Artykuł metodologiczny

Zweryfikowany panel LC-MS/MS do ilościowego określenia 11 leków opornych na gruźlicę w małych próbkach włosów

DOI:

10.3791/60861

⸱

19 maja 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Obstetrics, Gynecology and Reproductive Sciences, TB Hair Analysis Laboratory, University of California San Francisco, 2Department of Epidemiology and Biostatistics, University of California San Francisco, 3Department of Medicine, Division of HIV, Infectious Diseases, and Global Medicine, University of California San Francisco, 4Department of Medicine, Division of Pulmonary and Critical Care Medicine, University of California San Francisco

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecne metody analizy przestrzegania przez pacjentów złożonych schematów leczenia gruźlicy opornej na leki (DR-TB) mogą być niedokładne i wymagające dużych zasobów. Nasza metoda analizuje włosy, łatwo zbieralną i przechowywaną matrycę, pod kątem stężeń 11 leków DR-TB. Dzięki LC-MS/MS możemy określić poziomy leków poniżej nanogramów, które można wykorzystać do lepszego zrozumienia przestrzegania leków.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gruźlica oporna na leki (DR-TB) to rosnące zagrożenie dla zdrowia publicznego, a ocena poziomów leków terapeutycznych może przynieść istotne korzyści kliniczne. Poziomy leków w osocze są obecnie złotym standardem, ale wymagają flebotomii i łańcucha chłodzenia, a także rejestrują tylko bardzo świeże przestrzeganie stosowania. Nasza metoda wykorzystuje włosy, matrycę łatwą do zebrania i odzwierciedlającą długotrwałe stosowanie się do stosowania ciała, do testowania na obecność 11 leków przeciwgruźlicowych. Wcześniejsze badania naszej grupy pokazują, że poziomy leków przeciwretrowirusowych we włosach są powiązane z wynikami HIV. Nasza metoda leczenia DR-TB wykorzystuje 2 mg włosów (3 cm bliskich do nasady), które są rozdrabniane i ekstrahowane w metanolu. Próbki są analizowane pojedynczą metodą LC-MS/MS, która w ciągu 16 minut ilościowa określa 11 leków. Dolne granice ilościowe (LLOQ) dla 11 leków wahają się od 0,01 ng/mg do 1 ng/mg. Obecność leku potwierdza się poprzez porównanie stosunków dwóch przejść w spektrometrii masowej. Próbki są ilościowe za pomocą stosunku powierzchni leku do deuterowanego izotopolologu leku 15N- lub 13C. Użyliśmy krzywej kalibracyjnej w zakresie od 0,001 do 100 ng/mg. Zastosowanie metody na wygodnej próbce włosów pobranych od pacjentów z DR-TB podczas terapii bezpośrednio obserwowanej (DOT) wskazywało na poziomy leków we włosach mieszczące się w liniowym zakresie dynamicznym dziewięciu z jedenastu leków (izoniazyd, pyrazinamid, ethambutol, linezolid, levofloksacyna, moksyfloksacyna, klofazymina, bedaquilina, pretomanid). Żaden pacjent nie przyjmował protoonamidu, a zmierzone poziomy etionamidu były zbliżone do LLOQ (dalsze badania dotyczyły odpowiedniości metabolitu etionamidu do monitorowania ekspozycji). Podsumowując, opisujemy opracowanie panelu wieloanalitowego dla leków DR-TB we włosach jako technikę monitorowania leków terapeutycznych podczas leczenia gruźlicy opornej na leki.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W XXI wieku gruźlica oporna na leki (DR-TB) to ewoluująca katastrofa dla już słabych krajowych programów kontroli gruźlicy, z potwierdzonymi przypadkami podwojącym się tylko w ciągu ostatnich 5 lat, odpowiadając za niemal jedną trzecią wszystkich zgonów związanych z opornością na antybakteryje na świecie – 1,2. Skuteczne leczenie DR-TB konwencjonalnie wymagało dłuższych i bardziej toksycznych schematów drugiego biegu niż leczenie gruźlicy wrażliwej na leczenie leków. Ponadto pacjenci z DR-TB często mają poważne wcześniejsze trudności z przestrzeganiem gryźlicy, co przyczyniło się do początkowego powstania oporności3.

