Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Jednorodny glikokoniugat wytwarzany przez połączenie nienaturalnej inkorporacji aminokwasów i chemii kliknięć do celów szczepionkowych

4.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60821

⸱

19 grudnia 2020

 ,  ,  ,  , 
1Université de Nantes, CNRS, Unité Fonctionnalité et Ingénierie des Protéines (UFIP), UMR 6286

W tym artykule

Podsumowanie

Rozszerzenie kodu genetycznego jest stosowane do wprowadzenia nienaturalnego aminokwasu posiadającego biorthogonalną grupę funkcyjną na białku nośnikowym w określonym miejscu. Funkcja biortogalna jest dalej wykorzystywana do selektywnego sprzęgania antygenu węglowodanowego w celu uzyskania jednorodnej szczepionki skoniugowanej glikokoniugatem.

Streszczenie

Rozszerzenie kodu genetycznego to potężne narzędzie do wprowadzania nienaturalnych aminokwasów (UAA) do białek w celu modyfikacji ich cech, badania lub tworzenia nowych funkcji białek lub uzyskania dostępu do koniugatów białkowych. Tłumienie kodonów stop, a w szczególności tłumienie kodonów bursztynowych, stało się najpopularniejszą metodą genetycznego wprowadzania UAA w określonych pozycjach. Metodologia ta jest tutaj stosowana do przygotowania białka nośnikowego zawierającego użytk rolny z użyciem walory papieru o bioortogonalnej grupie funkcyjnej. Ten reaktywny uchwyt może być następnie wykorzystany do specyficznego i skutecznego przeszczepienia syntetycznego haptenu oligosacharydowego w celu uzyskania jednorodnej szczepionki skoniugowanej glikokoniugatem. Protokół ogranicza się do syntezy glikokoniugatów w stosunku 1:1 hapten węglowodanowy do białka nośnikowego, ale jest podatny na liczne pary biortorogalnych grup funkcyjnych. Jednorodność szczepionki glikokoniugatowej jest ważnym kryterium zapewniającym pełną charakterystykę fizykochemiczną, a tym samym spełnianie coraz bardziej wymagających zaleceń agencji regulacyjnych leków, kryterium, które nie jest spełnione przez klasyczne strategie koniugacji. Co więcej, protokół ten umożliwia precyzyjne dostrojenie struktury rzeczywistej szczepionki skoniugowanej, dając początek narzędziom do rozwiązywania problemów związanych z zależnością między strukturą a immunogennością.

Wprowadzenie

Szczepionki skoniugowane glikokoniugatem są niezbędnymi elementami arsenału szczepionek dostępnych w profilaktyce chorób zakaźnych. Są bezpieczne, dobrze tolerowane i skuteczne w szerokiej grupie wiekowej, w tym u małych niemowląt. Zapewniają optymalną ochronę przed infekcjami wywołanymi przez bakterie w kapsułkach, takie jak meningokoki, pneumokoki lub Haemophilus influenzae typu b1. Szczepionki glikokoniugacyjne są wykonane z oczyszczonych polisacharydów bakteryjnych, które tworzą kapsułki bakterii lub syntetycznych oligosacharydów, które naśladują te polisacharydy o ekspresji powierzchniowej2, które są kowalencyjnie połączone z białkiem nośnikowym. Obecność białka nośnikowego jest niezbędna do promowania ochronnej humoralnej odpowiedzi immunologicznej skierowanej przeciwko determinantowi antygenowemu wyrażonemu przez antygeny węglowodanowe3. Oprócz starannej selekcji i produkcji antygenu węglowodanowego, cechami, o których wiadomo, że mają wpływ na skuteczność szczepionki skoniugowanej glikokoniugatem, są: charakter białka nośnikowego, chemia koniugacji (w tym natura i długość łącznika, jeśli jest stosowany) lub stosunek sacharydu do białka3. Oczywiście pozycje, w których sacharyd jest sprzężony z białkiem, a także liczba punktów połączeń są istotne dla immunogenności. Do tej pory te dwa parametry prawie nie były badane, ponieważ otrzymywanie glikokoniugatów pozostaje w dużej mierze empiryczne. Ich synteza zwykle opiera się na wykorzystaniu funkcji amin lub kwasów karboksylowych, odpowiednio, lizyny lub reszt łańcucha bocznego kwasu asparaginowego/glutaminowego obecnych w sekwencji białka nośnikowego. Prowadzi to nie do pojedynczej, ale do niejednorodnej mieszaniny glikokoniugatów.

