Tutaj prezentujemy protokół do pomiaru interakcji eIF4E-eIF4G w żywych komórkach, który umożliwiłby użytkownikowi ocenę wywołanych przez lek zaburzeń dynamiki kompleksu eIF4F w formatach przesiewowych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Monitorowanie montażu eIF4F poprzez pomiar interakcji eIF4E-eIF4G w aktywnych komórkach
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Wykazano, że tworzenie kompleksu eIF4F jest kluczowym węzłem dla konwergencji szlaków sygnałowych, które często ulegają aktywacji onkogennej u ludzi. eIF4F to kompleks wiążący kapu, który bierze udział w fazie rekrutacji mRNA-rybosom podczas inicjacji translacji. W wielu komórkowych i przedklinicznych modelach nowotworów deregulacja eIF4F prowadzi do zwiększonej translacji określonych podzbiorów mRNA, które są zaangażowane w proliferację i przeżycie raka. eIF4F jest kompleksem heterotrimerycznym zbudowanym z podjednostki wiążącej czapeczkę eIF4E, helikazy eIF4A i podjednostki rusztowania eIF4G. Kluczowe znaczenie dla składania aktywnych kompleksów eIF4F ma interakcja białko-białko między białkami eIF4E i eIF4G. W tym artykule opisujemy protokół do pomiaru montażu eIF4F, który monitoruje stan interakcji eIF4E-eIF4G w aktywnych komórkach. Test interakcji białko-białko eIF4e:4G oparty na komórkach pozwala również na dokładną i wiarygodną ocenę zmian w integralności kompleksu eIF4F wywołanych przez leki. Przewidujemy, że metoda ta może być stosowana do weryfikacji aktywności dostępnych na rynku związków lub do dalszych badań przesiewowych nowych związków lub modalności, które skutecznie zakłócają powstawanie kompleksu eIF4F.
Wprowadzenie
Kontrola ekspresji genów odgrywa kluczową rolę w prawidłowym wykonywaniu programów komórkowych, takich jak wzrost, proliferacja i różnicowanie. Mechanizm kontroli regulacyjnej może być wywierany zarówno na poziomie transkrypcji genów, jak i na poziomie translacji mRNA. W ciągu ostatniej dekady stało się coraz bardziej oczywiste, że kontrola translacyjna poprzez modulację procesu inicjacji, a nie późniejsze etapy wydłużania i terminacji, może precyzyjnie regulować syntezę określonych podzbiorów białek, które odgrywają szeroki zakres funkcji biologicznych.
Zwiększona translacja mRNA zaangażowanych w przeżycie, reakcje antyautofagiczne i antyapoptotyczne były związane z kilkoma nowotworami i były również przyczynowo związane z nieprawidłową aktywacją lub nadmierną ekspresją czynników inicjujących translację1.
Kompleks eIF4F jest głównym regulatorem inicjacji translacji. Wiążąc strukturę kapu na końcu 5' mRNA, eIF4F napędza początkową rekrutację mRNA-rybosom, a co za tym idzie, zwiększa wydajność translacji mRNA słabo translowanych eukariotycznych mRNAs2. Translacja mRNA związanych z rakiem za pośrednictwem eIF4F została zgłoszona w wielu modelach nowotworowych zawierających nieprawidłową aktywację szlaków RAS / MAPK lub AKT / TOR, co sugeruje, że komórki rakowe zwiększają eIF4F w celu zwiększenia własnej aktywności pronowotworowej. Przerwanie tej pętli sprzężenia zwrotnego poprzez zahamowanie tworzenia kompleksu eIF4F jest zatem bardzo obiecującą strategią terapeutyczną3,4.
