Artykuł metodologiczny

Równoległe przesłuchanie rekrutacji β-Arrestin2 do badań przesiewowych ligandów w skali GPCR przy użyciu testu PRESTO-Tango

DOI:

10.3791/60823

⸱

10 marca 2020

 ,  , 
1Department of Biochemistry, Microbiology and Immunology, University of Ottawa, 2Brain and Mind Research Institute, University of Ottawa

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biorąc pod uwagę, że GPCR są atrakcyjnymi celami dla leków, badania przesiewowe ligandów GPCR są niezbędne do identyfikacji związków ołowiowych i badań nad desierotyzacją. W ramach tych wysiłków opisujemy PRESTO-Tango, platformę zasobów typu open source wykorzystywaną do jednoczesnego profilowania przejściowej rekrutacji β-arrestin2 przy około 300 GPCR przy użyciu testu reporterowego opartego na TEV.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jako największa i najbardziej wszechstronna nadrodzina genów i mediatory całej gamy komórkowych szlaków sygnałowych, receptory sprzężone z białkiem G (GPCR) stanowią jeden z najbardziej obiecujących celów dla przemysłu farmaceutycznego. Ergo, projektowanie, wdrażanie i optymalizacja testów przesiewowych ligandów GPCR ma kluczowe znaczenie, ponieważ stanowią one narzędzia zdalnego sterowania do odkrywania leków oraz manipulowania farmakologią i wynikami GPCR. W przeszłości testy zależne od białka G stanowiły typowy obszar badań, wykrywając zdarzenia wywołane ligandem i określając ilościowo generowanie wtórnych przekaźników. Jednak od czasu pojawienia się selektywności funkcjonalnej, a także zwiększonej świadomości na temat kilku innych szlaków niezależnych od białka G i ograniczeń związanych z testami zależnymi od białka G, istnieje większy nacisk na tworzenie alternatywnych testów przesiewowych ligandów GPCR. W tym celu opisujemy zastosowanie jednego z takich zasobów, platformy PRESTO-Tango, systemu opartego na reporterze lucyferazy, który umożliwia równoległe i jednoczesne badanie ludzkiego GPCR-omu, wyczyn, który wcześniej uważano za technicznie i ekonomicznie niewykonalny. Opierając się na niezależnym od białka G teście rekrutacji β-arrestin2, uniwersalność transportu i sygnalizacji za pośrednictwem β-arrestin2 w GPCR sprawia, że PRESTO-TANGO jest odpowiednim narzędziem do badania około 300 niewęchowych ludzkich GPCR, w tym około 100 receptorów sierocych. Czułość i wytrzymałość PRESTO-Tango sprawiają, że nadaje się on do pierwotnych badań przesiewowych o wysokiej przepustowości z wykorzystaniem bibliotek złożonych, wykorzystywanych do odkrywania nowych celów GPCR dla znanych leków lub do odkrywania nowych ligandów dla receptorów sierocych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Receptory sprzężone z białkiem G (GPCRs) stanowią największą i najbardziej zróżnicowaną rodzinę białek transbłonowych, działających jako interfejsy komunikacyjne między komórką a jej środowiskiem1. Wszechstronność GPCR podkreśla ich zdolność do wykrywania różnorodnych ligandów - od neuroprzekaźników po nukleotydy, peptydy po fotony i wiele innych - a także ich zdolność do regulowania licznych kaskad sygnałowych związanych ze wzrostem komórek, migracją, różnicowaniem, apoptozą, wypalaniem komórek itp.2,3. Biorąc pod uwagę ich wszechobecność i udział w wielu procesach fizjologicznych, ta rodzina receptorów ma ogromne znaczenie terapeutyczne, o czym świadczy fakt, że ponad jedna trzecia obecnie dostępnych leków na receptę celuje w GPCRs4. Jednak te istniejące terapie są ukierunkowane tylko na niewielką podgrupę nadrodziny (około 10%), a farmakologia wielu GPCR pozostaje niewyjaśniona. Co więcej, ponad 100 GPCR istnieje jako receptory sieroce, ponieważ nie zostały one dopasowane do endogennego ligandu5. W związku z tym badania przesiewowe ligandów GPCR mają kluczowe znaczenie w desierotyzacji i opracowywaniu leków, ponieważ torują drogę do odkrycia i optymalizacji wiodących, a być może do fazy badań klinicznych.

