Artykuł metodologiczny

Wysoka dokładność korekcji przesunięć chromatycznych 3D w erze obrazowania biologicznego o wysokiej rozdzielczości przy użyciu Chromagnon

8.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60800

⸱

16 czerwca 2020

 ,  ,  ,  , 
1Advanced ICT Research Institute Kobe, National Institute of Information and Communications Technology, 2Graduate School of Frontier Biosciences, Osaka University, 3Micron Advanced Bioimaging Unit, Department of Biochemistry, University of Oxford

W tym artykule

Podsumowanie

Korekcja przesunięć chromatycznych w trójwymiarowych (3D) wielokolorowych obrazach mikroskopii fluorescencyjnej jest kluczowa dla ilościowych analiz danych. Protokół ten został opracowany w celu pomiaru i korygowania przesunięć chromatycznych w próbkach biologicznych poprzez pozyskiwanie odpowiednich obrazów referencyjnych i przetwarzanie za pomocą oprogramowania open source Chromagnon.

Streszczenie

Ilościowa wielobarwna mikroskopia fluorescencyjna opiera się na starannym przestrzennym dopasowaniu kanałów kolorów uzyskanych na różnych długościach fal. Ze względu na aberrację chromatyczną i niedoskonałe wyrównanie kamer, obrazy uzyskane w każdym kanale mogą być przesuwane i powiększane, a także obracane względem siebie w dowolnym z trzech wymiarów. W przypadku klasycznej metody kalibracji przesunięcia chromatyczne są mierzone za pomocą wielokolorowych koralików przymocowanych do powierzchni szkiełka nakrywkowego, a dostępnych jest wiele programów do pomiaru przesunięć chromatycznych z takich próbek kalibracyjnych. Jednak aberracja chromatyczna może zmieniać się wraz z głębokością, zmieniać się w zależności od warunków obserwacji i być indukowana przez samą próbkę biologiczną, utrudniając w ten sposób określenie rzeczywistej wielkości przesunięcia chromatycznego w próbce będącej przedmiotem zainteresowania i w całej objętości. Korekcja przesunięć chromatycznych z większą dokładnością jest szczególnie istotna w przypadku mikroskopii superrozdzielczej, gdzie tylko niewielkie przesunięcia chromatyczne mogą wpływać na analizy ilościowe i zmieniać interpretację obrazów wielokolorowych. Opracowaliśmy oprogramowanie typu open source Chromagnon i towarzyszące mu metody pomiaru i korygowania przesunięć chromatycznych 3D w próbkach biologicznych. W tym miejscu udostępniamy szczegółowy protokół aplikacji, który zawiera specjalne wymagania dotyczące przygotowania próbki, akwizycji danych i przetwarzania oprogramowania w celu pomiaru przesunięć chromatycznych w próbkach biologicznych będących przedmiotem zainteresowania.

Wprowadzenie

Obrazowanie wielokolorowe jest jednym z podstawowych aspektów biologicznej mikroskopii fluorescencyjnej, w przypadkach, gdy relacje przestrzenne różnych cząsteczek lub struktur są szczególnie interesujące. Aberracja chromatyczna, aberracja optyczna światła polichromatycznego spowodowana dyspersją, zmienia pozorne położenie kolorowych obiektów zainteresowania. Podobnie mikroskopy wyposażone w wiele kamer poświęconych rejestrowaniu każdego koloru mają bardziej złożone przesunięcia chromatyczne spowodowane różnicami w elementach optycznych i niedoskonałym wyrównaniem kanałów. W związku z tym takie przesunięcia chromatyczne mogą prowadzić do błędnych wniosków, chyba że zostaną wyraźnie skorygowane przez użytkownika. Chociaż przesunięcia chromatyczne nie stanowią większego problemu, dopóki rozdzielczość mikroskopii jest ograniczona przez klasyczny limit rozdzielczości, niedawny rozwój mikroskopii superrozdzielczej1 spowodował potrzebę dokładniejszej korekcji przesunięć chromatycznych.

Powszechną praktyką jest mierzenie przesunięć chromatycznych systemów mikroskopowych za pomocą wielokolorowego szkiełka do kalibracji koralików2. Metoda kalibracji opartej na koralikach jest odpowiednia do pomiaru przesunięć chromatycznych od całej optyki mikroskopu w kierunku powierzchni szkiełka nakrywkowego2. Metoda ta nie jest jednak w stanie zmierzyć przesunięć chromatycznych w próbkach biologicznych będących przedmiotem zainteresowania. Należy zauważyć, że wiele próbek biologicznych jest trójwymiarowych (3D), a przesunięcia chromatyczne takich próbek różnią się od tych na powierzchni szkiełka nakrywkowego. Co więcej, przesunięcia chromatyczne zmieniają się wraz z warunkami obrazowania2,3. Zmierzyliśmy przesunięcia chromatyczne w próbkach biologicznych 3D i stwierdziliśmy, że niepewność przesunięć chromatycznych wynosiła często nawet 350 nm przy użyciu klasycznej metody kalibracji wielokolorowych koralików3. W związku z tym przesunięcia chromatyczne muszą być mierzone w próbkach biologicznych na głębokości zainteresowania i w stosowanych warunkach obrazowania.

Tutaj opisujemy procedury pomiaru przesunięć chromatycznych w próbkach biologicznych i korygowania tych przesunięć za pomocą naszego oprogramowania, Chromagnon3. Aby zmierzyć przesunięcia chromatyczne w próbkach biologicznych, nasza metoda wykorzystuje dwa rodzaje zestawów danych: obraz "docelowy" i obraz "referencyjny". Obraz "docelowy" to wielokolorowy obraz będący przedmiotem zainteresowania, na przykład obrazy barwione pod kątem DNA, otoczki jądrowej i mikrotubul. Często niemożliwe jest zmierzenie przesunięć chromatycznych na takim obrazie. W związku z tym potrzebujemy obrazu "referencyjnego", który jest dedykowany do pomiaru przesunięć chromatycznych w próbce. Jedyną definicją obrazu "referencyjnego" jest wielokolorowy obraz tego samego obiektu. W tym sensie wielokolorowy obraz koralików jest również rodzajem obrazu referencyjnego. W tym miejscu opisujemy trzy różne typy obrazów referencyjnych, które są używane do pomiaru przesunięć chromatycznych w próbkach biologicznych: "obrazy referencyjne przesłuchów", "obrazy referencyjne jasnego pola" i "obrazy referencyjne kalibracji biologicznej". Rodzaj obrazu referencyjnego zależy od typu używanego mikroskopu lub wymaganej dokładności korekcji, jak podsumowano w tabeli 1.

CrosstalkJasne poleKalibracja biologiczna (na innym slajdzie)Kalibracja biologiczna (na tym samym szkiełku)
Precyzjaa++++++b+++
prostota+++++++++
Stosowana mikroskopiaSzerokie pole widzeniaSzerokie pole widzeniacałycały
Dostępność lokalnego wyrównania++-c-c
a: Liczba znaków "+" oznacza rosnącą ocenę. Pojedynczy plus to około 50 nm, a trzy plus to około 15 nm w 3D.
b: Dokładność zależy od tego, jak bardzo zmienne warunki obrazowania są utrzymywane na stałym poziomie.
c: Kalibracja lokalna mierzona za pomocą próbek wielokolorowych ściegów może być łączona zgodnie z opisem w sekcji 4 protokołu.

Tabela 1: Parametry przy wyborze typu obrazów referencyjnych.

