Ten protokół przedstawia prosty i spójny sposób na przejściowe zwiększenie wartości interesującego genu za pomocą modRNA po zawale mięśnia sercowego u myszy.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Dostarczanie zmodyfikowanego mRNA w mysim modelu zawału mięśnia sercowego
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Zawał mięśnia sercowego (MI) jest główną przyczyną zachorowalności i śmiertelności w świecie zachodnim. W ciągu ostatniej dekady terapia genowa stała się obiecującą opcją leczenia chorób serca ze względu na swoją skuteczność i wyjątkowe efekty terapeutyczne. W celu naprawy uszkodzonej tkanki po zawale mięśnia sercowego, w różnych badaniach stosowano terapię genową opartą na DNA lub wirusową, ale napotkano znaczne przeszkody ze względu na słabą i niekontrolowaną ekspresję dostarczonych genów, obrzęk, arytmię i przerost serca. Syntetyczne zmodyfikowane mRNA (modRNA) przedstawia nowatorskie podejście do terapii genowej, które oferuje wysokie, przejściowe, bezpieczne, nieimmunogenne i kontrolowane dostarczanie mRNA do tkanki serca bez ryzyka integracji genomowej. Ze względu na te niezwykłe cechy w połączeniu z farmakokinetyką w kształcie dzwonu w sercu, modRNA stało się atrakcyjnym podejściem do leczenia chorób serca. Jednak, aby zwiększyć jego skuteczność in vivo, należy przestrzegać spójnej i niezawodnej metody dostarczania. W związku z tym, aby zmaksymalizować wydajność dostarczania modRNA i zapewnić spójność w wykorzystaniu modRNA do zastosowań in vivo, przedstawiono zoptymalizowaną metodę przygotowania i dostarczania modRNA do iniekcji dosercowej w mysim modelu MI. Protokół ten sprawi, że dostarczanie modRNA będzie bardziej dostępne dla badań podstawowych i translacyjnych.
Wprowadzenie
Terapia genowa to potężne narzędzie polegające na dostarczaniu kwasów nukleinowych do leczenia, leczenia lub zapobiegania chorobom ludzkim. Pomimo postępu w podejściach diagnostycznych i terapeutycznych w chorobach serca, sukces w dostarczaniu genów w zawale mięśnia sercowego (MI) i niewydolności serca (HF) jest ograniczony. Choć proces terapii genowej wydaje się prosty, jest to niezwykle złożone podejście, biorąc pod uwagę wiele czynników, które należy zoptymalizować przed zastosowaniem konkretnego pojazdu dostawczego. Prawidłowy wektor dostarczania powinien być nieimmunogenny, wydajny i stabilny w organizmie człowieka. Wysiłki w tej dziedzinie doprowadziły do powstania dwóch rodzajów systemów dostarczania: wirusowych lub niewirusowych. Szeroko stosowane systemy wirusowe, w tym transfer genów przez adenowirusa, retrowirusa, lentiwirusa lub wirusa związanego z adenowirusem, wykazały wyjątkową zdolność transdukcji. Jednak ich zastosowanie w klinikach jest ograniczone ze względu na silną odpowiedź immunologiczną indukowaną 1, ryzyko nowotworzenia2, lub obecność przeciwciał neutralizujących3, z których wszystkie pozostają główną przeszkodą w szerokim i skutecznym zastosowaniu wektorów wirusowych w terapii genowej człowieka. Z drugiej strony, pomimo imponującego wzorca ekspresji, dostarczenie nagiego plazmidowego DNA wykazuje niską skuteczność transfekcji, podczas gdy transfer mRNA wykazuje wysoką immunogenność i podatność na degradację przez RNase4.
Dzięki szeroko zakrojonym badaniom w dziedzinie mRNA, modRNA stało się atrakcyjnym narzędziem do dostarczania genów do serca i różnych innych narządów ze względu na swoje liczne zalety w porównaniu z tradycyjnymi wektorami5. Całkowite zastąpienie urydyny naturalnie występującą pseudourydyną skutkuje bardziej silną i przejściową ekspresją białka, przy minimalnej indukcji wrodzonej odpowiedzi immunologicznej i ryzyku integracji genomowej6. Niedawno opracowane protokoły wykorzystują zoptymalizowaną ilość analogu anty-reverse cap (ARCA), który dodatkowo zwiększa translację białek poprzez zwiększenie stabilności i transability syntetycznego mRNA7.