Metody badań przesiewowych ligandów GPCR tradycyjnie zaliczane są do jednej z dwóch kategorii, testów funkcjonalnych zależnych od białka G lub niezależnych od białka G6. Sygnalizacja GPCR jest regulowana przez heterotrimeryczne białka G (Gαβγ), które są aktywowane przez wymianę GTP na GDP związane z podjednostką Gα7. Sygnały z aktywowanego receptora są transdukowane przez białka G za pośrednictwem wtórnych przekaźników, takich jak cAMP, Wapń, DAG i IP3, aby pośredniczyć w dalszej sygnalizacji w dalszych efektorach8. Charakter funkcjonalnych konsekwencji sygnalizacji białka G został wykorzystany do stworzenia testów komórkowych, które odzwierciedlają aktywację receptora. Metody te, które mierzą zdarzenia proksymalne (bezpośrednie) lub dystalne (pośrednie) w sygnalizacji białka G, są najczęściej stosowane do badań przesiewowych ligandów GPCR i są głównie stosowane w badaniach nad desierotyzacją6. Przykłady testów, które bezpośrednio mierzą aktywację białka G za pośrednictwem GPCR, obejmują test wiązania [35S]GTPγS, który mierzy wiązanie znakowanego radioaktywnie i niehydrolizowalnego analogu GTP z podjednostką Gα, oraz sondy Förster/bioluminescencji rezonansu rezonansowego (odpowiednio FRET/BRET) do monitorowania interakcji GPCR-Gα i Gα/Gγ, które z biegiem lat zyskują coraz większą popularność9, 10. Testy monitorujące zdarzenia dystalne są najczęściej stosowanymi narzędziami do profilowania GPCR; na przykład testy cAMP i IP1/3 mierzą wewnątrzkomórkową akumulację wtórnych przekaźników zależnych od białka G, podczas gdy testy strumienia [Ca2 +] i reportera obejmujące specyficzne elementy odpowiedzi zaangażowane w aktywację białka G (CRE, NFAT-RE, SRE, SRF-RE) badają zdarzenia dalej po kaskadzie sygnalizacyjnej11. Podczas gdy większość z wyżej wymienionych testów można przeprowadzić na poziomie wysokiej przepustowości, są one dość czułe i mają pewne zalety specyficzne dla testu (np. rozróżnienie między pełnymi/częściowymi agonistami, neutralnymi antagonistami i odwrotnymi agonistami w przypadku wiązania GTPγS lub funkcjonalność testu na żywych komórkach, takich jak [Ca2+] i IP1/3)6, niestety nie istnieją żadne metody zależne od białka G, które pasowałyby do badania całego GPCR-omu leku. Wynika to w dużej mierze z natywnego sprzężenia wielu podrodzin białka G z GPCR, co skutkuje sygnalizacją w kilku kaskadach i nieznanym sprzężeniem białka G w sierocych GPCR. Aby złagodzić ten problem, opracowano testy, aby wymusić rozwiązłe sprzężenie białka G za pomocą jednego wspólnego odczytu sygnalizacji, takiego jak cAMP i Ca2+, chociaż większość z nich ma niską przepustowość12.

Ważnym aspektem cyklu życia GPCR jest zakończenie sygnalizacji zależnej od białka G, co następuje w dużej mierze poprzez rekrutację β-aresztin, co indukuje dysocjację białka G, a ostatecznie odczulanie receptora, który jest celem internalizacji pokrytej klatryną13. Najbardziej rozpowszechnionymi izoformami β-arrestin są niewizualne β-arrestin1 i β-arrestin2, oznaczane również odpowiednio jako arrestin-2 i arrestin-314. Wprowadź testy komórkowe niezależne od białka G, które nadają nowy wymiar badaniom przesiewowym ligandów GPCR; Transportem receptorów, testami rekrutacji całych komórek bez znaczników i β-aresztiną są godnymi uwagi przykładami. Testy transportu GPCR wykorzystują ligandy znakowane fluoroforem lub współinternalizowane przeciwciała skierowane do receptora15, podczas gdy testy całych komórek bez znaczników wykorzystują bioczujniki, które tłumaczą zmiany komórkowe wywołane wiązaniem liganda na wymierne wyniki, takie jak sygnały elektryczne lub optyczne16. Warto zauważyć, że kwintesencją interakcji GPCR-β-arrestin jest to, że test rekrutacyjny β-arrestin jest atrakcyjnym narzędziem w repertuarze testów funkcjonalnych17. System tango, po raz pierwszy opracowany przez Barnea i wsp. zaledwie dziesięć lat temu, obejmuje wprowadzenie trzech egzogennych elementów genetycznych: fuzji białek składającej się z β-aresztyny2 z proteazą wirusa wytrawiania tytoniu (TEVp), transaktywatora tetracykliny (tTA), który jest przywiązany do GPCR za pośrednictwem miejsca cięcia proteazy wirusa wytrawiania tytoniu (TEVcs) i jest poprzedzony sekwencją z C-końca receptora wazopresyny V2 (ogon V2) w celu promowania rekrutacji aresztyny, oraz gen lucyferazy reporterowej, którego transkrypcja jest wyzwalana przez translokację czynnika transkrypcyjnego tTA do jądra, które jest uwalniane od zakotwiczenia błony po rekrutacji β-arrestin2 (Rysunek 1) < klasa sup = "xref">18. Ilościowe odczyty aktywacji GPCR i rekrutacji β-arrestin2 można następnie określić poprzez odczyt luminescencji. Godnym uwagi rozróżnieniem jest to, że podczas gdy transport receptorów i metody bez znaczników całych komórek są stosunkowo niskoprzepustowe, Tango ma kilka zalet, w tym selektywny odczyt, który jest specyficzny dla docelowego receptora i czułość dzięki integracji sygnału, co czyni go odpowiednim kandydatem do badań przesiewowych ligandów na większą skalę18.