Wpływ reaktywności, dostępności lub dystrybucji reszt aminokwasowych w białku prowadzi do powstania bardziej zdefiniowanych glikokoniugatów, które są bardziej wiarygodne w dokumentowaniu efektu połączenia sacharyd/białko4. Krok naprzód w kierunku tego celu można osiągnąć poprzez zastosowanie technologii sprzęgania glikanów białkowych, procesu rekombinacji, który umożliwia produkcję kontrolowanych szczepionek skoniugowanych glikokoniugatem w fabrykach komórkowych5,6. Jednak glikozylacja zachodzi wyłącznie w reszcie asparaginy w seksonach D/EXNYS/T (gdzie X jest dowolnym z 20 naturalnych aminokwasów), niewystępującym naturalnie na białkach nośnikowych.

Selektywna mutageneza miejsca, a w szczególności włączenie cystein, aby wykorzystać ich wysoce i selektywną reaktywność, pojawia się jako alternatywa7,8. Produkcja białek nośnikowych zawierających w swojej sekwencji użytki deszczowe może zapewnić jeszcze większą elastyczność w przygotowywaniu jednorodnej szczepionki glikokoniugatowej. Opracowano ponad 100 UAA, które są dalej włączane do różnych białek9,10. Wiele z nich zawiera funkcje bioortogonalne, zwykle używane do przeprowadzania modyfikacji potranslacyjnych11 lub do przeszczepiania sond biofizycznych12 lub drugs13, ale które są idealnymi uchwytami do dalszej koniugacji z antygenami węglowodanowymi. Udane przykłady zostały potwierdzone przez Biotech14 przy użyciu bezkomórkowej syntezy białek15, ale przygotowanie szczepionek glikokoniugatowych zgodnie z tą strategią wciąż czeka na popularyzację.

Zastosowanie strategii in vivo do produkcji zmutowanego białka nośnikowego wymaga zmodyfikowanej maszynerii translacyjnej, która obejmuje specyficzny kodon, tRNA rozpoznające kodon i syntetazę aminoacylo-tRNA (aaRS), która specyficznie katalizuje transfer UAA na tRNA (Rysunek 1)16. Tłumienie pirolizynowego bursztynowego kodonu stop jest jedną z najczęściej stosowanych metod włączania użytków rolnych, w szczególności propargyl-lizyny (PrK)17. Te ostatnie mogą z kolei reagować z azydofunkcjonalizowanymi haptenami węglowodanowymi, zapewniając w pełni zdefiniowane, jednorodne glikokoniugaty. W niniejszym manuskrypcie opisujemy, jak zsyntetyzować propargylo-L-lizynę, UAA przenoszący uchwyt alkinowy, jak włączyć go do białka docelowego podczas jego translacji w bakterii i wreszcie, jak przeprowadzić koniugację między zmodyfikowanym białkiem a haptenem przenoszącym funkcję azydku za pomocą chemii kliknięć.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Synteza UAA: propargyl-lizyna (PrK)

