Artykuł metodologiczny

Izolacja i ekspansja neurosfer z postnatalnych (P1−3) mysich nisz neurogennych

14.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60822

⸱

23 maja 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Instituto de Medicina Molecular João Lobo Antunes, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa, 2Instituto de Farmacologia e Neurociências, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa, 3Instituto de Biologia Molecular, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa

W tym artykule

Podsumowanie

W tym artykule szczegółowo opisujemy protokół generowania kultur neurosfery z pourodzeniowych mysich nerwowych komórek macierzystych pochodzących z głównych nisz neurogennych myszy. Neurosfery służą do identyfikacji nerwowych komórek macierzystych z tkanki mózgowej, co pozwala na oszacowanie liczby komórek prekursorowych. Co więcej, te struktury 3D mogą być powlekane w warunkach różnicowania, dając początek neuronom, oligodendrocytom i astrocytom, umożliwiając badanie losu komórek.

Streszczenie

Test neurosfery jest niezwykle przydatną techniką in vitro do badania naturalnych właściwości nerwowych komórek macierzystych/progenitorowych (NSPC), w tym proliferacji, samoodnowy i multipotencji. W mózgu po urodzeniu i w wieku dorosłym NSPC są obecne głównie w dwóch niszach neurogennych: strefie podkomorowej (SVZ) wyściełającej komory boczne i strefie podziarnistej zakrętu zębatego hipokampa (DG). Izolacja nisz neurogennych od mózgu postnatalnego pozwala na uzyskanie większej ilości NSPC w hodowli, a w konsekwencji na korzyść wyższych plonów. Bliski kontakt między komórkami w każdej neurosferze tworzy mikrośrodowisko, które może przypominać nisze neurogenne. Tutaj szczegółowo opisujemy, jak generować kultury neurosfery pochodzące z SVZ i DG od myszy w wieku 1-3 dni (P1-3), a także pasażowanie w celu ekspansji neurosfery. Jest to korzystne podejście, ponieważ test neurosfery pozwala na szybkie generowanie klonów NSPC (6-12 dni) i przyczynia się do znacznego zmniejszenia liczby wykorzystania przez zwierzęta. Poprzez posiew neurosfer w warunkach różnicowania możemy uzyskać pseudomonowarstwę komórek złożoną z NSPC i zróżnicowanych komórek o różnych liniach nerwowych (neuronów, astrocytów i oligodendrocytów), co pozwala na badanie działania czynników wewnętrznych lub zewnętrznych na proliferację, różnicowanie, przeżycie komórek i neurytogenezę.

Wprowadzenie

Test neurosfery (NSA) został po raz pierwszy opisany w 1992 roku1,2 i nadal pozostaje unikalnym i potężnym narzędziem w badaniach nad neuronalnymi komórkami macierzystymi (NSC). Izolacja NSC od głównych regionów neurogennych wiąże się z trudnymi problemami, ponieważ wymagania dotyczące utrzymania tych komórek w warunkach fizjologicznych pozostają słabo poznane. W NSA komórki są hodowane w chemicznie zdefiniowanym podłożu wolnym od surowicy z obecnością czynników wzrostu, w tym naskórkowego czynnika wzrostu (EGF) i podstawowego czynnika wzrostu fibroblastów (bFGF)1,2,3. Neuronalne komórki prekursorowe (macierzyste i progenitorowe) są wybierane przy użyciu tych mitogenów, ponieważ komórki te reagują na EGF i FGF, wchodząc w okres aktywnej proliferacji, podczas gdy inne komórki, a mianowicie komórki zróżnicowane, umierają4. Neuronalne komórki prekursorowe rosną jako neurosfery, które mogą być następnie pasażowane, aby jeszcze bardziej rozszerzyć pulę tych komórek5. Co ważne, ponieważ te progenitorowe komórki macierzyste (NSPC) są multipotencjalne, są w stanie różnicować się w trzy główne typy komórek ośrodkowego układu nerwowego (OUN): neurony, oligodendrocyty i astrocyty5.

NSA dostarcza odnawialnego źródła niezróżnicowanych prekursorów OUN, które mogą być wykorzystane do badania kilku procesów, w tym proliferacji i samoodnawiania się NSC oraz różnicowania neuronów i gleju, zarówno w kontekście fizjologicznym, jak i chorobowym. Co więcej, badania in vitro mogą być wykorzystane do oceny stopnia wewnętrznej specyfikacji obecnej w prekursorach neuronalnych podczas rozwoju, a także do zbadania pełnego potencjału komórek, poprzez usunięcie zewnętrznych sygnałów związanych z ich normalnym środowiskiem6. Model neurosfery jest cenny dla oceny przypuszczalnych regulatorów, ponieważ utrzymując komórki w pożywce pozbawionej surowicy, sygnały środowiskowe są dostarczane tylko przez otaczające komórki6. Co więcej, w NSA NSPC łatwo się namnażają w hodowli, gęstość komórek na obszar jest wysoka, a niejednorodny skład neurosfer ma pewne podobieństwo do nisz in vivo6. Te dobrze ugruntowane zalety są powodem, dla którego metodologia ta jest szeroko stosowana przez wielu badaczy.

Poniższy protokół szczegółowo opisuje wszystkie procesy od izolacji populacji postnatalnej NSPC od dwóch głównych regionów neurogennych, strefy podkomorowej (SVZ) i zakrętu zębatego hipokampa (DG), aż do ekspansji tych komórek jako neurosfer, a także do różnicowania się w neurony, astrocyty i oligodendrocyty. Na koniec opisano również różne testy w celu uzyskania dostępu do właściwości pnia i multipotencji NSPC pochodzących z SVZ i DG.

Protokół

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z prawodawstwem Wspólnoty Europejskiej (86/609/EEC; 2010/63/UE; 2012/707/UE) i Portugalii (DL 113/2013) w zakresie ochrony zwierząt wykorzystywanych do celów naukowych. Protokół został zatwierdzony przez "Instytucjonalny Organ ds. Dobrostanu Zwierząt iMM - ORBEA-iMM oraz właściwy organ krajowy - DGAV (Direcção Geral de Alimentação e Veterinária)".

1. Podstawowa konfiguracja i przygotowanie podłoża hodowlanego

  1. W dniu rozbioru należy przygotować odpowiednią ilość pożywki wzrostowej odpowiadającej pożywce wolnej od surowicy (SFM) składającej się ze zmodyfikowanego podłoża orła firmy Dulbecco [(DMEM)/F12 z L-glutaminą] (tabela materiałów) uzupełnionego o 100 μg/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny (wstrzykiwacz/paciorkowiec), 1% B27, a także 10 ng/ml EGF i 5 ng/ml bFGF. Ogrzać pożywkę do temperatury 37 °C w łaźni wodnej.
    UWAGA: Objętość pożywki zależy od liczby młodych, dla 5 szczeniąt przygotuj ~100 ml (50 ml dla SVZ i 50 ml dla DG); Jednak po zliczeniu liczby komórek (krok 5.1) dokładna głośność będzie musiała zostać dostosowana.
  2. Do mikrodysekcji SVZ i DG należy przygotować pożywkę do dysparkcyjną bez wapnia i magnezu w postaci zrównoważonego roztworu soli fizjologicznej Hanksa (HBSS) uzupełnioną 100 U/ml długopisu/paciorkowca
    UWAGA: Przygotuj 50-100 ml pożywki preparyjnej.
  3. Ustaw mikroskop preparacyjny i przygotuj narzędzia potrzebne do usunięcia mózgu (nożyczki i mała szpatułka) oraz do mikrodysekcji SVZ i DG (małe nożyczki Dumont, kleszcze #7, kleszcze #5 #5S kleszcze) poprzez namoczenie w 70% etanolu.