"Crosstalk reference images" mają najwyższą dokładność korekcji i są stosunkowo proste do osiągnięcia3,4 (Tabela 1). Wadą jest ich ograniczenie w zastosowaniach mikroskopowych ze względu na niemożność pomiaru przesunięć chromatycznych w ścieżkach wzbudzenia. Ponadto, aby uzyskać takie obrazy, mikroskop powinien być wyposażony w wielopasmowe zwierciadła dichroiczne oraz filtry emisyjne, które są niezależnie sterowane od filtrów wzbudzenia lub źródeł światła. Odpowiednia mikroskopia obejmuje konwencjonalną mikroskopię szerokokątną, mikroskopię lokalizacyjną pojedynczych cząsteczek (SMLM), taką jak mikroskopia lokalizacyjna aktywowana światłem/stochastyczna mikroskopia rekonstrukcyjna optyczna (PALM/STORM)5,6 i mikroskopia ekspansywna7 obserwowane za pomocą mikroskopii szerokokątnej. Obraz referencyjny przesłuchu jest uzyskiwany z samej próbki docelowej. Jest to obraz przesłuchu (przebijającego) fluorescencji barwnika uzyskany we wszystkich wymaganych kanałach. Emisja fluorescencji zawsze rozszerza się w kierunku dłuższych fal, dlatego barwniki o najkrótszej długości fali emisji są wzbudzane w celu uzyskania fluorescencji przesłuchu w kanałach o dłuższych falach. Na przykład, gdy próbka jest barwiona na niebiesko, zielono i czerwono, wzbudzany jest tylko niebieski barwnik, a światło emisyjne uzyskuje się w kanałach niebieskim, zielonym i czerwonym. W tym protokole DNA barwione 4′,6-diamidyn-2-fenyloindolem (DAPI) wykorzystano w celu uzyskania fluorescencji przesłuchu.

"Obrazy referencyjne jasnego pola" są łatwiejszą i mniej fototoksyczną alternatywą dla "obrazów referencyjnych przesłuchów", ale są najmniej dokładne3 (Tabela 1). Są to obrazy jasnego pola próbki docelowej, uzyskane we wszystkich kanałach kolorów użytych na obrazie docelowym.

"Obrazy referencyjne kalibracji biologicznej" mają tę zaletę, że można je zastosować do każdego rodzaju mikroskopii, ze względu na ich zdolność do pomiaru przesunięć chromatycznych zarówno w ścieżce wzbudzenia, jak i emisji3,8 (Tabela 1). Odpowiednia mikroskopia obejmuje mikroskopię szerokokątną, mikroskopię konfokalną, mikroskopię arkuszy świetlnych, wymuszone zubożenie emisji (STED)9, mikroskopię oświetlenia strukturalnego (SIM)10, Airyscan/SORA11,12, SMLM obserwowany w trybie całkowitej fluorescencji wewnętrznego odbicia (TIRF), Olympus super resolution (OSR)13i tak dalej. Obraz referencyjny kalibracji biologicznej uzyskuje się z próbki kalibracyjnej podobnie przygotowanej jak próbka docelowa, ale z barwieniem pojedynczej struktury wieloma kolorami. Dokładność korekcji przewyższa rozdzielczość większości mikroskopii superrozdzielczych, a przygotowanie biologicznej próbki kalibracyjnej może być stosunkowo proste. Kolejną zaletą jest możliwość "uśrednienia" wielu obrazów referencyjnych. W związku z tym, nawet jeśli poszczególne obrazy zawierają słabe informacje do pomiaru przesunięć chromatycznych, zawartość informacji można zwiększyć, uśredniając wiele obrazów. Dokładność zależy od tego, jak bardzo warunki obrazowania są utrzymywane na stałym poziomie. Pod tym względem najlepszą wydajność uzyskuje się, gdy zarówno próbka docelowa, jak i próbka referencyjna znajdują się na tym samym szkiełku, przy użyciu np. 8-dołkowych szkieł nakrywkowych (tabela 1, skrajnie po prawej). W tym protokole aktyna barwiona trzema kolorami falloidyny została użyta jako kalibracja biologiczna.

Po uzyskaniu obrazu referencyjnego, przesunięcie chromatyczne jest mierzone i korygowane przez nasze oprogramowanie Chromagnon. Nie ma ograniczeń co do liczby kanałów, sekcji Z i ram czasowych, dla których Chromagnon może mierzyć i korygować przesunięcia chromatyczne. Chromagnon mierzy przesunięcia chromatyczne w dwóch etapach. Pierwszy krok polega na uzyskaniu parametrów wyrównania "globalnego" lub "afinicznego" translacji w osiach X, Y, Z, powiększenia wzdłuż osi X, Y, Z i obrotu wokół osi Z. Dokładność obliczeń globalnego wyrównania wynosi ~16 nm w 3D i ~8 nm w 2D. Drugim krokiem jest opcjonalne iteracyjne "lokalne wyrównanie" 2D na wyświetlanych obrazach w celu uzyskania większej dokładności. W procesie wyrównywania lokalnego obrazy są dzielone na wiele regionów i mierzone są przesunięcia chromatyczne w tych regionach lokalnych. Następnie regiony są dalej dzielone, a przesunięcia chromatyczne w podregionach są mierzone iteracyjnie, aż liczba pikseli w regionie osiągnie minimalną liczbę pikseli (zwykle 60 x 60 pikseli). Wynikowa lokalna mapa wyrównania jest łączona z globalnym parametrem wyrównania i jest stosowana do obrazu docelowego przez transformację sprężystą. Po tym kroku dokładność obliczeń poprawia się do ~14 nm w 3D i ~6 nm w 2D. Dopasowanie lokalne nie jest odpowiednie dla obrazów referencyjnych kalibracji biologicznej, ponieważ struktura biologiczna w odniesieniu różni się od struktury w obiekcie docelowym (tabela 1). W związku z tym dla obrazów referencyjnych kalibracji biologicznej używane jest tylko wyrównanie globalne.

Lokalne przesunięcia chromatyczne pochodzą z dwóch źródeł; instrumentalnego zniekształcenia lokalnego mikroskopu i biologicznej niejednorodności strukturalnej. Ponieważ zniekształcenia miejscowe instrumentalne mikroskopu są stałe, można je zmierzyć na podstawie próbki referencyjnej wielokolorowych kulek i skorygować jako stały parametr. Chromagnon może łączyć instrumentalną mapę lokalnych zniekształceń mikroskopowych z globalnymi parametrami wyrównania z kalibracji biologicznych (Tabela 1). Stosując tę metodę, oczekuje się, że średnia dokładność kalibracji biologicznej zostanie poprawiona o dodatkowe 1−2 nm.

Tutaj opisujemy protokół do korygowania przesunięć chromatycznych obrazów fluorescencyjnych 3D za pomocą naszego oprogramowania Chromagnon, od najłatwiejszego dołu do najwyższej dokładności. Jako przykład używamy barwienia immunologicznego komórek HeLa i obserwowaliśmy je za pomocą mikroskopii szerokokątnej 3D i 3D-SIM. W pierwszej części opisujemy, jak przygotować próbki docelowe i próbki do kalibracji biologicznej. Ta część protokołu powinna być zoptymalizowana pod kątem konkretnych celów badania. W drugiej części opisujemy metody pozyskiwania trzech rodzajów obrazów referencyjnych za pomocą mikroskopów. Założeniem było uzyskanie kanałów niebieskiego, zielonego i czerwonego, ale skład kanałów powinien być modyfikowany w zależności od konkretnych celów badań i ustawień mikroskopu. Nie ma znaczenia, czy mikroskop jest wyposażony w pojedynczą kamerę, czy w wiele kamer. W trzeciej części opisujemy, w jaki sposób można wykorzystać nasze oprogramowanie do pomiaru i korygowania przesunięć chromatycznych obrazu docelowego za pomocą obrazów referencyjnych. Wreszcie, w czwartej sekcji, opisujemy metodę uzupełniania obrazów referencyjnych kalibracji biologicznej przy użyciu instrumentalnej kalibracji lokalnej mikroskopu.