  1. Synteza N α-Boc-propargyl-lizyny18
    1. Rozpuścić 500 mg Boc-L-Lys-OH (2,03 mmol) w mieszaninie wodnego roztworu 1 M NaOH (5 ml) i THF (5 ml) w kolbie i wyposażyć kolbę w przegrodę silikonową.
    2. Schłodzić kolbę w łaźni lodowej, a następnie dodać kroplami 158 μl chloromrówczanu propargylu (1,62 mmol) (przez okres 2-3 minut) za pomocą mikrostrzykawki, mieszając.
    3. Podgrzej mieszaninę reakcyjną do temperatury pokojowej i kontynuuj mieszanie przez 10 godzin.
    4. Schłodzić roztwory 50 ml eteru dietylowego, 50 ml wodnego roztworu 1 M kwasu solnego i 60 ml octanu etylu w łaźni lodowej.
    5. Schłodzić surową mieszaninę reakcyjną w łaźni lodowej i wlać mieszaninę do rozdzielacza. Ekstrahować mieszaninę za pomocą 50 ml eteru dietylowego. Wyrzuć warstwę organiczną.
    6. Ostrożnie dodać 1 M wodny kwas solny do fazy wodnej w rozdzielaczu. Następnie dwukrotnie ekstrahować warstwę wodną za pomocą 30 ml octanu etylu. Sprawdzić obecność N-Boc-propargylo-lizyny w fazie organicznej metodą TLC przy użyciu CH2Cl2-metanolu (9:1) jako eluentu.
    7. Wysuszyć połączone warstwy organiczne naMgSO4, odfiltrować fazę stałą i zagęścić filtrat pod zmniejszonym ciśnieniem na wyparce obrotowej.
    8. Rozpuścić próbkę surowej oleistej N α-Boc-propargylo-lizyny w deuterowanym chloroformie (CDCl 3) i kontrolować jej tożsamość za pomocą 1 H NMR.
      UWAGA: Ekstrakcja może spowodować wzrost ciśnienia. Często uwalniaj narastające ciśnienie.
  2. Synteza nienaturalnego aminokwasu propargylo-L-lizyny (PrK)
    1. Wprowadzić N α-Boc-propargyl-lizynę do kolby okrągłodennej wyposażonej w przegrodę.
    2. Dodać 4 ml bezwodnego dichlorometanu (CH2Cl2) do kolby pod argonem w celu rozpuszczenia N α-Boc-propargylo-lizyny.
    3. Dodawać 4 ml kwasu trifluorooctowego (TFA) kroplami za pomocą strzykawki, mieszając.
    4. Mieszaninę reakcyjną mieszać przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Monitorować reakcję metodą TLC, używając CH2Cl 2-metanolu (9:1) jako eluentu.
    5. Skoncentrować mieszaninę reakcyjną pod zmniejszonym ciśnieniem.
    6. Dodać eter dietylowy do surowej pozostałości i inkubować ją w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę w celu wytrącenia PrK. Podczas pracy na większą skalę, jeśli PrK nie jest całkowicie wytrącony, należy go rozetrzeć, aby go wytrącić i w razie potrzeby wydłużyć czas inkubacji.
    7. Przefiltruj PrK w postaci białego ciała stałego na spiekanym szkle.
    8. Rozpuścić podwielokrotność PrK w D2O. Następnie przeprowadź analizy NMR, aby kontrolować jego tożsamość i czystość.
    9. W celu dalszego wykorzystania rozpuścić nienaturalny aminokwas PrK w wodzie destylowanej o końcowym stężeniu 100 mM i przechowywać w temperaturze -20 °C jako podwielokrotności 1 ml.