2. Pobieranie pourodzeniowych (P1−3) mózgów myszy i mikrodysekcji SVZ/DG

  1. Przygotować 60 mm szalki Petriego (obszar wzrostu 21 cm2) z HBSS uzupełnionym wstrzykiwaczem/paciorkowym i 2 probówkami z próbkami (jedną dla SVZ i jedną dla DG) z 500 μl uzupełnionego HBSS każda.
  2. Eutanazja szczeniąt myszy (P1−3) zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez placówkę/wytyczne Institutional Animal Care. Wykonaj dekapitację za pomocą pojedynczego nacięcia ostrymi nożyczkami u podstawy pnia mózgu.
  3. Trzymając brzuszną część ciała u podstawy głowy i za pomocą małych spiczastych nożyczek, wykonaj nacięcie w linii środkowej skóry na całej długości głowy, odsłaniając w ten sposób powierzchnię czaszki.
  4. Wykonaj podłużne nacięcie u podstawy czaszki i kontynuuj cięcie wzdłuż szwu strzałkowego za pomocą małych nożyczek o jak najmniejszym kącie, aby uniknąć uszkodzenia struktur mózgu.
  5. Oderwij czaszkę na boki za pomocą zakrzywionych kleszczy i odsłoń mózg.
    UWAGA: Upewnij się, że narzędzia preparacyjne są wolne od etanolu przed dotknięciem mózgu.
  6. Odizoluj mózg od czaszki za pomocą małej szpatułki, wsuwając się pod podstawę mózgu, aby przeciąć nerwy czaszkowe i naczynia krwionośne, które są połączone z podstawą mózgu, i przenieś mózg na szalkę Petriego zawierającą zimny roztwór HBSS.
  7. Umieść szalkę Petriego zawierającą mózg pod mikroskopem preparacyjnym w małym powiększeniu i umieść mózg na jego grzbietowej powierzchni.
  8. Za pomocą cienkich kleszczy usuń opony mózgowe z brzusznej strony mózgu i opuszki węchowe, jednocześnie przytrzymując mózg w pozycji przez móżdżek. Obróć mózg na brzuszną część i oderwij resztę opon mózgowych.
    UWAGA: Usunięcie opon mózgowo-rdzeniowych na grzbiecie jest kluczowym krokiem w celu zapewnienia prawidłowego krojenia mózgu.
  9. Wyrzuć móżdżek, wykonując cięcie za pomocą kleszczy. Umieść bibułę filtracyjną o wielkości porów 11 μm na rozdrabniaczu do tkanek (tabela materiałów) i umieść mózg na bibule filtracyjnej za pomocą zakrzywionych kleszczy. Pokrój mózg na skrawki koronalne o wielkości 450 μm i użyj mokrej blaszki, aby zebrać podzielony mózg na nową szalkę Petriego wypełnioną zimnym dodatkiem HBSS.
  10. Aby wypreparować SVZ, użyj kleszczy, aby oddzielić plasterki koronalne w sposób przedni od tylnego, aż do osiągnięcia plasterków z bocznymi komorami, pod mikroskopem preparacyjnym.
  11. Przeciąć cienką warstwę tkanki otaczającej boczną ścianę komór (która odpowiada SVZ) cienkimi kleszkami, z wyłączeniem miąższu prążkowia i ciała modzelowatego. Odizoluj SVZ, umieszczając końcówkę kleszczy w bocznych rogach komory bocznej: jeden bezpośrednio pod ciałem modzelowatym, a drugi w tkance bezpośrednio przylegającej do brzusznej części komory bocznej. Następnie przetnij niewielką linię tkanki otaczającą komorę boczną.
  12. Pobrać wypreparowaną tkankę do probówki z uzupełnionym roztworem HBSS wcześniej oznaczonym jako SVZ.
    UWAGA: Wyklucz SVZ w plasterkach, w których zaczynają pojawiać się zarówno komory boczne, jak i formacja hipokampa.
  13. Przejdź przez wszystkie plastry po mikrodysekcji SVZ w sposób przednio-tylny i dotrzyj do formacji hipokampa. Za pomocą kleszczy odrzuć pierwszy plasterek z hipokampem, w którym DG jest nadal nierozpoznawalny.
  14. Aby usunąć DG, najpierw odizoluj hipokamp od plasterków. Ponownie ustaw ostrość mikroskopu, aby uwidocznić granice wokół DG.
  15. Rozetnij część DG, wykonując cięcie między obszarem DG i CA1, a następnie pionowe cięcie między obszarem DG i CA3 za pomocą kleszczy. Usuń fimbrię i wszelkie przyległe tkanki.
    UWAGA: U zwierząt P1−3 DG jest prawie nie do odróżnienia od rogu Ammona, ale ma małą końcówkę.
  16. Pobrać wypreparowaną tkankę do probówki zawierającej uzupełnione roztwory HBSS uprzednio oznaczone jako DG.
    UWAGA: Ogólny uraz hipokampa lub okolic utrudni odizolowanie DG. Korzystanie z atlasu mózgu myszy po urodzeniu jest niezbędne, gdy użytkownik nie jest zaznajomiony z izolacją tkanki SVZ i DG z odcinków koronalnych.

3. Dysocjacja tkanek

  1. Aby oddzielić tkankę SVZ i DG obecną w odpowiednich probówkach, dodaj trypsynę-EDTA 0,05%, aby uzyskać końcowe stężenie 5-10% Trypsyny-EDTA 0,05% w HBSS. Inkubować przez około 15 minut w temperaturze 37 °C, aż tkanka się zlepi
    2. .
  2. Umyj tkankę z trypsyny, usuwając pożywkę i dodając 1 ml nowego roztworu uzupełnionego HBSS przez 4 kolejne razy.
  3. Usunąć HBSS i ponownie zawiesić strawioną tkankę w 1 ml SFM uzupełnionym 10 ng/ml EGF i 5 ng/ml bFGF. Mechanicznie rozdzielić osad, delikatnie pipetując w górę i w dół około 7−10x za pomocą pipety P1000, aż do uzyskania jednorodnego roztworu komórek.
    UWAGA: Nadmierna dysocjacja mechaniczna może prowadzić do zwiększonej śmierci komórki i negatywnie wpłynie na późniejszy wzrost komórek.

4. Test par komórek do badania losu komórki

  1. Przed eksperymentem należy przygotować powlekane płytki 24-dołkowe do przylegających kultur jednowarstwowych zgodnie z sekcjami 8-10.
  2. Aby policzyć liczbę komórek SVZ lub DG (uzyskaną w sekcji 3), które mają być powlekane, należy użyć roztworu zawierającego 0,2% błękitu trypanowego i policzyć komórki za pomocą hematocytometru.
  3. Rozcieńczyć zdysocjowaną zawiesinę komórek w SFM uzupełnioną 5 ng/ml EGF i 2,5 ng/ml bFGF (low EGF/bFGF) o gęstości 11 300 komórek/cm2 i pokryć je na szkiełkach nakrywkowych z powlekanego szkła.
  4. Po 24 godzinach unieruchomić komórki do immunocytochemii w stosunku do markerów NSC, takich jak region determinujący płeć Y-box 2 (Sox2) i gniazdo, a także za pomocą markera linii neuronalnej (mianowicie podwójnej kortyny [DCX], dla niedojrzałych neuronów) (patrz punkt 14).
    UWAGA: Sox2 jest markerem NSC, które przechodzą mitozę. Pary komórek Sox2+/+ powstałe w wyniku podziału pojedynczej komórki progenitorowej odzwierciedlają ekspansję komórek macierzystych7.

5. Ekspansja pourodzeniowych nerwowych komórek macierzystych jako neurosfer

  1. Aby określić gęstość zdysocjowanej zawiesiny komórek SVZ lub DG (uzyskanej w sekcji 3), należy policzyć komórki za pomocą hematocytometru.
  2. Rozcieńczyć zawiesinę jednokomórkową SVZ i DG o gęstości 2 x 104 komórek/ml w SFM uzupełnioną 10 ng/ml EGF i 5 ng/ml bFGF. Zasiewać komórki SVZ i DG na niepowlekanych płytkach Petriego o średnicy 60 mm i końcowej objętości 5 ml/szalkę Petriego.
  3. Inkubować komórki SVZ i DG odpowiednio przez 6-8 dni i 10-12 dni, aby utworzyć pierwotne neurosfery, w temperaturze 37 °C z 5% CO2,
    UWAGA: Dni inkubacji dłuższe niż wymienione mogą sprzyjać agregacji neurosfer i wyższym poziomom śmierci komórek w centrum neurosfery.
  4. Gdy większość neurosfer ma średnicę 150−200 μm, wykonaj przejście neurosfery.
    UWAGA: Neurosfery pasażujące, gdy nie mają odpowiedniej średnicy, zagrażają wszystkim następnym krokom.

6. Pasażowanie neurosfer

UWAGA: Następujący protokół może być zastosowany do rozbudowy zarówno neurosfer SVZ, jak i DG.

  1. Aby przejść przez neurosfery, należy zebrać SFM z czynnikami wzrostu zawierającymi neurosfery z szalki Petriego o średnicy 60 mm i odwirować przez 5 minut przy 300 x g.
  2. Wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad neurosfery za pomocą zestawu do dysocjacji chemicznej (myszy) zgodnie z instrukcjami producenta (Tabela materiałów).
    UWAGA: Dokładnie obserwuj czasy inkubacji, ponieważ mają one kluczowe znaczenie dla wydajności.
  3. Wirować przez 5 minut przy 300 x g, usunąć supernatant i dodać 1 ml SFM uzupełnionego 10 ng/ml EGF i 5 ng/ml bFGF.
  4. Trzykrotnie przecieraj w górę iw dół około 10 razy za pomocą pipety P1000, aby dysocjować neurosfery.
  5. Policz liczbę komórek za pomocą roztworu zawierającego 0,2% błękitu trypanowego i hematocytometru.
  6. Ponownie zasiać komórki o gęstości 2 x 104 komórki/ml na niepowlekanych płytkach Petriego o średnicy 60 mm.
  7. Inkubować komórki SVZ i DG odpowiednio przez 6-8 dni i 10-12 dni, aby uzyskać wtórne neurosfery, w temperaturze 37 °C z 5% CO2,
    UWAGA: Dostęp do zdolności do samodzielnego odnawiania NSPC pochodzących z SVZ i DG można uzyskać, postępując zgodnie z sekcjami 5 i 6 protokołu. W tym celu wysiewaj komórki SVZ i DG o gęstości 1,0 x 104 komórki/ml (na niepowlekanych płytkach 24-dołkowych) w pożywce wzrostowej SFM zawierającej 5 ng / ml EGF i 2,5 ng / ml bFGF (niski EGF / bFGF). Policz liczbę powstałych neurosfer pierwotnych i wtórnych.

7. Przechowywanie neurosfer

  1. Zebrać pożywkę zawierającą neurosfery (otrzymane z kroków 5.3 i 6.7) z 60 mm szalek Petriego.
  2. Wirować przez 5 minut przy 300 x g i wyrzucić supernatant.
  3. Przemyj komórki 2x 1 ml HBSS (5 min przy 300 x g).
  4. Wirować przez 5 minut przy 300 x g, odrzucić supernatant i przechowywać osad neurosfer w temperaturze -20 °C do analizy biologii molekularnej.

8. Procedura powlekania płyt PDL

  1. Aby przygotować roztwór 1 (0,1 M bufor boranowy), odważyć 3,92 g kwasu borowego i rozcieńczyć w 400 ml wody o wysokiej czystości. Dostosuj pH do 8,2 i uzupełnij do 500 ml wodą o wysokiej czystości.
  2. Aby przygotować roztwór 2 (0,167 M bufor boranowy), odważyć 10,3 g kwasu borowego i rozcieńczyć w 900 ml wody o wysokiej czystości. Dostosuj pH do 8,2 i uzupełnij do 1,000 ml wodą o wysokiej czystości.
  3. W celu rozpuszczenia poli-D-lizyny (PDL) (1 mg/ml w 0,1 M buforze boranowym) należy rozcieńczyć 100 mg PDL w 100 ml roztworu 1.
  4. Przygotować porcje 10 ml do natychmiastowego użycia lub zamrozić i przechowywać w temperaturze -20 °C.
  5. Pod przepływem laminarnym dodaj 1 szkiełko nakrywkowe na dołek i sterylizuj w świetle UV przez 15 minut.
  6. Użyć zrekonstytuowanego PDL lub rozmrozić zamrożony, odtworzony PDL.
  7. Przygotować końcowy roztwór 100 μg/ml PDL w 0,167 M buforze boranowym, dodając 10 ml odtworzonego PDL do 90 ml roztworu 2.
  8. Dodać końcowy roztwór do studzienek na co najmniej 2 godziny do nocy w temperaturze 37 °C.
    UWAGA: W przypadku płytek 24-dołkowych dodać objętość 500 μl do każdego dołka.
  9. Usuń roztwór i przemyj 3x wodą o wysokiej czystości.
  10. Pozostaw szkiełka nakrywkowe do wyschnięcia w okapie z przepływem laminarnym.
  11. Pozostawić wielodołkowe płytki do hodowli w temperaturze 4 °C.

9. Procedura powlekania płytek PDL/Laminin

  1. W dniu 1 pokryć płytki PDL zgodnie z opisem w punkcie 8.
  2. W dniu 2 usuń roztwór PDL i przemyj 3x wodą o wysokiej czystości. Pozostaw do wyschnięcia.
  3. Przygotuj 5 μg/ml lamininy w zimnym SFM pozbawionym czynników wzrostu.
  4. Dodać rozpuszczoną lamininę do szkiełek nakrywkowych i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc.
    UWAGA: W przypadku płytek 24-dołkowych dodać objętość 500 μl do każdego dołka.
  5. Usuń lamininę za pomocą pipety.
    UWAGA: Nie myj szkiełek nakrywkowych z lamininy.
  6. Zużyć natychmiast lub przechowywać w temperaturze -20 °C.

