Prezentujemy mysi model indukcji śmierci mózgu, aby ocenić wpływ jego patofizjologicznych skutków na organy, jak również na kolejne przeszczepy w kontekście przeszczepu narządów litych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Indukcja śmierci mózgu u myszy za pomocą monitorowania ciśnienia tętniczego krwi i wentylacji za pomocą tracheostomii
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Chociaż zarówno dawstwo od żywych dawców, jak i dawstwo po śmierci krążeniowej dostarczają alternatywnych możliwości przeszczepu narządów, dawstwo po śmierci mózgu dawcy (BD) nadal stanowi główne źródło przeszczepów litych. Niestety, wiadomo, że nieodwracalna utrata funkcji mózgu wywołuje wiele zmian patofizjologicznych, w tym modyfikacje hemodynamiczne i hormonalne, co ostatecznie prowadzi do ogólnoustrojowej odpowiedzi zapalnej. Nieliczne są modele, które pozwalają na systematyczne badanie tych efektów in vivo. Przedstawiamy mysi model indukcji ChAD, który może pomóc w badaniach nad niszczycielskim wpływem ChAD na jakość przeszczepu allogenicznego. Po wdrożeniu wewnątrztętniczego pomiaru ciśnienia krwi przez tętnicę szyjną wspólną i niezawodnej wentylacji za pomocą tracheostomii, ChAD jest indukowany przez stały wzrost ciśnienia śródczaszkowego za pomocą cewnika balonowego. Cztery godziny po indukcji ChAD można pobrać narządy do analizy lub do dalszych procedur transplantacyjnych. Nasza strategia umożliwia kompleksową analizę ChAD dawcy w modelu mysim, umożliwiając w ten sposób dogłębne zrozumienie skutków związanych z ChAD w transplantacji narządów litych i potencjalnie torując drogę do zoptymalizowanego kondycjonowania narządów.
Wprowadzenie
Transplantacja jest obecnie jedynym sposobem leczenia końcowej niewydolności narządów. Do tej pory pacjenci ze śmiercią mózgu (ChAD) byli głównym źródłem dawstwa narządów, chociaż dawstwo od żywych dawców i dawstwo po śmierci krążeniowej są cennymi alternatywami1. ChAD definiuje się jako nieodwracalną śpiączkę (o znanej przyczynie), brak odruchów pnia mózgu i bezdech2. Niestety, narządy ChAD wykazują gorsze wyniki w długoterminowym przeżyciu przeszczepu, niezależnie od niedopasowania ludzkiego antygenu leukocytarnego (HLA) i czasu niedokrwienia zimna3. W międzyczasie przeprowadzono intensywne badania nad tym niezależnym od antygenu czynnikiem ryzyka, w wyniku którego stwierdzono trzy główne aspekty zmian patofizjologicznych, w których pośredniczy konsekwencja ChAD: hemodynamiczny, hormonalny i zapalny4.
Do tej pory, eksperymentalne modele BD u gryzoni były głównie wykonywane na szczurach. Aby uzyskać lepszy wgląd w konsekwencje immunologiczne dla narządów litych po ChAD, naszym celem było ustalenie mysiego modelu ChAD, ponieważ obecnie tylko modele mysie pozwalają na kompleksowe badania czynników genetycznych lub immunologicznych. W tym kontekście system myszy zapewnia większą różnorodność narzędzi analitycznych.
Zasada indukcji BD, opisana tutaj, opiera się na wzroście ciśnienia śródczaszkowego wywołanym napompowaniem cewnika balonowego umieszczonego pod czaszką. Zwiększone ciśnienie śródczaszkowe naśladuje fizjologiczny mechanizm ChAD poprzez blokowanie perfuzji mózgu, móżdżku i pnia mózgu5,6. Aby zagwarantować odpowiednią perfuzję narządów obwodowych, podczas zabiegu obowiązkowy jest pomiar ciśnienia krwi. Cewnik używany w tym celu służy jednocześnie do podawania soli fizjologicznej w celu ustabilizowania ciśnienia krwi poprzez substytucję płynów. Ponieważ ChAD towarzyszy ustanie oddychania spontanicznego, należy zapewnić odpowiednią wentylację. Koc elektryczny utrzymuje fizjologiczną temperaturę ciała.
Podsumowując, ten model umożliwi dogłębne badania wpływu uszkodzenia wywołanego przez BD, na migrację leukocytów7, komplement aktywacji8, niedokrwienne uszkodzenie reperfuzyjne9, oraz inne czynniki.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z Zasadami Opieki nad Zwierzętami Laboratoryjnymi sformułowanymi przez National Society for Medical Research oraz Przewodnikiem do Opieki i Użytkowania Zwierząt Laboratoryjnych przygotowanym przez National Academy of Science i opublikowanym przez National Institutes of Health (Publikacja NIH nr 86-23, poprawiona w 1985 roku). Wszystkie eksperymenty zostały zatwierdzone przez austriackie Ministerstwo Edukacji, Nauki i Kultury (BMWF-66.011/0071-II/3b/2012).
1. Cewnikowanie tętnicze
- Znieczulij mysz dootrzewnowym wstrzyknięciem ketaminy i ksylazyny10 oraz lekiem przeciwbólowym zgodnie z lokalną praktyką (np. buprenorfiną). Uszczypnij tylne kończyny kleszczami, aby potwierdzić prawidłową głębokość znieczulenia.
UWAGA: W tym badaniu wykorzystano samce myszy C57BL / 6N w wieku 8-12 tygodni (waga 20-25 g). Autorzy bezskutecznie testowali męskie BALB/c w tym samym wieku, ale nie próbowali innych szczepów (patrz Dyskusja). - Usuń włosy w obszarach zainteresowania (głowa, szyja) za pomocą elektrycznej maszynki do golenia. Upewnij się, że nie pozostały żadne luźne włosy, aby zapobiec zanieczyszczeniu rany. Następnie zdezynfekuj pole operacyjne 70% etanolem/chlorheksydyną/betadyną i ułóż mysz na wznak z głową skierowaną w stronę chirurga.
- Wykonaj nacięcie linii środkowej szyjki macicy nożyczkami preparacyjnymi.
- Wypreparuj gruczoły podżuchwowe i tkankę mięśniową szyi i oddziel je w celu odsłonięcia wspólnej tętnicy szyjnej. Stosuj głównie rozwarstwianie za pomocą kleszczy.
- Miejsce trzecie 8-0 Ligatury jedwabne poniżej prawej tętnicy szyjnej wspólnej.
- Umieść zacisk na bliższej podwiązaniu i doprowadź napięcie do tętnicy, aby przepływ został zawieszony.
- Zamknij najbardziej dystalną ligaturę.
- Wprowadzić cewnik tętniczy przez mały, wstępnie uformowany otwór skórny po stronie czaszki nacięcia. Ściśnij i odkształc światło cewnika, jeśli wydaje się zbyt duże, aby zmniejszyć cofanie się krwi. Zafiksuj się wszystkimi trzema ligaturami.
- Przymocuj cewnik do skóry, aby uniknąć zwichnięcia. Zrób to za pomocą szwu (np. żyłki 5-0, niewchłanialnej), który łączy cewnik ze skórą w obszarze wstępnie uformowanego otworu skórnego.
2. Tracheostomia
- Tępo wypreparuj mięśnie przedtchawicze za pomocą kleszczy.
- Miejsce dwa 8-0 jedwabne ligatury pod tchawicą.
- Tracheotomia za pomocą mikronożyczek tak proksymalnie, jak to możliwe, aby uniknąć jednostronnej wentylacji. Użyj poziomej linii cięcia między dwiema chrząstkami tchawicy.
- Włóż rurkę wentylacyjną i zamocuj za pomocą obu przygotowanych ligatur.
UWAGA: Proksymalny koniec tchawicy nie musi być podwiązany. - Zamknij skórę szwem biegnącym (np. żyłka 6-0, niewchłanialna).
- Przewietrzyć mysz z częstotliwością 150/min i objętością oddechową 200 μl.