2. Produkcja białka rekombinowanego modyfikowanego przez PrK

  1. Przygotowanie plazmidu
    1. Skonstruuj plazmid ekspresyjny (pET24d-mPsaAK32TAG-ENLYFQ-HHHHHH), który zawiera docelowy dojrzały gen adhezyny powierzchniowej Pneumokoków A (mPsaA) (pET24d-mPsaA-WT), a następnie sekwencję proteazy wirusa wytrawiania tytoniu (TEV), klonując insert między miejscami restrykcyjnymi BamHI i XhoI plazmidu pET24d. Spowoduje to wprowadzenie znacznika His6 na C-końcu białka. Zastąp kodon lizyny-32 kodonem bursztynowym (TAG), stosując konwencjonalną technikę mutagenezy ukierunkowanej na miejsce.
    2. Skonstruuj plazmid o drugiej ekspresji (pEVOL-MmPylRS) zawierający dwie kopie genu kodującego syntetazę pirolizylo-tRNA z Methanosarcina mazei (MmPylRS) oraz gen kodujący odpowiadający mutRNA Pyr, jak opisano wcześniej19. Użyj tego specjalnie zaprojektowanego wektora plazmidowego, pEVOL, do efektywnej inkorporacji UAAs.
      UWAGA: Szczegółowe informacje o plazmidach są opisane w pliku uzupełniającym 1.
  2. Kotransformacja plazmidów w szczep ekspresyjny
    1. Rozmrozić 100 μl podwielokrotności chemicznie kompetentnej Escherichia coli BL21(DE3) na lodzie przez 5 minut.
    2. Dodaj 1 μl każdego plazmidu (50-100 ng każdego) do komórek i inkubuj przez 30 minut na lodzie.
    3. Przenieść mikroprobówkę o pojemności 1,5 ml z rozmrożonymi kompetentnymi komórkami do inkubatora w temperaturze 42 °C na 45 s, a następnie przenieść ją z powrotem do lodu na 2 minuty.
    4. Dodać 900 μl pożywki LB i inkubować pod wstrząsem przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C, aby umożliwić ekspresję antybiotyku. Następnie umieść bakterie na agarze LB z 25 μg/ml kanamycyny i 30 μg/ml chloramfenikolu. Pozostawić rozwój bakterii przez noc w temperaturze 37 °C.
  3. Ekspresja białek modyfikowanych PrK
    1. Zaszczepić pojedynczą współprzekształconą kolonię w 5 ml pożywki LB antybiotykami (25 μg/ml kanamycyny i 30 μg/ml chloramfenikolu). Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem.
    2. Rozcieńczyć kulturę pierwotną (5 ml) w 500 ml pożywki do autoindukcji zawierającej antybiotyki, 0,02% L-arabinozy i 1 mM nienaturalnego aminokwasu PrK i inkubować w temperaturze 37 °C przez 24 godziny z wytrząsaniem. Obejmują kontrolę ujemną poprzez równoległe przeprowadzanie hodowli bez PrK oraz kontrolę pozytywną polegającą na przeprowadzaniu hodowli klonu zawierającego białko wagowe.
    3. Z 500 ml pożywki hodowlanej należy podzielić na porcję 5 ml i odwirować przez 10 minut przy 5 000 g. Odrzucić supernatant i zamrozić osad w temperaturze -20 °C. Zebrać komórki z pozostałych 495 ml przez odwirowanie przez 10 minut przy 5 000 x g. Odrzucić supernatant i zamrozić osad w temperaturze -20 °C.
  4. Analiza surowych ekstraktów komórkowych z 5 ml próbek hodowlanych za pomocą SDS-PAGE i analizy western Blot
    1. Ponownie zawiesić 5 ml granulek komórek w 250 μl buforu do lizy (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4, 150 mM NaCl, pH 8, 5 mM imidazolu, 0,2 mM PMSF) i przenieść do mikroprobówki o pojemności 1,5 ml.
    2. Lizuj komórki, zamrażając probówki w ciekłym azocie, rozmrażając je w kąpieli o temperaturze 42 °C i wirując z dużą prędkością przez 30 s. Powtórz ten krok 3 razy.
    3. Odwiruj próbki o masie 17 000 x g przez 10 minut, aby wyeliminować resztki komórek.
    4. Pobrać 10 μl supernatantu i dodać 5 μl wody i 5 μl buforu ładującego (błękit bromofenolowy, SDS, β-merkaptoetanol). Podgrzewać próbki przez 5 minut w temperaturze 100 °C i przeprowadzić analizy SDS-PAGE i western Blot.
  5. Oczyszczanie białek metodą grawitacyjnej chromatografii powinowactwa z wykorzystaniem kulek niklowo-NTA
    1. Zawiesić osady komórkowe (z hodowli 495 ml) w 20 ml buforu do lizy (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4, 150 mM NaCl, pH 8, 5 mM imidazolu, 0,2 mM PMSF).
    2. Dodać 5 μl DNazy I (1 mg/ml) i 500 μl lizozymu (50 mg/ml) do zawiesiny i pozostawić do lizy przez inkubację zawiesiny w temperaturze 37 °C przez 30 min.
    3. Sonikować komórki przez 5 minut (cykle 5 s-5 s, amplituda 50%), a następnie usunąć resztki komórek przez odwirowanie przy 20 000 x g przez 30 minut, a następnie filtrację na filtrze 0,45 μm.
    4. Dodać żywicę Ni-NTA do zawiesiny (500 μl na 500 ml hodowli komórkowej) i delikatnie mieszać w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę.
    5. Wlać zawiesinę do kolumny polipropylenowej i zebrać frakcję niezwiązaną.
    6. Przemyć żywicę 10 ml buforu płuczącego zawierającego 50 mM Na2HPO4/NaH2PO4, 150 mM NaCl, 10 mM imidazolu. Umyj żywicę po raz drugi 5 ml buforu płuczącego (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4, 150 mM NaCl, 20 mM imidazolu). Zbierz frakcje prania.
    7. Eluować znakowane białko za pomocą 1 ml buforu elucyjnego (50 mM Na2HPO4 / NaH2PO4, 150 mM NaCl, 300 mM imidazolu). Powtórz ten krok 4 razy i zbierz wszystkie frakcje elucyjne.
    8. Przeanalizuj surowy lizat, a także 7 frakcji oczyszczających za pomocą SDS-PAGE na 12% żelu akrylowym.
    9. Połączyć frakcje zawierające czyste białko znakowane His i poddać je dializie w stosunku do 1 l buforu proteazy TEV (50 mM Tris-HCl, 0,5 mM EDTA, pH 8) przez noc za pomocą membrany dializacyjnej (odcięcie MW 6000-8000 Da). Zmierzyć stężenie białka przy 280 nm ze współczynnikiem ekstynkcji molowej 37 360 cm-1∙M-1 i masą cząsteczkową 34,14 kDa dla mPsaA.