10. Procedura powlekania poli-L-ornityną (PLO) / lamininą

  1. Pod przepływem laminarnym dodaj jedno szkiełko nakrywkowe na studzienkę i sterylizuj w świetle UV przez 15 minut.
  2. Dodaj 0,01% roztwór PLO do każdej studzienki przez 20 minut w temperaturze pokojowej (RT).
    UWAGA: W przypadku płytek 24-dołkowych dodać objętość 500 μl do każdego dołka.
  3. Usuń roztwór i przemyj 3x wysterylizowanym 1x PBS. Pozostaw do wyschnięcia.
  4. Przygotować 5 μg/ml lamininy w sterylnym 1x PBS.
  5. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze 37 °C.
  6. Usuń laminin.
    UWAGA: Nie myj szkiełek nakrywkowych z lamininy.
  7. Użyj natychmiast.
    UWAGA: Upewnij się, że szkiełko nakrywkowe jest całkowicie pokryte roztworem PLO, delikatnie stukając w szkiełko nakrywkowe końcówką pipety. Po wstrząśnięciu płytki wielodołkowe nie powinny wydawać żadnego dźwięku.

11. Ocena neurytogenezy poprzez generowanie zróżnicowanej monowarstwy komórki

  1. Zebrać pożywki zawierające neurosfery z 60 mm szalek Petriego (otrzymanych z sekcji 5) i odwirować przez 5 minut przy 300 x g w temperaturze pokojowej.
  2. Odrzucić supernatant i zdysocjować osad neurosfer w 1 ml dysocjacji PBS (tj. PBS bez Mg2 + / Ca2+ i z EDTA [2,7 mM KCl, 1,5 mM KH2PO4, 137 mM NaCl, 8,1 mM Na2HPO4 i 0,5 mM EDTA 4Na, przy pH = 7,40]) przez inkubację przez 15 minut, a następnie dysocjację mechaniczną. Alternatywnie, dysocjuj neurosfery za pomocą zestawu do dysocjacji chemicznej (mysz) (Tabela materiałów).
  3. Wirować przez 5 minut przy 300 x g w temperaturze pokojowej i odrzucić supernatant.
  4. Zawiesić osad komórkowy w 1 ml SFM pozbawionego czynników wzrostu.
  5. Określ gęstość komórek za pomocą hematocytometru.
  6. Rozcieńczyć zdysocjowaną zawiesinę komórek w zduszonej skórze pozbawionej czynników wzrostu o gęstości 3,766 komórek/cm2 i komórki płytkowe na szkiełkach nakrywkowych z powlekanego szkła na płytkach 24-dołkowych.
  7. Po 1-3 dniach zmocować komórki do immunocytochemii przeciwko białku cytoszkieletu (patrz punkt 14).

12. Zróżnicowanie kultur neurosfery

UWAGA: Neurosfery uzyskane z ekspansji komórek, zarówno z neurosfer pierwotnych, jak i pasażowych (uzyskanych w sekcjach 5 lub 6) mogą być różnicowane na komórki z różnych linii nerwowych.

  1. Gdy neurosfery mają średnicę 150−200 μm, zebrać 25 μl podłoża zawiesinowego neurosfery i płytkę na powlekanych szklanych szkiełkach nakrywkowych na płytkach 24-dołkowych.
    UWAGA: Aby zebrać więcej neurosfer, delikatnie obróć szalkę Petriego, aby skoncentrować neurosfery w środku. Następnie odpipetuj od środka.
  2. Umieścić płytki w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 15 minut, tak aby neurosfery przylegały do podłoża. Następnie dodać 500 μl SFM pozbawionego czynników wzrostu (warunki różnicujące).
  3. Po 24 godzinach należy zastąpić pożywkę świeżym zduszkiem pozbawionym czynników wzrostu.
  4. Rozróżnij dla różnych punktów czasowych (np. 2 i 7 dni in vitro, odpowiednio DIV2 i DIV7) z 5% CO2 i 95% powietrzem atmosferycznym o temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Przeżycie, proliferację i różnicowanie komórek można analizować przy użyciu różnych testów komórkowych.

13. Testy z zakresu biologii komórki

  1. Test przeżycia komórki
    1. Wystawić platerowane neurosfery na działanie 3 μg/ml jodku propidyny (PI) przez 30 minut przed utrwaleniem komórek w inkubatorze w temperaturze 37 °C.
      UWAGA: PI jest środkiem autofluorescencyjnym, który jest w stanie dostać się do komórek tylko z naruszoną integralnością błony8. Można zastosować inne metody analizy przeżycia komórek, takie jak barwienie kaspazą 3 lub test znakowania końcowych końcówek deoksynukleotydylotransferazy dUTP (TUNEL).
  2. Test proliferacji komórek
    1. Wystawić posiane neurosfery na działanie 10 μM 5-bromo-2'-deoksyurydyny (BrdU) przez 4 godziny przed utrwaleniem w inkubatorze w temperaturze 37 °C.
      UWAGA: BrdU jest syntetycznym analogiem tymidyny, który może być włączony podczas syntezy DNA w komórkach proliferujących9.
  3. Test różnicowania komórek
    1. Wystawić 7-dniowe posiane neurosfery na działanie 10 μM BrdU w ciągu pierwszych 24 godzin w inkubatorze w temperaturze 37 °C.
    2. Odnowić SFM pozbawiony czynników wzrostu (warunki różnicujące) i pozwolić komórkom rozwijać się pod nieobecność BrdU przez następne 6 dni aż do utrwalenia.
      UWAGA: Te eksperymenty z pogonią za impulsem, poprzez koznakowanie z markerami dojrzałych komórek nerwowych, pozwalają na ocenę komórek progenitorowych, które różnicują się w dojrzałe komórki podczas protokołu.

14. Barwienie immunologiczne kultur neurosfery

  1. Utrwalanie komórek
    1. Przygotować 4% paraformaldehydu (PFA) w 1x PBS i przechowywać w temperaturze 4 °C lub -20 °C.
    2. Usunąć zwęgloną skórę pozbawioną czynników wzrostu ze studzienek i dodać do każdej studzienki 500 μl 4% PFA w temperaturze 4 °C przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
    3. Umyj 3x 1x PBS, za każdym razem przez 5 minut, szkiełka nakrywkowe zawierające zróżnicowane neurosfery.
    4. Szkiełka nakrywkowe przechowywać do czasu użycia w 500 μl 1x PBS w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Jeśli eksperyment nie ma BrdU, przejdź do kroku 14.3.
  2. Metoda denaturacji (tylko dla eksperymentów BrdU)
    1. Przygotować 1 M HCl w temperaturze 37 °C.
    2. Spłucz szkiełka nakrywkowe 3x w 1x PBS.
    3. Przepuszczalność komórek przez 30 minut w PBS zawierającym 1% niejonowego środka powierzchniowo czynnego (np. Triton X-100).
    4. Denaturacja dsDNA za pomocą 1 M HCl wstępnie podgrzanego do 37 °C przez 30−40 min w temperaturze 37 °C (~300 μL/studzienkę).
    5. Umyj studzienki 4x z 1x PBS.
  3. Przepuszczalność i blokowanie
    1. Płukać szkiełka nakrywkowe w 1x PBS przez 5 min.
    2. Inkubować przez 1,5 godziny z 0,5% niejonowym środkiem powierzchniowo czynnym i 3% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) w 1x PBS (~300 μL/studzienkę).
      UWAGA: W przypadku NeuN użyj 6% BSA w 1x PBS.
  4. Inkubacja i montaż
    1. W dniu 1, bez mycia, inkubować komórki z przeciwciałami pierwszorzędowymi (tabela materiałów) w 0,1% niejonowym środku powierzchniowo czynnym i 0,3% BSA w 1x PBS w komorze inkubacyjnej (w przypadku płytek 24-dołkowych należy użyć 20 μL/dołek). Szkiełka nakrywkowe pozostawić do inkubacji przez noc w temperaturze 4 °C zabezpieczone przed światłem, jeśli przeciwciała są sprzężone z fluoroforem.
    2. W dniu 2 włóż szkiełka nakrywkowe do odpowiednich dołków i płucz 3x w 1x PBS przez 5 minut.
    3. Wybarwieć przeciw odpowiednim fluorescencyjnie sprzężonymi przeciwciałami drugorzędowymi (rozcieńczenie 1:200) i 12 μg/ml Hoechst 33342 w 1x PBS przez 2 godziny w temperaturze pokojowej i chronić światłem w komorze inkubacyjnej (20 μl/szkiełko nakrywkowe).
    4. Pierz szkiełka nakrywkowe 3x w 1x PBS przez 5 min.
    5. Zamontuj szkiełka nakrywkowe na szkiełkach mikroskopowych za pomocą 5 μl/szkiełko nakrywkowe fluorescencyjnego medium montażowego.
    6. Pozostaw szkiełka nakrywkowe do wyschnięcia na powietrzu w temperaturze pokojowej, chronione przed światłem, przez 1 dzień.
  5. mikroskopia
    1. Przeglądaj i uzyskuj obrazy za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.
    2. Dla każdego warunku należy użyć trzech powtórzeń. Wykonaj zliczanie komórek w pięciu niezależnych mikroskopijnych polach na każdym szkiełku nakrywkowym z obiektywem 40x (~100 komórek na pole).

