Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Bezmarkerowa delecja genu przez mutagenezę wymiany alleli w kasecie floksowanej w Chlamydia trachomatis

6.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60848

⸱

30 stycznia 2020

 , 
1Department of Microbiology, Immunology, and Molecular Genetics, University of Kentucky

W tym artykule

Podsumowanie

Opisana tutaj jest metoda celowanej, bezznacznikowej delecji genu w Chlamydia trachomatis przy użyciu mutagenezy wymiany alleli w kasecie floksowanej, FLAEM.

Streszczenie

Chlamydia trachomatis jest obligatoryjnym patogenem wewnątrzkomórkowym, który historycznie był trudny do genetycznego manipulowania. Zdecydowany postęp w wyjaśnianiu mechanizmów, które C. trachomatis wykorzystuje do tworzenia i utrzymywania uprzywilejowanej niszy wewnątrzkomórkowej, był ograniczony z powodu braku narzędzi genetycznych. Na szczęście w ostatnim czasie pojawiło się kilka nowych postępów w technikach manipulacji genetycznej. Jednym z nich jest rozwój mutagenezy allelowej wymiany zgłaszanej przez fluorescencję (FRAEM). Metoda ta umożliwia celowaną delecję genu w połączeniu z insercją kasety selekcyjnej kodującej oporność na antybiotyki i białko zielonej fluorescencji (GFP). Poleganie na tej strategii może być skomplikowane w przypadku celowania w geny w operonach policistronicznych ze względu na potencjał efektów biegunowych na geny niższego szczebla. Mutageneza allelicznego wymiennika kasetowego z klapkami (FLAEM), której protokół opisano tutaj, została opracowana w celu złagodzenia efektów biegunowych wywołanych przez kasetę. FLAEM wykorzystuje edycję genomu Cre-loxP do usunięcia kasety selekcyjnej po docelowej delecji przez wymianę alleli. Otrzymane szczepy zawierają bezmarkerowe delecje genów jednej lub więcej sekwencji kodujących. Technika ta ułatwia bezpośrednią ocenę funkcji genów i rozszerza repertuar narzędzi do manipulacji genetycznej u C. trachomatis.

Wprowadzenie

Chlamydia trachomatis jest główną przyczyną bakteryjnych chorób przenoszonych drogą płciową i stanowi znaczące obciążenie dla zdrowia ludzkiego. Każdego roku ponad 100 milionów ludzi zaraża się C. trachomatis1. Około 70% zakażeń u kobiet przebiega bezobjawowo pomimo szkodliwych skutków dla zdrowia reprodukcyjnego, takich jak zapalenie miednicy, ciąża pozamaciczna i/lub niepłodność. Następstwa choroby są bezpośrednio związane z immunopatologią zainicjowaną przez zakażenie C. trachomatis2. Skuteczna szczepionka nie została jeszcze opracowana; Dlatego zrozumienie funkcji bakteryjnych czynników wirulencji i innych produktów genów bakteryjnych jest ważnym i pilnym pytaniem badawczym.

Jako bakterie wewnątrzkomórkowe, inwazja komórek gospodarza, replikacja wewnątrzkomórkowa, uwalnianie potomstwa i unikanie odpowiedzi immunologicznych gospodarza są krytycznymi procesami. C. trachomatis tworzy wakuolę związaną z błoną przyzytoforyczną, zwaną inkluzją, do rozwoju wewnątrzkomórkowego. Ustanowienie inkluzji i wiele innych krytycznych procesów osiąga się poprzez wydzielanie białek efektorowych za pośrednictwem systemu sekrecji typu III (T3SS)3. Wyjaśnienie funkcji tych wydzielanych efektorów było ograniczone przez wiele lat ze względu na genetyczną nieuleczalność C. trachomatis. W przeciwieństwie do E. coli, wiele klasycznych technik klonowania nie ma zastosowania do Chlamydii. Kilka głównych ograniczeń dotyczy wydajności transformacji, braku reporterów kontrselekcji, takich jak sacB, i konserwacji plazmidu. Podczas gdy plazmidy E. coli mogą być na ogół utrzymywane w nieskończoność z początkiem replikacji i odpowiednim ciśnieniem selekcyjnym, plazmidy C. trachomatis wymagają dodatkowych ośmiu otwartych ramek odczytu (pgp1-8) do utrzymania, które znajdują się na natywnym plazmidzie pL2 w serovar4.