Poprzednie raporty wykazały ekspresję różnych genów reporterowych lub funkcjonalnych dostarczanych przez modRNA w mięśniu sercowym gryzoni po MI. Dzięki zastosowaniu modRNA, znaczne obszary mięśnia sercowego, w tym zarówno kardiomiocyty, jak i niekardiomiocyty, zostały pomyślnie transfekowane po uszkodzeniu serca8 w celu wywołania angiogenezy9,10, przeżycie komórek sercowych11, oraz proliferacja kardiomiocytów12. Pojedyncze podanie modRNA kodowanego dla zmutowanego ludzkiego folistatyny podobnego do 1 indukuje proliferację dorosłych CM myszy i znacznie zwiększa czynność serca, zmniejsza rozmiar blizny i zwiększa gęstość naczyń włosowatych 4 tygodnie po mi-MI12. Nowsze badanie wykazało poprawę funkcji serca po zawale mięśnia sercowego po zastosowaniu modRNA VEGFA w modelu trzody chlewnej10.
Tak więc, wraz ze wzrostem popularności modRNA w dziedzinie serca, konieczne jest opracowanie i optymalizacja protokołu dostarczania modRNA do serca po zawale mięśnia sercowego. Niniejszy protokół opisuje przygotowanie i dostarczanie oczyszczonego i zoptymalizowanego modRNA w biokompatybilnym preparacie cytrynianowo-solowym, który zapewnia solidną, stabilną ekspresję białka bez stymulowania odpowiedzi immunologicznej. Metoda pokazana w tym protokole i filmie demonstruje standardową procedurę chirurgiczną myszy MI polegającą na trwałym podwiązaniu lewej przedniej tętnicy zstępującej (LAD), a następnie trzech miejscowych wstrzyknięć dosercowych modRNA. Celem tego artykułu jest jasne zdefiniowanie wysoce dokładnej i powtarzalnej metody dostarczania modRNA do mięśnia sercowego myszy, aby zastosowanie modRNA było szeroko dostępne w terapii genowej serca.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie opisane tutaj procedury dla zwierząt zostały zatwierdzone przez Icahn School of Medicine w Mount Sinai Institutional Care and Use Committee.
1. Synteza modRNA
UWAGA: Szczegóły syntezy modRNA można znaleźć w Kondrat et al.13.
- Zamów matryce plazmidowe (tabela materiałów) i wygeneruj czysty produkt PCR, który zostanie użyty jako matryca mRNA.
- Przygotuj modRNA przez transkrypcję in vitro z dostosowaną mieszanką rybonukleozydów następujących (tabela materiałów): zestaw do transkrypcji T7, 6 mM analog anty-reverse cap (ARCA) 30-O-Me-m7G(50) ppp(50)G, 75 mM trifosforan guanozyny, 75 mM trifosforan adenozyny, 75 mM trifosforan cytydyny, 100 mM pseudourydyno-5-trifosforan i enzym DNazy T7.
- Oczyść modRNA wykonane w kroku 1.2 za pomocą zestawu do czyszczenia transkrypcji (tabela materiałów) i potraktuj fosfatazą antarktyczną. Następnie ponownie oczyść modRNA za pomocą zestawu do czyszczenia transkrypcji i określ go ilościowo za pomocą spektrofotometru.
- Wytrącić modRNA etanolem i octanem amonu i ponownie zawiesić w 10 mM Tris-HCl i 1 mM EDTA.
- Skoncentrować modRNA do dostarczenia in vivo przez filtry odśrodkowe i zmierzyć jakość za pomocą zautomatyzowanej platformy do elektroforezy (tabela materiałów).