15. Przygotowanie roztworów podstawowych EGF i bFGF

  1. Roztwór podstawowy EGF
    1. Aby rozpuścić liofilizowany EGF, należy rozcieńczyć produkt w wodzie o wysokiej czystości, aby osiągnąć końcowe stężenie 20 μg/ml.
    2. Podwielokrotność porcji i przechowywać w mikroprobówkach w temperaturze od -5 do -20 °C.
  2. bFGF roztwór podstawowy
    UWAGA: bFGF należy rozpuścić w roztworze 10 mM Tris, pH 7,6.
    1. Odwirować fiolkę na krótko przed otwarciem, aby zawartość opadła na dno.
    2. Przygotuj 50 ml 10 mM Tris, pH 7,6. W tym celu odważ 60,57 mg Tris ((HOCH2)3CNH2) i rozcieńcz go w 40 ml wody o wysokiej czystości. Dostosuj pH do 7,6 i uzupełnij do 50 ml wodą o wysokiej czystości.
    3. Przygotować 10 ml 0,1% BSA w 10 mM Tris, pH 7,6. W tym celu odważyć 10 mg BSA i rozcieńczyć je w 10 ml 10 mM Tris.
    4. Roztwory filtracyjne przygotowane w krokach 15.2.2 i 15.2.3 z filtrem 0,22 μm pod okapem z przepływem laminarnym.
    5. Rozpuść 10 μg bFGF w 1 000 μl 0,1% BSA w 10 mM Tris o pH 7,6, aby osiągnąć końcowe stężenie 10 μg/ml. Porcjować do mikroprobówek w temperaturze -20 °C przez maksymalnie 6 miesięcy.

Wyniki

Neurosfery z SVZ i DG, otrzymane przy użyciu NSA, składają się z niezróżnicowanych komórek wykazujących pozytywny wynik dla Sox2, czynnika transkrypcyjnego zaangażowanego w zdolność do samoodnawiania, oraz dla nestyny, białka filamentów pośrednich ekspresowanego w NSPCs (Rysunek 1A). Ponadto neurosfery pochodzące z SVZ mają większe rozmiary niż ich odpowiedniki z DG (Rysunek 1A). Co istotne, w warunkach różnicowania NSPCs pochodzące z SVZ i DG migrują poza neurosfery, tworząc pseudomonowarstwę komórek (Rysunek 1B).

W celu oceny zdolności do samoodnowy przeprowadzono test par komórkowych w oparciu o ekspresję Sox2 i nestyny, która wygasza się w dzielących się komórkach rozpoczynających proces różnicowania, w połączeniu z markerem linii neuronalnej, mianowicie DCX. W obu obszarach neurogennych można zaobserwować podziały symetryczne (samoodnowa) Sox2+/+/nestin+/+/DCX-/- (Rycina 2A1,B1), podziały asymetryczne Sox2-/+/nestin-/+/DCX+/- (Rycina 2A1,B2) oraz podziały symetryczne (różnicowanie) Sox2-/-/nestin-/-/DCX+/+ (Rycina 2A2,B1).

Pasażowanie neurosfer zwiększa wydajność NSPC; jednakże śmierć komórek w DIV2 zmienia się wraz z pasażowaniem. W rzeczywistości procent komórek dodatnich dla PI wzrasta wraz z pasażowaniem komórek w SVZ (P0: 15,6% ± 1,2% vs P1: 19,2% ± 2,7% vs P2: 32,35% ± 0,14% vs P3: 39,6% ± 4,0%) oraz w DG (P0: 16,31% ± 0,95% vs P1: 32,1% ± 1,7% vs P2: 27,42% vs P3: 32,2% ± 3,1%) (Rysunek 3).

Neurytogenezę można ocenić w neuronach uzyskanych z różnicowania NSPC z obszarów SVZ i DG na początku różnicowania: DIV1 (Rycina 4A,D), DIV2 (Rycina 4B,E) oraz DIV3 (Rycina 4C,F). W rzeczywistości, jak zaobserwowano na Rycynie 4, długość i stopień rozgałęzienia neurytów zwiększają się wraz z postępem różnicowania.

Proliferację komórek można ocenić w neurosferach pochodzących z SVZ i DG. Porównując pierwotne zróżnicowane neurosfery w DIV1 z SVZ (Rysunek 5A1) i DG (Rysunek 5A2), odsetek komórek BrdU-dodatnich jest wyższy w SVZ niż w DG (SVZ: 6,15% ± 0,64% vs DG: 3,27% ± 0,13%; p < 0,05; n = 4; Rysunek 5A3). Ponadto zróżnicowanie komórek można ocenić, łącząc barwienie BrdU z markerem dojrzałości, takim jak jądra neuronalne (NeuN), który identyfikuje dojrzałe neurony (Rysunek 5B1,B2). Rysunek 5B3 pokazuje, że odsetek proliferujących progenitorów, które różnicują się w dojrzałe neurony, jest podobny w SVZ i DG (SVZ: 12,04% ± 1,58% vs DG: 13,56% ± 0,48%; p > 0,05; n = 4).

Właściwości macierzystości i wielopotencjalności NSPC pochodzących z SVZ i DG można ocenić za pomocą NSA, analizując ekspresję różnych markerów w różnych dniach różnicowania (DIV2 i DIV7). Rzeczywiście, NSCs (komórki podwójnie dodatnie dla nestyny oraz gliałego białka włóknistego kwaśnego [GFAP]) występują w obu regionach neurogennych (Rysunek 6A,G). Komórki te są zdolne do różnicowania się w niedojrzałe neurony (komórki DCX-dodatnie) (Rysunek 6B,H), dojrzałe neurony (komórki NeuN-dodatnie) (Rysunek 6F,L), komórki prekursorowe oligodendrocytów (komórki dodatnie dla antygenu neuronowo-gialnego 2 [NG2] i receptora czynnika wzrostu pochodzenia płytkowego α [PDGFRα]) (Rysunek 6C,I), dojrzałe oligodendrocyty (komórki MBP-dodatnie, gdzie MBP to podstawowe białko mieliny) (Rysunek 6E,K) oraz astrocyty (komórki GFAP-dodatnie) (Rysunek 6D,J).