Protokół

1. Przygotowanie próbek

  1. Przygotowanie próbki docelowej
    1. Zasiać 2,5 x 105 komórki HeLa na szalku z dna szklanego o średnicy 35 mm i hodować je w 2 ml medium wzrostowego (podłoże Eagle’a zmodyfikowane przez Dulbecco z L-glutaminą i pirogronianem sodu, uzupełnione o 10% płodowej surowicy bydlęcej [FBS]) w temperaturze 37 °C oraz CO2 stężenie 5%. Alternatywnie, wysiać 6 x 104 komórki HeLa na szkiełku nakrywkowym z 8 komorami i hoduj je w 0,5 ml pożywki wzrostowej w 37 °C oraz CO2 stężenie 5%. Do mikroskopii o wysokiej rozdzielczości należy użyć szkiełka nakrywkowego nr 1,5 (o grubości 0,170 mm).
      UWAGA: W kolejnych etapach należy stosować objętości zmniejszone czterokrotnie dla pokryć szkiełek z 8 wgłębnikami, z wyjątkiem kroków 1.1.5, 1.1.6, 1.1.8, 1.1.1 oraz 1.2.5, w których objętość wynosi 100 µl niezależnie od rodzaju pojemnika.
    2. Po około 24 h inkubacji wymienić roztwór na 2 ml 3,7% formaldehydu w soli fizjologicznej buforowanej fosforanowo (PBS). Po delikatnym wymieszaniu kontynuować fiksację komórek przez 15 min w temperaturze pokojowej (RT) na platformie rotacyjnej.
      OSTROŻNIE: Pracować pod dygestorium.
    3. Przemyć komórki 2 ml PBS, powtarzając czynność 3 razy przez 5–10 min na rotatorze.
      UWAGA: Odpady zawierające formaldehyd należy utylizować zgodnie z lokalnymi przepisami.
    4. Przeprowadzić permeabilizację komórek, stosując 2 ml 0,1% Triton X-10 w PBS przez 5 min na platformie rotacyjnej, a następnie trzykrotnie przemyć komórki 2 ml PBS, każdy raz przez 5–10 min na platformie rotacyjnej.
    5. Inkubować komórki w 100 µL 1% albuminy surowicy wołowej (BSA) w PBS przez 1 h w temperaturze pokojowej na platformie rotacyjnej.
    6. Zastąp roztwór przez 100 µL mieszaniny przeciwciał pierwotnych (poliklonalne przeciwciało anty-emeryna14 i przeciwciało monoklonalne antytubulinowe15) w 1% BSA w PBS w odpowiednich rozcieńczeniach (1/500 dla przeciwciała anty-emeryna i 1/10 dla przeciwciała anty-tubuliny), a następnie inkubować przez noc w 4 °C.
    7. Przemyć komórki 2 ml PBS, powtarzając czynność 3–5 razy, po 10 min każdorazowo na platformie rotacyjnej.
    8. Wymień roztwór na 100 µL mieszaniny przeciwciał wtórnych (anty-królicze IgG z Alexa Fluor 48 oraz anty-mysie IgG z Alexa Fluor 5) w 1% BSA w PBS w rozcieńczeniu 1/50, a następnie inkubować przez 3–4 h w temperaturze pokojowej.
    9. Przemyj komórki 2 ml PBS, powtarzając czynność 3–4 razy po 5 min każdorazowo na platformie rotacyjnej.
    10. Wymień roztwór na 2 ml 0.5 µg/mL DAPI w PBS do barwienia DNA przez 30 min w temperaturze pokojowej na platformie rotacyjnej.
      UWAGA: Zamiast DAPI można również zastosować Hoechst 342 w tym samym stężeniu.
    11. Wymień roztwór na ~100 µL medium montażowego (Tabela materiałów).
  2. Przygotowanie biologicznej próbki kalibracyjnej
    1. Przygotować utrwalone komórki zgodnie z opisem w krokach 1.1.1–1.1.4.
      UWAGA: Zaleca się przygotowanie próbek na szkiełkach nakrywkowych z komorami, aby umieścić zarówno próbkę badaną, jak i referencyjną w oddzielnych komorach na tym samym szkiełku nakrywkowym (Tabela 1, najbardziej po prawej). Takie przygotowanie jest preferowane w przypadku eksperymentów wymagających najwyższej dokładności korekcji. Gdy próbka musi zostać przygotowana na zwykłym szkiełku nakrywce, należy użyć precyzyjnych szkiełek nakrywczych o niskiej zmienności grubości („No. 1.5H”), aby zapewnić powtarzalność.
    2. Przygotować roztwór zapasowy falloidyny sprzężonej z barwnikiem fluorescencyjnym w 1,5 ml metanolu i przechowywać w temperaturze -20 °CWymieszać roztwór zapasu falloidyny w PBS w następujących rozcieńczeniach: 1/10 dla falloidyny z Alexa Fluor 405, 1/10 dla falloidyny z Alexa Fluor 48 oraz 1/20 dla falloidyny z Alexa Fluor 594.
    3. Roztwór należy zastąpić 1 ml mieszaniny faloidyny przygotowanej w kroku 1.2.2 i inkubować przez 30 min w temperaturze pokojowej na platformie rotacyjnej.
    4. Przemyć komórki 2 ml PBS, powtarzając czynność 3–5 razy, przez 10 min każdorazowo na rotatorze.
    5. Wymień roztwór na ~100 µL medium montażowego.
      UWAGA: Próbki kalibracyjne mogą być przechowywane w 4 °C lub -20 °C do wielokrotnego użytku.

2. Pozyskiwanie obrazów referencyjnych

  1. Obrazy referencyjne przesłuchów
    1. Umieść przygotowaną w kroku 1.1 próbkę docelową pod mikroskopem szerzenia.
    2. Należy wykonać obraz fluorescencyjny celu w kanałach niebieskim, zielonym i czerwonym.
      UWAGA: W przypadku obrazów 3D wielkość kroku Z w obrazie referencyjnym może różnić się od wielkości kroku w obrazie docelowym, pod warunkiem, że plik obrazu zawiera informacje o wielkości kroku. Wielkość kroku Z dla obrazów referencyjnych i docelowych powinna być najlepiej mniejsza niż połowa rozdzielczości optycznej osi Z, którą oblicza się według wzoru Równanie limitu dyfrakcyjnego, \(2\lambda/NA^2\), stosowane w analizie rozdzielczości optycznej. dla mikroskopii z ograniczeniem dyfrakcyjnym, w której λ czy długość fali jest podana w nanometrach i ND jest aperturą numeryczną obiektywu. Na przykład, jeśli rozdzielczość osiowa wynosi 50 nm, należy zastosować krok Z mniejszy niż 275 nm. W przypadku obrazu referencyjnego serie czasowe nie są wymagane.
    3. Następnie, aby uzyskać obraz fluorescencyjny próbki referencyjnej, należy wybrać wyłącznie światło wzbudzenia dla DAPI oraz wybrać akwizycję w kanałach niebieskim, zielonym i czerwonym. Obraz referencyjny należy zarejestrować dokładnie w tej samej pozycji preparatu i na tej samej wysokości Z, w przypadku stosu 3D.
      UWAGA: W przypadku dłuższych długości fal emisji wymagane będzie zwiększenie intensywności oświetlenia oraz czasu ekspozycji.
  2. Obrazy referencyjne w jasnym polu
    1. Umieść próbkę docelową przygotowaną w kroku 1.1 na mikroskopie szerokopolowym.
    2. Należy uzyskać obraz fluorescencyjny celu w kanałach niebieskim, zielonym i czerwonym.
      UWAGA: Wartość kroku Z powinna najlepiej spełniać kryterium Nyquista, zgodnie z opisem w kroku 2.1.2.
    3. Wykonaj obraz w jasnym polu obiektu docelowego w kanałach niebieskim, zielonym i czerwonym dokładnie w tej samej pozycji stolika, co w punkcie 2.2.2, oraz na tej samej wysokości Z w przypadku stosu 3D.
  3. Obrazy referencyjne do kalibracji biologicznej
    1. Umieść próbkę docelową przygotowaną w kroku 1.1 na mikroskopie 3D-SIM.
    2. Należy pozyskać obraz fluorescencyjny celu w kanałach niebieskim, zielonym i czerwonym za pomocą techniki 3D-SIM. Następnie należy zrekonstruować obraz o wysokiej rozdzielczości (super-resolved image).
      UWAGA: Mikroskop może być dowolnego typu, np. 3D-SIM, konfokalny, STED itp. Wartość kroku Z powinna najlepiej spełniać kryterium Nyquista, opisane w kroku 2.1.2.
    3. Należy pozyskać za pomocą 3D-SIM wiele obrazów fluorescencyjnych referencji przygotowanej w kroku 1.2 w różnych pozycjach sceny, analogicznie do obrazu docelowego (krok 2.3.2). Następnie należy zrekonstruować obrazy o wysokiej rozdzielczości (super-resolved).
      UWAGA: Całkowita liczba pikseli w osiach XY musi być taka sama we wszystkich obrazach referencyjnych. Wielkość kroku w osi Z musi być taka sama we wszystkich obrazach referencyjnych. Zaleca się, aby całkowita liczba sekcji Z była taka sama jak w obrazie docelowym, choć nie jest to wymóg bezwzględny. Pozycja XY tych obrazów referencyjnych na stoliku nie ma znaczenia, ponieważ pozycja szkiełka nakrywkowego różni się już od pozycji próbki docelowej, a ponadto różnica w przesunięciu chromatycznym na pojedynczym szkiełku nakrywkowym wynosi mniej niż 15 nm.3Warunki obrazowania, w tym obiektyw, temperatura obserwacji, olej imersyjny, rozmiar otworu w mikroskopii konfokalnej oraz kąt nachylenia w mikroskopii z silnie nachylonym oświetleniem16, wszystkie powinny być zgodne z obrazem referencyjnym, aby uzyskać najlepsze wyniki. Jeśli mikroskop jest wyposażony w kilka kamer do jednoczesnego obrazowania wielu kanałów, obrazy referencyjne powinny być pozyskiwane co najmniej raz w tygodniu w celu skorygowania dryftu instrumentalnego.