3. Usunięcie znacznika histydyny przez trawienie proteazy TEV

  1. Zebrać próbkę białka do probówki o pojemności 50 ml i dodać bufor TEV (50 mM Tris HCl, 0,5 mM EDTA, pH 8) do 1 ml w stężeniu 2 mg/mL.
    UWAGA: Stężenie może się różnić w zależności od poprzednich wyników. Stężenia białek, które przetestowaliśmy, mieszczą się w typowym zakresie 2-3 mg/ml.
  2. Dodać 100 μl proteazy TEV (dodać 1 μl zawierającej 10 jednostek proteazy TEV na 20 μg białka do strawienia).
  3. Dodać 50 μl 0,1 M ditiotreitolu (DTT).
  4. W komplecie z buforem TEV (50 mM Tris HCl, 0,5 mM EDTA, pH 8) do 5 mL.
  5. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C, powoli wstrząsając.
    UWAGA: Jeśli trawienie nie jest zakończone, dodaj więcej proteazy TEV, inkubuj przez dłuższy czas lub w wyższej temperaturze do 30 °C.
  6. Dializować strawione białko w celu usunięcia EDTA w temperaturze 4 °C przez noc za pomocą membrany dializacyjnej (odcięcie 6000-8000 Da) w stosunku do buforu fosforanowego (50 mM Na2HPO4 / NaH2PO4, 150 mM NaCl, 5 mM imidazolu).
  7. W celu wyeliminowania proteazy TEV i niestrawionego białka należy inkubować mieszaninę z kulkami Ni-NTA i delikatnie mieszać przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C.
  8. Wlać zawiesinę do kolumny polipropylenowej. Zebrać frakcję niezwiązaną i przemyć kolumnę 5 ml buforu płuczącego (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4, 150 mM NaCl, 10 mM imidazolu)
    UWAGA: Białko będące przedmiotem zainteresowania powinno być odzyskane we frakcji niezwiązanej i przemywającej.
  9. Eluować proteazę TEV i niestrawione białko, dodając 5 ml buforu elucyjnego (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4, 150 mM NaCl, 300 mM imidazolu) na kolumnie. Sprawdzić frakcje pod kątem zawartości białka przy 280 nm i za pomocą analizy SDS-PAGE.
  10. Sprawdź wydajność trawienia, ładując strawione próbki na STRONĘ KARTY CHARAKTERYSTYKI z niestrawionym białkiem jako kontrolą.
  11. Dializować strawione białko w stosunku do 1 l buforu klik (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4, pH 8) w temperaturze 4 °C przez noc za pomocą membrany dializacyjnej (odcięcie 6000-8000 Da) w celu usunięcia imidazolu, a także w celu wymiany buforu, a następnie zmierzyć stężenie białka przy 280 nm ze współczynnikiem ekstynkcji molowej i masą cząsteczkową mPsaA (37 360 cm-1∙M-1 i MW 34,14 kDa).

4. Ocena dostępności i funkcjonalności nienaturalnego aminokwasu propargyl-lizyny dla chemii kliknięć

UWAGA: Sprzęż mPsaA z azydkiem 6-heksachloro-fluoresceiny, korzystając z protokołu opisanego przez Presolskiego i wsp.20 dla chemii kliknięć.

  1. Weź 432,5 μl białka z mutacją PrK o stężeniu 57,8 μM do mikroprobówki o pojemności 2 ml.
    UWAGA: Dopuszczalne jest minimalne stężenie alkinu wynoszące 2 μM. Jeśli stężenie białka jest niższe, należy je zagęścić za pomocą koncentratora odśrodkowego lub sprzyjać równowadze reakcji poprzez zwiększenie stosunku molowego azydku do alkinu.
  2. Dodać 10 μl 5 mM azydku 6-heksachlorofluoresceiny, a następnie dodać premiks 2,5 μl roztworuCuSO4 w 20 mM i 7,5 μl tris(benzylotriazolylometylo)aminy (THPTA) w 50 mM (stężenia roztworów podstawowych).
    1. Dodać 25 μl wodnego roztworu 100 mM chlorowodorku aminoguanidyny.
    2. Dodać 25 μl z 20 mg/ml przygotowanego doraźnie wodnego roztworu askorbinianu sodu.
    3. Zamknij probówkę, kilkakrotnie wymieszaj przez odwrócenie i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.
    4. Zatrzymaj reakcję, dodając 50 μl 0,5 M EDTA.
    5. Pobrać 15 μl mieszaniny reakcyjnej i umieścić ją w mikroprobówce, dodać 5 μl buforu ładującego (błękit bromofenolowy, SDS, β-merkaptoetanol), podgrzewać mieszaninę w temperaturze 100 °C przez 5 min, a następnie załadować ją do 12% żelu akrylowego. Po migracji wizualizuj koniugat fluorescencyjny na żelu w świetle UV przy długości fali 312 nm.