W przeciwieństwie do zakażenia HIV, gdzie ładunki wirusowe mogą być wykorzystywane do monitorowania leczenia, zastępcze punkty końcowe odpowiedzi leczenia w TB są opóźnione i niewiarygodne na poziomie4 dla jednostki. Monitorowanie przestrzegania przez pacjentów, ważnego czynnika predyktycznego stężenia subterapeutycznego leku przeciwgruźliczego i niepowodzenia leczenia, również jest wyzwaniem. Samozgłoszone przestrzeganie cierpi na błędy przypominania i chęć zadowolenia pracowników 5,6. Liczba tabletek i systemy monitorowania zdarzeń lekowych (MEMS) mogą być bardziej obiektywne 7, ale nie mierzą rzeczywistego spożycia leków 8,9,10. Poziomy leków w biomatrycach mogą dostarczać zarówno danych dotyczących zgodności, jak i farmakokinetycznych. Dlatego poziomy leków w osocze są powszechnie stosowane w monitorowaniu leków terapeutycznych11,12. W kontekście monitorowania przestrzegania leków poziomy w osoczu oznaczają jednak krótkoterminową ekspozycję i są ograniczone przez istotną zmienność wewnątrz- i między pacjentami przy określaniu odpowiedniego zakresu referencyjnego przestrzegania. Efekty "białego płaszcza", gdzie przestrzeganie leków poprawia się przed wizytami w klinice lub badaniach, dodatkowo komplikują zdolność poziomów w osoczu do zapewnienia dokładnych wzorców przestrzegania leków13.

Hair to alternatywna biomatryca, która może mierzyć długotrwałą ekspozycję na leki14,15. Wiele leków i endogennych metabolitów włącza się do matrycy białkowej włosów z krążenia układowego podczas wzrostu włosów. W miarę jak ten dynamiczny proces trwa podczas wzrostu włosów, ilość leku zdeponowanego w matrycy włosów zależy od ciągłej obecności leku w krążeniu, co sprawia, że włosy stanowią doskonały czasowy odczyt przyjmowanego leku. Włosy jako biomatryca mają dodatkową zaletę, że łatwo je zbierać bez potrzeby chłodzenia do przechowywania i wysyłki w porównaniu do krwi. Co więcej, włosy nie są niebezpieczne dla organizmu, co daje dodatkowe korzyści w zakresie wykonalności w tej dziedzinie.

Poziomy leków na włosy od dawna są stosowane w zastosowaniach kryminalistycznych16. W ciągu ostatniej dekady poziomy antyretrowirusowych (ARV) na włosach wykazały się skutecznością w ocenie przestrzegania leków w leczeniu i zapobieganiu HIV, do czego nasza grupa się przyczyniła. Wykazano, że poziomy ARV we włosach są najsilniejszymi niezależnymi predyktorami wyników leczenia zakażenia HIV 17,18,19,20,21. Aby ustalić, czy poziomy włosów pacjentów z DR-TB będą miały takie samo zastosowanie w przewidywaniu wyników leczenia, wykorzystaliśmy LC-MS/MS do opracowania i zweryfikowania metody analizy 11 leków DR-TB w małych próbkach włosów. Jako wstępną ocenę wydajności testu zmierzyliśmy poziomy leków DR-TB w próbie wygodnej pacjentów z DR-TB otrzymujących bezpośrednio obserwowaną terapię (DOT) w Western Cape, RPA22.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszyscy pacjenci wyrazili pisemną świadomą zgodę przed pobraniem próbki włosów. Uzyskaliśmy zgodę Instytucjonalnej Rady Przeglądowej od Uniwersytetu Kapsztadzkiego oraz Uniwersytetu Kalifornijskiego w San Francisco.

1. Próbkowanie włosów

  1. Uzyskaj pisemną świadomą zgodę.
  2. Użyj czystych nożyczek, aby przyciąć około 20-30 pasm włosów z okolic potylicznej jak najbliżej skóry głowy.
  3. Oklej dystalną stronę włosów, aby wskazać kierunek. Złóż próbkę włosów w kwadrat z folii aluminiowej i przechowuj w temperaturze pokojowej. Oznacz dalszy koniec włosa, aby uniknąć ewentualnego skażenia przez dodatkowe dotykanie końca bliższego.
  4. Oprócz próbek pacjentów, pobierz "puste włosy": próbkę włosów ze skóry głowy od osoby, która nie przyjmowała leków na gruźlicę. Pobierz dużą ilość (>30 mg pustego włosa na każde 20 próbek pacjentów).

2. Ekstrakcja leków

  1. Oznacz rurki koralikowe. Każda próbka pacjenta wymaga jednej probówki. Oznacz 12 lamp od "C0" do "C11", po jednej dla każdego z 12 punktów kalibracji. Oznacz tubkę do kontroli niskiej jakości, tubkę do kontroli średniej jakości oraz tubkę do kontroli wysokiej jakości. Na koniec oznacz tubę do Matrix Blank.
  2. Otwórz kwadrat z folii aluminiowej zawierający próbkę włosów. Jeśli próbka włosów jest dłuższa niż 3 cm, tnij włosy na odległość 3 cm od końca bliższego i użyj tej części bliższej do analizy.
  3. Zważ 2 mg próbki włosów do probówki z koralikami.
  4. Zważ 2 mg pustych włosów w 16 dodatkowych tubkach z koralikami. Będą one używane jako punkty kalibracyjne, kontrola jakości oraz pusta matryca. Probówki będą przebiegać według tej samej procedury ekstrakcji co próbki pacjenta, z wyjątkiem dopełnienia standardów referencyjnych leków na poziomach wskazanych w krokach 2.8 i 2.9.
  5. Włóż wszystkie rurki kulkowe do homogenizatora. Uruchom homogenizator z prędkością 6,95 m/s. Biegnij przez dwa cykle po 30 sekund każdy, z 15-sekundowym okresem odpoczynku pomiędzy nimi.
  6. Zrób wewnętrzną standardową mieszankę i dodaj ją do próbek.
    1. Dodaj ~40 mL metanolu do kolby objętościowej 50 mL.
    2. W fiolkach z bursztynowym szkłem przygotuj mieszanki wewnętrznych standardów pokazanych w Tabeli 1, używając metanolu jako rozpuszczalnika.
      UWAGA: Metanol jest bardzo lotny. Podczas tego procesu pozostaw wszystkie fiolki zamknięte, aby zapobiec utracie spowodowanej parowaniem.
    3. Z tych mieszanek dodaj objętość pokazaną w Tabeli 1 do kolby objętościowej 50 mL. Następnie napełnij kolbę metanolem do 50 mL.
    4. Zakramp i wymieszaj kolbę objętościową. Dodaj 500 μL tej mieszaniny do każdej z rozdrobnionych rurek włosowych, z wyjątkiem rurki matrycy. Dodaj 500 μL metanolu do pustej rurki matrycy.
  7. Zrób referencyjne standardowe miksy.
    1. Ustalić przejrzyste standardy odniesienia dla następujących leków z metanolem, aby uzyskać stężenie pokazane w tabeli w kroku 2.7.2. Potrzebne jest tylko 1 mL z następujących stężeń.
    2. Dodaj 1768 μL metanolu do fiolki, a następnie do tej samej fiolki dodaj ilości referencyjnych standardów wymienionych w Tabeli 2, aby uzyskać 2 mL końcowej objętości. Oznacz tę fiolkę "Ref Std Mix 1x". Wir.
    3. Zwiększ 100 μL z "Ref Std Mix 1x" do 900 μL metanolu w nowej fiolce. Oznacz tę fiolkę "Ref Std Mix 10x". Wir.
    4. Zwiększ 100 μL z "Ref Std Mix 10x" do 900 μL metanolu w nowej fiolce. Oznacz tę fiolkę "Ref Std Mix 100x". Wir.
    5. Zwiększ 100 μL z "Ref Std Mix 100x" do 900 μL metanolu w nowej fiolce. Oznacz tę fiolkę "Ref Std Mix 1000x". Wir.
  8. Podnieś lampy kalibracyjne, dodając ilość Ref Std Mix opisaną w Tabeli 3.
  9. Twórz miksy QC i spike'uj lampy do kontroli jakości.
    1. Etykietuj 5 fiolek "QC-A" do "QC-E".
    2. Dodaj następujące ilości metanolu do pięciu oznaczonych fiolek:
      QC-A: 990 μL
      QC-B: 940 μL
      QC-C: 950 μL
      QC-D: 980 μL
      QC-E: 950 μL
       