2. Przygotowanie iniekcji modRNA do dostarczenia in vivo
- Obliczyć objętość potrzebną do wstrzyknięcia 100 μg lucyferazy (Luc)/Cre modRNA na podstawie stężenia modRNA.
- Wymieszać obliczoną objętość modRNA z równymi częściami roztworu sacharozy przygotowanego w wodzie wolnej od nukleaz (0,3 g/ml) i 0,1 M roztworu cytrynianu (pH = 7) (zalecane 20 μl każdy).
- Doprowadzić końcową objętość wstrzyknięcia do 60 μl, dodając roztwór soli fizjologicznej.
3. Operacja zawału mięśnia sercowego
- Znieczulenie i przygotowanie zwierzęcia
UWAGA: W tym badaniu wykorzystano samce i samice myszy CFW w wieku 8-12 tygodni.- Znieczulij mysz 2% izofluranem za pomocą komory indukcyjnej i ułóż zwierzę na grzbiecie w pozycji grzbietowej z maską na nos i usta, aby utrzymać znieczulenie. Utrzymuj znieczulenie poprzez wentylację mechaniczną za pomocą respiratora wyposażonego w rurkę oddechową 7−8 mm i filtr.
- Aby unieruchomić mysz na platformie operacyjnej, zabezpiecz jej kończyny taśmą chirurgiczną. Ogol okolice szyi i lewą stronę klatki piersiowej i zdezynfekuj za pomocą 70% etanolu i jodu powidonu. Powtórz etap dezynfekcji dwukrotnie. Sprawdź jego odruchy, szczypiąc ogon i tylne łapy, aby ocenić głębokość znieczulenia.
- Stale monitoruj i utrzymuj temperaturę ciała w normotermii (37,5−38 °C).
- Utrzymuj otwarte drogi oddechowe, wykonując intubację dotchawiczą. Aby to zrobić, umieść mysz w pozycji brzusznej z ustami skierowanymi w stronę eksperymentatora i delikatnie wyciągnij język. Wyreguluj kąt nachylenia szyi i wyprostuj ścieżkę intubacji, a następnie wciśnij kaniulę intubacyjną.
- W przypadku, gdy zwierzę nie jest w stanie przez nią oddychać, można wykonać tracheostomię. Wykonaj nacięcie szyjki macicy wzdłuż linii środkowej, izolując skórę, mięśnie i tkankę zarysowującą tchawicę za pomocą mikroskopu. Gdy tchawica jest wyraźnie widoczna, włóż rurkę dotchawiczą do tkanki między dwoma pierścieniami wkładów poniżej głośni, wykonując mały otwór i przytrzymując czaszkową część tchawicy za pomocą kleszczy mikrochirurgicznych.
- Obserwuj ruch klatki piersiowej myszy, aby sprawdzić, czy oba płuca otrzymują tlen. Częstość oddechów (RR) powinna wynosić około 120 oddechów na minutę, przy ciśnieniu wdechowym 17−18 cmH2O.
- Podwiązanie lewej tętnicy zstępującej przedniej (LAD)
- Aby wykonać podwiązanie LAD, należy ostrożnie obrócić mysz tak, aby leżała na prawym boku. Podnieś skórę i wykonaj torakotomię lewostronną między 3. a 4. żebrem i ostrożnie wypreparuj tkankę i mięsień. Użyj kauteryzacji, aby zapobiec krwawieniu.
- Ostrożnie otwórz klatkę piersiową, a gdy już się otworzy, znajdź serce, nie dotykając płuca żadnym ostrym przedmiotem. Umieść retraktory w nacięciu, aby jama klatki piersiowej była otwarta i miała wyraźny widok serca. Teraz przesuń płuca na krawędź nacięcia i usuń część worka osierdziowego, która pokrywa serce, aby uzyskać dostęp do przedniej powierzchni serca.
- Ostrożnie zidentyfikuj LAD, który może być postrzegany jako ciemnoczerwone naczynie znajdujące się między tętnicą płucną a lewym małżowiną uszną. Podwiązać LAD proksymalnie za pomocą jednego szwu jedwabnego 7-0. Umieścić rurkę w klatce piersiowej (28 G, cewnik dożylny) między 4. a 5. żebrem.
