Produkcja autologicznego osocza bogatopłytkowego w celu zwiększenia ekspansji ludzkich fibroblastów in vitro

Podsumowanie

Ten protokół przedstawia urządzenie, które wytwarza PRP, aby przyspieszyć ekspansję in vitro komórek w 100% autologicznym systemie hodowli fibroblastów.

Streszczenie

Obecnie istnieje duże kliniczne zainteresowanie wykorzystaniem autologicznych fibroblastów do naprawy skóry. W większości przypadków wymagana jest hodowla komórek skóry in vitro. Jednak hodowla komórkowa przy użyciu ksenogenicznych lub allogenicznych pożywek hodowlanych ma pewne wady (tj. ryzyko przeniesienia czynnika zakaźnego lub powolną ekspansję komórek). W tym przypadku opracowywany jest system hodowli autologicznej do namnażania ludzkich komórek fibroblastów skóry in vitro przy użyciu własnego osocza bogatopłytkowego (PRP) pacjenta. Ludzkie fibroblasty skóry są izolowane od pacjenta podczas wykonywania abdominoplastyki. Hodowle są obserwowane przez okres do 7 dni przy użyciu pożywki uzupełnionej płodową surowicą bydlęcą (FBS) lub PRP. Ocenia się zawartość komórek krwi w preparatach PRP, proliferację i różnicowanie fibroblastów. Protokół ten opisuje sposób otrzymywania standaryzowanego, nieaktywowanego preparatu PRP za pomocą dedykowanego wyrobu medycznego. Do przygotowania potrzebne jest jedynie urządzenie medyczne (CuteCell-PRP) i wirówka. To urządzenie nadaje się do odpowiednich warunków praktyki medycznej i jest jednoetapowym, apirogenicznym i sterylnym systemem zamkniętym, który wymaga pojedynczego, miękkiego wirowania 1,500 x g przez 5 minut. Po odwirowaniu składniki krwi są oddzielane, a osocze bogatopłytkowe jest łatwo zbierane. Urządzenie to pozwala na szybkie, spójne i standaryzowane przygotowanie PRP, które może być stosowane jako suplement do hodowli komórkowych do ekspansji in vitro komórek ludzkich. Uzyskany w ten sposób PRP zawiera 1,5-krotne stężenie płytek krwi w porównaniu z krwią pełną razem, z preferencyjnym usunięciem czerwonych i białych krwinek. Wykazano, że PRP wykazuje efekt zwiększający proliferację komórek w porównaniu z FBS (7,7x) i że fibroblasty są aktywowane po leczeniu PRP.

Wprowadzenie

Medycyna regeneracyjna ma na celu leczenie lub wymianę tkanek i organów uszkodzonych przez wiek, chorobę lub uraz, a także korygowanie wad wrodzonych. W terapii autologicznej komórki lub tkanki są pobierane od pacjenta, namnażane lub modyfikowane, a następnie ponownie wprowadzane do dawcy. Ta forma terapii ma szeroki potencjał w dziedzinie dermatologii¹. W autologicznej terapii fibroblastami fibroblasty pacjenta są hodowane i ponownie wstrzykiwane w celu leczenia zmarszczek, rytów lub blizn potrądzikowych. Ponieważ fibroblasty są głównymi funkcjonalnymi komórkami w skórze właściwej, wstrzykiwanie autologicznych fibroblastów może być bardziej korzystne niż inne terapie w odmładzaniu twarzy².

W skórze, fibroblasty są odpowiedzialne za syntezę i wydzielanie białek zewnątrzkomórkowych (tj. kolagenu, elastyny, kwasu hialuronowego i glikozaminoglikanów). Uwalniają również czynniki wzrostu, które regulują funkcję komórki, migrację i interakcje komórka-macierz/komórka-komórka w prawidłowej homeostazie skóry i gojeniu się ran³. Fibroblasty skórne zostały już wprowadzone jako potencjalna kliniczna terapia komórkowa do gojenia ran skóry⁴, regeneracja tkanek⁵, lub wypełniacze skórne w zabiegach chirurgii estetycznej i plastycznej⁶. Niektóre badania sugerują nawet, że w kontekście medycyny regeneracyjnej fibroblasty mogą być bardziej praktyczną i skuteczną terapią komórkową niż mezenchymalne komórki macierzyste⁷.