    3. Korzystając z zapasów leków o wartości 1 mg/mL utworzonych w kroku 2.7.1, dodaj 10 μL do konkretnych fiolek wymienionych poniżej. Dla zapasów BDQ i CLF, które są na poziomie 0,5 mg/mL, należy dodać 20 μL do fiolek wymienionych poniżej.
      QC-A: PTH
      QC-B: EMB, CLF, BDQ, PTM
      QC-C: INH, LFX, LZD, MFX, PZA
      QC-D: PTH, EMB
      QC-E: CLF, BDQ, PTM

      UWAGA: Niektóre leki występują w wielu mieszankach.
    4. Oznacz fiolkę jako "QC-A df100". Rozcieńcz 10 μL QC-A do metanolu o pojemności 990 μL.
    5. Oznacz fiolkę jako "Low QC Stock". Dodaj 1832 μL metanolu do tej fiolki. Dodaj poniżej opisane ilości mikserów QC:
      QC-A df100: 80 μL
      QC-B: 8 μL
      QC-C: 80 μL
       
    6. Oznacz fiolkę jako "Mid QC stock". Dodaj 760 μL metanolu do tej fiolki. Dodaj poniżej opisane ilości mikserów QC:
      QC-A df100: 800 μL
      QC-B: 40 μL
      QC-C: 400 μL
       
    7. Oznacz fiolkę jako "Wysoka jakość jakości". Dodaj 1376 μL metanolu do tej fiolki. Dodaj poniżej opisane ilości mikserów QC:
      QC-D: 160 μL
      QC-E: 320 μL
      MFX, 1mg/mL kolba: 16 μL
      INH, 1mg/mL magazyn: 32 μL
      LFX, 1mg/mL magazyn: 32 μL
      LZD, 1mg/mL kolba: 32 μL
      PZA, 1mg/mL magazyn: 32 μL
       
    8. Kolczasty 10 μL Low QC do rurki kulkowej Low QC.
    9. Kolczasty 10 μL Mid QC do rurki kulkowej Mid QC.
    10. Kolczasty 10 μL High QC do rurki kulkowej High QC.
  10. Wszystkie rurki umieść w gorącym shakerze na 2 godziny w temperaturze 37 °C. Potrząsanie powinno być na tyle powolne, aby woda nie rozpryskiwała się na rurki.
  11. Wyjmij rurki z shakera. Przelej płyn z rurek kulkowych do nowych rurek mikrowirówki. Oznacz te rurki mikrowirówki w ten sam sposób.
  12. Dodaj 500 μL metanolu do starych rurek. Kap i wir.
  13. Po raz drugi przenieś ciecz z rurek kulkowych do odpowiedniej rurki mikrowirówki. Można przenosić rozdrobnione włosy. Ostatecznie zostanie to wypalone.
  14. Wiruj rurki mikrowirówki przez 10 minut przy 2 800 x g.
  15. Ostrożnie usuń ciecz i przelej ją do nowych rurek wirówek z odpowiednimi etykietami. Uważaj, aby nie ruszać ani nie przenosić osadu do włosów.
  16. Odparuj ciecz w rurkach wirówek do wyschnięcia w temperaturze 32 °C.
  17. Rekonstytuować próbki, dodając 200 μL fazy mobilnej A (wody klasy HPLC z 1% kwasem mrówkowym) do suchych rurek. Wir.
  18. Przelej płyn do bursztynowych fiolek z wkładkami 250 μL.