- Zamknij nacięcie klatki piersiowej warstwami. Użyj jedwabnych szwów biegowych 6-0, aby dostosować żebra i użyj jedwabnych szwów biegowych 5-0, aby zamknąć skórę. Upewnij się, że zostawiłeś odpowiednie okno na przyszłe pomiary echokardiograficzne.
- Ostrożnie osuszyć klatkę piersiową ciepłym roztworem izotonicznym (9 g chlorku sodu w 1 l wody) za pomocą strzykawki o pojemności 2 ml. Umieść mysz na plecach. W przypadku wykonywania tracheostomii wyjmij rurkę dotchawiczą i za pomocą jedwabnych szwów 7-0 dopasuj pierścienie wkładu tchawicy za pomocą jednego szwu. Umieść maskę na twarz na myszy i zamknij skórę za pomocą jedwabnych szwów biegowych 5-0.
- W fazie rekonwalescencji należy odłączyć kaniulę intubacyjną od respiratora i umożliwić spontaniczne oddychanie. Umieść zwierzę pod lampą grzewczą, aż uzyska przytomność. Nie pozostawiaj zwierzęcia bez opieki po zabiegu, dopóki nie będzie w pełni wybudzone.
- Leczenie bólu należy stosować buprenofiną w dawce 0,1 mg/kg masy ciała, wstrzykiwaną podskórnie przez kolejne 3 dni w odstępach 12 godzin.
4. Sercowe dostarczanie modRNA
- Dostarczyć łącznie 60 μl modRNA przygotowanego w kroku 2.3 domięśniowo (IM) za pomocą strzykawki insulinowej (31 G) po zawale mięśnia sercowego.
- Wstrzyknąć 20 μl modRNA w trzy różne miejsca mięśnia sercowego otaczające obszar zawału (dwa po obu stronach podwiązania i jeden w wierzchołku). Wstrzyknięcia należy wykonać bezpośrednio po LAD, przed zamknięciem klatki piersiowej.
UWAGA: Reprezentatywne obrazy miejsc iniekcji modRNA można zobaczyć na Rysunek 1.
- Wstrzyknąć 20 μl modRNA w trzy różne miejsca mięśnia sercowego otaczające obszar zawału (dwa po obu stronach podwiązania i jeden w wierzchołku). Wstrzyknięcia należy wykonać bezpośrednio po LAD, przed zamknięciem klatki piersiowej.
5. Walidacja ekspresji białka w sercu po zawale mięśnia sercowego
- Ekspresja modRNA lucyferazy przy użyciu systemu obrazowania bioluminescencyjnego
UWAGA: Łącznie 100 μg mRNA Luc przygotowanego w 60 μl buforu cytrynianu sacharozy jest bezpośrednio wstrzykiwane do serca myszy CFW po MI.- Po 24 godzinach od wstrzyknięcia MI i modRNA znieczulić myszy 2% izofluranem za pomocą komory indukcyjnej i dootrzewnowo wstrzyknąć lucyferynę (150 mg / g masy ciała) w celu walidacji sygnału Luc in vivo.
- Obrazuj myszy za pomocą systemu obrazowania bioluminescencyjnego co 2 minuty, aż sygnał Luc osiągnie nasycenie.
- Określ ilościowo zebrane dane obrazowe za pomocą oprogramowania do analizy obrazowania. Użyj myszy, którym wstrzyknięto sól fizjologiczną, tylko jako odczyt wyjściowy dla ekspresji Luc i odejmij sygnał tła zebrany od myszy, którym wstrzyknięto sól fizjologiczną.
UWAGA: Sygnał Luc jest wyrażony w p/s/cm2/sr x 106.
- Barwienie immunologiczne w celu walidacji transfekcji Cre
- Aby potwierdzić transfekcję Cre, należy uśmiercić zwierzęta 24 godziny po wstrzyknięciu, stosując dootrzewnowe wstrzyknięcie 100 mg/kg ketaminy i 10 mg/kg ksylazyny, a następnie zwichnąć szyjkę macicy. Przed wykonaniem nacięcia zdezynfekuj klatkę piersiową i brzuch za pomocą wacika nasączonego 70% alkoholem.
