jest przygotowanie szczepu transgenicznego zawierającego dwie kopie genu, które są połączone z GFP lub mCherry, aby oznaczyć tę samą strukturę dwoma kolorami. Jeśli liczba kopii genu jest krytyczna, jak często obserwuje się w przypadku białek błonowych, pojedyncza kopia genu może być tandemowo połączona z GFP i mCherry (ryc. 7). Fotokonwertowalne białka fluorescencyjne, takie jak mEOS218, mogą być również stosowane poprzez oświetlenie umiarkowanym poziomem światła fioletowego w celu uzyskania obu rodzajów białek z fotokonwersją lub bez. W warunkach niskiej zawartości tlenu GFP może być również stosowany jako białko fotokonwertowalne z zielonego na czerwone 19,20. Wybór odpowiedniej próbki kalibracyjnej sprawi, że eksperyment będzie bardziej solidny.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było wspierane przez JSPS KAKENHI Granty Numery JP19H03202 do A.M., JP18H05528 i JP17H03636 do T.H., oraz JP17H01444 i JP18H05533 do H.Y. L.S. dziękuje za wsparcie ze strony Welcome Trust Strategic Awards 091911 oraz 107457/Z/15/Z finansujące zaawansowane obrazowanie w Micron Oxford.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
16% roztwór formaldehyduPolyscience18814-10
35 mm naczynie ze szklanym dnemMatTekP35G-1.5-10-C
Alexa Fluor 405 falloidynaThermo Fisher ScientificA30104
Alexa Fluor 488 falloidynaThermo Fisher ScientificA12379
Alexa Fluor 594 falloidynaThermo Fisher ScientificA12381
Surowica bydlęcaThermo Fisher Scientific16170078
Szkiełko nakrywkoweMatsunamiNo. 1S HT
DAPI (4',6-diamidino-2-fenyloindol, dichlorowodorek)Thermo Fisher ScientificD1306
Dulbecco' s Zmodyfikowana pożywka Eagle z L-Gln i pirogronianem soduNacalai Tesque08458-16
Pożywka montażowa (VECTASHIELD)Vector LaboratoriesH-1000
Mysie przeciwciało monoklonalne antytubulinowe (TAT1)Opisane w ref 15.
Szkło nakrywkowe komorowe Nunc Lab-Tek II (8 dołków)Thermo Fisher Scientific155409
Przeciwciało poliklonalne anty-emeryny królika (ED1)Prezent od Hiroshi Yorifuji, Gunma University, Gunma, Japonia i Kiichi Arahata, National Center of Neurology and Psychiatry, Tokio, Japonia; zmarły.
Przeciwciało drugorzędowe z Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA-11034
Przeciwciało drugorzędowe z Alexa Fluor 555Thermo Fisher ScientificA-21424
Przeciwciało drugorzędowe z Alexa Fluor 594Thermo Fisher ScientificA-11032
TetraSpeck Mikrosfery, 0,2 i mikro; mThermo Fisher ScientificT7280

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schermelleh, L., et al. Super-resolution microscopy demystified. Nature Cell Biology. 21 (1), 72-84 (2019).
  2. Manders, E. M. M. Chromatic shift in multicolour confocal microscopy. Journal of Microscopy. 185 (3), 321-328 (1997).
  3. Matsuda, A., Schermelleh, L., Hirano, Y., Haraguchi, T., Hiraoka, Y. Accurate and fiducial-marker-free correction for three-dimensional chromatic shift in biological fluorescence microscopy. Scientific Reports. 8 (1), 7583(2018).
  4. Grünwald, D., Singer, R. H. In vivo imaging of labelled endogenous β-actin mRNA during nucleocytoplasmic transport. Nature. 467 (7315), 604-607 (2010).
  5. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
  6. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
  7. Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. Expansion microscopy. Science. 347 (6221), 543-548 (2015).
  8. Kraus, F., et al. Quantitative 3D structured illumination microscopy of nuclear structures. Nature Protocols. 2, 1011-1028 (2017).
  9. Hell, S. W. Far-Field Optical Nanoscopy. Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).
  10. Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
  11. Schulz, O., et al. Resolution doubling in fluorescence microscopy with confocal spinning-disk image scanning microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 110 (52), 21000-21005 (2013).
  12. Müller, C. B., Enderlein, J. Image Scanning Microscopy. Physical Review Letters. 104 (19), 198101(1981).
  13. Hayashi, S., Okada, Y. Ultrafast superresolution fluorescence imaging with spinning disk confocal microscope optics. Molecular Biology of the Cell. 26 (9), 1743-1751 (2015).
  14. Yorifuji, H., et al. Emerin, deficiency of which causes Emery-Dreifuss muscular dystrophy, is localized at the inner nuclear membrane. Neurogenetics. 1 (2), 135-140 (1997).
  15. Woods, A., Sherwin, T., Sasse, R., MacRae, T. H., Baines, A. J., Gull, K. Definition of individual components within the cytoskeleton of Trypanosoma brucei by a library of monoclonal antibodies. Journal of Cell Science. 93 (3), 491-500 (1989).
  16. Tokunaga, M., Imamoto, N., Sakata-Sogawa, K. Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells. Nature Methods. 5 (2), 159-161 (2008).
  17. Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529(2017).
  18. McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein for fusion tags. Nature Methods. 6 (2), 131-133 (2009).
  19. Sawin, K. E., Nurse, P. Photoactivation of green fluorescent protein. Current Biology. 7 (10), 606-607 (1997).
  20. Elowitz, M. B., Surette, M. G., Wolf, P. E., Stock, J., Leibler, S. Photoactivation turns green fluorescent protein red. Current Biology. 7 (10), 809-812 (1997).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Korekcja przesuni cia chromatycznegotr jwymiarowe przesuni cia chromatyczneoprogramowanie Chromagnonmikroskopia fluorescencyjnaobrazowanie superrozdzielczeprzygotowanie pr bek biologicznychakwizycja obrazu referencyjnegomikroskopia szerokopolowamikroskopia 3D SIMprotok barwienia przeciwcia ami

Powiązane artykuły