3. Korekcja przesunięcia chromatycznego przy użyciu oprogramowania Chromagnon

  1. Korzystając z przeglądarki internetowej, przejdź pod adres https://github.com/macronucleus/Chromagnon/releases i pobierz najnowszą wersję binarną programu Chromagnon.
    UWAGA: Wersje binarne są dostępne dla systemów Windows, Mac oraz niektórych wersji Linuxa.
  2. Wypakuj program i umieść plik wykonywalny w dogodnym miejscu. W systemie Windows lub Mac dwukrotnie kliknij plik, aby go uruchomić; w systemie Linux uruchom plik binarny z wiersza poleceń.
    UWAGA: Otworzy się graficzny interfejs użytkownika, przedstawiony na Rysunku 1. Przy pierwszym uruchomieniu dwuklikiem system może zablokować otwarcie programu ze względów bezpieczeństwa. W takim przypadku zastosuj zależną od platformy metodę otwierania programów pobranych z internetu.

Interfejs oprogramowania Chromagnon do przetwarzania danych; konfiguracja okien referencyjnych i docelowych; analiza widmowa.
Rysunek 1: Zrzut ekranu z Kromagnon graficzny interfejs użytkownika Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

  1. Przeciągnij i upuść pliki referencyjne do "Reference box" (Rysunek 1) lub kliknij Reference files (Rysunek 1A), aby otworzyć okno wyboru plików. W zależności od formatów plików, jeśli program poprosi o zainstalowanie zestawu narzędzi Java Development Kit (JDK), naciśnij yes, co przeniesie użytkownika na stronę pobierania. Pobierz i zainstaluj JDK dla swojego systemu operacyjnego zgodnie z instrukcjami. Po ponownym uruchomieniu programu Chromagnon powinien być w stanie odczytać dany format plików obrazów.
    UWAGA: Chromagnon obsługuje większość formatów plików obrazów (wielostronicowe 'tif', 'czi', 'nd2', 'oib', 'lif', 'dv' itp.). Na tym etapie preferowany jest oryginalny format obrazu z mikroskopu, ponieważ podczas konwersji obrazu do wielostronicowego pliku tif mogą zostać utracone metadane. Jeśli nazwa kanału jest wyświetlana jako 0, 1, 2 itp. zamiast długości fal, takich jak 528, 609 (Rysunek 2A, zielone ramki), oznacza to, że Chromagnon nie rozpoznaje tożsamości kanałów w obrazie. W takim przypadku należy upewnić się, że kolejność kanałów oraz rozmiar piksela w pliku referencyjnym są zgodne z tymi w pliku docelowym. Na przykład, jeśli kolejność kanałów w referencji to zielony i czerwony, to kolejność kanałów w pliku docelowym również musi być zielony i czerwony, a nie czerwony i zielony.

Konfiguracja chromatograficzna, analiza danych widmowych, adnotacje długości fali, schemat interfejsu oprogramowania.
Rysunek 2: Przykładowy zrzut ekranu z procesu ładowania wielu plików. (A) Przypadek, w którym wszystkie obrazy referencyjne posiadają odpowiadające im obrazy docelowe. Nazwy kanałów zostały prawidłowo zidentyfikowane na podstawie długości fal (oznaczonych zieloną ramką) w plikach obrazów wykorzystanych w tym przykładzie. (B) Przypadek, w którym pojedynczy obraz referencyjny jest wykorzystywany do korekcji wielu obrazów docelowych. (C) Przypadek, w którym uśredniano wiele obrazów referencyjnych (oznaczonych czerwoną ramką), a otrzymany po uśrednieniu obraz referencyjny został wykorzystany do korekcji wielu obrazów docelowych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

  1. Przeciągnij i upuść pliki docelowe do pola „Target box” (Rycina 1) lub kliknij Target files (Rycina 1B), aby otworzyć okno wyboru plików.
    UWAGA: Jeśli istnieje wiele obrazów docelowych i każdy z nich posiada odpowiadające mu obrazy referencyjne, odpowiedni obraz referencyjny i obraz docelowy muszą znajdować się w tym samym wierszu w odpowiednich polach referencyjnym i docelowym (Rycina 2A). Pojedynczy obraz referencyjny może być również użyty do wyrównania wielu obrazów docelowych (Rycina 2B).
  2. Zaznacz pole wyboru crop margins, jeśli nie jest zaznaczone (Rycina 1C).
    UWAGA: Jeśli to pole jest zaznaczone, marginesy powstałe w wyniku wyrównania zostaną przycięte. Zaznacz tę opcję do ogólnego użytku, ale odznacz ją, jeśli wymagane jest porównanie obrazów przed i po wyrównaniu na poziomie pojedynczych pikseli.
  3. Wybierz format obrazu wyjściowego z listy wyboru (Rycina 1D).
    UWAGA: Dostępne formaty to „tif” (format ImageJ17), „dv” oraz „ome.tif”; format „ome.tif” jest dostępny dopiero po zainstalowaniu JDK.
  4. Określ przyrostek dla nazwy pliku wyjściowego (Rycina 1E, wartość domyślna to „_ALN”), który zostanie dodany do nazwy pliku docelowego.
  5. W przypadku obrazów referencyjnych crosstalk o wysokim stosunku sygnału do szumu, użyj lokalnego wyrównania z listy wyboru Local align (Rycina 1F): wybierz Projection, aby użyć lokalnego wyrównania, oraz None, aby je wyłączyć. Ustaw minimalny rozmiar okna na 60 (Rycina 1G).
    UWAGA: Podczas korzystania z lokalnego wyrównania wszystkie obrazy docelowe muszą posiadać odpowiadające im obrazy referencyjne (Rycina 2A). Lokalnego wyrównania nie zaleca się dla obrazów referencyjnych do kalibracji biologicznej, ponieważ lokalne przesunięcia chromatyczne różnią się od próbki do próbki (Tabela 1). Z tego samego powodu pojedyncze lokalne wyrównanie nie może być zastosowane do wielu obrazów docelowych (Rycina 2B). Wyjątkiem jest sytuacja, gdy badana próbka znajduje się tylko na powierzchni szkiełka podstawowego, a pole widzenia jest wypełnione jasnymi obiektami, podobnie jak w przypadku próbek wielokolorowych kulek fluorescencyjnych.
  6. W przypadku wielu obrazów referencyjnych do kalibracji biologicznej, zaznacz opcję average references (Rycina 1H), aby zmierzyć pojedynczy parametr wyrównania z obrazu uśrednionego; pojedynczy parametr wyrównania zostanie następnie zastosowany do wszystkich obrazów docelowych (Rycina 2C). Dla Local align (Rycina 1F>) wybierz None.
  7. Kliknij Run all (Rycina 1I), aby rozpocząć pomiary; parametry wyrównania zostaną zastosowane do obrazów docelowych.
    UWAGA: Po zmierzeniu przesunięć chromatycznych z plików referencyjnych program tworzy pliki z rozszerzeniem „chromagnon.csv” lub „chromagnon.tif”. Typ pliku wyjściowego zależy od tego, czy zastosowano lokalne wyrównanie (Rycina 1F). Jeśli wyrównanie odbywa się bez wyrównania lokalnego, wynikiem jest plik „chromagnon.csv”, natomiast przy użyciu wyrównania lokalnego wynikiem jest „chromagnon.tif”. Nazwy plików są takie same jak pliku referencyjnego, z wyjątkiem określonego przyrostka (Rycina 1J, domyślnie brak przyrostka) oraz rozszerzenia („chromagnon.csv” lub „chromagnon.tif”). Szczegółowy opis procesu wyrównania znajduje się w pliku „Chromagnon.log” utworzonym w tym samym folderze.
  8. Zaczekaj, aż skorygowany obraz pojawi się w przeglądarce (Rycina 3).
    UWAGA: Przeciąganie obrazu myszą przesuwa go, a obracanie kółkiem myszy zmienia powiększenie. Przesuń suwak (Rycina 3A), aby zmienić wyświetlaną sekcję Z (i/lub T, jeśli dotyczy). Jeśli przeglądarka odświeża obraz zbyt wolno, kliknij przycisk Load whole data into memory (Rycina 3B), aby zatrzymać dostęp do danych na dysku twardym. Przeciąganie lewej lub prawej krawędzi kolorowych pól (Rycina 3C) pozwala kontrolować minimalne lub maksymalne wartości wyświetlania. Kliknięcie przycisku dla każdego kanału (Rycina 3D) przełącza widoczność wybranego kanału w przeglądarce. Kliknięcie prawym przyciskiem myszy na kolorowym polu (Rycina 3D) umożliwia wybór kolorów wyświetlania lub zmianę opcji wyświetlania paska kolorów; pozwala to również określić dokładne minimalne i maksymalne wartości skalowania wyświetlania poprzez wybór opcji „scale to …”. Kliknięcie przycisku Orthogonal view (Rycina 3E) pokazuje obrazy w rzutach ZY i XZ. Przesuwanie linii krzyża zmienia pozycję wyświetlaną w rzutach bocznych.

Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej; analiza znakowanych jąder komórkowych; wzbudzenie optyczne; narzędzie histogramu.
Rysunek 3: Zrzut ekranu z przeglądarki obrazów. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

  1. Aby sprawdzić, czy pomiar został wykonany prawidłowo, przeciągnij i upuść obrazy referencyjne do pola „Reference box” oraz „Target box”. Uruchom program i sprawdź, czy obrazy idealnie się pokrywają.
    UWAGA: Jeśli są dostępne, pliki „chromagnon.csv” lub „chromagnon.tif” mogą być użyte jako referencje w celu pominięcia pomiarów. Jeśli przesunięcie chromatyczne na obrazie pozostaje nieskorygowane, należy wypróbować rozwiązania podsumowane w Tabeli 2.
  2. Aby uzyskać dostęp do parametrów wyrównania w próbce lub gdy parametry wyrównania muszą zostać edytowane ręcznie, otwórz pliki „chromagnon.csv” bezpośrednio za pomocą dowolnego edytora tekstu lub programu do arkuszy kalkulacyjnych. Po edycji zapisz plik jako „csv”.
    UWAGA: Wartości dla „tz”, „ty”, „tx” podawane są w pikselach, dla „r” w stopniach, a dla „mz”, „my” i „mx” jako współczynniki powiększenia.
    1. Alternatywnie można wczytać plik „chromagnon.csv” lub „chromagnon.tif” do pola Reference lub Target programu Chromagnon (Rysunek 1), a następnie kliknąć go dwukrotnie, aby otworzyć edytor wyrównania (Rysunek 4).
    2. Aby zobaczyć, jak bardzo kanał jest przesunięty podczas edycji parametrów, przeciągnij i upuść plik obrazu referencyjnego na dolny obszar (Rysunek 4A), aby otworzyć obraz w edytorze. Po edycji wartości w tabeli (Rysunek 4B>) i naciśnięciu klawisza enter/return, zaobserwuj, jak obraz odpowiadającego kanału przesuwa się wraz ze zmianą wartości. Po edycji kliknij save as… (Rysunek 4C>), aby zapisać zmiany.

Interfejs analizy danych chromatograficznych; wyświetlanie długości fal, ustawień i opcji plików.
Rysunek 4: Zrzut ekranu edytora parametrów dopasowania. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Aby sprawdzić lokalną mapę wyrównania, należy wczytać plik „chromagnon.tif” poprzez pole Reference lub Target w programie Chromagnon (Rysunek 1), a następnie dwukrotnie kliknąć go, aby otworzyć edytor wyrównania (Rysunek 4). Kliknij view (Rysunek 4D), aby wyświetlić lokalne przesunięcie wskazane liniami, których długość jest powiększona przez czynnik określony na liście wyboru magnification (Rysunek 4E).
    UWAGA: Poprzez określenie „original image file” (Rysunek 4F), przesunięcia są nanoszone wraz z oryginalnym obrazem.

4. Generowanie lokalnej mapy dopasowania specyficznej dla mikroskopu

  1. Rozcieńczyć 2 µL wielokolorowych kulek fluorescencyjnych o średnicy 20 nm w 18 µL etanolu.
  2. Wymieszać roztwór w wirówce typu vortex i nanieść 10 µL roztworu kulek na środek szalki z szklanym dnem. W przypadku mikroskopii o wysokiej rozdzielczości należy upewnić się, że zastosowano szkiełka nakrywowe #1.5 (o grubości 0.170 mm).
  3. Pozostawić szalkę w temperaturze RT przez 1 h do całkowitego wyschnięcia.
  4. Umieścić szalkę w mikroskopie przeznaczonym do kalibracji i ustawić ostrość na kulkach fluorescencyjnych.
  5. Przechwycić obrazy 2D lub 3D za pomocą kalibrowanego mikroskopu. Wykonać kilka obrazów, zmieniając pozycję stolika.
  6. Otworzyć interfejs graficzny użytkownika programu Chromagnon.
  7. Przeciągnąć i upuścić pliki obrazów kulek do pola „Reference box” (Rysunek 1) lub kliknąć Reference files (Rysunek 1A), aby otworzyć okno wyboru plików.
  8. Zaznaczyć opcję average references (Rysunek 1H). Z listy wyboru Local align (Rysunek 1F) wybrać Projection. Ustawić minimalny rozmiar okna na 60 (Rysunek 1G). Kliknąć Run all (Rysunek 1I), aby rozpocząć pomiary.
    UWAGA: Tworzony jest plik „.chromagnon.tif”, w którym zapisywana jest mapa lokalnego dopasowania mikroskopu.
  9. Po zakończeniu pomiaru kliknąć Extra parameters (Rysunek 1K). W polu Local distortion of your microscope instrument kliknąć listę wyboru i wybrać New…, aby otworzyć okno dialogowe. Przeciągnąć i upuścić plik „chromagnon.tif” wygenerowany w kroku 4.8 do pola nazwy pliku lub kliknąć przycisk choose file, aby otworzyć okno wyboru plików. Wpisać nazwę mikroskopu i kliknąć OK.
  10. Podczas pomiaru przesunięć chromatycznych wynikających z przesłuchów (crosstalk) lub w przypadku obrazów referencyjnych do kalibracji biologicznej, kliknąć Extra parameters (Rysunek 1K). W polu Local distortion of your microscope instrument wybrać nazwę mikroskopu określoną w kroku 4.9. Kliknąć OK.
    UWAGA: Wybór w polu „Local distortion of your microscope instrument” nie jest zapisywany po zamknięciu programu.
  11. Przejść do korekcji chromatycznej bez lokalnego dopasowania, zgodnie z opisem w sekcji 3.
    UWAGA: Możliwe jest również zastosowanie lokalnego dopasowania jako uzupełnienia kalibracji mikroskopu. W takim przypadku lokalne dopasowanie rozpoczyna się od kalibracji mikroskopu.

Wyniki

Przykład korekcji przesunięcia chromatycznego z wykorzystaniem referencyjnego obrazu przenikania (crosstalk) przedstawiono na Rysunku 5. Obraz uzyskano za pomocą mikroskopu szerokopolowego wyposażonego w jedną kamerę. Emisję fluorescencji DAPI wykorzystano jako referencję (Rysunek 5A,B) do korekcji kanałów niebieskiego, zielonego i czerwonego. Obraz składa się z 3 kanałów po 60 przekrojów Z, z których każdy obejmuje 256 x 256 pikseli. Przed pomiarem przesunięć chromatycznych obrazy poddano dekonwolucji. Pomiar lokalnych przesunięć chromatycznych za pomocą programu Chromagnon trwał 51 s na komputerze Mac z procesorem Intel Core i7 (quad core, 8-wątkowy, 2,7 GHz), 16 GB RAM i dyskiem flash 1 TB. Parametr wyrównania zastosowano do obrazu docelowego (Rysunek 5C,D), który posiada dokładnie taką samą liczbę wokseli jak obraz referencyjny. Przygotowanie wyrównanego pliku trwało 3 s. W wyniku przycięcia pikseli krawędziowych podczas procesu wyrównywania (pole wyboru crop margins na Rysunku 1C), liczba wokseli po wyrównaniu uległa zmniejszeniu (Rysunek 5B, 51 przekrojów Z, 252 x 251 pikseli). DNA w mostku anafazowym (wskazane grotami strzałek) przed wyrównaniem widoczne jest błędnie poza otoczką jądrową (Rysunek 5C, co jest wyraźne w dolnym panelu przedstawiającym widok XZ), natomiast po wyrównaniu znajduje się zgodnie z oczekiwaniami wewnątrz otoczki (Rysunek 5D).

Przykład korekcji przesunięcia chromatycznego z wykorzystaniem biologicznego obrazu referencyjnego do kalibracji przedstawiono na Rysunku 6. Obrazy uzyskano za pomocą mikroskopu SIM wyposażonego w trzy kamery. Uśredniono trzy obrazy komórek HeLa barwionych falloidynami sprzężonymi z barwnikami niebieskim, zielonym i czerwonym (Rysunek 6A). Obraz referencyjny składa się z 3 kanałów po 76 przekrojów Z, z których każdy ma rozdzielczość 1 024 x 1 024 pikseli. Pomiar przesunięć chromatycznych za pomocą programu Chromagnon bez lokalnego dopasowania zajął 194 s na opisanym powyżej systemie Mac. Parametr ten zastosowano do obrazu docelowego składającego się z 3 kanałów po 73 przekroje Z, z których każdy ma rozdzielczość 1 024 x 1 024 pikseli. Generowanie dopasowanego pliku trwało 25 s. Widok XZ pokazuje nieprawidłowe pozycje kanałów wzdłuż osi Z oraz w niewielkim stopniu wzdłuż osi X (Rysunek 6A,C), jednak błąd ten został skorygowany po dopasowaniu (Rysunek 6B,D).

Proces wyrównywania mikroskopii fluorescencyjnej w analizie komórkowej; porównanie wizualne przed i po.
Rysunek 5: Przykład dopasowania z obrazem referencyjnym przesłuchów. Komórki HeLa barwiono DAPI w celu uwidocznienia DNA (kolor magenta), Alexa Fluor 48 (kolor żółty) dla otoczki jądrowej oraz Alexa Fluor 5 (kolor niebieski) dla mikrotubul. Obrazy uzyskano za pomocą trójwymiarowej mikroskopii szerokopolowej z wykorzystaniem jednej kamery, a następnie poddano je dekonwolucji.A,B) Reprezentatywny obraz referencyjny przesłuchu z wykorzystaniem emisji DAPI, przed i po wyrównaniu przez ChromagnonWyświetlono trzy nałożone na siebie kanały kolorów.C,D) Przekrój optyczny stosu 3D w trzech kanałach przed i po wyrównaniu. Aberracja chromatyczna w osi jest widoczna w obrębie mostka anafazowego wskazanego grotami strzałek. Pasek skali na panelu A wskazuje 5 µm dla wszystkich paneli. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Porównanie dopasowania mikroskopowego; referencyjne vs. docelowe; wyniki obrazowania fluorescencyjnego; przed/po.
Rysunek 6: Przykład wyrównania z biologicznym obrazem referencyjnym do kalibracji Obrazy pozyskano za pomocą mikroskopu 3D-SIM wyposażonego w trzy kamery.A,B) obraz referencyjny uśredniony z trzech obrazów wykonanych przed (A) i po (B) ustawienia. Komórki HeLa barwiono falloidyną sprzężoną z Alexa Fluor 405, 48 lub 594. (C,D) obraz docelowy przed (C) oraz po (D) dopasowanie. Komórki HeLa barwiono DAPI w celu uwidocznienia DNA (kolor magenta), Alexa Fluor 48 (kolor żółty) dla otoczki jądrowej oraz Alexa Fluor 594 (kolor niebieski) dla mikrotubul. Pasek skali na panelu A wskazuje 5 µm dla wszystkich paneli. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Procedura korekcji chromatycznej stanowi kompromis między dokładnością a nakładem pracy. Aby uniknąć zbędnego wysiłku, warto wcześniej określić, jaka dokładność jest wymagana dla danego badania. W przypadku konwencjonalnego obrazowania szerokopolowego (na żywo) najwyższa dokładność może nie być konieczna, dlatego obrazy referencyjne w jasnym polu są często wystarczające do skorygowania przesunięcia chromatycznego. Podobnie, gdy warunki obrazowania i środowisko pozostają stałe, powtarzalne stosowanie kalibracji biologicznej pozwoli zaoszczędzić czas. Z drugiej strony, jeśli pożądana jest wysokodokładna rejestracja, niezbędne są wysokiej jakości obrazy referencyjne kalibracji biologicznej lub przesłuchów (crosstalk). Dla uzyskania najlepszych wyników obrazy referencyjne powinny być pozyskiwane w warunkach i w czasie jak najbliższych obrazom docelowym. Dopóki zarówno obrazy referencyjne, jak i docelowe są pozyskiwane za pomocą tej samej mikroskopii, wyższa rozdzielczość przestrzenna poprawi dokładność korekcji. Jeśli dla obu typów obrazów dostępna jest dekonwolucja, zastosowanie jej przed korekcją może zwiększyć dokładność procesu. Ponadto, dla osiągnięcia optymalnych wyników, w pliku referencyjnym i docelowym powinno zostać spełnione twierdzenie o próbkowaniu dla optycznej osi Z w celu precyzyjnej interpolacji podpikselowej (krok protokołu 2.1.3).

Brak korekcji przesunięcia chromatycznego prowadzi do błędnych wniosków. Co więcej, zastosowanie niewłaściwej kalibracji może nawet pogorszyć przesunięcia chromatyczne zamiast je skorygować, czego należy zatem unikać. Możliwe przyczyny błędów oraz ich typowe rozwiązania podsumowano w Tabeli 2. Aby zbadać przyczynę błędu, w pierwszej kolejności należy wizualnie sprawdzić, czy przesunięcie chromatyczne na obrazie referencyjnym zostało dokładnie skorygowane (krok protokołu 3.12). Większość błędów wynika z jakości obrazów referencyjnych i można je łatwo naprawić zgodnie z opisami w Tabeli 2. W odniesieniu do jakości obrazów referencyjnych należy zaznaczyć, że dokładność wyrównania globalnego spada, jeśli całe pole widzenia nie jest wypełnione próbką (Rysunek 7, Tabela 2). W porównaniu z dobrym przykładem pokazanym na Rysunku 7A, zły przykład na Rysunku 7B zawiera tylko trzy otoczki jądrowe w lewym górnym obszarze, a program Chromagnon nie zdołał wyrównać części tego obrazu. Dzieje się tak dlatego, że metoda wyrównania globalnego w Chromagnon dzieli pole widzenia na cztery obszary (Rysunek 7C), aby z wysoką dokładnością zmierzyć różnice w rotacji i powiększeniu3. Metoda ta, przy prawidłowym działaniu, jest o rząd wielkości dokładniejsza niż inne metody liniowe, takie jak transformacja log-polarna i metody simpleksowe3. Jeśli którykolwiek z czterech obszarów jest niedostępny, Chromagnon przełączy się na mniej skuteczne metody liniowe. Dlatego w celu uzyskania najlepszych wyników przykłady pokazane na Rysunku 7B i Rysunku 7C są niewskazane; wszystkie cztery obszary powinny być wypełnione obiektami. Użytkownicy mogą sprawdzić, czy którykolwiek z kwadratowych obszarów pola widzenia jest niedostępny do pomiaru, zaglądając do pliku dziennika („Chromagnon.log”; patrz krok protokołu 3.10). Na szczęście problem ten można łatwo rozwiązać poprzez uśrednianie wielu biologicznych obrazów kalibracyjnych lub stosowanie wyrównania lokalnego dla obrazów crosstalk lub obrazów referencyjnych w jasnym polu (Tabela 2). W przeciwieństwie do przypadku błędów w korekcji obrazów referencyjnych, błędy w korekcji obrazów docelowych są trudniejsze do zidentyfikowania. Ponieważ takie błędy wynikają z różnic w formatach plików, warunkach obrazowania, czasie obrazowania oraz metodach obrazowania/wyrównania pomiędzy obrazami referencyjnymi a docelowymi (Tabela 2), użytkownicy powinni zachować ostrożność podczas korzystania z obrazów referencyjnych uzyskanych w innych warunkach lub w innym czasie niż obrazy docelowe. Przykładowe obrazy do testów są dostępne pod adresem (https://github.com/macronucleus/Chromagnon), co pozwala uzyskać konkretne wyobrażenie o prawidłowych i błędnych przykładach obrazów.