3. Przygotowanie do LC-MS/MS

  1. Przygotuj jeden litr wody fazy A (wody klasy HPLC z 1% kwasem mrówkowym), dodając trochę wody klasy HPLC do kolby objętościowej o pojemności jednego litra. Następnie dodaj 10 ml kwasu mówkowego >95% do tej kolby, a następnie napełnij do linii wodą klasy HPLC.
    1. Przygotuj jeden litr fazy komórkowej B (acetonitryl z 0,1% kwasem mrówkowym), dodając acetonitryl do kolby o pojemności jednego litra objętości. Następnie dodaj 1 ml >95% kwasu mrówkowego do tej kolby, a następnie napełnij do linii acetonitrylem.
  2. Zamontuj kolumnę o wymiarach 2 x 100 mm o rozmiarze cząstek 2,5 μm i porach 100 Å z kulkami fenylowymi z eterowymi zakończeniami, w pełni wykonaną z porowatej krzemionki w komorze kolumny. Upewnij się, że kolumna ma też zamontowany zalecany przez producenta wkład ochronny.
  3. Otwórz oprogramowanie do akwizycji danych i kliknij dwukrotnie Konfiguracja sprzętu. Zaznacz LCMS i kliknij Aktywuj Profil.
    1. Kliknij Nowy Podprojekt lub, jeśli inne podprojekty już istnieją, kliknij Kopiuj Podprojekt. Nazwij podprojekt.
    2. Kliknij Nowy dokument. Metoda zdobywania podwójnego kliknięcia. Kliknij Mass Spec w oknie metody pozyskiwania.
    3. Zmień rozwijany typ skanu na MRM (MRM). Upewnij się, że polaryzacja jest ustawiona na dodatnią.
    4. Kliknij Import List i wybierz .csv plik MDR-TB LCMS metodą transitions.csv zawartą w Materiałach Uzupełniających.
    5. Przewiń w dół i ustaw czas trwania na 16,751 min. Odpowiedni czas cyklu i liczba cykli będą się automatycznie wypełniać.
    6. W lewym pasku bocznym kliknij Zintegrowany zawór Valco. Upewnij się, że nazwa stanowiska dla kroku 0 to A. W kolumnie Total Time (min) wpisz 0,4 w pierwszym wierszu i 13 w drugim.
    7. W kolumnie Pozycja ustaw pierwszy wiersz na B, a drugi na A.
    8. W lewym pasku bocznym kliknij Binary Pump. Ustaw tabelę gradientu i przepływu zgodnie z Tabelą 4.
    9. W lewym pasku bocznym kliknij Autosampler. Zmień objętość wtrysku na 10 μL. Kliknij włączoną kontrolę temperatury i ustaw na 4 °C.
    10. W lewym pasku bocznym kliknij Column Compartment. Ustaw zarówno prawą, jak i lewą temperaturę na 50 °C.
    11. Metoda zamknięcia i zapisu.
  4. Utwórz partię, klikając Nowy dokument i wybierając Partię Akwizycji. Wpisz nazwę zestawu i wybierz nowo utworzoną metodę z paska rozwijanego.
    1. W arkuszu kalkulacyjnym stwórz partię, która podąża za następującą kolejnością: krzywa kalibrująca, kontrola jakości, próbki pacjentów, krzywa kalibracji, krzywa kalibracji, krzywa jakości, kontrola jakości. Dodaj iniekcje z rozpuszczalnika na początku i końcu cyklu, a także przed i po krzywej kalibracyjnej, kontroli jakości oraz próbek pacjentów. Po wstrzyknięciu krzywej kalibracyjnej i fiolki o wysokiej jakości należy wykonać co najmniej osiem iniekcji do pustych rozpuszczalników, aby zmniejszyć ilość analizy.
      UWAGA: W zależności od wieku kolumny może być konieczne dodanie większej ilości iniekcji do rozpuszczalnika.
    2. W kolumnie przylegającej do nazw próbek wpisz odpowiednią pozycję autosamplera dla odpowiedniej fiolki.
    3. Kliknij Dodaj zestaw. W oknie wyskakującym wpisz liczbę próbek w partii.
    4. Skopiuj i wklej nazwy próbek oraz lokalizacje fiolek z arkusza kalkulacyjnego do nowo utworzonej partii.
    5. Przejdź do zakładki Wyślij . Kliknij przycisk Wyślij .
  5. Wyrównuj system, wprowadzając linię rozpuszczalnika A do fazy mobilnej A oraz linię rozpuszczalnika B do fazy mobilnej B. Otwórz zawór przepróżniający w pompie binarnej.
    1. Ustaw skład rozpuszczalnika na 50% B przy przepływie 4 mL/min. Włącz pompę binarną.
    2. Po 5 minutach zmniejsz przepływ do 0,3 mL/min. Zamknij zawór przepychający. Sprawdź, czy nie ma przecieków.
    3. W oprogramowaniu naciśnij Equilibrate na górnym pasku narzędzi. Ustaw czas na >5 min, naciśnij OK.
    4. Po wyważeniu instrumentu moduły w prawym dolnym rogu okna będą wyglądać na zielone. Sprawdź, czy ciśnienie się ustabilizowało, a następnie rozpocznij partię , klikając Start próbki.