Mając na uwadze te strategiczne cechy, Kroeze i in. opracowali PRESTO-Tango (Parallel Receptor-ome Expression and Screening via Transcriptional Output-Tango), wysokoprzepustową platformę open-source, która wykorzystuje podejście Tango do profilowania GPCR-omu w sposób równoległy i jednoczesny19. Wykorzystując "rozwiązłą" rekrutację β-aresztyny2 do prawie wszystkich GPCR, PRESTO-Tango jest pierwszym w swoim rodzaju testem funkcjonalnym opartym na komórkach, umożliwiającym szybkie "pierwsze" badania przesiewowe związków małocząsteczkowych w prawie wszystkich niewęchowych GPCR, w tym sierocych, niezależnie od sprzężenia podrodziny białka G.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Podstawowe badanie przesiewowe: hodowla komórkowa i siew płytkowy

  1. Aby przygotować płytki pokryte poli-L-lizyną (PLL), należy dozować 20 μl/basenik roztworu podstawowego PLL o stężeniu 25 μg/ml na białych lub czarnych 384-dołkowych optycznych płytkach dolnych za pomocą elektronicznej pipety wielokanałowej lub dozownika odczynników. Inkubować płytki w temperaturze pokojowej przez 0,5–2 godz.
    UWAGA: Jeśli używasz czarnych płytek 384-dołkowych, spodziewaj się, że sygnał tła będzie niższy w porównaniu z białymi płytkami. Czarne płytki są zalecane w celu zmniejszenia przebijania luminescencji między sąsiednimi studzienkami.
  2. Aby zakonserwować powlekane talerze i zmyć nadmiar PLL, usuń PLL, przesuwając go po zlewie, osusz ręcznik papierowy i dodaj 40 μl/studzienkę rozcieńczonego 1x roztworu antybiotyku przeciwgrzybiczego za pomocą elektronicznej pipety wielokanałowej lub dozownika odczynników. Przechowuj płytki pokryte PLL w temperaturze 4 °C, aż będą gotowe do wysiewu.
  3. Utrzymuj komórki HTLA (uprzejmie dostarczone przez dr Richarda Axela) - ludzką embrionalną linię komórek nerkowych (HEK293T) stabilnie eksprymującą β-arrestin2-TEV i lucyferazy sterowane tTA - w kompletnym zmodyfikowanym pożywce Eagle's Eagle (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionej 5% płodowej surowicy bydlęcej, 5% surowicy cielęcej bydlęcej, 2,5 μg / ml puromycyny, 50 μg / ml higromycyny, 100 j./ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze zawierającym 5% CO2 .
  4. Hodować komórki HTLA na szalkach o średnicy 150 mm i przekazywać komórki dwa razy w tygodniu przy współczynniku rozcieńczenia 1:10, z optymalną liczbą pasaży komórkowych 5–25. Upewnij się, że wystarczająca liczba szalek o średnicy 150 mm zlewa się w dniu wysiewu płytek 384-dołkowych, w zależności od skali sita pierwotnego.
    UWAGA: Użycie komórek HTLA większych niż pasaż 25 może skutkować zmniejszoną żywotnością, dając nieoptymalne wyniki.
  5. Aby wysiać komórki HTLA do pierwotnego sita, delikatnie przepłukać zlewającą się 150-milimetrową naczynie (naczynia) 1x solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), pH 7,4. Odłącz komórki z około 6 ml 0,05% trypsyny/0,53 mM EDTA i przenieś do probówki wirówkowej zawierającej co najmniej równą ilość kompletnej zmodyfikowanej pożywki Eagle (DMEM) firmy Dulbecco w celu zneutralizowania trypsyny.
  6. Odwiruj komórki HTLA przy 500 x g przez 3 minuty i ponownie zawieś osad komórkowy o gęstości 0,22 x 106 komórek/ml w kompletnym DMEM, pomijając dodanie 2,5 μg/ml puromycyny i 50 μg/ml higromycyny, ponieważ mogą one zmniejszyć skuteczność transfekcji.
  7. Inkubować niezbędne 384-dołkowe płytki pokryte PLL w temperaturze 37 °C, aby je ogrzać przed wysiewem komórek. Usuń roztwór do przechowywania 1x antybiotyk-antybiotyk z płytki (płytek) pokrytej PLL w 384 dołkach, przesuwając talerz nad zlewem i przyklejając go taśmą do ręcznika papierowego do wyschnięcia.
  8. Komórki nasienne do 384-dołkowych płytek pokrytych PLL o końcowej gęstości 10 000 komórek/studzienkę, dozując 45 μl zawiesiny HTLA 0,22 x 106 komórek/ml za pomocą elektronicznej pipety wielokanałowej. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez noc. Jeśli preferowana jest transfekcja tego samego dnia, wysiewaj komórki o gęstości 16 000 komórek/dołek i wykonaj transfekcję 4 godziny później.
    UWAGA: Aby uzyskać wysoką wydajność transfekcji, optymalna jest 50–70% konfluencja komórek.

