Opisana tutaj jest metoda celowanej, bezznacznikowej delecji genu w Chlamydia trachomatis przy użyciu mutagenezy wymiany alleli w kasecie floksowanej, FLAEM.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Bezmarkerowa delecja genu przez mutagenezę wymiany alleli w kasecie floksowanej w Chlamydia trachomatis
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Chlamydia trachomatis jest obligatoryjnym patogenem wewnątrzkomórkowym, który historycznie był trudny do genetycznego manipulowania. Zdecydowany postęp w wyjaśnianiu mechanizmów, które C. trachomatis wykorzystuje do tworzenia i utrzymywania uprzywilejowanej niszy wewnątrzkomórkowej, był ograniczony z powodu braku narzędzi genetycznych. Na szczęście w ostatnim czasie pojawiło się kilka nowych postępów w technikach manipulacji genetycznej. Jednym z nich jest rozwój mutagenezy allelowej wymiany zgłaszanej przez fluorescencję (FRAEM). Metoda ta umożliwia celowaną delecję genu w połączeniu z insercją kasety selekcyjnej kodującej oporność na antybiotyki i białko zielonej fluorescencji (GFP). Poleganie na tej strategii może być skomplikowane w przypadku celowania w geny w operonach policistronicznych ze względu na potencjał efektów biegunowych na geny niższego szczebla. Mutageneza allelicznego wymiennika kasetowego z klapkami (FLAEM), której protokół opisano tutaj, została opracowana w celu złagodzenia efektów biegunowych wywołanych przez kasetę. FLAEM wykorzystuje edycję genomu Cre-loxP do usunięcia kasety selekcyjnej po docelowej delecji przez wymianę alleli. Otrzymane szczepy zawierają bezmarkerowe delecje genów jednej lub więcej sekwencji kodujących. Technika ta ułatwia bezpośrednią ocenę funkcji genów i rozszerza repertuar narzędzi do manipulacji genetycznej u C. trachomatis.
Wprowadzenie
Chlamydia trachomatis jest główną przyczyną bakteryjnych chorób przenoszonych drogą płciową i stanowi znaczące obciążenie dla zdrowia ludzkiego. Każdego roku ponad 100 milionów ludzi zaraża się C. trachomatis1. Około 70% zakażeń u kobiet przebiega bezobjawowo pomimo szkodliwych skutków dla zdrowia reprodukcyjnego, takich jak zapalenie miednicy, ciąża pozamaciczna i/lub niepłodność. Następstwa choroby są bezpośrednio związane z immunopatologią zainicjowaną przez zakażenie C. trachomatis2. Skuteczna szczepionka nie została jeszcze opracowana; Dlatego zrozumienie funkcji bakteryjnych czynników wir....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Projektowanie i montaż pSUmC-4.0 z ramionami homologicznymi specyficznymi dla interesującego genu
- Zidentyfikuj regiony ~ 3 kb bezpośrednio przed i za genem docelowym do delecji, aby służyć jako ramiona homologii 5' i 3' dla rekombinacji homologicznej (Rysunek 1).
- Zaprojektuj startery PCR, aby 1) amplifikować ramię homologii 3 kb 5' z genomowego DNA chlamydii i 2) zawierać zwis 15-30 pz specyficzny dla pSUmC-4.0 po strawieniu w miejscu enzymu restrykcyjnego Salla. Upewnij się, że obszary podkładu nakładające się na pSUmC-4.0 mają temperaturę topnienia 55 °C, a temperatury topnienia spinki do włosów dla całego podk....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Metoda bezmarkerowej delecji genów w C. trachomatis przy użyciu FLAEM opiera się na starannych technikach klonowania i transformacji. Pomyślna rekombinacja alleliczna jest kluczowym pierwszym krokiem i wymaga identyfikacji oraz insercji ramion homologii do wektora klonującego pSUmC-4.0 (Rycina 1). Niezbędnym drugim krokiem w procesie bezmarkerowej delecji genu jest usunięcie reportera fluorescencyjnego i kasety selekcji antybiotykowej za pomocą edycji genomu Cre-lox, przedstawionej .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opisany tutaj protokół generowania bezmarkerowych delecji genów u C. trachomatis za pomocą FLAEM umożliwia celowaną delecję nieistotnych genów i eliminuje efekty biegunowe wywołane przez kasetę. Protokół opiera się na starannym zaprojektowaniu ramion homologii 5' i 3' wprowadzonych do wektora samobójczego pSUmC 4.0, skutecznej transformacji C. trachomatis i starannym badaniu przesiewowym izolowanych zmutowanych szczepów. Skuteczna inżynieria genomu za pomocą tej metody skutkuje bakteriami, które nie są .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez granty Publicznej Służby Zdrowia z National Institute of Health, NIAID (granty A1065530 i Al124649), dla K.A. Fields.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Agaroza | KSE Scientific | BMK-A1705 | Biologia molekularna Klasa |