Do pokrywania szkiełek podstawowych w celu utworzenia pseudomonowarstwy komórek w warunkach różnicowania można zastosować różne podłoża. Jak pokazano na Rycynie uzupełniającej 1, komórki DG wykazują większą migrację, gdy szkiełka podstawowe są dodatkowo pokryte lamininą w połączeniu z PLO lub PDL niż w przypadku zastosowania samego PDL (Rycina uzupełniająca 1B−H). W rzeczywistości, gdy jako podłoża stosuje się wspólnie PDL i lamininę (Rycina uzupełniająca 1C,G), komórki DG tworzą bardziej zbitą pseudomonowarstwę niż komórki SVZ, dla których zastosowano wyłącznie PDL (Rycina uzupełniająca 1A,E).

Co istotne, wyniki te wykazują potencjał NSA w ocenie właściwości pluripotencji i wielopotencjalności NSCs pochodzących z dwóch głównych nisz neurogennych.

Kultury komórek SVZ i DG z barwieniem Hoechst/SOX2/Nestin; mikroskopia, badanie neurogenezy.
Rycina 1: NSPC pochodzące z strefy podkomorowej i zakrętu zębatego hodowane jako neurosfery lub pseudomonowarstwy. (A) Reprezentatywne obrazy w świetle przechodzącym (A1,A3) i fluorescencyjne (A2,A4) neurosfer pochodzących z SVZ i DG, gdzie jądra barwiono Hoechst 33342 (niebieski), a NSC pod kątem Sox2 (zielony) i nestyny (czerwony). (B) Reprezentatywne obrazy w świetle przechodzącym pseudomonowarstw wytworzonych z neurosfer pochodzących z SVZ i DG w warunkach różnicowania. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Mikroskopia fluorescencyjna, różnicowanie neuronalne, Sox2 DCX, analiza immunofluorescencyjna, komórki SVZ i DG.
Rysunek 2: Test par komórek. Reprezentatywne obrazy fluorescencyjne par komórek pochodzących z podziału komórki progenitorowej. Jądra komórek SVZ i DG zostały zabarwione Hoechst 33342 (niebieski), komórki macierzystopodobne na Sox2 (czerwony) i nestynę (biały), a niedojrzałe neurony na DCX (zielony). Groty strzałek na panelach A1 i B1 wskazują symetryczne podziały samoodnawiające Sox2+/+/nestin+/+/DCX-/-, strzałki na panelach A1 i B2 wskazują podziały asymetryczne Sox2+/-/nestin+/-/DCX-/+, a strzałki przerywane na panelach A2 i B1 pokazują symetryczne podziały różnicujące Sox2-/-/nestin-/-/DCX+/+. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wykres słupkowy przedstawiający procent komórek wykazujących pozytywność na PI w strefie podkomorowej (SVZ) i zakręcie zębatym (DG) w stadiach P0-P3, wskazujący na żywotność komórek.
Rysunek 3: Analiza przeżywalności komórek wraz z pasażowaniem komórek. Analiza ilościowa komórek PI-dodatnich w 2. dniu in vitro (DIV2) w kulturach zróżnicowanych neurosfer pochodzących z strefy podkomorowej (SVZ) i zakrętu zębatego (DG), po 0, 1, 2 i 3 pasażach (P0–P3). Dane przedstawiono jako średnia ± SEM, n = 1–8. PI = jodek propidyny. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Mikroskopia rozwoju neuronalnego, barwienie Hoechst Tuj1, DIV1-3, regiony SVZ DG, fluorescencja komórek.
Rycina 4: Analiza neuritogenezy w dniach DIV 1, 2 i 3. Reprezentatywne obrazy fluorescencji konfokalnej neurytów, zidentyfikowanych za pomocą sygnału βIII-tubuliny, w neuronach SVZ i DG w dniach (A,D) DIV1, (B,E) DIV2 oraz (C,F) DIV3. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Mikroskopia immunofluorescencyjna komórek; marker BrdU; SVZ vs DG; analiza komórek neuronalnych; wyniki na wykresie słupkowym.
Rycina 5: Analiza proliferacji komórek. Reprezentatywne obrazy konfokalne komórek BrdU-dodatnich w DIV1 w (A1) SVZ i (A2) DG. (A3) Analiza ilościowa komórek BrdU-dodatnich w DIV1 w zróżnicowanych kulturach neurosfer pochodzących z DG i SVZ. Dane przedstawiono jako średnia ± SEM, n = 4. *p < 0,05 w teście t. Reprezentatywne obrazy fluorescencyjne komórek BrdU- i NeuN-dodatnich w DIV7 w (B1) SVZ i (B2) DG. Grotowid szykują komórki BrdU-/NeuN-dodatnie. (B3) Analiza ilościowa komórek BrdU-/NeuN-dodatnich w DIV7 w obu niszach. Dane przedstawiono jako średnia ± SEM, n = 4. BrdU: 5-bromo-2'-deoksyurydyna, syntetyczny analog tymidyny. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Immunofluorescencja komórek neuronalnych, DIV2 vs DIV7, barwienie Hoechst, markery GFAP, Nestin, DCX, mikroskopia konfokalna.
Rycina 6: Typy komórek neuronalnych obecne w hodowli zróżnicowanych neurosfer pochodzących z SVZ i DG. Reprezentatywne obrazy fluorescencyjne typów komórek pochodzących z SVZ i DG po 2 i 7 dniach różnicowania neurosfer (DIV2 i DIV7), gdzie jądra komórkowe zabarwiono Hoechst 33342 (niebieski) oraz: (A,G) NSCs na GFAP (zielony) i nestin (czerwony), (B,H) niedojrzałe neurony na DCX (zielony), (C,I) komórki prekursorowe oligodendrocytów na PDGFRα (zielony) i NG2 (czerwony), (D,J) astrocyty na GFAP (zielony), (E,K) dojrzałe oligodendrocyty na MBP (zielony) oraz (F,L) dojrzałe neurony na NeuN (czerwony). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza mikroskopowa wykazująca komórki barwione Hoechst; powiększenie 10x/40x; efekt podłoży.
Rycina uzupełniająca 1: Testowanie różnych podłoży pod kątem adhezji i migracji neurosfer w celu utworzenia pseudomonowarstwy. Reprezentatywne obrazy fluorescencyjne dla (A,E) pseudomonowarstwy pochodzącej z SVZ z zastosowaniem poli-D-lizyny jako podłoża, (B,F) pseudomonowarstwy pochodzącej z DG z zastosowaniem poli-D-lizyny jako podłoża, (C,G) pseudomonowarstwy pochodzącej z DG z zastosowaniem poli-D-lizyny z lamininą jako podłoża oraz (D,H) pseudomonowarstwy pochodzącej z DG z zastosowaniem poli-D-lizyny z poli-L-ornityną jako podłoża. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Systemy NSPC in vitro pozwalają na lepsze zrozumienie mechanizmów komórkowych i molekularnych, które można dalej walidować in vivo. NSA jest bardzo potężną metodą naśladowania warunków fizjologicznych ze względu na ich trójwymiarową strukturę. Co więcej, ten system hodowli jest również technicznie łatwiejszy do hodowli10 w porównaniu z innymi systemami in vitro, takimi jak system hodowli jednowarstwowej. Rzeczywiście, dzięki NSA łatwo jest kontrolować eksponowane sygnały zewnętrzne podczas rozwoju komórki, zarówno w fazie ekspansji, jak i różnicowania, poprzez dodawanie precyzyjnych i zmiennych ilości czynników będących przedmiotem zainteresowania pożywki, a także poprzez hodowlę neurosfer z innymi typamikomórek6. Ponadto, w porównaniu z hodowlami jednowarstwowymi, w NSA możliwe jest uzyskanie większej gęstości komórek z niewielkiej ilości tkanki lub z niewielką liczbą komórek, co pozwala na prowadzenie równoległych badań, zmniejszając w ten sposób liczbę zwierząt1.