ProblemPrzyczynaRozwiązanie
Nie udało się poprawić obrazu referencyjnegoNiski kontrastJeśli to możliwe, uzyskaj obraz o wyższym kontraście. W przypadku zastosowania referencyjnego obrazu w jasnym polu, wykonaj ponowne obrazowanie w roztworze na bazie wody, aby uzyskać wyższy kontrast komórki. Alternatywnie można spróbować zastosować komputerową redukcję szumów (np. filtrowanie gaussowskie). Wyłącz wyrównywanie lokalne, które jest bardziej podatne na szumy.
Zanieczyszczenie obrazami niepowiązanymiJeśli to możliwe, usuń z próbki źródła obrazów niezwiązanych z badanym obiektem. W przypadku obrazów referencyjnych dla przesłuchów (crosstalk), sprawdź widma wzbudzenia barwników użytych do obrazowania celu. Jeśli barwniki te ulegają wzbudzeniu podczas akwizycji obrazu referencyjnego dla przesłuchów (np. Alexa Fluor 568 lub 594), rozważ zastosowanie innych barwników (np. Alexa Fluor 55). Jeśli zanieczyszczenia pyłem na matrycy kamery powodują wyraźne różnice między kanałami, wyczyść matrycę lub zastosuj komputerową metodę korekcji pola (flat-fielding).
Niezwykle jasny punkt powstały w wyniku działania promieniowania kosmicznegoW razie możliwości należy ponownie pozyskać obraz. Alternatywnie można spróbować zastosować komputerową redukcję szumów (np. filtrowanie medianowe lub gaussowskie).
Artefakty dekonwolucji (sygnały sztuczne na krawędziach osiowych i bocznych)Usuń piksele krawędziowe lub sekcje Z po dekonwolucji. Jeśli przycięto jedną stronę, należy przyciąć również stronę przeciwległą, aby zachować centrum obrazu.
Zbyt rzadki skok w osi ZNależy wykonać stos obrazów (Z-stack), aby spełnić kryterium Nyquista, zgodnie z opisem w protokole 2.1.3.
Aberracja optycznaAberracja sferyczna jest główną aberracją powodowaną przez użytkowników. Należy dobrać odpowiedni obiektyw do próbki i zastosować szkiełko cover slip o grubości 170 µmJeśli obiektyw jest wyposażony w pierścień korekcyjny, należy go wyregulować, aby znaleźć pozycję, w której w punkcie ogniskowania uzyskuje się najwyższą liczbę sygnałów fluorescencyjnych. W przypadku obiektywu imersyjnego olejowego bez pierścienia korekcyjnego należy dobrać olej imersyjny o takim współczynniku załamania światła, który zwiększy liczbę sygnałów fluorescencyjnych w punkcie ogniskowania.
Pole widzenia jest niezapełnione (Ryc. 7)W przypadku obrazów referencyjnych do kalibracji biologicznej należy uśrednić wiele obrazów. W przypadku obrazów referencyjnych dla przesłuchów (crosstalk) lub pola jasnego należy zastosować lokalne dopasowanie.
Niezidentyfikowany błąd oprogramowaniaZgłoś problem za pośrednictwem GitHub (https://github.com/macronucleus/Chromagnon/issues)
Nie udało się skorygować obrazu docelowegoMetadane pliku obrazu zostały utraconeNależy użyć oryginalnego formatu pliku z mikroskopu, który zawiera pełne metadane, i unikać konwersji do wielostronicowego pliku TIFF przed przetworzeniem. Należy zastosować tę samą kolejność kanałów, która została zapisana w protokole 3.3.
Błędne metody ustawiania dla danej mikroskopiiNie należy stosować metody wyrównania lokalnego podczas pomiarów z biologicznych obrazów referencyjnych do obrazów docelowych. Nie należy używać obrazów referencyjnych przesłuchów (crosstalk) innych niż pochodzące z mikroskopii szerokopolowej.
Różnice w warunkach obrazowaniaNależy zachować stałe warunki obrazowania pomiędzy obrazami referencyjnymi a docelowymi, zgodnie z protokołem 2.3.3.
Różnice w próbce (w tym w szkiełku nakrywce)Zawsze należy stosować to samo medium montażowe, szkiełko nakrywki (np. nr 1.5H) oraz podobną głębię ostrości.
Dryf mikroskopu od czasu ostatniej kalibracjiPrzeprowadzaj kalibrację nie rzadziej niż co dwa tygodnie. Utrzymuj stałą temperaturę i korzystaj z stołu optycznego (pływającego), aby uniknąć dryfu sprzętowego mikroskopu.

Tabela 2: Rozwiązywanie problemów z korekcją chromatyczną.

Porównanie segmentacji komórek: wyniki poprawne, błędne i niepożądane w analizie obrazów mikroskopowych.
Rysunek 7: Przykłady obrazów referencyjnych. Otoczka jądrowa w komórkach drożdży rozdzielających się, znakowana GFP i mCherry. Obrazy uzyskano za pomocą konwencjonalnej mikroskopii szerokopolowej. Przesunięcia chromatyczne skorygowano przy użyciu Kromagnon bez lokalnego dopasowania, wykorzystując same obrazy jako obrazy referencyjne. Następnie wykonano dekonwolucję obrazów w celu uwidocznienia szczegółów. (A) Dobry przykład z wieloma obiektami w polu widzenia. (B) Zły przykład z obiektami znajdującymi się tylko w lewym górnym rogu. Przesunięcie jest wyraźne w określonym obszarze obrazu. (C) Niepożądany przykład, w którym jedna z ćwiartkek (oddzielona kropkowanymi liniami krzyża) jest pusta. Pasek skali w panelu A wskazuje 5 µm dla pełnego widoku pola i 1.25 µm dotyczy powiększonego widoku i ma zastosowanie do wszystkich paneli. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

W niniejszym protokole opisano trzy różne typy referencyjne (Tabela 1). Wśród nich obrazy referencyjne przesłuchów (crosstalk) oraz obrazy referencyjne kalibracji biologicznej wymagają dalszej szczegółowej dyskusji. W przypadku obrazów referencyjnych przesłuchów, próbki barwione DAPI lub Hoechst 3342 i zamontowane w glicerolu lub komercyjnych mediach montażowych mogą być efektywnie wykorzystane do wyrównania kanałów niebieskiego, zielonego i czerwonego. Podobnie, Alexa Fluor 48 może być użyty do wyrównania kanałów zielonego i czerwonego. Jednakże uzyskanie fluorescencji przesłuchów jest często trudne, ponieważ wiele barwników niebieskich, z wyjątkiem DAPI i Hoechst, jest słabszych i szybciej ulega degradacji niż większość barwników zielonych i czerwonych. Ponadto widma emisji nowoczesnych barwników są węższe, co utrudnia wyrównanie więcej niż trzech kanałów tą metodą. Należy również zwrócić uwagę na niektóre powszechne barwniki czerwone (np. Alexa Flour 568 i 594, ale nie Alexa Fluor 5), które mogą być wzbudzane światłem fioletowym, co uniemożliwia uzyskanie wysokokontrastowych obrazów przesłuchów z barwników niebieskich. Koleją wadą jest to, że metoda ta nie pozwala na pomiar aberracji chromatycznej ścieżek światła wzbudzenia w przypadku wzbudzenia wielokolorowego, ponieważ do wzbudzenia używana jest tylko jedna długość fali (Tabela 1). Ponieważ większość zaawansowanych mikroskopów wykorzystuje zmodyfikowaną optykę oświetlenia, zastosowanie tej metody jest ograniczone. Mimo to, jej wyższa dokładność korekcji jest wystarczająco korzystna, aby została opisana w tym protokole. Generalnie obraz przesłuchów powinien zostać wykonany po obrazie docelowym, aby zapobiec blaknięciu lub efektom fototoksycznym. W przypadku SMLM obserwowanego w trybie szerokopolowym, obraz referencyjny powinien zostać uzyskany przed obrazem docelowym, ponieważ barwniki fluorescencyjne mogą ulec blaknięciu podczas obrazowania.