| Chlorowodorek anhydrotetracykliny | ACROS Organics | 233131000 | |
| CaCl2 Bufor | 10 mM Tris pH 7,4, 50 mM Dwuwodny chlorek wapnia Dwuwodny | ||
| chlorek wapnia | Sigma | C7902-500G | Nadaje się do hodowli komórkowych |
| Cykloheksymid | Sigma | 7698-1G | |
| dam-/dcm- Kompetentny E. coli | New England BioLabs | C2925H | |
| DMSO | ATCC | 4-X | Sterylna przefiltrowana hodowla komórkowa testowana |
| Kwas glutaminowy | Sigma | G8415-100G | Kwas L-glutaminowy |
| Pożywka wzrostowa #1 | Pożywka RPMI 1640 uzupełniona 10 % (obj./obj.) inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą (FBS). | ||
| Pożywka wzrostowa #2 | Pożywka RPMI 1640 uzupełniona 10% (obj./obj.) inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą (FBS) oraz 1 &mikro; g / ml cykloheksymidu | ||
| Zrównoważony roztwór soli Hanksa (HBSS) (1x) | Gibco | 24020-117 | |
| Inaktywowana termicznie płodowa surowica bydlęca kwalifikowana jednorazowy strzał (FBS) | Gibco | A38402-02 | |
| McCoy Cells | ATCC | CRL-1696 | |
| Zestaw miniprzygotowawczy Monarch Plasmid | New England BioLabs | T1010S | Oczyszczanie |
| DNA na małą skalęNaH2PO4 | Sigma | S3139-250G | Monozasadowy fosforan sodu |
| Na2HPO4 | Sigma | S5136-500G | Fosforan sodu dwuzasadowy |
| NEB 10-beta Elektrokompetentny E. coli Komórki | New England BioLabs | C3020K | |
| NEBuilder HiFi Zestaw do klonowania | DNA Nowy Anglia BioLabs | E5520S | Zestaw montażowy Gibsona |
| Sól sodowa penicyliny G | Sigma | P3032-10MU | Bioodczynnik odpowiedni do hodowli komórkowych |
| QIAGEN Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12162 | Oczyszczanie DNA na dużą skalę |
| Q5 Gorący start Polimeraza DNA o wysokiej wierności | New England BioLabs | M0515 | Fragment polimerazy PCR |
| RPMI 1640 Medium (1x) | Gibco | 11875-093 | Zawierający 2mM L-glutamina |
| Sall-HF | New England BioLabs | R3138S | |
| Sbfl-HF | New England BioLabs | R3642S | |
| Selection Media #1 | RMPI 10 % FBS, 1 &mikro; g/ml cykloheksymidu, 500 i mikro; g/ml spektynomycyny i 50 ng/ml bezwodnej tetracykliny rozpuszczonej w DMSO | ||
| Selection Media #2 | RMPI 10 % FBS, 1 &mikro; g/ml cykloheksymidu, 500 i mikro; g/ml spektynomycyny | ||
| Pożywka selekcyjna #3 | RPMI 10 % FBS, 1 i mikro; g/ml cykloheksymidu, 50 ng/ml aTc oraz 0,6 &mikro; g / ml penicyliny | ||
| Roztwór buforowy octanu sodu | Sigma | S7899-100ML | 3M |
| SOC Outgrowth Medium | New England BioLabs | B9020SVIAL | |
| Pentahydrat dichlorowodorku spektynomycyny, klasa hodowli komórkowej | Alfa Aesar | J61820 | |
| Sacharoza | Sigma | S1888-1KG | Bioreagent odpowiedni do hodowli komórkowych |
| Bufor sacharozowo-fosforanowo-glutaminianu (SPG) | 37.5 g sacharozy, 1.25 g Na2HPO4, 0.18 g NaH2PO4, kwas glutaminowy 0.36 na 500 ml wody do hodowli tkankowych | ||
| Tris | AMRESCO | 0497-5KG | Ultraczysta |
| trypsyna-EDTA (1x) | Gibco | 25200-056 | 0.25% |
| Woda | Sigma | W3500-500ML | Sterylnie filtrowany, BioReagent, Nadaje się do hodowli komórkowych |
Bibliografia
- World Health Organization. Global Incidence and Prevalence of Selected Curable Sexually Transmitted Infections: 2008: World Health Organization. Sexual and Reproductive Health Matters. 20, World Health Organization. World Health Organization, Department of Reproductive Health and Research, 2012 ISBN 978 92 4 1503839 207-208 (2012).
- Stephen, R. S.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