 4. Analiza danych

  1. Po zakończeniu partii otwórz oprogramowanie do ilości. Kliknij ikonę różdżki, aby utworzyć nową tabelę wyników .
    1. Kliknij Przeglądaj , aby przejść do odpowiedniego folderu, a następnie zaznacz plik danych i kliknij strzałkę wskazującą w prawo, aby przenieść dane do wybranego obszaru. Kliknij Następne.
    2. Wybierz Utwórz nową metodę i kliknij Nowa. Wprowadź nową nazwę metody ilości, naciśnij Zapisz, a potem Następny.
    3. Wybierz pierwsze wstrzyknięcie środkowego punktu kalibracji. Naciśnij Next.
    4. Zaznacz wszystkie przejścia wewnętrznych standardów w kolumnie IS .
    5. Dla przejść kwantyfikatorów dla standardów referencyjnych wybierz odpowiadające mu IS w kolumnie Nazwa IS . Kliknij Następne.
    6. Przewiń przejścia, aby upewnić się, że automatycznie wybrany czas przechowywania jest dokładny. Upewnij się, że wygładzanie Gaussa jest ustawione na 1.5. Wszystkie pozostałe domyślne ustawienia mogą pozostać bez zmian (np. Procent szumu 100%, Podpunkt bazowy, okno 2,00 min, Szczytowy podział 2 punkty).
      UWAGA: Jeśli chcesz, modyfikuj parametry automatycznej całkowania w tym momencie. Ponieważ te parametry zmieniają się w zależności od konfiguracji instrumentów, nie uwzględniliśmy tutaj naszych parametrów.
    7. Kliknij Zakończ, aby zastosować metodę ilościowania do partii.
  2. Kliknij w lewy górny róg. Wyświetla przycisk peak review , aby zobaczyć chromatogramy. Przechodzisz przez przejścia za pomocą lewego paska bocznego. Przewiń każdą iniekcję każdego przejścia kwantyfikatora i ręcznie integruj właściwy pik, jeśli to konieczne.
    1. Aby ręcznie zintegrować szczyt, kliknij przycisk Włącz tryb ręcznej integracji , powiększ chromatogram klikając i przeciągając wzdłuż osi x lub y, a następnie narysuj linię od jednej linii bazowej do drugiej, definiując szczyt. Rysunek 3 pokazuje dwa chromatogramy: jeden z INH, a więc został ręcznie zintegrowany, oraz drugi, który nie zawiera INH.
      UWAGA: Wszystkie iniekcje muszą być zintegrowane według tych samych parametrów. Szerokość szczytu może stanowić wskazówkę do przestrzegania tych parametrów, ale czasem szerokość szczytowa może się różnić. Aby ilościowo określić pik, czas retencji musi mieścić się w granicach ±0,15 min od oczekiwanego czasu retencji dla danego analitu (zgodnie z normą referencyjną pik), jakościowo potwierdzony jako posiadający oczekiwany stosunek kwantyfikatora do kwalifikatora (jak pokazano na Rysunku 2) oraz mieć stosunek sygnału do szumu większy niż 10.
  3. W kolumnie Typ próbki ustaw wstrzyknięcia krzywej kalibracyjnej (z wyjątkiem wtrysków krzywej kalibracji pustych) na Standard. Ustaw zastrzyki kontroli jakości na Kontrolę Jakości. Pozostałe zastrzyki zostaw jako nieznane.
    UWAGA: Będzie to ustawione we wszystkich przejściach.
  4. W kolumnie Rzeczywiste Stężenie wpisz stężenia znalezione w Tabeli 5 dla wszystkich zastrzyków do krzywej kalibracji i kontroli jakości.
  5. Kliknij drugi od lewego górnego rogu Wyświetla przycisk krzywej kalibracji . Kliknij przycisk Regresja .
  6. Ustaw Weighting Type na 1/x i naciśnij OK.
  7. Zweryfikować krzywą kalibracyjną i próbki kontroli jakości, aby upewnić się, że partia przebiegła pomyślnie.
    1. Dla każdego przejścia referencyjnego kwantyfikatora (nie wewnętrznych przejść standardowych) sprawdź dokładność wstrzyknięcia każdej krzywej kalibracyjnej (w kolumnie Dokładność ). Co najmniej dwie trzecie punktów kalibracji musi mieć dokładność w zakresie 80-120%.
    2. Dla punktów kalibracyjnych znacznie wykraczających poza oczekiwaną dokładność, wtrysk może być wyjątkiem od wyjątku. Wyklucz wartości odstające (outliary), jeśli ich obliczone stężenie jest więcej niż dwa odchylenia standardowe od pozostałych dwóch zastrzyków tej fiolki. Kliknięcie przycisku "et peak" do 'not found nad każdym chromatogramem.
    3. Sprawdź, czy wartość R wyświetlana powyżej krzywej kalibracyjnej to >0,975.
    4. Sprawdź, czy wszystkie iniekcje kontroli jakości mają dokładność w zakresie 80-120%.
  8. Jeśli spełnione są wszystkie powyższe warunki, partia została przejęta, a próbki można ilościowo określić. Kliknij Edytuj w pasku narzędzi, a następnie kliknij Skopiuj całą tabelę. Wklej tabelę do arkusza kalkulacyjnego.
  9. Weź średnią obliczonego stężenia z dwóch zastrzyków próbek, aby określić zgłoszone stężenie każdej próbki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ilustracja chromatogramu z potwierdzonymi poziomami wszystkich 11 leków DR-TB pokazana jest na Rysunku 1. Czas retencji dla każdego analitu może się zmieniać przy użyciu różnych instrumentów i kolumn, dlatego dokładny czas retencji należy określać indywidualnie.