W ostatnich latach powstało wiele narzędzi genetycznych, które uwzględniają unikalną biologię Chlamydii, jednak nadal istnieją ograniczenia5,6,7. Mutageneza chemiczna przez leczenie metanosulfonianem etylu (EMS) może wprowadzać mutacje typu missense lub (rzadziej) może powodować przejścia nukleotydowe wprowadzające przedwczesny kodon stop, co daje mutację nonsensowną8. Insercja transpozonów jest skuteczna w przypadku rozerwania genów, ale obecna technologia w badaniach nad Chlamydią jest pracochłonna i czasochłonna9. Zarówno leczenie EMS, jak i techniki mutagenezy transpozonów generują losowe mutacje i wymagają rygorystycznych metod przesiewowych w celu wyizolowania zmutowanych szczepów. Metoda rozbijania genów poprzez insercję intronów grupy II (np. TargeTron) pozwala na ukierunkowaną mutagenezę; Jednak ta metoda jest ograniczona wydajnością, a miejsce wstawienia nie zawsze jest prawidłowo przewidziane10.

Mutageneza wymiany allelicznej zgłaszana przez fluorescencję (FRAEM) to strategia stosowana do celowanej delecji genów w połączeniu z wstawieniem kasety selekcyjnej zapewniającej oporność na antybiotyki i reportera fluorescencji11. Projekt FRAEM komplikuje jednak potencjalny wpływ biegunowy indukowany kasetą na geny znajdujące się w dalszych etapach łańcucha dostaw, zwłaszcza w przypadku celowania w geny w operonach policistronicznych. Mutageneza wymiany alleli w kasecie floksowanej (FLAEM) to nowatorskie podejście genetyczne opracowane w celu złagodzenia efektów biegunowych wywołanych przez kasetę, które wcześniej obserwowano w przypadku selekcji FRAEM cassette12. FLAEM wykorzystuje edycję genomu Cre-loxP w celu usunięcia kasety selekcyjnej i przywrócenia ekspresji dalszych genów. Kaseta selekcyjna zawierająca oporność na antybiotyki i białko zielonej fluorescencji (GFP) została przeprojektowana z flankującymi miejscami loxP. Te miejsca loxP mogą rekombinować w obecności rekombinazy Cre i powodować wycięcie kasety z genomu13. Wykazano, że ta strategia łagodzi efekty biegunowe wywołane kasetą, gdy celuje w tmeA do usunięcia12,14.

Obie metody FRAEM i FLAEM wykorzystują ten sam wektor samobójczy, pSUmC 4.0, który może być warunkowo podtrzymywany poprzez indukowaną ekspresję pgp6. Wcześniej wykazano, że ekspresja pgp6 jest niezbędna do retencji plazmidu i dlatego jest wykorzystywana do kontrolowania konserwacji plazmidu11,15. Gdy C. trachomatis jest hodowany w pożywkach uzupełnionych bezwodną tetracykliną (aTc) w celu wywołania ekspresji pgp6, wektor jest utrzymywany. W przypadku braku aTc wektor jest tracony. Celowa delecja genu osiąga się poprzez alleliczną wymianę genu na kasetę selekcyjną. Regiony 3 kb bezpośrednio przed i za docelowym genem służą jako ramiona homologii do rekombinacji. Ramiona te są klonowane do wektora pSUmC 4.0 otaczającego kasetę wyboru. Udane zdarzenia transformacji i rekombinacji C. trachomatis obserwuje się poprzez raportowanie fluorescencji. Ekspresja mCherry na szkielecie wektora i gfp w kasecie selekcyjnej daje czerwone i zielone inkluzje fluorescencyjne. Po usunięciu aTc z pożywki hodowlanej, inkluzje tylko zielone wskazują na udane zdarzenia rekombinacji z utratą wektora samobójczego i integracją kasety selekcyjnej z genomem bakteryjnym.

FLAEM reprezentuje rozszerzenie FRAEM poprzez późniejszą transformację wektora wyrażającego rekombinazę Cre, pSU-Cre, w nowo utworzony zmutowany szczep. Rekombinaza Cre ułatwia rekombinację między miejscami loxP i wycięcie kasety selekcyjnej. Zdarzenia rekombinacji są sygnalizowane za pomocą raportowania fluorescencji. Wektor pSU-Cre koduje mCherry; Tak więc udana transformacja jest wskazywana przez dodanie czerwonej fluorescencji do inkluzji wyrażających GFP. Uprawa przy braku nacisku selekcyjnego na kasetę powoduje rekombinację za pośrednictwem Cre w miejscach loxP, a utrata kasety jest sygnalizowana przez inkluzje tylko w kolorze czerwonym. Podobnie jak w przypadku pSUmC-4.0, indukowana ekspresja pgp6 jest wykorzystywana do warunkowego utrzymania pSU-Cre. Po usunięciu aTc i selekcji antybiotyków, plazmid jest utwardzany, a powstały szczep delecji bez markerów jest niefluorescencyjny. Metoda ta rozwiązuje problem efektów biegunowych wywołanych przez kasetę.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Projektowanie i montaż pSUmC-4.0 z ramionami homologicznymi specyficznymi dla interesującego genu