Aby uzyskać wystarczającą ilość fibroblastów do zastosowań klinicznych, ekspansja komórek jest zazwyczaj obowiązkowa. Hodowla komórkowa ex vivo/in vitro wymaga podłoża podstawowego uzupełnionego czynnikami wzrostu, białkami i enzymami w celu wsparcia adhezji i proliferacji komórek. Surowica bydlęca płodu (FBS) jest powszechnym suplementem do hodowli komórkowych, ponieważ krew płodu 1) jest bogata w czynniki wzrostu w porównaniu z krwią osoby dorosłej i 2) ma niską zawartość przeciwciał⁸. Wraz z postępem terapii komórkowej pojawiają się obawy co do bezpieczeństwa klasycznych warunków hodowli komórkowych, w których FBS jest dodawany do pożywki hodowlanej. Co więcej, obecnie istnieje tendencja do zastępowania FBS alternatywami⁹. Kilka substytutów FBS wykazało obiecujące wyniki¹⁰.

Alternatywa dla osocza bogatopłytkowego (PRP) została tutaj wybrana, a my opracowaliśmy urządzenie medyczne do produkcji standaryzowanego preparatu PRP, o nazwie CuteCell-PRP. Przeznaczeniem tego urządzenia jest przygotowanie autologicznego PRP do stosowania jako suplement pożywki hodowlanej do ekspansji in vitro komórek autologicznych w warunkach GMP.

PRP jest zdefiniowany jako skoncentrowana zawiesina płytek krwi w osoczu. Ponieważ istnieje wiele protokołów przygotowania, które różnią się 1) ilością potrzebnej krwi, 2) rodzajami używanych urządzeń i 3) protokołem wirowania, wynikowe stężenia płytek krwi wahają się od nieco powyżej do ponad 10-krotności wartości wyjściowej krwi. Ponadto preparaty PRP zawierają różne poziomy zanieczyszczenia krwinkami czerwonymi i białymi. Terminologia "PRP" jest zatem używana do opisania produktów, które znacznie różnią się składem biologicznym i potencjalnymi efektami terapeutycznymi.

W większości badań, substytucja FBS jest osiągana przy użyciu różnych stężeń PRP, które są aktywowane (przez trombinę lub wapń). Ta sztuczna aktywacja powoduje natychmiastowe i ważne uwalnianie czynników wzrostu płytek krwi od 15 minut do 24 h¹¹. Dlatego uważa się, że aktywacja płytek krwi jest niepożądana w przypadku zastosowań w hodowlach komórkowych, w których wymagane jest powolne uwalnianie czynników wzrostu ze stopniowej degranulacji płytek krwi.

terapia PRP polega na przygotowaniu autologicznych płytek krwi w skoncentrowanym osoczu¹². Optymalne stężenie płytek krwi jest niejasne, a dostępna jest szeroka gama komercyjnych urządzeń do przygotowania PRP¹³. Ten brak standaryzacji wynika z niespójności między badaniami i doprowadził do powstania czarnej skrzynki dotyczącej dawkowania i czasu wstrzykiwania. Protokół ten opisuje procedurę uzyskiwania autologicznego PRP przy użyciu tego dedykowanego urządzenia PRP w celu ekspansji fibroblastów skóry w 100% autologicznym modelu hodowli ex vivo.

Protokół

Protokół badania był zgodny z Deklaracją Helsińską, a wszyscy pacjenci wyrazili pisemną świadomą zgodę przed udziałem w badaniu. Próbki skóry pobierane są od zdrowych kobiet poddawanych plastyce brzucha na Oddziale Chirurgii Plastycznej, Rekonstrukcyjnej i Estetycznej Szpitala Uniwersyteckiego w Genewie (Genewa, Szwajcaria). Procedura jest zgodna z zasadami Deklaracji Helsińskiej i została zatwierdzona przez lokalną instytucjonalną komisję etyki (protokół #3126).

1. Przygotowanie PRP

UWAGA: Probówki CuteCell-PRP (Tabela Materiałów) są przeznaczone do szybkiego przygotowania PRP z małej objętości krwi pacjenta w systemie zamkniętym.

1. Pobieranie krwi pełnej
   UWAGA: Krew autologiczną należy pobrać z żyły obwodowej ramienia za pomocą igły motylkowej bezpośrednio podłączonej do rurki PRP, zgodnie z protokołem pobrania instytutu medycznego. Krew może być pobierana bezpośrednio przez kaniulę żylną, jeśli pacjent jest pod narkozą.
   1. Otworzyć blister z tubką. Wykonaj nakłucie żylne i napełnij żądaną liczbę probówek PRP krwią pełną. Podciśnienie w probówkach umożliwi automatyczne pobranie niezbędnej objętości krwi (~10 ml).
   2. Ostrożnie odwróć kilkakrotnie probówki do góry nogami, aby wymieszać krew z antykoagulantem.
   3. Z wnętrza komory bezpieczeństwa biologicznego (klasa 2) pobrać 100 μl całkowitej ilości krwi pełnej za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml w celu dalszego zliczenia liczby krwinek.
2. Wirowanie
   UWAGA: Upewnij się, że wirówka jest prawidłowo wyważona przed jej uruchomieniem.
   1. Po zebraniu krwi w probówkach PRP, jeśli to konieczne, przygotuj probówkę przeciwwagi (dostarczaną oddzielnie) z wodą do tego samego poziomu, co krew w probówce PRP. Umieść napełnione probówki w wirówce naprzeciwko siebie, upewniając się, że maszyna jest wyważona.
   2. Odwirować próbki o masie 1 500 x g przez 5 min.
      UWAGA: Ustaw odpowiednią prędkość obrotową zgodnie z instrukcjami producenta wirówki. Po odwirowaniu krew ulegnie frakcjonowaniu. Czerwone i białe krwinki są uwięzione pod żelem, a płytki krwi osadzają się na powierzchni żelu (Ryc. 1).
3. Delikatnie odwrócić probówkę PRP 20x, aby ponownie zawiesić osad płytek krwi w supernatantze osocza.
   UWAGA: Upewnij się, że płytki krwi są całkowicie odłączone od żelu. Osocze powinno zmienić się z klarownego i przezroczystego na mętne. Jeśli obecne są agregaty płytek krwi, należy je pobrać wraz z osoczem.
4. Aby pobrać PRP, należy pobrać roztwór osocza z probówki za pomocą urządzenia do przenoszenia strzykawki podłączonej do strzykawki o pojemności 10 ml.
   UWAGA: Z każdej probówki uzyska się około 5 ml PRP. Roztwór PRP jest teraz gotowy do zmieszania z końcowym preparatem pożywki. Roztwór może być przechowywany w temperaturze pokojowej (RT) w komorze bezpieczeństwa do czasu przyszłych kroków związanych z analizatorem hematologicznym i użytkowaniem.
5. Przed użyciem PRP należy określić stężenie płytek krwi, średnią objętość płytek krwi oraz liczbę czerwonych i białych krwinek za pomocą automatycznego analizatora hematologicznego (tabela materiałów). W tym celu należy ostrożnie pobrać 100 μl roztworu i przenieść do probówki o pojemności 1,5 ml.
   UWAGA: Osocze bogatopłytkowe (PRP) stosuje się jako autologiczny suplement do hodowli w stężeniu 5–20% v/v. Optymalne stężenie PRP należy określić dla każdej linii komórkowej. Aby zapobiec tworzeniu się skrzepów fibryny, końcową pożywkę hodowlaną należy uzupełnić heparyną o stężeniu 2 j./ml.