3. Indukcja śmierci mózgu
- Ustaw mysz w pozycji leżącej.
- Usuń skórę z czaszki za pomocą nożyczek chirurgicznych i kleszczy, aby przytrzymać skórę.
- Wywierć otwór o kalibrze 1 mm przyśrodkowo nad lewą korą ciemieniową. Przerwij wiercenie przed naruszeniem wewnętrznej zwartej kości i opony twardej.
- Przeniknij do końcowego mostu tkankowego czaszki za pomocą kleszczy, usuwając ostre krawędzie.
- Wprowadzić cewnik balonowy tak, aby znajdował się całkowicie w jamie czaszki. Upewnij się, że balon jest wstępnie napełniony solą fizjologiczną i całe powietrze zostało usunięte.
- Rozpocznij napełnianie od ~0,1 ml/min przez okres 10-15 min (całkowita objętość 0,8-1,2 ml) za pomocą pompy strzykawkowej.
UWAGA: Mysz będzie wykazywać mioklonie, rozszerzenie źrenic, dalszą aktywność napadową i agonalne westchnienia. - Ogłoś śmierć mózgu myszy, gdy ogon myszy zesztywnieje i wyprostuje się.
UWAGA: ChAD potwierdza charakterystyczny początkowy szczyt ciśnienia krwi (odruch Cushinga), brak odruchów pnia mózgu i spontaniczny oddech. Podczas eksperymentów należy unikać regularnych testów bezdechu, ponieważ myszy mogą stać się niestabilne w krążeniu z powodu braku tlenu. - Zatrzymaj nadmuchiwanie cewnika balonowego.
- Połóż koc grzewczy na myszy, aby uniknąć hipotermii.
4. Podczas okresu BD
- Regularnie monitoruj i dokumentuj ciśnienie krwi. Wyklucz myszy z przedłużoną fazą hipotensyjną (średnie ciśnienie tętnicze [MAP] < 50 mmHg przez >30 min).
- Podawaj 0,1 ml soli fizjologicznej co 30 minut, aby ustabilizować ciśnienie krwi myszy.
UWAGA: W sumie 0,8 ml soli fizjologicznej podano każdej myszy w tym badaniu. - Po 4 godzinach trwania BD należy pobrać narządy/tkanki myszy. Wyklucz mysz z eksperymentu, jeśli serce myszy nie bije pod koniec eksperymentu.
5. Procedura pozorna
- Wykonaj kroki 1.1−3.3.
UWAGA: Nie otwieraj wewnętrznej kości zbitej. Nie wkładaj ani nie napełniaj cewnika balonowego. - Trzymaj się blisko myszy i stale obserwuj zwierzę. Kilkakrotnie szczypnij tylne kończyny kleszczami, aby potwierdzić prawidłową głębokość znieczulenia. Zastosuj dodatkowe znieczulenie podskórnie (około 1/2 dawki początkowej), jeśli mysz wykazuje oznaki przebudzenia, co według naszego doświadczenia następuje po około 2-3 godzinach od znieczulenia.
- Zastosuj taką samą ilość soli fizjologicznej dożylnie, jak u myszy BD.
UWAGA: Mysz pozorowana odzyska spontaniczne oddychanie po zaprzestaniu wentylacji. Mysz BD nie będzie. Badanie bezdechu powinno być wykonywane podczas tworzenia modelu, ale podczas eksperymentów należy go unikać ze względu na niepotrzebny stres fizjologiczny.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Mysi model BD został pomyślnie przeprowadzony ponad 100 razy, przy stopniu powodzenia przekraczającym 90%. Ponadto bezpiecznie wykonano pointerwencyjną transplantację organów serca i nerek7.
BD wywołuje szereg zmian patofizjologicznych, które mogą być dalej badane z wykorzystaniem tego modelu. Jak pokazano na Rycynie 1, ciśnienie krwi wykazuje początkowy szczyt nadciśnieniowy...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
ChAD, czynnik ryzyka dla jakości przeszczepu allogenicznego u dawców wielonarządowych, pociąga za sobą mnóstwo zmian patofizjologicznych, które można wystarczająco ocenić tylko za pomocą modeli in vivo. Zmiany hemodynamiczne, burza cytokinowa, zmiany hormonalne i ich ostateczny wpływ na jakość i przeżywalność narządów nie mogą być analizowane in vitro4. Większość podstawowych badań transplantacyjnych, a także immunologicznych opiera się na zaawansowanych narzędziach diagnostycznych, które są powsz...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Cewnik tętniczy (BD Neoflon 26G) | Przetworniki | ||
| (APT300) | Harvard Apparatus Inc. | 73-3862 | |
| Cewnik do embolektomii tętniczej Fogarty N° 3 | Edwards Lifesciences Corporation | 120403F | |
| Kleszcze | FST | 11271-30 | |
| Homeotermiczne systemy z elastyczną sondą | Harvard Apparatus Inc. | 55-7020 | |
| Ketansol | Graeub 6680110 | ||
| Mikronożyczki | FST | 15018-10 | |
| Uchwyt na igły | FST | 12060-02 | |
| Prolene 5-0 | Ethicon | 8698H | |
| Pump 11 Elite Infusion Tylko jeden | Harvard Apparatus Inc. | 70-4500 | |
| Nożyce | FST | 14075-11 | |
| Mikroskop stereotaktyczny | Olympus | SZX7 | |
| Transpore Tape | 3M | 1527-1 | |
| Podkłady | Molinea.A | 274301 | |
| Wentylator dla myszy (MiniVent Model 845) | Harvard Apparatus Inc. | 73-0043 | |
| Xylasol | Graeub | 7630109 |
Bibliografia
- Hart, A., et al. OPTN/SRTR 2017 Annual Data Report: Kidney. American Journal of Transplantation. 19 (Suppl 2), 19(2019).
- The Quality Standards Subcommittee of the American Academy of Neurology. Practice parameters for determining brain death in adults (summary statement). Neurology. 45 (5), 1012-1014 (1995).
- Terasaki, P. I., Cecka, J. M., Gjertson, D. W., Takemoto, S. High survival rates of kidney transplants from spousal and living unrelated donors. New England Journal Medicine. 333 (6), 333-336 (1995).
- Pratschke, J., Neuhaus, P., Tullius, S. G. What can be learned from brain-death models? Transplant International. 18 (1), 15-21 (2005).
- Wilhelm, M. J., et al. Activation of the heart by donor brain death accelerates acute rejection after transplantation. Circulation. 102 (19), 2426-2433 (2000).
- Pomper, G., et al. Introducing a mouse model of brain death. Journal of Neuroscience Methods. 192 (1), 70-74 (2010).
- Ritschl, P. V., et al. Donor brain death leads to differential immune activation in solid organs but does not accelerate ischaemia-reperfusion injury. Journal of Pathology. 239 (1), 84-96 (2016).
- Atkinson, C., et al. Donor brain death exacerbates complement-dependent ischemia/reperfusion injury in transplanted hearts. Circulation. 127 (12), 1290-1299 (2013).
- Oberhuber, R., et al. Treatment with tetrahydrobiopterin overcomes brain death-associated injury in a murine model of pancreas transplantation. American Journal of Transplantation. 15 (11), 2865-2876 (2015).
- Floerchinger, B., et al. Inflammatory immune responses in a reproducible mouse brain death model. Transplant Immunology. 27 (1), 25-29 (2012).
- Steen, P. A., Milde, J. H., Michenfelder, J. D. No barbiturate protection in a dog model of complete cerebral ischemia. Annals of Neurology. 5 (4), 343-349 (1979).
- Cooper, D. K., Novitzky, D., Wicomb, W. N. The pathophysiological effects of brain death on potential donor organs, with particular reference to the heart. Annals of the Royal College of Surgeons of England. 71 (4), 261-266 (1989).
- Herijgers, P., Leunens, V., Tjandra-Maga, T. B., Mubagwa, K., Flameng, W. Changes in organ perfusion after brain death in the rat and its relation to circulating catecholamines. Transplantation. 62 (3), 330-335 (1996).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