Biologiczne obrazy referencyjne do kalibracji pozwalają użytkownikom na łatwe dopasowanie dowolnej liczby kanałów kosztem dodatkowego przygotowania próbek. Inną zaletą biologicznych obrazów referencyjnych do kalibracji jest możliwość „uśredniania” wielu referencji, co pomaga wypełnić wszystkie pola widzenia. Metoda ta może być obarczona błędami wynikającymi z różnic w warunkach obrazowania, jeśli próbka kalibracyjna jest przygotowana na innym szkiełku. Większość tych problemów można rozwiązać, przygotowując zarówno cele, jak i referencje na tym samym szkiełku przy użyciu komercyjnych lamidek z komorą (Tabela 1), przy zachowaniu stałych pozostałych warunków obrazowania, zgodnie z krokiem 2.3.3 protokołu. W takim przypadku można spodziewać się dokładności korekcji zbliżonej do tej uzyskanej przy użyciu obrazów referencyjnych dla przeplotów (crosstalk)3. Protokół wykorzystujący faloidynę, przedstawiony tutaj, jest jednym z najprostszych sposobów barwienia pojedynczej struktury komórkowej wieloma kolorami. Istnieje wiele możliwych scenariuszy przygotowania biologicznych próbek kalibracyjnych. W przypadku immunobarwienia próbkę można znakować jednym przeciwciałem pierwotnym, a następnie barwić przeciwciałami wtórnymi w wielu kolorach. W ten sposób pojedynczą strukturę docelową można znakować wieloma kolorami. Alternatywnie, 5-etynyl-2'-deoksyurydyna, wykrywana za pomocą chemii „klik”, znakuje nowo syntetyzowane DNA w wielu kolorach przy wysokiej gęstości, co zostało szczegółowo opisane wcześniej8. W przypadku żywych komórek użyteczne jest przygotowanie szczepu transgenicznego posiadającego dwie kopie genu połączone z GFP lub mCherry, aby znakować tę samą strukturę dwoma kolorami. Jeśli liczba kopii genu jest krytyczna, co często obserwuje się w przypadku białek błonowych, pojedynczą kopię genu można połączyć tandemowo z GFP i mCherry (Rysunek 7). Można również zastosować fotokonwertowalne białka fluorescencyjne, takie jak mEOS218, poprzez naświetlanie umiarkowanym natężeniem światła fioletowego w celu uzyskania obu form białka, z fotokonwersją lub bez niej. W warunkach niskiego poziomu tlenu GFP może być również stosowane jako białko fotokonwertowalne z koloru zielonego na czerwony19,20. Wybór odpowiedniej próbki kalibracyjnej sprawi zatem, że eksperyment będzie bardziej wiarygodny.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez JSPS KAKENHI Granty Numery JP19H03202 do A.M., JP18H05528 i JP17H03636 do T.H., oraz JP17H01444 i JP18H05533 do H.Y. L.S. dziękuje za wsparcie ze strony Welcome Trust Strategic Awards 091911 oraz 107457/Z/15/Z finansujące zaawansowane obrazowanie w Micron Oxford.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
16% roztwór formaldehyduPolyscience18814-10
35 mm naczynie ze szklanym dnemMatTekP35G-1.5-10-C
Alexa Fluor 405 falloidynaThermo Fisher ScientificA30104
Alexa Fluor 488 falloidynaThermo Fisher ScientificA12379
Alexa Fluor 594 falloidynaThermo Fisher ScientificA12381
Surowica bydlęcaThermo Fisher Scientific16170078
Szkiełko nakrywkoweMatsunamiNo. 1S HT
DAPI (4',6-diamidino-2-fenyloindol, dichlorowodorek)Thermo Fisher ScientificD1306
Dulbecco' s Zmodyfikowana pożywka Eagle z L-Gln i pirogronianem soduNacalai Tesque08458-16
Pożywka montażowa (VECTASHIELD)Vector LaboratoriesH-1000
Mysie przeciwciało monoklonalne antytubulinowe (TAT1)Opisane w ref 15.
Szkło nakrywkowe komorowe Nunc Lab-Tek II (8 dołków)Thermo Fisher Scientific155409
Przeciwciało poliklonalne anty-emeryny królika (ED1)Prezent od Hiroshi Yorifuji, Gunma University, Gunma, Japonia i Kiichi Arahata, National Center of Neurology and Psychiatry, Tokio, Japonia; zmarły.
Przeciwciało drugorzędowe z Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA-11034
Przeciwciało drugorzędowe z Alexa Fluor 555Thermo Fisher ScientificA-21424
Przeciwciało drugorzędowe z Alexa Fluor 594Thermo Fisher ScientificA-11032
TetraSpeck Mikrosfery, 0,2 i mikro; mThermo Fisher ScientificT7280

Bibliografia

  1. Schermelleh, L., et al. Super-resolution microscopy demystified. Nature Cell Biology. 21 (1), 72-84 (2019).
  2. Manders, E. M. M. Chromatic shift in multicolour confocal microscopy. Journal of Microscopy. 185 (3), 321-328 (1997).
  3. Matsuda, A., Schermelleh, L., Hirano, Y., Haraguchi, T., Hiraoka, Y. Accurate and fiducial-marker-free correction for three-dimensional chromatic shift in biological fluorescence microscopy. Scientific Reports. 8 (1), 7583(2018).
  4. Grünwald, D., Singer, R. H. In vivo imaging of labelled endogenous β-actin mRNA during nucleocytoplasmic transport. Nature. 467 (7315), 604-607 (2010).
  5. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
  6. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
  7. Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. Expansion microscopy. Science. 347 (6221), 543-548 (2015).
  8. Kraus, F., et al. Quantitative 3D structured illumination microscopy of nuclear structures. Nature Protocols. 2, 1011-1028 (2017).
  9. Hell, S. W. Far-Field Optical Nanoscopy. Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).
  10. Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
  11. Schulz, O., et al. Resolution doubling in fluorescence microscopy with confocal spinning-disk image scanning microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 110 (52), 21000-21005 (2013).
  12. Müller, C. B., Enderlein, J. Image Scanning Microscopy. Physical Review Letters. 104 (19), 198101(1981).
  13. Hayashi, S., Okada, Y. Ultrafast superresolution fluorescence imaging with spinning disk confocal microscope optics. Molecular Biology of the Cell. 26 (9), 1743-1751 (2015).
  14. Yorifuji, H., et al. Emerin, deficiency of which causes Emery-Dreifuss muscular dystrophy, is localized at the inner nuclear membrane. Neurogenetics. 1 (2), 135-140 (1997).
  15. Woods, A., Sherwin, T., Sasse, R., MacRae, T. H., Baines, A. J., Gull, K. Definition of individual components within the cytoskeleton of Trypanosoma brucei by a library of monoclonal antibodies. Journal of Cell Science. 93 (3), 491-500 (1989).
  16. Tokunaga, M., Imamoto, N., Sakata-Sogawa, K. Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells. Nature Methods. 5 (2), 159-161 (2008).
  17. Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529(2017).
  18. McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein for fusion tags. Nature Methods. 6 (2), 131-133 (2009).
  19. Sawin, K. E., Nurse, P. Photoactivation of green fluorescent protein. Current Biology. 7 (10), 606-607 (1997).
  20. Elowitz, M. B., Surette, M. G., Wolf, P. E., Stock, J., Leibler, S. Photoactivation turns green fluorescent protein red. Current Biology. 7 (10), 809-812 (1997).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Korekcja przesunięcia chromatycznegotrójwymiarowe przesunięcia chromatyczneoprogramowanie Chromagnonmikroskopia fluorescencyjnaobrazowanie superrozdzielczeprzygotowanie próbek biologicznychakwizycja obrazu referencyjnegomikroskopia szerokopolowamikroskopia 3D SIMprotokół barwienia przeciwciałami
Wysoka dokładność korekcji przesunięć chromatycznych 3D w erze obrazowania biologicznego o wysokiej rozdzielczości przy użyciu Chromagnon
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.