NSA jest najpowszechniejszą metodą izolacji i namnażania NSC 11,12,13, może być stosowana do szacowania liczby komórek prekursorowych obecnych w danej próbce tkanki 5 oraz częstości występowania komórek prekursorowych w różnych warunkach. Jednak zarówno neurosfery, jak i kultury jednowarstwowe nie odpowiadają za NSC w stanie spoczynku14. Co więcej, NSA ma pewne ograniczenia 11,12,13, a wynikająca z tego częstotliwość neurosfery zależy od wielu czynników, w tym składników pożywki, procedury rozbioru 11,12,13 i agregacji neurosfery 5 . Rzeczywiście, w kulturze o dużej gęstości neurosfery mają tendencję do agregacji. W związku z tym należy zachować ostrożność przy szacowaniu liczby komórek prekursorowych w próbce. Aby przezwyciężyć powyższe ograniczenia, izolowane NSPC mogą być również rozszerzane i pasażowane w monowarstwie 5,15. Co ważne, wykorzystanie NSA do porównania częstości występowania komórek prekursorowych w różnych warunkach jest bardzo przydatne i dokładne, ponieważ wszystkie te ograniczenia są ukryte i podobne we wszystkich warunkach przeprowadzonych w tym samym eksperymencie.

W kulturze neurosfery istnieją krytyczne etapy, które wymagają uwagi. Na etapie pobierania mózgu, całkowite usunięcie opon mózgowych i dobra izolacja nisz neurogennych są niezbędne, aby zmaksymalizować czystość i wydajność NSPC. Podczas dysocjacji tkanek, ze względu na proteolityczną aktywność trypsyny, nadmierne stosowanie trypsyny lub dłuższy czas inkubacji może prowadzić do lizy komórek. Co więcej, dzień przejścia ma kluczowe znaczenie dla uzyskania zdrowej populacji neurosfer. Pasażujące neurosfery o średnicy większej niż 200 μm mają ogromny wpływ na żywotność, zdolność proliferacyjną i różnicującą NSPC. Co ważne, dłuższe cykle pasaży, więcej niż 10, mogą zwiększać niestabilność genetyczną6. Co więcej, powlekanie PDL i PLD/lamininą odpowiednio dla komórek SVZ i DG jest niezbędne do zapewnienia dobrej migracji komórek z neurosfer bez uszczerbku dla procesu różnicowania. Jeśli chodzi o analizę immunocytochemiczną, dłuższe czasy inkubacji z PFA mogą zagrozić barwieniu poprzez maskowanie antygenów i zwiększanie tła.

NSA jest potężnym narzędziem zapewniającym spójne i nieograniczone źródło NSPC do badań in vitro nad rozwojem i różnicowaniem neuronalnym, a także do celów terapeutycznych16,17. Rzeczywiście, test ten można zastosować do modeli genetycznych i behawioralnych w celu lepszego zrozumienia mechanizmów molekularnych i komórkowych zaangażowanych w proliferację i różnicowanie NSPC18,19. Test ten jest również przydatny do testowania różnych leków i związków 20,21,22, a także do wykonywania manipulacji genetycznych19,23 w celu modulowania właściwości NSC. Oprócz immunocytochemii można przeprowadzić reakcję łańcuchową polimerazy z odwrotną transkrypcją i analizę Western blot w celu uzyskania dostępu do ekspresji RNA i białka, podczas gdy badania elektrofizjologiczne i obrazowanie wapnia można wykorzystać do oceny funkcji nowo narodzonych neuronów21.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez IF/01227/2015 i UID/BIM/50005/2019, projeto financiado pela Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT)/ Ministério da Ciência, Tecnologia e Ensino Superior (MCTES) através de Fundos do Orçamento de Estado. R.S. (SFRH/BD/128280/2017, F.F.R. (IMM/CT/35-2018), D.M.L. (PD/BD/141784/2018) i R.S.R. (SFRH/BD/129710/2017) otrzymali stypendium FCT. Autorzy pragną podziękować członkom ośrodka bioobrazowania w Instituto de Medicina Molecular João Lobo Antunes za pomoc w mikroskopii.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,05% Trypsyna-EDTA (1X)Gibco25300-054
0,4% roztwór błękitu trypanowegoSigma-AldrichT8154-20ML
12mm Szkiełka nakrywkowe szklaneVWR631-1577
15mL Probówka wirówkowaCorning430791
5-bromo-2'-deoksyurydynaSigma-AldrichB9285-1G
50 ml Rurka wirówkowaCorning430829
70% etanoluManuel Vieira & Cª (Irmã o) Sucrs, LdaUN1170
Szkiełka adhezyjne, Menzel Glä ser, SuperFrost PlusVWR631-9483
Alexa Fluor 488 osioł anty-kurczak IgG (H+L)Life TechnologiesA11039
Alexa Fluor 488 osioł anty-królik IgG (H+L)Life TechnologiesA21206
Alexa Fluor 488 osioł anty-szczurzy IgG (H+L)Life TechnologiesA21208
Alexa Fluor 568 osioł anty-mysz IgG (H+L)Life TechnologiesA10037
Alexa Fluor 568 osioł anty-królik IgG (H+L)Life TechnologiesA10042
Alexa Fluor 647 kozia anty-mysia IgG (H+L)Life TechnologiesA21235
Anty-5-bromo-2-deoksyurydynaDakoM0744
Anty-CD140a (PDGFR&alfa;) (szczur)BD Biosciences558774Rozcieńczyć w stosunku 1:500.
Siarczan anty-chondroityny Proteoglikan NG2 (królik)Merck MiliporeAB5320Rozcieńczony w stosunku 1:200.
Anty-Doublecortin (królik)Abcamab18723Rozcieńczyć w stosunku 1:200.
Systemy synaptyczneanty-Doublecortin (kurczak)326006Rozcieńczyć w stosunku 1:500.
Kwaśne białko fibrylarne przeciwglejowe (królik)Sigma-AldrichG9269-.2MLRozcieńczony w stosunku 1:1000.
Antymielinowe białko podstawowe (królik)Technologia sygnalizacji komórkowej78896SRozcieńczony w stosunku 1:200.
Anti-Nestin (mysz)Merck MiliporeMAB353Rozcieńczony w stosunku 1:200.
Jądra antyneuronalne (myszy)Merck MiliporeMAB377Użyj 6% BSA w PBS 1X. Rozcieńczyć w stosunku 1:400.
Anti-SOX2 (królik)Abcamab97959Rozcieńczyć w stosunku 1:500.
Anty-tubulina β 3 (królik)BioLegend802001Rozcieńczyć w stosunku 1:200.
Mikroskop szerokokątny Axiovert 200Suplement ZEISS
B-27 (50X), bez surowicyThermoFisher17504044
Kwas borowySigma-AldrichB6768-500g
Albumina surowicy bydlęcejNZYTechMB04602
Komora zliczania komórek, NeubauerHirschmann8100104
Hodowla komórkowa CO Inkubator 2ESCOCCL-170B-8
Corning Costar TC-Treated 24 Płytka wielodołkowaCorningCLS3524-100EA
Di-sodowy wodorofosforan dwuwodnyMerck Milipore1.06580.1000
DMEM/F-12, Suplement GlutaMAXThermoFisher31331028
Dumont #5 - Kleszcze drobnoziarnisteFST11254-20
Kleszcze do #5S DumontFST11252-00
Dumont #7 KleszczeFST11272-30
Naskórkowy czynnik wzrostuThermoFisher53003018
Czynnik wzrostu fibroblastówThermoFisher13256029
Bibuły filtracyjneWhatman1001-055
SharpFST14060-09
Gillete Platinum 5 ostrzyGillette
HBSS, bez wapnia, bez magnezuThermoFisher14175053
Hoechst 33342Invitrogen1399
Kwas solnyMerck Milipore1.09057.1000 (1L)
Szafa bezpieczeństwa biologicznego Labculture klasy IIESCO2012-65727
LamininSigma-AldrichL2020
Rozdrabniacz do tkanek McILWAINMickle Laboratory Engineering CO. LTD.MTC/2Ustaw na 450 μ
m Mikro szpatułka - 12 cmFST10091-12
Mikroprobówka 0,5 mlSARSTEDT72.699
Mikroprobówka 1,5 mlSARSTEDT72.690.001
Mikroprobówka 2,0 mlSARSTEDT72.691
Zestaw do dysocjacji chemicznej NeuroCult (mysz)Komórka macierzysta5707
Mikroskop Olympus SZ51OlympusSZ51
Paraformaldehyd, proszekVWR28794.295
Penicylina-StreptomycynaThermoFisher15140122
szalki Petriego 60 mmCorning430166
Roztwory wzorcowe fosforanów, PO43 - w wodzieBDH ARISTAR452232C
Poli-D-Lizyna 100mgSigma-AldrichP7886
Roztwór poli-L-ornitynySigma-AldrichP4957
Chlorek potasuSigma-AldrichP5405-250g
Jodek propidynySigma-AldrichP4170-25MG
Chlorek soduVWR27800.360.5K
Wodorotlenek soduMerck Milipore535C549998
Triton X-100BDH14630
VWR INCU-Line IL10VWR390-0384
-