2. Izolacja autologicznych fibroblastów i hodowla w pożywkach uzupełnionych FBS lub PRP

1. Umyj próbki skóry w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), delikatnie wstrząsając w probówce polipropylenowej o pojemności 50 ml.
2. Jeżeli próbka skóry jest stosunkowo duża (>10^cm2), należy umieścić próbkę na pokrywie naczynia do hodowli tkankowej o powierzchni 150^cm2 (naskórkiem do dołu). Usuń podskórną tkankę tłuszczową za pomocą kleszczy i nożyczek. Aby zapobiec wysuszeniu chusteczki, należy ją płukać co kilka minut w PBS.
   UWAGA: Do mniejszych próbek należy używać mniejszego naczynia do hodowli tkankowych.
3. Po zakończeniu przycinania tłuszczu pokrój tkankę na paski o wymiarach około 0,5 cm x 1,5 cm za pomocą sterylnego skalpela.
4. Dodać 5 ml mieszaniny kolagenazy i dypazy (tabela materiałów; 14 jednostek Wünscha/ml) do sterylnej probówki o pojemności 15 ml.
5. Przenieś przeciętą tkankę do probówki, upewniając się, że kawałki tkanki są zanurzone w roztworze. Szczelnie zakręć rurkę.
6. Umieścić probówki w inkubatorze w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem orbitalnym przez 150 minut. Po inkubacji umieścić probówkę zawierającą tkankę w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
7. Umieść pokrywkę sterylnego naczynia hodowlanego o średnicy 100 mm do góry nogami w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Przenieść strawiony roztwór tkankowy na dno naczynia hodowlanego o średnicy 100 mm, nie rozpryskując się. Jeśli w probówce pozostaną jakiekolwiek kawałki tkanki, użyj sterylnej pipety o pojemności 1 ml lub sterylnych kleszczyków, aby przenieść kawałki tkanki na dno naczynia hodowlanego o średnicy 100 mm.
8. Trzymając pasek naskórka skierowany do góry, oddziel nienaruszony arkusz naskórka od skóry właściwej za pomocą dwóch par kleszczy. Przytrzymaj skórę właściwą paska tkanki za pomocą kleszczy, a krawędź naskórka za pomocą innej pary kleszczy. Rozerwij skórę właściwą i naskórek na dwie części, trzymając oddzielone kawałki na tej samej pokrywie. Spróbuj szybko wykonać ten krok i powtórz manipulację dla każdego kawałka tkanki.
9. Przenieść kawałki skóry do nowej płytki hodowlanej o średnicy 100 mm zawierającej PBS.
10. Za pomocą kleszczy laboratoryjnych umieść kawałki skóry w 15 ml probówce polipropylenowej z 3 ml 0,3% trypsyny/PBS. Inkubować przez 10-20 minut w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i odwracać probówkę kilka razy co 2-3 minuty.
11. Aby zatrzymać reakcję enzymatyczną, dodaj 3-5 ml lodowatej kompletnej pożywki wzrostowej (zmodyfikowana pożywka Eagle [DMEM] firmy Dulbecco lub RPMI zawierająca 10% FBS). Kilkakrotnie energicznie wymieszaj rurkę. Przefiltruj zawiesinę fibroblastów przez nylonową siatkę o grubości 85 μm (umieszczoną na górze probówki o pojemności 50 ml), aby usunąć zanieczyszczenia skórne.
12. Wirować przez 10 minut w temperaturze 150 x g, w temperaturze 4 °C. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 100−1.000 μl kompletnej pożywki wzrostowej.
13. Używając błękitu trypanowego (współczynnik rozcieńczenia x2) zmieszanego z zawiesiną komórek, policz liczbę komórek całkowitych i żywotnych, wypełniając komorę hemocytometru.
    UWAGA: Żywotność komórek zależy od warunków stosowanych do trawienia enzymatycznego. Aby zwiększyć regenerację komórek i ich żywotność, próbkę skóry można pokroić na mniejsze kawałki.
14. Płytka 3−10 x 10⁴ komórki w 5 ml kompletnej pożywki wzrostowej FBS (DMEM, 10% FBS inaktywowane termicznie przez 60 min w 56 °C, 1% 1 M roztwór buforowy HEPES, 1% 100x mieszanina aminokwasów endogennych, 1% 100x L-glutamina, 1% 100x penicylina/streptomycyna, 1% 100x pirogronian sodu) w kolbie do hodowli tkankowych o średnicy 25 cm². Inkubować w temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Żywotne fibroblasty przyczepią się do kolby w ciągu 24 godzin i zaczną wykazywać kształt wrzeciona w ciągu 2-3 dni.
15. W dniu 2 odessać pożywkę zawierającą nieprzylegające komórki i dodać świeżą pożywkę.
    UWAGA: Ponieważ martwe komórki w pożywce hodowlanej wpływają na wzrost żywotnych fibroblastów, nieprzylegające, martwe komórki muszą zostać usunięte z hodowli.
16. Zmieniaj podłoże co 3-4 dni, aż kultura osiągnie 70-80% zbieżności.
17. Aby pobrać fibroblasty, przemyć PBS i inkubować w roztworze trypsyny/EDTA przez 3 minuty w temperaturze 37 °C w inkubatorze.
18. Aby zatrzymać reakcję, dodaj 3-5 ml ciepłej kompletnej pożywki wzrostowej (DMEM lub RPMI zawierającej 10% FBS). Pobrać porcję zawiesiny komórek, aby policzyć komórki za pomocą hemocytometru. Odwirowywać zawiesinę przez 5 minut przy 200 x g i usunąć pożywkę przez aspirację.
19. Hodowla fibroblastów w pożywce PRP (DMEM, 20% PRP, 1% 1 M roztwór buforowy HEPES, 1% 100x mieszanina aminokwasów endogennych, 1% 100x L-glutamina, 1% 100x penicylina/streptomycyna, 1% 100x pirogronian sodu, 2 U/ml heparyny) w inkubatorze w temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Minimalna zalecana gęstość komórek to 4,000 żywotnych komórek/cm².
20. Aby ocenić wpływ PRP na proliferację fibroblastów, fibroblasty nasienne (pasaż 2) w 24-dołkowych płytkach o gęstości 8 x 10³ komórki na dołek w pożywce PRP o różnych stężeniach PRP (1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40% i 50%) oraz z heparyną 2 U/ml lub w klasycznych warunkach hodowlanych (10% FBS). Po 7 dniach hodowli dodaj do komórek ważny barwnik (fioletowy barwnik proliferacji komórek) i oceń proliferację za pomocą cytometrii przepływowej.
21. Aby zbadać przegrupowania cytoszkieletu, komórki nasienne w 96 dołkach czarnych/przezroczystych płaskich płytkach o płaskim dnie w stężeniu 1 x 10⁵ komórek/ml w pełnym wzroście FBS DMEM (patrz krok 2.14) uzupełnione 0,5% FBS przez 24 godziny. Traktuj komórki 10% FBS lub różnymi stężeniami PRP (1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40% i 50%) przez 7 dni.
    1. Utrwalić fibroblasty 4% paraformaldehydem przez 10 minut i przepuszczalnie 0,1% Triton X-100 przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Wybarwić fibroblasty 50 ml 5 U/ml falloidyny, przemyć 2x PBS i oznaczyć 50 ml 1 mg / ml 4′,6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI) przez 5 min. Do wizualizacji barwienia falloidyny użyto czytnika wielomodowego obrazowania komórek Cytation 3 (BioTek).