2. Podstawowe badanie przesiewowe: przygotowanie płytki DNA i transfekcja

  1. Aby przygotować 384-dołkową płytkę źródłową DNA do transfekcji, jak pokazano na Rysunek 2, rozprowadź plazmidowe cDNA kodujące interesujące nas konstrukty GPCR-Tango na 96-dołkowej płytce, z innym GPCR / dołkiem. Plazmidowe DNA powinno być zawieszone w 0,1x buforze Tris-EDTA(TE) w stężeniu 50 ng/μL.
    UWAGA: 96-dołkowe płytki DNA mogą być szczelnie zamknięte i przechowywane w temperaturze -20 °C, a następnie ponownie wykorzystane do wielu eksperymentów przesiewowych. Wszystkie konstrukty kodujące cDNA GPCR-Tango są dostępne na rynku (patrz Tabela Materiałów) i są klonowane w plazmidzie neomycyny pcDNA3.1. Zestaw PRESTO-Tango GPCR składa się z czterech 96-dołkowych płytek, z których każda zawiera 80 GPCR, kilku studzienek z pustym wektorem jako kontrolą ujemną oraz studzienek kontroli pozytywnej, które zawierają receptor dopaminy D2 (DRD2) oraz studzienek zawierających plazmid kodujący białko fluorescencyjne (YFP) w celu śledzenia wydajności transfekcji.
  2. Za pomocą pipety wielokanałowej ręcznie przenieś roztwór DNA z 96-dołkowej płytki do 384-dołkowej płytki źródłowej DNA, dodając 10 μl na 384-dołk. Aby upewnić się, że każdy warunek eksperymentu jest oceniany w kwadransie, połowa 96-dołkowej płytki DNA (rzędy A-D lub E-H) pokryje pełną płytkę 384-dołkową, rozprowadzając każdy GPCR w dwóch kwadrantach (pierwsza ćwiartka = - związek, druga ćwiartka = + związek), tak aby ten sam GPCR został transfekowany w 8 dołkach płytki 384-dołkowej (patrz Rysunek 2 jako przewodnik).
  3. Zbierz następujące odczynniki do transfekcji potrzebne do metody wytrącania fosforanu wapnia, zgodnie z opisem Jordan et al.20: 0,1x bufor TE (1 mM Tris-HCl i 0,1 mM EDTA); 2,5 M roztwór CaCl2; 2x bufor Hepes, pH 7,05 (50 mM HEPES, 280 mM NaCl, 1,5 mM Na2HPO4). Wysterylizować wszystkie roztwory przez filtrację i przechowywać w temperaturze 4 °C. W dniu transfekcji pozwól odczynnikom osiągnąć temperaturę pokojową przed użyciem.
  4. Rozcieńczyć 2,5 M roztwór podstawowy CaCl2 w 0,1x TE (rozcieńczenie 1:8) do końcowego stężenia 0,313 M CaCl2 i zawirować. Przenieść 40 μl 0,313 M CaCl2 do 384-dołkowej płytki źródłowej DNA i mieszać, pipetując w górę i w dół za pomocą ręcznej pipety wielokanałowej lub automatycznego pipetara 384-kanałowego na stole.
  5. Dodać 50 μl 2x buforu Hepes do 384-dołkowej płytki źródłowej DNA, ponownie wymieszać pipetując w górę iw dół i odstawić na 1 minutę; każda 384-dołkowa będzie miała odpowiednią ilość mieszaniny DNA/transfekcji do transfekcji dziewięciu 384-dołkowych płytek, w zależności od liczby związków, które należy przetestować. Przenieść 10 μl mieszaniny DNA/transfekcji z 384-dołkowej płytki źródłowej DNA do wysianych komórek HTLA i inkubować płytki przez noc w temperaturze 37 °C.

3. Podstawowe badanie przesiewowe: Stymulacja komórek

  1. Dwadzieścia cztery godziny później zdekantuj transfekowaną pożywkę komórkową, delikatnie przesuwając płytkę 384-dołkową nad zlewem i przyklejając ją taśmą do ręcznika papierowego lub za pomocą głowicy aspiratora. Powoli dodawaj 40 μl głodowej pożywki (DMEM uzupełniony 1% dializowaną płodową surowicą bydlęcą (dFBS) i 1x antybiotykiem/antybiotykiem), uważając, aby nie dotykać komórek bezpośrednio.
  2. Odpipetować 20 μl interesującego nas związku o stężeniu 3x (końcowe stężenie leku w płytce komórkowej wyniesie 1x) do naprzemiennych rzędów ze stymulacją (+) i 20 μl buforu nośnika dla naprzemiennych rzędów bez (-) związku. Umieścić płytkę komórkową w temperaturze 37 °C w 5% CO2 i inkubować przez co najmniej 16 godzin.

4. Badanie główne: Odczyt luminescencji

  1. Przygotuj odczynnik Glo, zmodyfikowany z Baker and Boyce21: 108 mM Tris–HCl; 42 mM Tris-Base, 75 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 5 mM Dithiothrei-tol (DTT), 0,2 mM Koenzym A, 0,14 mg/ml D-Lucyferyna, 1,1 mM ATP, 0,25% v/v Triton X-100, 2 mM Wodorosiarczyn sodu.
    UWAGA: Roztwory podstawowe odczynników można przygotować z wyprzedzeniem, z wyjątkiem D-Lucyferyny, która jest zawsze świeżo dodawana do odczynnika Glo w postaci sproszkowanej. Jeśli użyto czarnych płytek, ilość D-lucyferyny można zwiększyć do 0,25 mg / ml.
  2. Po 16–24 godzinach od stymulacji zdekantować transfekowaną pożywkę komórkową, delikatnie przesuwając 384-dołkową płytkę nad zlewem i przyklejając ją taśmą do ręcznika papierowego. Dodać 20 μl/basenik odczynnika Glo i inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 5–20 minut. Odczytaj płytki za pomocą licznika luminescencji mikropłytki, z czasem całkowania wynoszącym 1 s/studzienkę.

5. Badanie główne: Analiza danych

  1. Wyeksportuj zapisane pliki z licznika luminescencji jako arkusz kalkulacyjny; wyniki zostaną zapisane w jednostkach luminescencji względnej (RLU). Opierając się na układzie płytki 384-dołkowej, oblicz aktywację (zmianę fałdowania) każdego receptora, korzystając z następującego wzoru:
    figure-protocol-1
    UWAGA: Tutaj próbka RLU odnosi się do wartości każdej z czterech dołek replikowanych stymulowanego (+ związek) kwadrantu, średnia tła RLU jest średnią ujemnych kontroli na płytce, a średnia podstawowa RLU odnosi się do średniej nieleczonego kwadrantu tego samego receptora (-związek). Ponadto należy obliczyć odchylenie standardowe 4 punktów danych, aby zweryfikować jakość wyników. Zaleca się wykonanie transformacji log2 na średniej zmian fałdowania w celu skorygowania heteroskedastyczności; Baza Log2 to praktyczny wybór, który pomaga zidentyfikować pozytywne trafienia. Empirycznie ustalić progi dodatnich trafień; Należy zauważyć, że niektóre receptory mogą mieć zaledwie 2-krotny wzrost i do 40-krotny wzrost u innych z pełnym agonistą.
  2. Na podstawie wyników wybierz GPCR, które są potencjalnymi pozytywnymi trafieniami do wtórnego badania przesiewowego.