5. Koniugacja mPsaA z azydofunkcjonalizowanym antygenem węglowodanowym (Pn14TS-N3) za pomocą chemii kliknięć

  1. sprzęg
    1. Weź 432,5 μl białka z mutacją PrK w 57,8 μM do mikroprobówki o pojemności 2 ml.
    2. Dodać 10 μl z 5 mM Pn14TS-N321 do wody, a następnie dodać premiks 2,5 μl roztworu CuSO4 przy 20 mM i 7,5 μl THPTA o stężeniu 50 mM.
      UWAGA: Synteza Pn14TS-N3, tetrasacharydu naśladującego polisacharyd otoczkowy Streptococcus pneumoniae serotyp 14, została opisana w pozycji referencyjnej 21. Teoretycznie można zastosować dowolny antygen węglowodanowy zawierający funkcję azydkową.
    3. Dodać 25 μl 100 mM chlorowodorku aminoguanidyny.
    4. Dodać 25 μl z 20 mg/ml doraźnie przygotowanego wodnego roztworu askorbinianu sodu.
    5. Zamknąć probówkę, kilkakrotnie wymieszać przez odwrócenie i inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.
    6. Zatrzymaj reakcję, dodając 50 μl 0,5 M EDTA.
    7. Pobrać 15 μl próbek i przeanalizować za pomocą SDS-PAGE.
  2. Filtracja żelowa, oczyszczanie glikokoniugatu
    1. Oczyść glikokoniugat przez nałożenie go na kolumnę z agarozą z wykluczeniem sterycznym (wymiary złoża 15 x 600, zakres frakcjonowania 3 000-70 000), zrównoważoną buforem 100 mM PBS, pH 7,3 przy przepływie 0,8 ml / min z detekcją przy 280 nm.
    2. Zebrać frakcje zawierające glikokoniugat.
      UWAGA: W przypadku przedłużonego przechowywania, glikokoniugat należy dializować w stosunku do 1 lH2Odwa razy przez 2 godziny, a następnie przez noc w temperaturze 4 °C za pomocą membrany dializacyjnej (odcięcie Mw 6000-8000 Da), a następnie liofilizować i przechowywać glikokoniugat w temperaturze -80 °C.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W niniejszym projekcie przygotowano jednorodną szczepionkę glikokoniugatu, wykorzystując strategię supresji bursztynowego kodonu stop w celu wprowadzenia UAA w określonym miejscu (Rycina 1). Jako białkową część nośnika wybrano adhezynę powierzchniową A pneumokoków. Białko to jest wysoce konserwatywne i ekspresjonowane przez wszystkie szczepy Streptococcus pneumoniae22. Jest ono silnie immunogenne i było wcześniej stosowane jak...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Mutageneza ukierunkowana na miejsce jest prostą strategią polegającą na włączeniu określonych aminokwasów w określonej pozycji białka, które pozostaje prawie nieużywane, w celu przygotowania szczepionek glikokoniugatowych 7,8,14. Klasyczna mutageneza oparta na podejściu opartym na 20 naturalnych aminokwasach jest bardzo skuteczna, ponieważ nie jest wymagana żadna modyfikacja maszynerii translacyjnej. Mutacje cysteiny są zwykle u...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