- Otwórz klatkę piersiową, wykonując poprzeczne nacięcie ~1 cm niżej niż mostek i przesuń nożyczki w kierunku głowy, przecinając klatkę piersiową.
- Otwórz klatkę piersiową i wstrzyknij 1 ml sterylnego PBS do prawej komory w celu usunięcia nadmiaru krwi. Natychmiast wyciąć serce i umieścić je w sterylnym PBS, aby zmyć pozostałą krew.
- Utrwalić serce w 4% paraformaldehydzie (PFA) przez 24 godziny, a następnie przez noc inkubować w 30% roztworze sacharozy w temperaturze 4 °C. Następnego dnia osadzamy serca w podłożu o optymalnej temperaturze cięcia i kroimy je na grubość 10 μm za pomocą kriostatu.
- Wybarwić skrawki pierwszorzędowym przeciwciałem przeciwko sercowej troponinie I (cTNI) i oznaczyć je fluorescencyjnym przeciwciałem drugorzędowym. Aby zidentyfikować jądro, wybarwić 4',6-diamidyno-2-fenyloindolem (DAPI) przez 5 minut. Zobrazuj szkiełka za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.
6. Analiza statystyczna
- Narysuj wykres słupkowy na podstawie wyrażenia Luc u myszy z solą fizjologiczną i myszami, którym wstrzyknięto Luc, a następnie podaj wartości jako średnią ± SEM. Porównaj obie grupy za pomocą niesparowanego testu t (****p < 0,0001).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Myszy w wieku od ośmiu do dziesięciu tygodni zanieczulono izofluranem i zaintubowano. Po wprowadzeniu zwierzęcia w stan znieczulenia, lewy obszar klatki piersiowej ogolono i wysterylizowano etanolem, a następnie odsłonięto serce w celu ligacji LAD. Lewą tętnicę wieńcową zamknięto, mocno zawiązując szew pod tętnicą (schemat przedstawiony na Rysunku 1A). Po uzyskaniu skutecznego zawału (wskaźnikiem była bladość wolnej ściany lewej komory), bezpośrednio do mięśnia sercowego, w trzech różnych mi...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Terapia genowa wykazała ogromny potencjał, aby znacznie przyspieszyć leczenie chorób serca. Jednak tradycyjne narzędzia stosowane we wstępnych badaniach klinicznych w leczeniu niewydolności serca wykazały ograniczoną skuteczność i wiążą się z poważnymi skutkami ubocznymi. Zmodyfikowane RNA przedstawia niewirusowe dostarczanie genów, które stale zyskuje na popularności jako narzędzie transferu genów w sercu. ModRNA nie wymaga lokalizacji jądrowej genów do translacji, a tym samym zapewnia wydajną i szybką ekspresję białka....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Autorzy dziękują Ann Anu Kurian za pomoc przy tym manuskrypcie. Praca ta została sfinansowana z grantu na rozpoczęcie działalności kardiologicznej przyznanego laboratorium Zangi, a także z grantu NIH R01 HL142768-01
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Adenozynotrifosforan | Invitrogen | AMB13345 | Zawarte w zestawie Megascript |
| Fosfataza antarktyczna | New England Biolabs | M0289L | |
| Analog anty-odwrotnej nasadki, 30-O-Mem7G(50) ppp(50)G | TriLink Biotechnologies | N-7003 | |
| System obrazowania bioluminescencji | Perkin Elmer | 124262 | IVIS100 system obrazowania urządzenia ze sprzężeniem ładunkowym |
| zwijacze | FST | 18200-09 | |
| Tropnina sercowa I | Abcam | 47003 | |
| Trifosforan cytydyny | Invitrogen | AMB13345 | Zawarte w zestawie Megascript |
| Podwójny system anestezjologiczny | Aparat Harvard | 75-2001 | |
| Kleszcze - Adson | FST | 91106-12 | |
| Kleszcze - Dumont #7 | FST | 91197-00 | |