Kompleks eIF4F składa się z (i) eIF4E, podjednostki wiążącej czapeczkę eIF4F, która oddziałuje ze strukturą kapu znajdującą się na 5' UTR mRNA, (ii) eIF4A, helikazy RNA i (iii) eIF4G, białka rusztowania, które oddziałuje zarówno z eIF4A, jak i eIF4E i które ostatecznie rekrutuje podjednostkę rybosomalną 40S5. Asocjacja eIF4G z eIF4E jest krokiem ograniczającym szybkość składania funkcjonalnych kompleksów eIF4F i jest ujemnie regulowana przez białka wiążące eIF4E (4EBP, elementy 1, 2 i 3))6. Konkurując z wiązaniem eIF4G z eIF4E za pośrednictwem interfejsu, który składa się z kanonicznych i niekanonicznych sekwencji wiążących eIF4E7,8,9 (region obejmujący aa 604-646 na ludzkim eIF4E), 4EBP zmniejsza pulę eIF4E aktywnie zaangażowanych w translację i zapobiegających tworzeniu się kompleksów eIF4F. Wzajemne oddziaływanie tych interakcji białko-białko jest głównie regulowane przez ssaczy cel fosforylacji 4EBP za pośrednictwem rapamycyny (mTOR). Pod wpływem bodźców mitogennych mTOR bezpośrednio fosforyluje członków rodziny białek 4E-BP, zmniejszając ich związek z eIF4E, a tym samym promując interakcję eIF4E-eIF4G i tworzenie funkcjonalnych kompleksów eIF4F10.
Pomimo ogromnego wysiłku włożonego w opracowanie związków ukierunkowanych na integralność kompleksu eIF4F, brak testów mierzących bezpośrednie zakłócenie interakcji eIF4E-eIF4G w żywych komórkach ograniczył poszukiwania komórkowych aktywnych związków uderzeniowych. Zastosowaliśmy test lucyferazy oparty na analogu koelentrazyny (np. Test komplementacji oparty na Nanoluc) do monitorowania w czasie rzeczywistym stanu integralności eIF4F poprzez interakcję eIF4E-eIF4G. System białkowy komplementacji lucyferazy składa się z fragmentu białka o masie 18 kDa (SubA) i fragmentu peptydu 11 aminokwasów (SubB) zoptymalizowanego pod kątem minimalnej samoasocjacji i stabilności11. Po wyrażeniu jako produkt fuzji z ludzką domeną interakcji eIF4E na pełnej długości i domeną interakcji eIF4E z ludzkiego eiF4G1 (aa 604-646), dwa oddziałujące białka zbliżyą fragment SubA i SubB do siebie i zaindukują tworzenie substancji czynnej lucyferazy, która w obecności przepuszczalnego dla komórek substratu ostatecznie wygeneruje jasny sygnał luminescencyjny (ryc. 1). W innym miejscu informowaliśmy o budowie i walidacji systemu komplementacji eIF4E:eIF4G604-64616.
Tutaj opisujemy, jak system komplementacji eIF4E:eIF4G604-646 (dostępny na żądanie) może być zastosowany do dokładnego pomiaru zakłóceń eIF4E-eIF4G za pośrednictwem 4EBP1 w żywych komórkach. Dodatkowo demonstrujemy jego użyteczność, mierząc działanie kilku inhibitorów mTOR, które są obecnie w fazie badań klinicznych jako potencjalne leki przeciwnowotworowe12. Ze względu na to, że efekty niezgodne z celem często maskują aktywność specyficzną dla leku, opisujemy również, w jaki sposób można rozszerzyć wszechstronność pomiarów systemu eIF4E:eIF4G604-646 o ortogonalne pomiary żywotności komórek, aby je uwzględnić.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Linia komórkowa HEK293 została użyta do protokołu i została wyhodowana w zmodyfikowanym pożywce Eagle firmy Dulbecco uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą, 2 mM L-glutaminą i 100 U/ml penicyliny/streptomycyny. Komórki hodowano w temperaturze 37 °C z 5% CO2 w wilgotnym środowisku.