6. Wtórne badanie przesiewowe: Sadzenie komórek i transfekcje

  1. Subkultura komórek HTLA na szalkach o średnicy 100 mm przy całkowitej gęstości komórek 5 x 106 komórek w 11 ml kompletnej pożywki (4,55 x 105/ml) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 24 godziny. Jeśli preferowana jest transfekcja tego samego dnia, wysiewaj komórki o gęstości 7,5 x 106 komórek i wykonaj transfekcję 4 godziny później.
  2. Odczynniki potrzebne do wytrącania fosforanu wapnia należy wstępnie podgrzać w temperaturze pokojowej. Połącz 450 μl 0,1x buforu TE z 50 μl 2,5 M CaCl2 i szybko wiruj; Ilości te są specyficzne dla jednej szalki o średnicy 100 mm, w zależności od objętości pożywki, którą zawiera.
  3. W probówce dodać 500 μl roztworu TE/CaCl2 do 10 μg gDNA GPCR i zawirować. Dodać 500 μl 2x roztworu buforowego Hepes do probówki, energicznie wstrząsnąć (nie wirować) i inkubować przez 1 min.
    UWAGA: 1 μg dowolnego plazmidu kodującego białko fluorescencyjne (np. YFP, mCherry itp.) może być współtransfekowany z 9 μg cDNA GPCR, co daje łącznie 10 μg. Białko fluorescencyjne służy do śledzenia wydajności transfekcji, a ta minimalna ilość nie będzie zakłócać testu.
  4. Bezpośrednio po krótkiej inkubacji naniec kroplami 1 ml roztworu na komórki. Delikatnie kołysać płytką w przód i w tył, aby równomiernie rozprowadzić osad, uważając, aby nie zawirować płytki, i inkubować w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.
  5. Następnego dnia obserwuj skuteczność transfekcji, patrząc na ekspresję białka fluorescencyjnego pod fluorescencyjnym obrazowaniem komórek; idealne są transfekcje większe niż 50%.
  6. Inkubować niezbędną 384-dołkową płytkę (płytki) pokrytą PLL w inkubatorze w temperaturze 37 °C, aby ogrzać ją przed wysiewem komórek. Usuń roztwór do przechowywania 1x antybiotyk-antybiotyk z płytki (płytek) pokrytej PLL w 384 dołkach, przesuwając talerz nad zlewem i przyklejając go taśmą do ręcznika papierowego do wyschnięcia.
  7. Delikatnie przepłucz transfekowane komórki roztworem Versene (1X PBS, pH 7,4; 0,53 mM EDTA) i odłącz, dodając do naczynia 3 ml 0,05% trypsyny/0,53 mM EDTA. Przenieść zawartość do probówki wirówkowej zawierającej co najmniej równą ilość kompletnego DMEM w celu zneutralizowania trypsyny.
  8. Odwiruj komórki w temperaturze 500 x g przez 3 minuty i ponownie zawieś komórki o gęstości 0,4 x 106 komórek/ml w głodujących podłożach. Komórki nasienne do 384-dołkowej płytki (płytek) pokrytej PLL o końcowej gęstości 25 000 komórek/basenik, dozując 45 μl zawiesiny komórkowej za pomocą elektronicznego pipety wielokanałowej. Umieścić płytki z powrotem w temperaturze 37 °C na co najmniej 4 godziny, pozwalając komórkom prawidłowo przyłączyć się do studzienek przed przystąpieniem do stymulacji.

7. Wtórne badanie przesiewowe: Przygotowanie płytki leku dla 16-punktowej (pół logarytmu) krzywej dawkowania

  1. Do płytki 96-dołkowej dodaj 270 μl 1X buforu leku HBSS (1x Zbilansowany roztwór soli Hanka [HBSS], 20 mM HEPES pH 7,4, 1x antybiotyk-antybiotyk), z wyłączeniem ostatniego rzędu (rzędu H) płytki, jak pokazano w Rysunek 4.
    UWAGA: W przypadku peptydów, cząsteczek koloidalnych i związków słabo rozpuszczalnych w wodzie sugeruje się dodanie 0,1–1% BSA. Aby zapobiec utlenianiu leków, można również dodać do 0,01% kwasu askorbinowego.
  2. Z zapasu leku przygotuj roztwór leku (określany jako "wysokie" stężenie), obliczając końcowe stężenie 3x (końcowe stężenie leku w płytce komórkowej wyniesie 1x). Na przykład, dla krzywej dawka-odpowiedź, której najwyższym stężeniem jest 10 μM, należy przygotować "wysokie" stężenie na poziomie 30 μM. Odpipetować 300 μl "wysokiego" stężenia do studzienek w rzędzie H.
  3. W innej probówce przygotuj "niskie" stężenie, które reprezentuje "wysokie" stężenie podzielone przez 3,16 (pół logarytmu). Opierając się na poprzednim przykładzie, "niskie" stężenie wynosiłoby 9,49 μM. Pipes 300 μl "niskiego" stężenia do studzienek w rzędzie H, sąsiadujących z dołkami "wysokimi".
    UWAGA: Całkowita liczba 96 dołków potrzebnych w rzędzie H będzie zależeć od liczby komórek i warunków stymulacji. Cztery dołki (dwie "wysokie" i dwie "niskie") będą miały wystarczającą ilość roztworu leku, aby stymulować całą płytkę 384-dołkową.
  4. Przeprowadzić rozcieńczenie seryjne, pipetując 30 μl roztworu leku z dołka "Wysoki" i "Niski" w rzędzie H do poprzedniego rzędu (rząd G) i wymieszać, pipetując ręcznie w górę i w dół lub, zgodnie z zaleceniami, za pomocą elektronicznej pipety wielokanałowej z funkcją "Pipeta i mieszanie". Powtórz ten krok aż do pierwszego i najbardziej rozcieńczonego rzędu (rząd A), odrzucając końcówki między rozcieńczeniami.
    UWAGA: W razie potrzeby, seryjne rozcieńczenia można zatrzymać przed rzędem A, co stanowi kontrolę wewnętrzną bez użycia leku, innymi słowy, "prawdziwe zero".
  5. Używając Rysunek 4 jako odniesienie, stymuluj transfekowane komórki, pipetując 20 μl "niskich" rozcieńczeń kolumny z płytki 96-dołkowej do rzędów A–O poprzednio zasianej płytki 384-dołkowej, a także 20 μL rozcieńczeń kolumny "wysokiej" do dołków B–P. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez minimum 16 godzin.