E.C. z wdzięcznością dziękuje za wsparcie finansowe od La Région Pays de la Loire (Pari Scientifique Program "BioSynProt"), w szczególności stypendium doktoranckie dla telewizji. Dziękujemy również dr. Robertowi B. Quastowi (INRA UMR0792, CNRS UMR5504, LISBP, Tuluza, Francja) za jego cenne porady techniczne.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AIM (autoinductif medium)FormediumAIMLB0210Stały proszek
Boc-Lys-OHAlfa-AesarH63859Stały proszek
BL21(DE3)Merck Novagen69450E. coli str. B, F- ompT gal dcm lon hsdSB(rB-mB-) λ (DE3 [lacI lacUV5-T7p07 ind1 sam7 nin5]) [malB+]K-12(λ S)
Membrana
Filtr DNAseI
0,45 i mikro; m
L-arabinoze
lizozymu
Żywica Ni-NTAMachery NagelProtinoKoraliki Ni-NTA w zawiesinie do 20% etanolu
odśrodkowe Pall
pET24d-mPsaAK32TAG-ENLYFQ-HHHHHHto badanietakie samo jak pET24d-mPsaA-WT, ale z mutacją K32TAG w Gen mPsaA
pET24d-mPsaA-WTto badanieplazmid pET24d z genem Wt mPsaA sklonowanym między miejscami restrykcyjnymi BamHI i XhoI z sekwencją proteazy TEV, po której następuje znacznik His6 na C-końcowym końcu genu mPsaA i przenoszący gen oporności na kanamycynę
plazmid pEVOLprezent od Edwarda Lemke EMBL (ref 19)plazmid pochodzenia p15A, dwie kopie MmPylRS (jedna pod promotorem GlnS i jedna pod promotorem pAra), jedna kopia tRNACUA pod promotorem ProK, gen oporności na chloramfenikol
Chloromrówczanpropargylu Sigma-Aldrich460923Liquid
SonicatorThermo FisherFB120-220
dializyUrządzenie