1. Ilościowa ocena rozerwania kompleksu eIF4F za pomocą testu komplementacji eIF4E:eIF4G604-646
- Hodowla komórkowa i transfekcja przejściowa testu komplementacji eIF4E:eIF4G604-646
- Do wszystkich eksperymentów używaj świeżo rozmrożonych komórek z mniej niż 20 pasażami. W dniu 1 określ liczbę komórek za pomocą standardowego licznika komórek i policz całkowitą liczbę żywotnych komórek za pomocą metody wykluczenia błękitu trypana13.
- Wysiewaj płytki 6-dołkowe z 0,9 - 1,2 x 106 komórek HEK 293 na dołek w 2 ml standardowej pożywki wzrostowej.
UWAGA: Aby osiągnąć najlepszą wydajność transfekcji w obrębie linii komórkowych wskazanych powyżej, należy upewnić się, że posiane komórki zlewają się w 70-90% następnego dnia po wysiewie. - Rankiem w dniu 2 należy wykonać kotransfekcję komórek z plazmidem SubA-eIF4E i eIF4G604-646-SubB za pomocą odczynnika do transfekcji na bazie lipidów (patrz tabela materiałów), jak opisano poniżej.
- Rozcieńczyć 9 μl roztworu na bazie liposomów w probówce zawierającej 125 μl zredukowanej pożywki surowicy bez czerwieni fenolowej (patrz tabela materiałów) przy każdej transfekcji i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
- Przygotować wzorcową mieszaninę DNA, rozcieńczając 3 μg każdego plazmidu w 125 μl zredukowanej pożywki surowicy dla każdej probówki do transfekcji.
- Dodać 12 μl odczynników wzmacniających do probówki z mieszanką główną DNA, dobrze wymieszać i natychmiast dodać mieszankę główną DNA: wzmacniacz do każdej probówki rozcieńczonych liposomów w stosunku 1:1. Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
- Dodać kompleks DNA-lipid do każdej studzienki i inkubować komórki w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 24 godziny.
- Rankiem 3 dnia przepłucz każdą studzienkę 1 ml PBS.
- Usunąć PBS i inkubować komórki w każdym dołku z 0,3 ml trypsyny przez 5 minut w temperaturze 37 °C.
- Zneutralizować trypsynę, dodając 2 ml zredukowanej pożywki surowicy bez czerwieni fenolowej zawierającej 0% FCS w każdym dołku i przenieść transfekowane komórki do probówki o pojemności 15 ml.
UWAGA: Czerwień fenolowa może zakłócać aktywność lucyferazy; W związku z tym, począwszy od tego etapu, z komórkami należy obchodzić się w pożywce bez czerwieni fenolowej. - Wirować komórki przez 5 minut przy 290 x g i odessać pożywkę. Zawiesić komórki w 2 ml zredukowanej pożywki surowicy bez czerwieni fenolowej zawierającej 0% FCS. Policz zgodnie z opisem w kroku 1.1.
- Nasiona transfekowały komórki HEK 293 w 96 nieprzezroczystych płytkach o gęstości 30 000 komórek na basenik w 90 μl pożywki bez czerwieni fenolowej zawierającej 0% FCS. W celu uzyskania 3 powtórzeń technicznych w tym samym eksperymencie dla 3 różnych związków, należy zasiać 60 dołków na płytkach z komórkami z wyłączeniem dołków na krawędziach.
- Natychmiast po wysianiu transfekowanych komórek dodać 10 μl 10% roztworu związku DMSO (patrz krok 1.2).
- Przygotowanie mieszanki
- Przygotować 1 mM złożone roztwory podstawowe, rozpuszczając interesujący nas związek w 100% DMSO (v/v). Aby uzyskać 3 powtórzenia dla każdego miareczkowania złożonego, należy użyć 8 μl 1 mM roztworu podstawowego związku.