  1. Zidentyfikuj regiony ~ 3 kb bezpośrednio przed i za genem docelowym do delecji, aby służyć jako ramiona homologii 5' i 3' dla rekombinacji homologicznej (Rysunek 1).
  2. Zaprojektuj startery PCR, aby 1) amplifikować ramię homologii 3 kb 5' z genomowego DNA chlamydii i 2) zawierać zwis 15-30 pz specyficzny dla pSUmC-4.0 po strawieniu w miejscu enzymu restrykcyjnego Salla. Upewnij się, że obszary podkładu nakładające się na pSUmC-4.0 mają temperaturę topnienia 55 °C, a temperatury topnienia spinki do włosów dla całego podkładu wynoszą <35 °C.
  3. Zaprojektuj startery PCR, aby 1) amplifikować ramię homologii 3' o wielkości 3 kb z genomowego DNA chlamydii i 2) zawierać zwis 15-30 pz specyficzny dla pSUmC-4.0 po strawieniu w miejscu enzymu restrykcyjnego SbfI. Upewnij się, że obszary podkładu nakładające się na pSUmC-4.0 mają temperaturę topnienia 55 °C, a temperatury topnienia spinki do włosów dla całego podkładu wynoszą <35 °C.
  4. Zaprojektuj startery przesiewowe PCR, które wzmocnią insercję każdego ramienia homologicznego do wektora pSUmC-4.0 po reakcji składania DNA16. Zaprojektuj te startery tak, aby wyżarzały ~ 500 pz poza miejscami ograniczenia, aby umożliwić łatwą wizualizację produktu PCR, nawet jeśli wprowadzenie nie powiodło się (Rysunek 1).
  5. Amplifikować ramiona homologii 3 kb 5' i 3' ze świeżo wyekstrahowanego genomowego DNA chlamydiowego metodą PCR w jednej lub dwóch reakcjach, aby uzyskać wystarczającą ilość fragmentu do późniejszego złożenia DNA. Postępuj zgodnie z protokołem producenta polimerazy DNA, aby uzyskać określone warunki konfiguracji reakcji i cyklu.
  6. Sprawdź, czy oba produkty PCR mają odpowiednią wielkość i czy reakcje nie zawierają żadnych zanieczyszczających prążków. Przeprowadź 5 μl każdej reakcji PCR na 1% żelu agarozowym DNA.
  7. Oczyścić i zagęścić fragmenty PCR przez ekstrakcję fenolem/chloroformem i wytrącanie etanolu.
    1. Zebrać wszystkie 3' reakcje PCR razem w probówce o pojemności 1,5 ml i doprowadzić do końcowej objętości 200 μl za pomocą H2O bez nukleaz. Powtórz ten proces dla reakcji 5' PCR.
    2. Dodaj 200 μl fenolu do każdej probówki i wiruj przez 30–60 s. Wiruj każdą probówkę w mikrowirówce przy >21 000 x g przez 20 minut w temperaturze pokojowej (RT).
    3. Przenieś górną warstwę fazy wodnej każdej probówki do nowej probówki o pojemności 1,5 ml, dodaj jedną dziesiątą objętości 3 M octanu sodu do każdej probówki, a następnie przesuń, aby wymieszać.
    4. Dodaj 3 objętości 100% etanolu do każdej probówki i przesuń, aby wymieszać. Inkubować obie probówki w temperaturze -80 °C przez 20 minut.
    5. Osadzać DNA, obracając każdą probówkę w temperaturze >21 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Wyrzucić supernatant.
    6. Przemyć osad DNA 100 μl 70 % etanolu. Wirować każdą probówkę w temperaturze >21 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant.
    7. Ponownie przemyć osad DNA 100 μl 100% etanolu. Wirować każdą probówkę w temperaturze >21 000 przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant.
    8. Pozostaw osad do całkowitego wyschnięcia na powietrzu, a następnie delikatnie zawieś DNA w 12 μl H2O bez nukleaz, przesuwając w celu wymieszania.