Chromatogramy jonów ekstrahowanych (EIC) dla jednego konkretnego leku (izoniazyd, INH) w jednym z kalibratorów (próbka z czymś naznaczonym standardami referencyjnymi DR-TB) są pokazane na

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiamy tutaj protokół dla metody, którą opracowaliśmy i zweryfikowaliśmy do ilościowego określania 11 leków przeciwgruźlicowych stosowanych w leczeniu DR-TB w małych próbkach włosów przy użyciu LC-MS/MS. Nie opracowano, nie zostało wcześniej opracowane, zweryfikowane ani opublikowane żadna inna metoda ilościowego określania tych 11 leków we włosach. Nasza metoda pozwala ilościowo określić poziomy leków poniżej nanogramów tylko w 20-30 pasmach włosów o długości około 3 centymetrów (~2 mg) i została już zatwierdzona...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prace te były wspierane przez National Institute of Allergy and Infectious Diseases RO1 AI123024 (współpromotorzy: John Metcalfe i Monica Gandhi).

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy pragną podziękować profesorowi Keertanowi Dhedzie, dr. Alemu Esmailowi oraz Marietjie Pretorius z Instytutu Płuc Uniwersytetu w Kapsztadzie, którzy umożliwili pobranie próbek włosów do badania. Autorzy również z wdzięcznością doceniają wkład uczestników tego badania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2 ml fiolki do zastrzykówAgilent Technologies5182-0716
Wkładki do fiolek z zastrzyków 250 uLAgilent Technologies5181-8872
Kulka 24OMNI International19001
Rurki z kulkami (zestaw kulek 2 mL, ceramika 2,8 mm, mikrorurki 2 mL)OMNI International19628
BedaquilinaToronto Research ChemicalsB119550
Bedaquiline-d6Toronto Research ChemicalsB119552
KlofaziminaToronto Research ChemicalsC324300
Klofazimina-d7Toronto Research ChemicalsC324302
Jednorazowe rurki do hodowli z wapiennego szkłaVWR60825-425
EthambutolToronto Research ChemicalsE889800
Ethambutol-d4Toronto Research ChemicalsE889802
EtionamidToronto Research ChemicalsE890420
Etionamid-d5ClearSynthCS-O-06597
Kwas mrówkowySigma-AldrichF0507-100mL
Butelki szklaneCorning1395-1L
Hot ShakerBellco Glass Inc7746-32110
HPLCAgilent TechnologiesInfinity 1260
Acetonitryl klasy HPLCHoneywell015-4
Metanol klasy HPLCHoneywell230-1L
Woda klasy HPLCAqua Solutions IncW1089-4L
IzoniazydToronto Research ChemicalsI821450
Izoniazyd-d4Toronto Research ChemicalsI821452
Kolumna LC, Synergi 2,5 um Polar RP 100 A 100 x 2 mmFenomeneks00D-4371-B0
Nabój LC guardFenomeneksAJ0-8788
Uchwyt na nabój LC guardFenomeneksAJ0-9000
Oprogramowanie ilościowe LC-MS/MSSciexMultiquant 2.1
LewofloksacynaSigma-Aldrich1362103-200MG
Lewofloksacyna-d8Toronto Research ChemicalsL360002
LinezolidToronto Research ChemicalsL466500
Linezolid-d3Toronto Research ChemicalsL466502
Rurki mikrowirówkoweE& K Scientific695554
MoksyfloxacynaToronto Research ChemicalsM745000
Moksyfloksacyna-13C, d3Toronto Research ChemicalsM745003
MS/MSSciexTriple Quad 5500
OPC 14714Toronto Research ChemicalsO667600
Pretomanid (PA-824)Toronto Research ChemicalsP122500
ProtoonamidToronto Research ChemicalsP839100
Protoonamid-d5Toronto Research ChemicalsP839102
PirazynamidToronto Research ChemicalsP840600
Pirazynamid-15N, d3Toronto Research ChemicalsP840602
Pokrywki przegrody do fiolek do zastrzykówAgilent Technologies5185-5862
Parownik LV TurbovapBiotage103198/11