UWAGA: Objętość użytego związku podstawowego o wielkości 1 mM jest większa niż potrzebna. Ma to na celu uwzględnienie ewentualnych błędów pipetowania. - Przeprowadzić 2-krotne seryjne rozcieńczenie roztworu związku podstawowego 4 μl 1 mM podstawowego roztworu do 4 μl 100% DMSO dla każdego punktu miareczkowania.
UWAGA: Aby uzyskać pełne miareczkowanie złożone, należy wykonać 9 seryjnych rozcieńczeń z wyjściowego zapasu w 100% DMSO. Jeśli konieczne jest przetestowanie wielu związków, należy użyć płytki 96-dołkowej i pipety wielokanałowej, aby ułatwić ten etap i późniejsze rozcieńczenia. - Dodać 36 μL sterylnej wody klasy HPLC do każdego punktu 2-krotnego seryjnego rozcieńczenia, aby przygotować 40 μL 10x roztworów roboczych w 10% DMSO (v/v) (tj. 100 μM do 0,39 μM 10% serii podstawowej DMSO doprowadzi do końcowego roztworu od 10 μM do 0,039 μM, w 1% DMSO po dodaniu do komórek). Jeśli chodzi o kontrolę leczenia, należy również przygotować 10% roztwór podstawowy tylko DMSO w sterylnej wodzie klasy HPLC.
- Dodać 10 μl 10x roztworów roboczych do komórek na 96-dołkowej nieprzezroczystej płytce w celu uzyskania zamierzonego stężenia końcowego przy resztkowym stężeniu DMSO wynoszącym 1% (v/v) w całkowitej objętości 100 μL i inkubować przez 3 godziny w temperaturze 37 °C z 5% v/v atmosferycznym CO2.
- Przygotować 1 mM złożone roztwory podstawowe, rozpuszczając interesujący nas związek w 100% DMSO (v/v). Aby uzyskać 3 powtórzenia dla każdego miareczkowania złożonego, należy użyć 8 μl 1 mM roztworu podstawowego związku.
- Komplementacja lucyferazy i test żywotności
- Po 3 godzinach od narkotyzacji należy rozpocząć przygotowanie odczynnika substratowego lucyferazy, łącząc 1 objętość substratu z 19 objętościami odczynnika do rozcieńczania (patrz instrukcje producenta).
UWAGA: Test lucyferazy przeprowadza się przy użyciu dostępnego na rynku zestawu (patrz Tabela materiałów). - Za pomocą pipety wielokanałowej natychmiast dodaj 25 μl odczynnika substratowego.
- Potrząsaj płytką z prędkością 350 obr./min przez 50 minut na wytrząsarce orbitalnej w temperaturze pokojowej.
- Oceń luminescencję za pomocą czytnika płytek. W tym celu należy ustawić czytnik lusterek na luminescencję, a filtr emisyjny na 455. Użyj wysokości pomiaru 6.5 mm przy czasie pomiaru 1 s.
- Aby ocenić żywotność komórek, dodać 33 μl odczynnika do oznaczania żywotności, a następnie ponownie zmierzyć luminescencję po 15 minutach w temperaturze pokojowej, używając czytnika płytek.
- Oceń luminescencję za pomocą czytnika płytek, ustawiając czytnik lusterek na Luminescencja, a filtr emisyjny na 600 nm. Użyj wysokości pomiaru 6.5 mm przy czasie pomiaru 1 s.
UWAGA: Żywotność ocenia się, mierząc wewnątrzkomórkowy poziom ATP podczas lizy komórek zgodnie z instrukcjami producenta. Multipleksowanie jest w tym przypadku możliwe, ponieważ test żywotności wykorzystuje inną lucyferazy o innej długości fali emisyjnej. - Użyj danych, aby określić wartości IC50 każdego związku, dopasowując dane do równania krzywej dopasowania 4 parametrów:
Y = ((A-D)/(1+((x/C)^B))) + D
Wartości liczbowe D i A muszą być ograniczone w procesie dopasowywania krzywych:
D = wartość luminescencji na osi Y dla minimalnej asymptoty krzywej lub minimalnego teoretycznego poziomu odpowiedzi oczekiwanego w teście komplementacji eIF4E:4G.