  8. Wytrawić 500 ng wektora pSUmC-4,0 w reakcji 20 μl z 1 jednostką Sall i 1 jednostką SbfI zgodnie z protokołem producenta. Inkubować reakcję przez około 3 godziny lub przez noc, aby zapewnić całkowite trawienie wektora.
  9. Oczyść i zagęścić strawiony szkielet przez ekstrakcję fenolem/chloroformem i wytrącanie etanolu, jak opisano wcześniej (etap 1.7.1–1.7.9).
  10. Połącz strawiony wektor pSUmC-4.0 i produkty PCR ramienia homologii 5' i 3' w stosunku 0,01 pmol pSUmC-4,0 do 0,09 pmol każde ramię homologii. Złóż fragmenty w reakcji składania DNA zgodnie z protokołem producenta.
  11. Przekształć 50 μl elektrokompetentnych bakterii E. coli w 1 μl reakcji składania DNA. Przekształcić E. coli na płytkach agarowych LB zawierających 100 μg/ml spektynomycyny, rozprowadzając 150 μl na płytkę. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez noc.
  12. Następnego dnia przebadaj kolonie pod kątem zielonej i czerwonej fluorescencji za pomocą odwróconego mikroskopu epifluorescencyjnego. Oczekuje się, że na jedną płytkę agarową przypadnie łącznie 5–30 kolonii.
  13. Wybierz 5-10 kolonii, aby zaszczepić 4 ml bulionu LB uzupełnionego 100 μg/ml spektynomycyny. Inkubować kultury w temperaturze 37 °C przez noc, wytrząsając przy 250 obr./min.
  14. Korzystając z nocnych kultur E. coli, przeprowadź oczyszczanie DNA na małą skalę. Eluować DNA za pomocą 50 μlH2Owolnego od nukleaz.
  15. Potwierdź wstawienie każdego ramienia homologicznego do wektora pSUmC-4.0 za pomocą starterów przesiewowych PCR (zaprojektowanych w kroku 1.4) w celu amplifikacji każdej insercji. Jeśli składanie DNA zakończy się pomyślnie, należy zaobserwować produkt PCR o wielkości ~4 kb w 1% żelu agarozowym DNA zarówno dla regionów ramienia 5', jak i 3'. Produkt PCR o objętości ~1 kb wskazuje na brak insercji.
    UWAGA: Jeśli wstawienie ramion homologii nie powiedzie się w reakcji składania podwójnych fragmentów, wykonaj dwie reakcje montażu, aby indywidualnie wstawić ramię 5', a następnie ramię 3'. Przetraw wektor za pomocą samego Salla przed złożeniem za pomocą ramienia 5', a następnie przetraw wektor za pomocą SbfI, aby złożyć ramię 3'.
  16. Przekształć E. coli kompetentną przez zaporę / dcm z 200 ng pSUmc-4.0 połączonym z obydwoma ramionami homologicznymi. Utrzyj przekształcone bakterie na płytkach agarowych LB zawierających 100 μg/ml spektynomycyny, rozprowadzając 25 μl na płytkę. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez noc. Spodziewanych jest łącznie 20–200 kolonii.
  17. Przesiać płytki pod kątem kolonii czerwonej i zielonej fluorescencji, jak opisano w kroku 1.13.
  18. Stwórz kulturę do oczyszczania DNA na dużą skalę, zaszczepiając 100 ml bulionu LB zawierającego 100 μg/ml spektynomycyny czerwonymi i zielonymi koloniami. Inkubować kulturę w temperaturze 37 °C przez noc, wytrząsając przy 250 obr./min.
  19. Zbierz kulturę i oczyść DNA za pomocą oczyszczania DNA na dużą skalę.
    1. Ponownie zawiesić oczyszczony plazmidowy DNA w 100 μl NF-H2O. Całkowita wydajność DNA wynosząca co najmniej 2 μg/μl jest idealna do transformacji C. trachomatis.
    2. Zsekwencjonuj regiony ramienia homologii 5' i 3', aby zapewnić prawidłowe złożenie w pSUmC-4.0 przed przekształceniem C. trachomatis.