Bibliografia

  1. Rappuoli, R. Glycoconjugate vaccines: Principles and mechanisms. Science Translational Medicine. 10 (456), (2018).
  2. Verez-Bencomo, V., et al. A synthetic conjugate polysaccharide vaccine against Haemophilus influenzae type b. Science (New York, N.Y). 305 (5683), 522-525 (2004).
  3. Berti, F., Adamo, R. Antimicrobial glycoconjugate vaccines: an overview of classic and modern approaches for protein modification. Chemical Society Reviews. 47 (24), 9015-9025 (2018).
  4. Stefanetti, G., et al. Sugar-Protein Connectivity Impacts on the Immunogenicity of Site-Selective Salmonella O-Antigen Glycoconjugate Vaccines. Angewandte Chemie (International Ed. in English). 54 (45), 13198-13203 (2015).
  5. Kay, E., Cuccui, J., Wren, B. W. Recent advances in the production of recombinant glycoconjugate vaccines. NPJ Vaccines. 4, 16(2019).
  6. Ma, Z., Zhang, H., Wang, P. G., Liu, X. W., Chen, M. Peptide adjacent to glycosylation sites impacts immunogenicity of glycoconjugate vaccine. Oncotarget. 9 (1), 75-82 (2018).
  7. Grayson, E. J., Bernardes, G. J. L., Chalker, J. M., Boutureira, O., Koeppe, J. R., Davis, B. G. A coordinated synthesis and conjugation strategy for the preparation of homogeneous glycoconjugate vaccine candidates. Angewandte Chemie (International Ed. in English). 50 (18), 4127-4132 (2011).
  8. Pillot, A., et al. Site-Specific Conjugation for Fully Controlled Glycoconjugate Vaccine Preparation. Frontiers in Chemistry. , (2019).
  9. Neumann-Staubitz, P., Neumann, H. The use of unnatural amino acids to study and engineer protein function. Current Opinion in Structural Biology. 38, 119-128 (2016).
  10. Dumas, A., Lercher, L., Spicer, C. D., Davis, B. G. Designing logical codon reassignment - Expanding the chemistry in biology. Chemical Science. 6 (1), 50-69 (2015).
  11. Chen, H., Venkat, S., McGuire, P., Gan, Q., Fan, C. Recent Development of Genetic Code Expansion for Posttranslational Modification Studies. Molecules (Basel, Switzerland). 23 (7), (2018).
  12. Adumeau, P., Sharma, S. K., Brent, C., Zeglis, B. M. Site-Specifically Labeled Immunoconjugates for Molecular Imaging--Part 2: Peptide Tags and Unnatural Amino Acids. Molecular imaging and biology: MIB: the official publication of the Academy of Molecular Imaging. 18 (2), 153-165 (2016).
  13. Kularatne, S. A., et al. A CXCR4-targeted site-specific antibody-drug conjugate. Angewandte Chemie (International Ed. in English). 53 (44), 11863-11867 (2014).
  14. WIPO. Patent US20180333484 Polypeptide-Antigen Conjugates with Non-Natural Amino Acids. , https://patentscope.wipo.int/search/en/detail.jsf?docId=US233548973&recNum=65&docAn=15859251&queryString=(GBS)&maxRec=11858 (2018).
  15. Quast, R. B., Mrusek, D., Hoffmeister, C., Sonnabend, A., Kubick, S. Cotranslational incorporation of non-standard amino acids using cell-free protein synthesis. FEBS letters. 589 (15), 1703-1712 (2015).
  16. Wang, L. Engineering the Genetic Code in Cells and Animals: Biological Considerations and Impacts. Accounts of Chemical Research. 50 (11), 2767-2775 (2017).
  17. Brabham, R., Fascione, M. A. Pyrrolysine Amber Stop-Codon Suppression: Development and Applications. Chembiochem: A European Journal of Chemical Biology. 18 (20), 1973-1983 (2017).
  18. Oller-Salvia, B. Genetic Encoding of a Non-Canonical Amino Acid for the Generation of Antibody-Drug Conjugates Through a Fast Bioorthogonal Reaction. , https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Genetic+Encoding+of+a+Non-Canonical+Amino+Acid+for+the+Generation+of+Antibody-Drug+Conjugates+Through+a+Fast+Bioorthogonal+Reaction (2019).
  19. Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. Journal of Molecular Biology. 395 (2), 361-374 (2010).
  20. Presolski, S. I., Hong, V. P., Finn, M. G. Copper-Catalyzed Azide-Alkyne Click Chemistry for Bioconjugation. Current Protocols in Chemical Biology. 3 (4), 153-162 (2011).
  21. Prasanna, M., et al. Semisynthetic glycoconjugate based on dual role protein/PsaA as a pneumococcal vaccine. European Journal of Pharmaceutical Sciences: Official Journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 129, 31-41 (2019).
  22. Morrison, K. E., et al. Confirmation of psaA in all 90 serotypes of Streptococcus pneumoniae by PCR and potential of this assay for identification and diagnosis. Journal of Clinical Microbiology. 38 (1), 434-437 (2000).
  23. Lin, H., Lin, Z., Meng, C., Huang, J., Guo, Y. Preparation and immunogenicity of capsular polysaccharide-surface adhesin A (PsaA) conjugate of Streptococcuspneumoniae. Immunobiology. 215 (7), 545-550 (2010).
  24. Safari, D., et al. Identification of the smallest structure capable of evoking opsonophagocytic antibodies against Streptococcus pneumoniae type 14. Infection and Immunity. 76 (10), 4615-4623 (2008).
  25. Wang, Q., Parrish, A. R., Wang, L. Expanding the genetic code for biological studies. Chemistry & Biology. 16 (3), 323-336 (2009).
  26. Lawrence, M. C., Pilling, P. A., Epa, V. C., Berry, A. M., Ogunniyi, A. D., Paton, J. C. The crystal structure of pneumococcal surface antigen PsaA reveals a metal-binding site and a novel structure for a putative ABC-type binding protein. Structure (London, England: 1993). 6 (12), 1553-1561 (1998).
  27. Wright, T. H., Davis, B. G. Post-translational mutagenesis for installation of natural and unnatural amino acid side chains into recombinant proteins. Nature Protocols. 12 (10), 2243-2250 (2017).
  28. Dadová, J., Galan, S. R., Davis, B. G. Synthesis of modified proteins via functionalization of dehydroalanine. Current Opinion in Chemical Biology. 46, 71-81 (2018).
  29. Worst, E. G., et al. Residue-specific Incorporation of Noncanonical Amino Acids into Model Proteins Using an Escherichia coli Cell-free Transcription-translation System. Journal of Visualized Experiments. (114), (2016).
  30. Carboni, F., et al. GBS type III oligosaccharides containing a minimal protective epitope can be turned into effective vaccines by multivalent presentation. The Journal of Infectious Diseases. , (2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

szczepionka glikokoniugowanarozszerzenie kodu genetycznegosupresja kodonu bursztynowegooczyszczanie białekfiltracja żelowaspektrometria masSDS-PAGEWestern blot
Jednorodny glikokoniugat wytwarzany przez połączenie nienaturalnej inkorporacji aminokwasów i chemii kliknięć do celów szczepionkowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.