A = wartość luminescencji na osi Y dla maksymalnej asymptoty krzywej lub maksymalnej odpowiedzi na poziomie teoretycznym oczekiwanej w teście komplementacji eIF4E:4G.
UWAGA: Wartość minimalnej odpowiedzi pochodzi z 1% leczenia kontrolnego DMSO (v/v), a wartość maksymalnej odpowiedzi pochodzi z maksymalnej odpowiedzi inhibitora mTOR o wysokim powinowactwie, który ustabilizował się bez wpływu na żywotność komórek.
- Po 3 godzinach od narkotyzacji należy rozpocząć przygotowanie odczynnika substratowego lucyferazy, łącząc 1 objętość substratu z 19 objętościami odczynnika do rozcieńczania (patrz instrukcje producenta).
2. Korelacja hamowania testu eIF4E:eIF4G604-646 z rozerwaniem kompleksu eIF4F w komórkach
- Aby potwierdzić, że sygnał mierzony za pomocą testu odpowiada fizycznemu zakłóceniu interakcji eIF4E-eIF4G przez związek, komórki nasienne zgodnie z opisem w kroku 1.1.
- Następnego dnia zastąpić pożywkę 1 ml zredukowanej pożywki surowicy niezawierającej czerwieni fenolowej i inkubować przez 4 godziny z interesującym związkiem. Zapewnić stężenie resztkowe DMSO na poziomie 1% (v/v) w całkowitej objętości 1 ml.
UWAGA: Aby łatwo umożliwić korelację z wynikiem, należy użyć stężeń związków na początku, środku i końcu zmierzonej krzywej miareczkowania testu komplementacji. - Lizuj komórki i wykonaj ściąganie m7GTP w dół w celu wyizolowania kompleksów eIF4F i eIF4E: 4EBP1. Szczegółowe procedury dotyczące przeprowadzania eksperymentu z rozwijanym m7GTP można znaleźć gdzie indziej14.
- Wykryj poziomy białek eIF4G, eIF4E i 4EBP1 związanych z m7GTP za pomocą analizy western blot, a następnie skoreluj je z rozerwaniem kompleksu eIF4F za pomocą hamowania sygnału testu komplementacji.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Aby zweryfikować czułość systemu komplementacji eIF4E:eIF4G604-646, oceniono inhibicję składania kompleksu eIF4F zapśredniczoną przez 4EBP1 przy użyciu inhibitorów mTOR. Poprzez hamowanie zależnej od kinazy mTORC1 fosforylacji białek z rodziny 4EBP, inhibicja mTOR zwiększa asocjację 4EBP1 z eIF4E, a w konsekwencji prowadzi do rozpadu kompleksu eIF4F15. Przebadano dwie klasy inhibitorów kinaz mTOR o różnym mechanizmie działania: rapalogi (np. rapamycynę),...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Metoda opisana w tym artykule wykorzystuje test komplementacji oparty na lucyferazy do ilościowego monitorowania składania kompleksu eIF4F poprzez bezpośredni pomiar interakcji eIF4G-eIF4E w żywych komórkach. Przedstawiliśmy szczegółowe informacje na temat stosowania systemu komplementacji eIF4E-eIF4G, a także wykazaliśmy, że system jest niezwykle dokładny w pomiarze indukowanej lekiem dysocjacji interakcji eIF4E-eIF4G za pośrednictwem 4EBP116. Aby ułatwić przepustowość tego testu, konfiguracja ek...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez główny budżet z p53lab (BMSI, A*STAR) oraz grant VIP JCO (A*STAR).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Komórki 293FT | Thermo Fisher Scientific | R70007 | |
| Mikropłytka do hodowli komórkowych 96 dołków, F-Bottom | greiner bio-one | 655083 | |
| Miano komórek Glo 2.0 | PROMEGA | G9241 | |
| Envision Multilabel Reader | PerkinElmer | nie dotyczy | |
| Pipety wielokanałowe Finnpipette F2 12-kanałowe 30-300 ml | Thermo Fisher Scientific | 4662070 | |
| Pipety wielokanałowe Finnpipette F2 12-kanałowe 5-50 ml | Thermo Fisher Scientific | 4662050 | |
| FUGENE6 | PROMEGA | E2692 | |
| Lipofectamina 3000 | Thermo Fisher Scientific | L3000015 | |
| NanoBiT PPI Starter Systems | PROMEGA | N2014 | |
| Optimem I Zredukowana surowica Mediun, bez czerwieni fenolowej | Thermo Fisher Scientific | 11058021 | |
| Wytrząsarka orbitalna | Eppendorf | nie ma zastosowania | |
| γ-Aminofenyl-m7GTP (C10-spacer)-Agarose | Jena Bioscience | AC-155S |
Bibliografia
- Silvera, D., Formenti, S. C., Schneider, R. J. Translational control in cancer. Nature Reviews Cancer. 10 (4), 254-266 (2010).
