Monitorowanie montażu eIF4F poprzez pomiar interakcji eIF4E-eIF4G w aktywnych komórkach

Yuri Frosi; Siti  Radhiah Ramlan; Christopher  J. Brown

doi:10.3791/60850

Method Article

Monitorowanie montażu eIF4F poprzez pomiar interakcji eIF4E-eIF4G w aktywnych komórkach

DOI:

10.3791/60850

⸱

May 1st, 2020

Yuri Frosi , Siti Radhiah Ramlan , Christopher J. Brown

¹p53 Laboratory, Neuros/Immunos, A*STAR (Agency for Science, Technology and Research)

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół do pomiaru interakcji eIF4E-eIF4G w żywych komórkach, który umożliwiłby użytkownikowi ocenę wywołanych przez lek zaburzeń dynamiki kompleksu eIF4F w formatach przesiewowych.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wykazano, że tworzenie kompleksu eIF4F jest kluczowym węzłem dla konwergencji szlaków sygnałowych, które często ulegają aktywacji onkogennej u ludzi. eIF4F to kompleks wiążący kapu, który bierze udział w fazie rekrutacji mRNA-rybosom podczas inicjacji translacji. W wielu komórkowych i przedklinicznych modelach nowotworów deregulacja eIF4F prowadzi do zwiększonej translacji określonych podzbiorów mRNA, które są zaangażowane w proliferację i przeżycie raka. eIF4F jest kompleksem heterotrimerycznym zbudowanym z podjednostki wiążącej czapeczkę eIF4E, helikazy eIF4A i podjednostki rusztowania eIF4G. Kluczowe znaczenie dla składania aktywnych kompleksów eIF4F ma interakcja białko-białko między białkami eIF4E i eIF4G. W tym artykule opisujemy protokół do pomiaru montażu eIF4F, który monitoruje stan interakcji eIF4E-eIF4G w aktywnych komórkach. Test interakcji białko-białko eIF4e:4G oparty na komórkach pozwala również na dokładną i wiarygodną ocenę zmian w integralności kompleksu eIF4F wywołanych przez leki. Przewidujemy, że metoda ta może być stosowana do weryfikacji aktywności dostępnych na rynku związków lub do dalszych badań przesiewowych nowych związków lub modalności, które skutecznie zakłócają powstawanie kompleksu eIF4F.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kontrola ekspresji genów odgrywa kluczową rolę w prawidłowym wykonywaniu programów komórkowych, takich jak wzrost, proliferacja i różnicowanie. Mechanizm kontroli regulacyjnej może być wywierany zarówno na poziomie transkrypcji genów, jak i na poziomie translacji mRNA. W ciągu ostatniej dekady stało się coraz bardziej oczywiste, że kontrola translacyjna poprzez modulację procesu inicjacji, a nie późniejsze etapy wydłużania i terminacji, może precyzyjnie regulować syntezę określonych podzbiorów białek, które odgrywają szeroki zakres funkcji biologicznych.

Zwiększona translacja mRNA zaangażowanych w przeżycie, reakcje antyautofagiczne i antya....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Linia komórkowa HEK293 została użyta do protokołu i została wyhodowana w zmodyfikowanym pożywce Eagle firmy Dulbecco uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą, 2 mM L-glutaminą i 100 U/ml penicyliny/streptomycyny. Komórki hodowano w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ w wilgotnym środowisku.

1. Ilościowa ocena rozerwania kompleksu eIF4F za pomocą testu komplementacji eIF4E:eIF4G^604-646

Hodowla komórkowa i transfekcja przejściowa testu komplementacji eIF4E:eIF4G^604-646
1. Do wszystkich eksperymentów używaj świeżo rozmrożonych komórek z mniej niż 20 pasażami. W dniu 1 określ liczbę komórek za pomo....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W celu sprawdzenia czułości systemu komplementacji eIF4E:eIF4G^604-646, za pomocą inhibitorów mTOR oceniono inhibicję składania kompleksu eIF4F za pośrednictwem 4EBP1. Hamując zależną od kinazy mTORC1 fosforylację rodziny białek 4EBP, hamowanie mTOR zwiększa asocjację 4EBP1 z eIF4E, a tym samym demontaż eIF4F¹⁵. Przetestowano dwie klasy mechanistycznie różnych inhibitorów kinaz mTOR: rapalogi (np. Rapamycyna), które są allosterycznymi inhibitorami mTORC1,.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metoda opisana w tym artykule wykorzystuje test komplementacji oparty na lucyferazy do ilościowego monitorowania składania kompleksu eIF4F poprzez bezpośredni pomiar interakcji eIF4G-eIF4E w żywych komórkach. Przedstawiliśmy szczegółowe informacje na temat stosowania systemu komplementacji eIF4E-eIF4G, a także wykazaliśmy, że system jest niezwykle dokładny w pomiarze indukowanej lekiem dysocjacji interakcji eIF4E-eIF4G za pośrednictwem 4EBP1¹⁶. Aby ułatwić przepustowość tego testu, konfiguracja ek.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez główny budżet z p53lab (BMSI, A*STAR) oraz grant VIP JCO (A*STAR).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number
Komórki 293FT	Thermo Fisher Scientific	R70007
Mikropłytka do hodowli komórkowych 96 dołków, F-Bottom	greiner bio-one	655083
Miano komórek Glo 2.0	PROMEGA	G9241
Envision Multilabel Reader	PerkinElmer	nie dotyczy
Pipety wielokanałowe Finnpipette F2 12-kanałowe 30-300 ml	Thermo Fisher Scientific	4662070
Pipety wielokanałowe Finnpipette F2 12-kanałowe 5-50 ml	Thermo Fisher Scientific	4662050
FUGENE6	PROMEGA	E2692
Lipofectamina 3000	Thermo Fisher Scientific	L3000015
NanoBiT PPI Starter Systems	PROMEGA	N2014
Optimem I Zredukowana surowica Mediun, bez czerwieni fenolowej	Thermo Fisher Scientific	11058021
Wytrząsarka orbitalna	Eppendorf	nie ma zastosowania
γ-Aminofenyl-m⁷GTP (C₁₀-spacer)-Agarose	Jena Bioscience	AC-155S

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Silvera, D., Formenti, S. C., Schneider, R. J. Translational control in cancer. Nature Reviews Cancer. 10 (4), 254-266 (2010).
Gebauer, F., Hentze, M. W. Molecular Mechanism of translational control. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 827-835 (2004).
Bhat, M., ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Monitorowanie montażu eIF4F poprzez pomiar interakcji eIF4E-eIF4G w aktywnych komórkach

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles