Opisujemy zastosowanie analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego do monitorowania zmian w czasie rzeczywistym w glikolizie i fosforylacji oksydacyjnej podczas kapacytacji nasienia myszy.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Używanie analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego do pomiaru zmian w glikolizie i fosforylacji oksydacyjnej podczas kapacytacji plemników myszy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Plemniki ssaków nabywają zdolność do zapłodnienia w żeńskim układzie rozrodczym w procesie znanym jako capacitation. Procesy związane z pojemnością wymagają energii. Trwa debata na temat źródeł generujących ATP, który napędza ruchliwość postępową plemników, kapacytację, hiperaktywację i reakcję akrosomalną. W tym miejscu opisujemy zastosowanie analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego jako narzędzia do analizy zmian w metabolizmie energetycznym podczas kapacytacji plemników myszy. Wykorzystując fluorofory wrażliwe na H+ iO2-, metoda ta umożliwia monitorowanie glikolizy i fosforylacji oksydacyjnej w czasie rzeczywistym w plemnikach niepojemnościowych i pojemnościowych. Zastosowanie tego testu w obecności różnych substratów energetycznych i/lub aktywatorów farmakologicznych i/lub inhibitorów może dostarczyć ważnych informacji na temat udziału różnych szlaków metabolicznych i przecięcia między kaskadami sygnałowymi a metabolizmem podczas kapacytacji plemników.
Wprowadzenie
Zastosowanie spektrometrii mas zrewolucjonizowało badania nad metabolizmem. Ukierunkowane profilowanie metaboliczne i śledzenie metabolomiczne umożliwiają precyzyjne monitorowanie zmian w metabolizmie energetycznym. Jednak skuteczne przeprowadzanie metabolomiki wymaga intensywnego szkolenia, doświadczonego personelu oraz drogich, bardzo czułych spektrometrów masowych, które nie są łatwo dostępne w każdym laboratorium. W ostatnich latach korzystanie z analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego, takiego jak Seahorse XFe96, stało się popularne jako zastępcza metoda pomiaru zmian w metabolizmie energetycznym w różnych typach komórek1,
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Plemniki pobierane są od 8-16-tygodniowych samców myszy CD-1. Eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania (IACUC) Weill Cornell Medicine.
1. Dzień przed testem
- Przygotowanie wkładu czujnika i kalibru analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego
- Aby nawodnić wkład czujnika, wyjmij wkład czujnika z zestawu XFe96 Extracellular Flux Assay Kit i umieść wkład czujnika do góry nogami obok tabliczki użytkowej.
- Napełnij zbiornik roztworu 25 ml podwójnie destylowanegoH2Oza pomocą pipety wielokanałowej, dodaj 200 μL<....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Metoda ta wykorzystuje analizator przepływu zewnątrzkomórkowego do monitorowania w czasie rzeczywistym zmian szybkości glikolizy i fosforylacji oksydacyjnej (oxphos) podczas kapacytacji plemników myszy. Rysunek 4 przedstawia przykładowy eksperyment, w którym kapacytacja plemników odbywała się w obecności glukozy jako jedynego substratu energetycznego oraz 2-DG, antymycyny i rotenonu jako modulatorów farmakologicznych. Substrat energetyczny w buforze TYH anali.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Utrata kapacytacji plemników przy braku pewnych substratów metabolicznych lub krytycznych enzymów metabolicznych ujawniła, że metabolizm energetyczny jest kluczowym czynnikiem wspierającym udane zapłodnienie. Przełącznik metaboliczny podczas aktywacji komórek jest dobrze ugruntowaną koncepcją w innych typach komórek, jednak dopiero zaczynamy rozumieć, w jaki sposób plemniki dostosowują swój metabolizm do rosnącego zapotrzebowania na energię podczas kapacytacji. Korzystając z analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego, op.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Autorzy pragną podziękować za wsparcie ze strony dr Lavoisiera Ramosa-Espiritu z Rockefeller High Throughput and Spectroscopy Resource Center.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Reodczynniki | |||
| 2-Deoxy-D-glucose | Sigma-Aldrich | D8375 | 2-DG |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I7018 | IBMX; przygotować 500 mM roztwór podstawowy w DMSO (111,1 mg/ml) i przechowywać w małych porcjach |
| Antymycyna A | Sigma-Aldrich | A8674 | Anta; przygotować 5 mM roztwór podstawowy w DMSO (2,7 mg/ml) i przechowywać w małych porcjach |
| Albumina surowicy bydlęcej | Sigma-Aldrich | A1470 | BSA |
| Chlorek wapnia | Sigma-Aldrich | C1016 | CaCl2 |
| Konkanakalina A, lektyna z Arachis hypogaea (orzeszki ziemne) | Sigma-Aldrich | L7381 | ConA Glukoza |
| Sigma-Aldrich | G7528 | ||
| Hepes | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| Isothesia | Henry Schein Zdrowie zwierząt | 1169567761 | Izofluran |
| Siarczan magnezu | Sigma-Aldrich | M2643 | MgSO4 |
| N6,2'-O-dibutyryloadenozyna 3',5'-cykliczna sól sodowa monofosforanu | Sigma-Aldrich | D0627 | db-cAMP |
| Chlorek potasu | Sigma-Aldrich | P9333 | KCl |
| Diwodorofosforan potasu | Sigma-Aldrich | P5655 | KH2PO4 |
| Rotenone | Cayman Chemical Company | 13995 | Rot; przygotować 5 mM roztwór podstawowy w DMSO (2 mg/ml) i przechowywać w małych podwielokrotnościach |
| Wodorowęglan sodu | Sigma-Aldrich | S5761 | NaHCO3-Chlorek |
| sodu | Sigma-Aldrich | S9888 | NaCl |
| Equipment i materiały< / Strong> | |||
| Pipeta 12-kanałowa 10-100 μ L | eppendorf | ES-12-100 | |
| Pipeta 12-kanałowa 50-300 μ L | vwr | 613-5257 | |
| 37 ° C, inkubator bez CO2 | vwr | 1545 | |
| mL probówki do cetrifuge | eppendorf | 30119380 | |
| 50 mL stożkowe probówki wirówkowe | vwr | 76211-286 | |
| Wirówka z adapterem płytkowym | Thermo Scientific | IEC FL40R | |
| Zestaw preparacyjny | World Precision Instruments | MOUSEKIT | |
| Mikroskop z kontrastem odwróconych faz z obiektywem 40X | Nikon | ||
| OctaPool Solution Reservoirs, 25 ml, dzielone | Thomas Scientific | 1159X93 | |
| OctaPool Solution Reservoirs, 25 mL, dzielone | Thomas Scientific | 1159X95 | |
| Seahorse XFe96 Analizator | Agilent | ||
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent | 102416-100 | Sprzedawany również jako XFe96 FluxPak mini (102601-100) z 6 zamiast 18 wózków. |
Bibliografia
- Wu, M., et al. Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 292 (1), C125-C136 (2007).
- Amo, T., Yadava, N., Oh, R., Nicholls, D. G., Brand, M. D.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