| Trifosforan guanozyny | Invitrogen | AMB13345 | Zawarte w zestawie Megascript |
| Zestaw do transkrypcji in vitro | Zestaw Invitrogen | AMB13345 | 5X MEGAscript T7 |
| Kaniula do intubacji | Aparat Harvard Zestaw | ||
| Megaclear | Life Technologies | ||
| Wentylator dla myszy | Aparat Harvard | 73-4279 | |
| N1-metylo pseudourydyno-5-trifosforan | TriLink Biotechnologies | N-1081 | |
| Spektrometr NanoDrop | Thermo Scientific | ||
| Uchwyt igły Olsen hegar z nożyczkami do szwów | FST | 12002-12 | |
| Szablony plazmidowe | GeneArt, Thermo Fisher Scientific | ||
| Nożyczki preparacyjne z ostrym zakończeniem | FST | 14200-12 | |
| Stereoskop | Zeiss | ||
| Szwy | Ethicon | Y433H | 5.00 |
| Nici | Ethicon | Y432H | 6.00 |
| Nici | Ethicon | 7733G | 7.00 |
| T7 Enzym DNazy | Invitrogen | AMB13345 | Zawarte w zestawie Megascript |
| Stacja | taśmowaAligent | 4200 | |
| Zestaw do czyszczenia transkrypcji | Invitrogen | AM1908 | Megaclear |
| Ultra-4 filtry odśrodkowe 10k | Amicon | UFC801096 |
Bibliografia
- Muruve, D. A. The innate immune response to adenovirus vectors. Human Gene Therapy. 15 (12), 1157-1166 (2004).
- Donsante, A., et al. Observed incidence of tumorigenesis in long-term rodent studies of rAAV vectors. Gene Therapy. 8 (17), 1343-1346 (2001).
- Calcedo, R., Wilson, J. M. Humoral Immune Response to AAV. Frontiers in Immunology. 4, 341(2013).
- Diebold, S. S., et al. Nucleic acid agonists for Toll-like receptor 7 are defined by the presence of uridine ribonucleotides. European Journal of Immunology. 36 (12), 3256-3267 (2006).
- Magadum, A., Kaur, K., Zangi, L. mRNA-Based Protein Replacement Therapy for the Heart. Molecular Therapy. 27 (4), 785-793 (2019).
- Kariko, K., et al. Incorporation of pseudouridine into mRNA yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability. Molecular Therapy. 16 (11), 1833-1840 (2008).
- Hadas, Y., et al. Optimizing Modified mRNA In Vitro Synthesis Protocol for Heart Gene Therapy. Molecular Therapy- Methods and Clinical Development. 14, 300-305 (2019).
- Sultana, N., et al. Optimizing Cardiac Delivery of Modified mRNA. Molecular Therapy. 25 (6), 1306-1315 (2017).
- Zangi, L., et al. Modified mRNA directs the fate of heart progenitor cells and induces vascular regeneration after myocardial infarction. Nature Biotechnology. 31 (10), 898-907 (2013).
- Carlsson, L., et al. Purified VEGF-A mRNA Improves Cardiac Function after Intracardiac Injection 1 Week Post-myocardial Infarction in Swine. Molecular Therapy Methods Clinical Development. 9, 330-346 (2018).
- Huang, C. L., et al. Synthetic chemically modified mRNA-based delivery of cytoprotective factor promotes early cardiomyocyte survival post-acute myocardial infarction. Molecular Pharmaceutics. 12 (3), 991-996 (2015).
- Magadum, A., et al. Ablation of a Single N-Glycosylation Site in Human FSTL 1 Induces Cardiomyocyte Proliferation and Cardiac Regeneration. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 13, 133-143 (2018).
- Kondrat, J., Sultana, N., Zangi, L. Synthesis of Modified mRNA for Myocardial Delivery. Methods in Molecular Biology. 1521, 127-138 (2017).
- Gan, L. M., et al. Intradermal delivery of modified mRNA encoding VEGF-A in patients with type 2 diabetes. Nature Communication. 10 (1), 871(2019).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