Wyniki

Ta opatentowana technologia stanowi prostym, szybkim i powtarzalnym wyrobem medycznym służącym do otrzymywania standaryzowanych preparatów PRP. Jest to jednowypadowy, w pełni zamknięty system, który umożliwia przygotowanie PRP z pełnej krwi żylnej po 5 min wirowania przy 1,50 x g (dzięki zastosowaniu technologii żelu separującego). PRP otrzymane po wirowaniu jest oczyszczone z erytrocytów i leukocytów, które osadzają się poniżej żelu. Po kilkukrotnym odwróceniu probówki płytki krwi znajdujące się nad żelem zosta...

Dyskusja

Zalety stosowania autologicznych fibroblastów jako naturalnej alternatywy w porównaniu z innymi materiałami wypełniającymi w terapii komórek ran obejmują dobrą biokompatybilność, minimalne skutki uboczne oraz łatwość pobierania i stosowania. Jednak przed zastosowaniem tych środków terapeutycznych w codziennych warunkach klinicznych konieczne są odpowiednie badania przedkliniczne w celu zidentyfikowania cech wzrostu oraz oceny funkcji biologicznej i bezpieczeństwa izolowanych fibroblastów zarówno przed, jak i po przeszcze...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
96-dołkowy przezroczysty płaskie dno	BD Falcon	353219	32 / skrzynka
Ślad komórkowy Fioletowy barwnik	Thermo Fischer Scientific	C34557	180 testów
CuteCell PRP	Regen Lab SA	CC-PRP-3T	3 probówki w opakowaniu
DAPI	Sigma	D9542	1 mg
DMEM	Gibco	52400-025	500 mL
FBS	Gibco	10270106	500 ml
glutaminy 200 mM	Gibco	25030024	100 ml
licznik hematologiczny	Sysmex	KK-21N
Heparyna 5000E Skroplona	Drossapharm AG		0,5 ml
buforowego HEPES 1M	Gibco	15630-056	100 ml
Liberase DH	Roche	5401054001	2x 5 mg w opakowaniu
MEM NEAA 100x	Gibco	11140-035	100 ml
Na pirogronian 1 mg / ml	Gibco	11360-039	100 ml
Penicylina streptomycyna	Gibco	15140122	100 ml
Phalloidin alexa Fluor 488	Sondy molekularne	A12379	300 jednostek
RPMI	Gibco	31966-021	500 ml
Trypsyna 1x 0,25%	Gibco	25050-014	100 ml
Trypsyna EDTA 0,25%	Gibco	25200056	100 ml

roztworu