2. Transformacja C. trachomatis za pomocą pSUmC 4.0 + Homology Arms for Gene Deletion przez wymianę alleliczną

  1. Nasiona komórek McCoya, mysich fibroblastów standardowo używanych do hodowli Chlamydii, na dwie 6-dołkowe płytki (1 x 106 komórek / dołek) z pożywką wzrostową #1. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C z 5% CO2 aż do zlewania się monowarstwy (około 24 godziny).
  2. W probówce o pojemności 1,5 ml dodaj objętość serowarów L2 (EB) C. trachomatis WT serowarów L2, która jest wystarczająca do zakażenia 12 dołków płytki 6-dołkowej przy MOI wynoszącym 2. Granulować EB w ilości >20 000 x g przez 30 minut, a następnie wyrzucić supernatant.
  3. Zainicjuj transformację chlamydiową, delikatnie zawieszając EB w 600 μl buforu CaCl2, a następnie dodaj 24 μg ramion homologii pSUmC-4.0 + do probówki. Delikatnie wymieszaj roztwór, trzepając. Inkubować probówkę w temperaturze RT przez 30 minut i mieszać co 10 minut.
  4. Dodaj roztwór transformacyjny do 24 ml zbilansowanego roztworu soli Hanksa (HBSS) i wymieszaj, delikatnie pipetując. Przenieść 2 ml inokulum do każdej studzienki z przenikającymi się komórkami McCoya w 6 dołkach i zainfekować przez odwirowanie przy 900 x g przez 1 godzinę w temperaturze 20 °C.
  5. Usuń inokulum i zastąp go 2 ml / studzienkę pożywką wzrostową RPMI #2. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
  6. Po minimum 7 godzinach, ale nie więcej niż 12 godzinach, zastąp pożywkę 2 ml / studzienkę pożywki selekcyjnej #1. Kontynuować inkubację w temperaturze 37 °C przez 48 godzin od momentu zakażenia.
  7. Zbierz i przenieś bakterie na świeżą monowarstwę komórek McCoya.
    1. Za pomocą skrobaka do komórek delikatnie zeskrob monowarstwę McCoya, aby podnieść komórki do podłoża. Przenieść materiał z każdej studzienki do probówki o pojemności 2 ml. Osadzać materiał komórkowy w temperaturze >20 000 x g w mikrowirówce przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
    2. Usunąć i wyrzucić sklarowany osad. Zawiesić osad komórkowy w 1 ml HBSS, delikatnie pipetując.
    3. Osadzać resztki komórek w odległości 200 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Przenieść supernatant do świeżej studzienki z przenikającymi się komórkami McCoya. Dodaj dodatkowy 1 ml HBSS do każdej studzienki, aby uzyskać całkowitą objętość 2 ml / studzienkę.
    4. Zakażenie przeprowadzić przez odwirowanie w temperaturze 900 x g przez 1 godzinę w temperaturze 20 °C. Natychmiast po zakażeniu zastąpić inokulum pożywką selekcyjną #1.
  8. Kontynuuj przenoszenie bakterii na świeżą monowarstwę komórek McCoya (sekcja 2.7) co 48 godzin przez trzy lub więcej pasaży, aż do wykrycia czerwonych i zielonych wtrąceń za pomocą odwróconego mikroskopu epifluorescencyjnego 24 godziny po zakażeniu (24 hpi).
  9. Po wykryciu czerwonych i zielonych inkluzji kontynuuj przechodzenie przez monowarstwę (sekcja 2.7) za pomocą pożywki selekcyjnej #2.
  10. Kontynuuj przechodzenie przez monowarstwę, aż zostaną wykryte inkluzje tylko zielone 24 hpi (przejście #3 lub późniejsze), co wskazuje na utratę wektora pSUmC-4.0 i włączenie kasety selekcyjnej loxP do genomu.
  11. Wybierz jedną studzienkę z inkluzjami tylko zielonymi, aby wzbogacić ją przez pasażowanie. Zbierz i zamroź wszelkie inne studnie, które również zawierają tylko zielone inkluzje w buforze sacharozowo-fosforanowo-glutaminianu (SPG).
    1. Aby wzbogacić inkluzje zawierające tylko zieleń, należy przepuścić monowarstwę z jednego dołka płytki 6-dołkowej, jak to zrobiono w kroku 2.7, ale po osadzeniu resztek komórek (krok 2.7.3), przenieść supernatant do stożka z 12 ml HBSS. Użyj tego inokulum, aby zainfekować dwie płytki 6-dołkowe, dodając 2 ml na studzienkę, a następnie wirować płytki przy 900 x g przez 60 minut w temperaturze 20 °C.
    2. Aby zamrozić dodatkowe studzienki, zbierz monowarstwę jak w kroku 2.7.1, ale ponownie zawieś granulki w 1 ml SPG zamiast HBSS. Osadzać resztki komórek (krok 2.7.3) i przenieść supernatant do krioprobówki o pojemności 1,5 ml. Zamrażać materiał w temperaturze -80 °C.
  12. Po wzbogaceniu inkluzji tylko zielonych do MOI 0,5–1,0 (jeszcze jedno do dwóch przejść po wykryciu), zbierz monowarstwy do SPG, jak opisano w kroku 2.11.2. Otrzymać podwielokrotności 50 μl w probówkach o pojemności 1,5 ml i zamrozić w temperaturze -80 °C.
  13. Miano bakterii tylko zielonych do określenia inkluzji, tworząc jednostki/μl, zgodnie ze standardowym protokołem miareczkowania17.