8. Wtórne badanie przesiewowe: Odczyt luminescencji i analiza danych

  1. Po 16–24 godzinach od stymulacji zdekantować transfekowaną pożywkę komórkową, delikatnie przesuwając 384-dołkową płytkę nad zlewem i przyklejając ją taśmą do ręcznika papierowego. Dodać 20 μl/basenik odczynnika Glo i inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 5–20 minut. Odczytaj płytki za pomocą licznika luminescencji mikropłytki, z czasem całkowania wynoszącym 1 s/studzienkę.
  2. Wyeksportuj zapisane pliki z licznika luminescencji jako arkusz kalkulacyjny; wyniki zostaną zapisane w jednostkach luminescencji względnej (RLU). Przenieś dane z płytki 384-dołkowej do oprogramowania statystycznego, aby przeanalizować wyniki za pomocą wbudowanej analizy XY w celu dopasowania krzywej regresji nieliniowej. Wybierz wbudowaną 3-parametrową funkcję stymulacji dawka-odpowiedź "Log(agonista) vs. odpowiedź (trzy parametry),
    figure-protocol-2
    UWAGA: Tutaj góra i dół to płaskowyże w jednostkach osi Y, odpowiednio maksymalna odpowiedź i poziom podstawowy, EC50 to stężenie agonisty, które generuje 50% odpowiedzi między górą a dołem, a X odnosi się do stężenia logarytmicznego agonisty. Model ten zakłada, że krzywa dawka-odpowiedź ma standardowe nachylenie wzgórza wynoszące 1.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Korzystając z protokołu PRESTO-Tango przedstawionego tutaj, ekstrakt z granulek chromofiliny (CG) został przebadany pod kątem 168 niewęchowych celów GPCR, z których większość stanowiły receptory sieroce. Profilowanie wspomnianego ekstraktu przeprowadzono poprzez badanie mobilizacji β-arrestin2 w wybranych receptorach, w oparciu o zasadę zaprojektowaną przez Barnea i wsp.18 (Ryc. 1). Plazmidowe cDNA badanych GPCR pobrano z zestawu PRESTO-Tango GPCR i zmontowano w dwóch 96-dołkow...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Konformacyjnie dynamiczne GPCR są potęgami transdukcji sygnału. Właściwości fizykochemiczne kieszeni wiążących te receptory heptaheliczne, a także ich znaczenie fizjologiczne podkreślają potrzebę stosowania narzędzi do badań przesiewowych ligandów GPCR. Jak przedstawiono powyżej, test PRESTO-Tango jest szybki, czuły i przyjazny dla użytkownika, dzięki czemu nadaje się do opracowywania leków. Test ten nie tylko mierzy aktywację indukowaną przez agonistę, ale może być również wykorzystany do ilościowego określenia aktywnoś...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują, że nie mają sprzecznych interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Kanadyjskie Instytuty Badań nad Zdrowiem (grant CIHR #MOP142219).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
384 Well Optyczne płytki dolne, baza polimerowa polistyrenu, poddana obróbce kultur komórkowych,, z pokrywką, sterylnaNUNC12-566 384
Well Optical Bottom Plates, baza polimerowa polistyrenu, poddana hodowli komórkowej, biała, z pokrywką, sterylnaNUNC12-566-1
384 Well Round Bottom, polipropylen, niepoddany obróbce, niebieski, niesterylny, bez pokrywkiThermoFisher12-565-390
Antybiotyk-Antybiotyk PrzeciwgrzybiczyŻubr 450-115-EL
D-Lucyferyna, sól sodowaGoldBioLUCNA
DMEM z L-Glutaminą, 4,5g/L Glukoza i Pirogronian SoduCorning10-013-CV
Eppendorf Xplorer, 12-kanałowy, zmienny, 15– 300 i mikro; LEppendorf4861000155
Eppendorf Xplorer, 12-kanałowy, zmienny, 5– 100 &mikro; LEppendorf4861000139
Matrix Platemate 2x3ThermoFisher801-10001
MicroBeta 1450 WallacPerkin Elmer
Penicilin-StreptomycinŻubr450-201-EL
Bromowodorek poli-L-lizynyMillipore-SigmaP2636-500MG
Zestaw Roth Lab PRESTO-Tango GPCR AddgeneZestaw #1000000068