- Gebauer, F., Hentze, M. W. Molecular Mechanism of translational control. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 827-835 (2004).
- Bhat, M., et al. Targeting the translation machinery in cancer. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (4), 261-278 (2015).
- Pelletier, J., Graff, J., Ruggero, D., Sonenberg, N. Targeting the eIF4F translation initiation complex: a critical nexus for cancer development. Cancer Research. 75 (2), 250-263 (2015).
- Montanaro, L., Pandolfi, P. P. Initiation of mRNA translation in oncogenesis: the role of eIF4E. Cell Cycle. 11, 1387-1389 (2004).
- Merrick, W. C. eIF4E: A retrospective. Journal of Biological Chemistry. 290 (40), 24091-24099 (2015).
- Marcotrigiano, J., Gingras, A. C., Sonenberg, N., Burley, S. K. Cap-dependent translation initiation in eukaryotes is regulated by a molecular mimic of eIF4G. Molecular Cell. 3 (6), 707-716 (1999).
- Umenaga, Y., Paku, K. S., In, Y., Ishida, T., Tomoo, K. Identification and function of the second eIF4E-binding region in N-terminal domain of eIF4G: comparison with eIF4E-binding protein. Biochemical and Biophysical Research Communication. 414 (3), 462-467 (2011).
- Grüner, S., et al. The Structures of eIF4E-eIF4G Complexes Reveal an Extended Interface to Regulate Translation Initiation. Molecular Cell. 64 (3), 467-479 (2016).
- Gingras, A. C., et al. Hierarchical phosphorylation of the translation inhibitor 4E-BP1. Genes and Development. 15 (21), 2852-2864 (2001).
- Dixon, A. S., et al. NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells. ACS Chemical Biology. 11 (2), 400-408 (2016).
- Sun, S. Y. mTOR kinase inhibitors as potential cancer therapeutic drugs. Cancer Letters. 340 (1), 1-8 (2013).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. , Appendix 3: Appendix 3B (2001).
- Sekiyama, N., et al. Molecular mechanism of the dual activity of 4EGI-1: Dissociating eIF4G from eIF4E but stabilizing the binding of unphosphorylated 4E-BP1. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 112 (30), e4036-e4045 (2015).
- Muller, D., et al. 4E-BP restrains eIF4E phosphorylation. Translation. 1 (2), e25819(2013).
- Frosi, Y., Usher, R., Lian, D. T. G., Lane, D. P., Brown, C. J. Monitoring flux in signalling pathways through measurements of 4EBP1-mediated eIF4F complex assembly. BMC Biology. (1), 40(2019).
- Ran, X., Gestwicki, J. E. Inhibitors of protein-protein interactions (PPIs): An analysis of scaffold choices and buried surface area. Current Opinion in Chemical Biology. 44, 75-86 (2018).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