Bibliografia

  1. Reynolds, B., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).
  2. Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay. Journal of Visualized Experiments. (45), e2393(2010).
  3. Vescovi, A. L., Reynolds, B. A., Fraser, D. D., Weiss, S. bFGF regulates the proliferative fate of unipotent (neuronal) and bipotent (neuronal/astroglial) EGF-generated CNS progenitor cells. Neuron. 11 (5), 951-966 (1993).
  4. Rietze, R. L., Reynolds, B. A. Neural Stem Cell Isolation and Characterization. Methods in Enzymology. 419, 3-23 (2006).
  5. Walker, T. L., Kempermann, G. One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice. Journal of Visualized Experiments. (84), e51225(2014).
  6. Jensen, J. B., Parmar, M. Strengths and Limitations of the Neurosphere Culture System. Molecular Neurobiology. 34 (3), 153-162 (2006).
  7. Xapelli, S., et al. Activation of Type 1 Cannabinoid Receptor (CB1R) Promotes Neurogenesis in Murine Subventricular Zone Cell Cultures. PLoS ONE. 8 (5), e63529(2013).
  8. Riccardi, C., Nicoletti, I. Analysis of apoptosis by propidium iodide staining and flow cytometry. Nature Protocols. 1 (3), 1458-1461 (2006).
  9. Nowakowski, R. S., Lewin, S. B., Miller, M. W. Bromodeoxyuridine immunohistochemical determination of the lengths of the cell cycle and the DNA-synthetic phase for an anatomically defined population. Journal of Neurocytology. 18 (3), 311-318 (1989).
  10. Weinberg, D., Adams, C. F., Chari, D. M. Deploying clinical grade magnetic nanoparticles with magnetic fields to magnetolabel neural stem cells in adherent versus suspension cultures. RSC Advances. 5 (54), 43353-43360 (2015).
  11. Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M., Ansari, S., Reynolds, B. A. Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay. Journal of Visualized Experiments. (47), e2457(2011).
  12. Azari, H., Louis, S. A., Sharififar, S., Vedam-Mai, V., Reynolds, B. A. Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells. Journal of Visualized Experiments. (49), e2639(2011).
  13. Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres-re-evaluating the relationship. Nature Methods. 2 (5), 333-336 (2005).
  14. Pastrana, E., Cheng, L. C., Doetsch, F. Simultaneous prospective purification of adult subventricular zone neural stem cells and their progeny. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (15), 6387-6392 (2009).
  15. Conti, L., Cattaneo, E. Neural stem cell systems: physiological players or in vitro entities? Nature Reviews Neuroscience. 11 (3), 176-187 (2010).
  16. Ghate, P. S., Sidhar, H., Carlson, G. A., Giri, R. K. Development of a novel cellular model of Alzheimer's disease utilizing neurosphere cultures derived from B6C3-Tg(APPswe,PSEN1dE9)85Dbo/J embryonic mouse brain. SpringerPlus. 3 (1), 161(2014).
  17. Pluchino, S., et al. Injection of adult neurospheres induces recovery in a chronic model of multiple sclerosis. Nature. 422 (6933), 688-694 (2003).
  18. Ogawa, Y., Kaizu, K., Yanagi, Y., Takada, S., Sakuraba, H., Oishi, K. Abnormal differentiation of Sandhoff disease model mouse-derived multipotent stem cells toward a neural lineage. PLoS ONE. 12 (6), e0178978(2017).
  19. Khacho, M., et al. Mitochondrial Dynamics Impacts Stem Cell Identity and Fate Decisions by Regulating a Nuclear Transcriptional Program. Cell Stem Cell. 19 (2), 232-247 (2016).
  20. Soares, R., et al. Tauroursodeoxycholic Acid Enhances Mitochondrial Biogenesis, Neural Stem Cell Pool, and Early Neurogenesis in Adult Rats. Molecular Neurobiology. 55 (5), 3725-3738 (2017).
  21. Rodrigues, R. S., Ribeiro, F. F., Ferreira, F., Vaz, S. H., Sebastião, A. M., Xapelli, S. Interaction between Cannabinoid Type 1 and Type 2 Receptors in the Modulation of Subventricular Zone and Dentate Gyrus Neurogenesis. Frontiers in Pharmacology. 8, 516(2017).
  22. Xapelli, S., et al. Modulation of subventricular zone oligodendrogenesis: a role for hemopressin? Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 59(2014).
  23. Kim, H. J., et al. Dynamin-related protein 1 controls the migration and neuronal differentiation of subventricular zone-derived neural progenitor cells. Scientific Reports. 5 (1), 15962(2015).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Test neurosferkom rki macierzyste tkanki nerwowejstrefa podkomorowastrefa podziarnistasekcja m zgu myszytrawienie trypsyn z EDTAepidermalny czynnik wzrostupodstawowy czynnik wzrostu fibroblast wpasa owanie kom rekimmunocytochemia
Izolacja i ekspansja neurosfer z postnatalnych (P1−3) mysich nisz neurogennych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.