3. Izolacja klonalna C. trachomatis Mutant delecji tylko w kolorze zielonym zawierający kasetę selekcyjną z bokami loxP poprzez ograniczenie rozcieńczenia

  1. Wysiewaj 384-dołkową płytkę do hodowli tkankowej z 50 μl komórek McCoya w ~ 2,000 komórek / dołku w pożywce wzrostowej #1. Inkubować w temperaturze 37 °C z 5 % CO2 przez ~24 godziny lub do momentu zlewu.
  2. Rozcieńczyć podwielokrotność bakterii zawierających tylko zielone składniki w HBSS, aby uzyskać ~50 EB na 20 ml. Przenieść rozcieńczone inokulum do tacki zbiornika.
    1. Wyjmij pożywkę z płytki 384-dołkowej, mocno przesuwając całą płytkę do góry nogami do pojemnika na odpady. Za pomocą pipety wielokanałowej dodać 50 μl inokulum C. trachomatis do każdej studzienki. Zakażenie przeprowadzić przez odwirowanie w temperaturze 900 x g przez 1 godzinę w temperaturze 20 °C.
      UWAGA: Uważaj, aby nie trzepać tak mocno, że monowarstwa się odczepi. Jeśli komórki są nadmiernie zlewające się, łatwiej się odłączają.
  3. Usunąć inokulum przez strzepnięcie i zastąpić 50 μl / studzienką pożywką wzrostową #2. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C z 5% CO2,
    UWAGA: Na tym etapie integracja kasety selekcyjnej z genomem jest stabilna, więc selekcja antybiotyków za pomocą spektynomycyny nie jest już wymagana.
  4. Po inkubacji płytki przez 5–12 dni zidentyfikuj poszczególne studzienki z zielonymi inkluzjami fluorescencyjnymi za pomocą odwróconego mikroskopu epifluorescencyjnego lub platformy przesiewowej o wysokiej zawartości.
  5. Zbieraj studnie z wtrąceniami tylko zielonymi, zeskrobując monowarstwę końcówką p-10 i przenosząc całą zawartość studzienki do probówki zawierającej 2 ml HBSS. Delikatnie wymieszaj i nałóż 2 ml inokulum na świeżą, zlewającą się monowarstwę McCoya w 6-dołkowej płytce do infekcji.
    UWAGA: Podczas identyfikowania poszczególnych studzienek z inkluzjami, inkluzje będą znajdować się w klastrze ze względu na ekspansję od początkowego włączenia. Jeśli studnia ma wiele klastrów, jest prawdopodobne, że więcej niż jeden EB początkowo zainfekował tę studnię. Studzienki te nie powinny być zbierane, a w niektórych przypadkach może być konieczne wielokrotne przeprowadzanie izolacji klonalnej przez seryjne rozcieńczanie.
  6. Zainfekować 6-dołkową płytkę przez odwirowanie przy 900 x g przez 1 godzinę w temperaturze 20 °C. Zastąp inokulum 2 ml / studzienkową pożywką wzrostową #2. Inkubować w temperaturze 37 °C z 5 % CO2 przez 48 godzin.
  7. Powtórz kroki 2.11–2.13, aby wzbogacić, zamrozić i mianować populacje klonów.
  8. Potwierdź delecję docelowych genów z klonalnie izolowanego C. trachomatis za pomocą qPCR, jak opisano wcześniej12.