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Liapakis, G., et al. The G-protein coupled receptor family: actors with many faces. Current pharmaceutical design. 18 (2), 175-185 (2012).
  2. Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. J. Seven-transmembrane receptors. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 3 (9), 639-650 (2002).
  3. Kroeze, W. K., Sheffler, D. J., Roth, B. L. G-protein-coupled receptors at a glance. Journal of cell science. 116, Pt 24 4867-4869 (2003).
  4. Rask-Andersen, M., Almén, M. S., Schiöth, H. B. Trends in the exploitation of novel drug targets. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (8), 579-590 (2011).
  5. Ngo, T., et al. Identifying ligands at orphan GPCRs: current status using structure-based approaches. British journal of pharmacology. 173 (20), 2934-2951 (2016).
  6. Zhang, R., Xie, X. Tools for GPCR drug discovery. Acta pharmacologica Sinica. 33 (3), 372-384 (2012).
  7. Kimple, A. J., Bosch, D. E., Giguere, P. M., Siderovski, D. P. Regulators of G-Protein Signaling and Their G Substrates: Promises and Challenges in Their Use as Drug Discovery Targets. Pharmacological Reviews. 63 (3), 728-749 (2011).
  8. Wettschureck, N., Offermanns, S. Mammalian G Proteins and Their Cell Type Specific Functions. Physiological Reviews. 85 (4), 1159-1204 (2005).
  9. Denis, C., Saulière, A., Galandrin, S., Sénard, J. -M., Galés, C. Probing heterotrimeric G protein activation: applications to biased ligands. Current Pharmaceutical Design. 18 (2), 128-144 (2012).
  10. Yin, H., et al. Lipid G protein-coupled receptor ligand identification using beta-arrestin PathHunter assay. The Journal of Biological Chemistry. 284 (18), 12328-12338 (2009).
  11. Cheng, Z., et al. Luciferase Reporter Assay System for Deciphering GPCR Pathways. Current Chemical Genomics. 4, 84-91 (2010).
  12. Roth, B. L., Kroeze, W. K. Integrated Approaches for Genome-wide Interrogation of the Druggable Non-olfactory G Protein-coupled Receptor Superfamily. The Journal of Biological Chemistry. 290 (32), 19471-19477 (2015).
  13. Jean-Charles, P. -Y., Kaur, S., Shenoy, S. K. G Protein-Coupled Receptor Signaling Through β-Arrestin-Dependent Mechanisms. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 70 (3), 142-158 (2017).
  14. Smith, J. S., Rajagopal, S. The β-Arrestins: Multifunctional Regulators of G Protein-coupled Receptors. The Journal of Biological Chemistry. 291 (17), 8969-8977 (2016).
  15. Böhme, I., Beck-Sickinger, A. G. Illuminating the life of GPCRs. Cell Communication and Signaling. 7 (1), 16(2009).
  16. Fang, Y. Label-Free Receptor Assays. Drug discovery today. Technologies. 7 (1), 5-11 (2011).
  17. Wang, T., et al. Measurement of β-Arrestin Recruitment for GPCR Targets. Assay Guidance Manual. Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences. , (2004).
  18. Barnea, G., et al. The genetic design of signaling cascades to record receptor activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (1), 64-69 (2008).
  19. Kroeze, W. K., et al. PRESTO-Tango as an open-source resource for interrogation of the druggable human GPCRome. Nature Structural & Molecular Biology. 22 (5), 362-369 (2015).
  20. Jordan, M., Schallhorn, A., Wurm, F. M. Transfecting Mammalian Cells: Optimization of Critical Parameters Affecting Calcium-Phosphate Precipitate Formation. Nucleic Acids Research. 24 (4), 596-601 (1996).
  21. Baker, J. M., Boyce, F. M. High-throughput functional screening using a homemade dual-glow luciferase assay. Journal of Visualized Experiments. (88), 50282(2014).
  22. Li, H., Eishingdrelo, A., Kongsamut, S., Eishingdrelo, H. G-protein-coupled receptors mediate 14-3-3 signal transduction. Signal Transduction and Targeted Therapy. 1 (1), 16018(2016).
  23. Walther, C., Ferguson, S. S. G. Minireview: Role of intracellular scaffolding proteins in the regulation of endocrine G protein-coupled receptor signaling. Molecular Endocrinology. 29 (6), Baltimore, Md. 814-830 (2015).
  24. Gurevich, E. V., Benovic, J. L., Gurevich, V. V. Arrestin2 expression selectively increases during neural differentiation. Journal of Neurochemistry. 91 (6), 1404-1416 (2004).
  25. Shaikh, S., Nicholson, L. F. B. Optimization of the Tet-On system for inducible expression of RAGE. Journal of Biomolecular Techniques JBT. 17 (4), 283-292 (2006).
  26. Blau, H. M., Rossi, F. M. Tet B or not tet B: advances in tetracycline-inducible gene expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (3), 797-799 (1999).
  27. Roche, O., et al. Development of a Virtual Screening Method for Identification of "Frequent Hitters" in Compound Libraries. Journal of Medicinal Chemistry. 45 (1), 137-142 (2002).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Rekrutacja beta arrestyny 2przesiewowe badanie ligand w GPCRwysokoprzepustowe badania przesiewowesystem reporterowy lucyferazykom rki HTLApowlekanie poli L lizyntransfekcja fosforanem wapniadetekcja za pomoc odczynnika Glowluminometr do mikrop ytek

Powiązane artykuły