4. Transformacja C. trachomatis FRAEM Mutant z pSU-Cre w celu zainicjowania usuwania kasety selekcyjnej z boków loxP

  1. Powtórz proces transformacji na płytce 6-dołkowej, jak opisano wcześniej (kroki 2.1–2.8) przy użyciu klonalnie izolowanego mutanta C. trachomatis FRAEM, wektora pSU-Cre i pożywki selekcyjnej #3.
    UWAGA: Na udaną transformację wskazują inkluzje, które są czerwoną i zieloną fluorescencyjną.
    1. Przejść przez monowarstwę, aż zostaną wykryte inkluzje tylko na czerwono za pomocą odwróconego mikroskopu epifluorescencyjnego, co wskazuje na utratę kasety selekcyjnej (dwa do trzech pasaży). Kontynuuj przechodzenie monowarstwy, aż wtrącenia tylko czerwone zostaną wzbogacone do MOI ~0,5.
  2. Klonalnie wyizoluj inkluzje tylko w kolorze czerwonym, ograniczając rozcieńczenie w płytce 384-dołkowej, jak opisano wcześniej (kroki 3.1–3.8); jednak użyj pożywki selekcyjnej #3 dla wszystkich kroków.
  3. Wzbogać populacje klonów przez pasażowanie do MOI 0,1. Po wzbogaceniu zastąp pożywkę sekcyjną pożywką wzrostową #2, aby zainicjować utratę wektora pSU-Cre (około trzech do czterech pasaży).
  4. Klonalnie wyizoluj bakterie niefluorescencyjne (kroki 3.1–3.8); jednak ręcznie zeskanuj płytkę za pomocą mikroskopu jasnego pola, aby wykryć inkluzje. Wzbogać i zamrozić bakterie (krok 2.11–2.12).
  5. Badanie przesiewowe zmutowanego szczepu za pomocą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym, Western blotting i sekwencjonowania DNA całego genomu, jak opisano wcześniej12.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Metoda bezmarkerowej delecji genów w C. trachomatis przy użyciu FLAEM opiera się na starannych technikach klonowania i transformacji. Pomyślna rekombinacja alleliczna jest kluczowym pierwszym krokiem i wymaga identyfikacji oraz insercji ramion homologii do wektora klonującego pSUmC-4.0 (Rycina 1). Niezbędnym drugim krokiem w procesie bezmarkerowej delecji genu jest usunięcie reportera fluorescencyjnego i kasety selekcji antybiotykowej za pomocą edycji genomu Cre-lox, przedstawionej ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisany tutaj protokół generowania bezmarkerowych delecji genów u C. trachomatis za pomocą FLAEM umożliwia celowaną delecję nieistotnych genów i eliminuje efekty biegunowe wywołane przez kasetę. Protokół opiera się na starannym zaprojektowaniu ramion homologii 5' i 3' wprowadzonych do wektora samobójczego pSUmC 4.0, skutecznej transformacji C. trachomatis i starannym badaniu przesiewowym izolowanych zmutowanych szczepów. Skuteczna inżynieria genomu za pomocą tej metody skutkuje bakteriami, które nie są ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez granty Publicznej Służby Zdrowia z National Institute of Health, NIAID (granty A1065530 i Al124649), dla K.A. Fields.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AgarozaKSE ScientificBMK-A1705Biologia molekularna Klasa
Chlorowodorek anhydrotetracyklinyACROS Organics233131000
CaCl2 Bufor10 mM Tris pH 7,4, 50 mM Dwuwodny chlorek wapnia Dwuwodny
chlorek wapniaSigmaC7902-500GNadaje się do hodowli komórkowych
CykloheksymidSigma7698-1G
dam-/dcm- Kompetentny E. coliNew England BioLabsC2925H
DMSOATCC4-XSterylna przefiltrowana hodowla komórkowa testowana
Kwas glutaminowySigmaG8415-100GKwas L-glutaminowy
Pożywka wzrostowa #1Pożywka RPMI 1640 uzupełniona 10 % (obj./obj.) inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą (FBS).
Pożywka wzrostowa #2Pożywka RPMI 1640 uzupełniona 10% (obj./obj.) inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą (FBS) oraz 1 &mikro; g / ml cykloheksymidu
Zrównoważony roztwór soli Hanksa (HBSS) (1x)Gibco24020-117
Inaktywowana termicznie płodowa surowica bydlęca kwalifikowana jednorazowy strzał (FBS)GibcoA38402-02
McCoy CellsATCCCRL-1696
Zestaw miniprzygotowawczy Monarch PlasmidNew England BioLabsT1010SOczyszczanie
DNA na małą skalęNaH2PO4SigmaS3139-250GMonozasadowy fosforan sodu
Na2HPO4SigmaS5136-500GFosforan sodu dwuzasadowy
NEB 10-beta Elektrokompetentny E. coli KomórkiNew England BioLabsC3020K
NEBuilder HiFi Zestaw do klonowaniaDNA Nowy Anglia BioLabsE5520SZestaw montażowy Gibsona
Sól sodowa penicyliny GSigmaP3032-10MUBioodczynnik odpowiedni do hodowli komórkowych
QIAGEN Plasmid Maxi KitQIAGEN12162Oczyszczanie DNA na dużą skalę
Q5 Gorący start Polimeraza DNA o wysokiej wiernościNew England BioLabsM0515Fragment polimerazy PCR
RPMI 1640 Medium (1x)Gibco11875-093Zawierający 2mM L-glutamina
Sall-HFNew England BioLabsR3138S
Sbfl-HFNew England BioLabsR3642S
Selection Media #1RMPI 10 % FBS, 1 &mikro; g/ml cykloheksymidu, 500 i mikro; g/ml spektynomycyny i 50 ng/ml bezwodnej tetracykliny rozpuszczonej w DMSO
Selection Media #2RMPI 10 % FBS, 1 &mikro; g/ml cykloheksymidu, 500 i mikro; g/ml spektynomycyny
Pożywka selekcyjna #3RPMI 10 % FBS, 1 i mikro; g/ml cykloheksymidu, 50 ng/ml aTc oraz 0,6 &mikro; g / ml penicyliny
Roztwór buforowy octanu soduSigmaS7899-100ML3M
SOC Outgrowth MediumNew England BioLabsB9020SVIAL
Pentahydrat dichlorowodorku spektynomycyny, klasa hodowli komórkowejAlfa AesarJ61820
SacharozaSigmaS1888-1KGBioreagent odpowiedni do hodowli komórkowych
Bufor sacharozowo-fosforanowo-glutaminianu (SPG)37.5 g sacharozy, 1.25 g Na2HPO4, 0.18 g NaH2PO4, kwas glutaminowy 0.36 na 500 ml wody do hodowli tkankowych
TrisAMRESCO0497-5KGUltraczysta
trypsyna-EDTA (1x)Gibco25200-0560.25%
WodaSigmaW3500-500MLSterylnie filtrowany, BioReagent, Nadaje się do hodowli komórkowych

Bibliografia

  1. World Health Organization. Global Incidence and Prevalence of Selected Curable Sexually Transmitted Infections: 2008: World Health Organization. Sexual and Reproductive Health Matters. 20, World Health Organization. World Health Organization, Department of Reproductive Health and Research, 2012 ISBN 978 92 4 1503839 207-208 (2012).
  2. Stephen, R. S. The Cellular Paradigm of Chlamydial Pathogenesis. Trends in Microbiology. 11, 44-51 (2003).
  3. Mueller, K. E., Plano, G. V., Fields, K. A. New Frontiers in Type III Secretion Biology: the Chlamydia Perspective. Infection and Immunity. 82, 2-9 (2014).
  4. Seth-Smith, H. M. B., et al. Co-evolution of genomes and plasmids within Chlamydia trachomatis and the emergence in Sweden of a new variant strain. BMC Genomics. 10, 239(2009).
  5. Brothwell, J. A., Muramatsu, M. K., Zhong, G., Nelson, D. E. Advances and obstacles in genetic dissection of chlamydial virulence. Current Topics in Microbiology and Immunology. 412, 133-158 (2018).
  6. McClure, E. E., et al. Engineering of obligate Intracellular bacteria: progress, challenges and paradigms. Nature Reviews Microbiology. 15, 544-558 (2017).
  7. Rahnama, M., Fields, K. A. Transformation of Chlamydia: current approaches and impact on our understanding of chlamydial infection biology. Microbes and Infection. 20 (7-8), 445-450 (2018).
  8. Kari, L., et al. Generation of targeted Chlamydia trachomatis null mutants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 7189-7193 (2011).
  9. LaBrie, S. D., et al. Transposon Mutagenesis in Chlmaydia trachomatis Identifies CT339 as a ComEC Homolog Important for DNA Uptake and Later Gene Transfer. mBio. 10 (4), 01343(2019).
  10. Johnson, C. M., Fisher, D. J. Site-specific, insertional inactivation of incA in Chlamydia trachomatis using a group II intron. PLoS One. 8, 83989(2013).
  11. Mueller, K. E., Wolf, K., Fields, K. A. Gene Deletion by Fluorescence-Reported Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis. mBio. 7, 01817(2016).
  12. Keb, G., Hayman, R., Fields, K. A. Floxed cassette Allelic Exchange Mutagenesis Enables Markerless Gene Deletion in Chlamydia trachomatis and can Reverse Cassette-Induced Polar Effects. Journal of Bacteriology. 200, 00479(2018).
  13. Yarmolinsky, M., Hoess, R. THe legacy of Nat Sternberg: the genesis of Cre-lox technology. Annual Review of Virology. 2, 25-40 (2015).
  14. McKuen, M. J., Mueller, K. E., Bae, Y. S., Fields, K. A. Fluorescence-Reported Allelic Exchange Mutagenesis Reveals a Role for Chlamydia trachomatis TmeA in Invasion that is Independent of Host AHNAK. Infection and Immunity. 85 (12), 00640(2017).
  15. Song, L., et al. Chlamydia trachomatis Plasmid-Encoded Pgp4 is a Transcriptional Regulator of Virulence-Associated Genes. Infection and Immunity. 81 (3), 636-644 (2013).
  16. Silayeva, O., Barnes, A. C. Gibson Assembly facilitates bacterial allelic exchange mutagenesis. Journal of Microbiological Methods. 144, 157-163 (2017).
  17. Hackstadt, T., Scidmore, M., Rockey, D. Lipid Metabolism in Chlamydia trachomatis-Infected Cells: Directed Trafficking of Golgi-Derived Sphingolipids to the Chlamydial Inclusion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (11), 4877-4881 (1995).
  18. Jeffrey, B. M., Suchland, R. J., Eriksen, S. G., Sandoz, K. M., Rockey, D. D. Genomic and phenotypic characterization of in vitro-generated Chlamydia trachomatis recombinants. BMC Microbiology. 13, 142(2013).
  19. Suchland, R. J., Bourillon, A., Denamur, E., Stamm, W. E., Rothstein, D. M. Rifampin-resistant RNA polymerase mutants of Chlamydia trachomatis remain susceptible to the ansamycin rifalazil. Antimicrobial Agents Chemotherapy. 49, 1120-1126 (2005).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Edycja genomu Cre-loxPrekombinacja homologicznaskładanie DNAmikroskopia epifluorescencyjnailościowy PCRWestern blottingsekwencjonowanie całego genomu
Bezmarkerowa delecja genu przez mutagenezę wymiany alleli w kasecie floksowanej w Chlamydia trachomatis
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.