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. WHO. Global Tuberculosis Control 2017. , Geneva. Available from: www.who.int/tb/publications/global_report/en/ (2017).
  2. WHO. Tuberculosis. , Geneva. Available from: www.who.int/mediacentre/factsheets/fs104/en/ (2017).
  3. Kurbatova, E. V., et al. Predictors of poor outcomes among patients treated for multidrug-resistant tuberculosis at DOTS-plus projects. Tuberculosis (Edinb). 92, 397-403 (2012).
  4. Dheda, K., et al. The epidemiology, pathogenesis, transmission, diagnosis, and management of multidrug-resistant, extensively drug-resistant, and incurable tuberculosis. Lancet Respiratory Medicine. , (2017).
  5. Berg, K. M., Arnsten, J. H. Practical and conceptual challenges in measuring antiretroviral adherence. Journal of Acquired Immunodeficiency Syndromes (JAIDS). 43, Suppl 1 79-87 (2006).
  6. Kagee, A., Nel, A. Assessing the association between self-report items for HIV pill adherence and biological measures. AIDS Care. 24 (11), 1448-1452 (2012).
  7. Haberer, J. E., et al. Adherence to antiretroviral prophylaxis for HIV prevention: a substudy cohort within a clinical trial of serodiscordant couples in East Africa. PLoS Medicine. 10 (9), 1001511(2013).
  8. Pullar, T., Kumar, S., Tindall, H., Feely, M. Time to stop counting the tablets. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 46 (2), 163-168 (1989).
  9. Liu, H., et al. A comparison study of multiple measures of adherence to HIV protease inhibitors. Annals of Internal Medicine. 134 (10), 968-977 (2001).
  10. Wendel, C., et al. Barriers to use of electronic adherence monitoring in an HIV clinic. Annals of Pharmacotherapy. 35, 1010-1101 (2001).
  11. Ruiz, J., et al. Impact of voriconazole plasma concentrations on treatment response in critically ill patients. Clinical Pharmacology & Therapeutic. , (2019).
  12. Saktiawati, A. M., et al. Optimal sampling strategies for therapeutic drug monitoring of first-line tuberculosis drugs in patients with tuberculosis. Clinical Phamacokinetics. , (2019).
  13. Podsadecki, T. J., Vrijens, B. C., Tousset, E. P., Rode, R. A., Hanna, G. J. "White coat compliance" limits the reliability of therapeutic drug monitoring in HIV-1-infected patients. HIV Clinical Trials. 9 (4), 238-246 (2008).
  14. Cuypers, E., Flanagan, R. J. The interpretation of hair analysis for drugs and drug metabolites. Clinical Toxicology. 56 (2), 90-100 (2018).
  15. Knitz, P., Villain, M., Crimele, V. Hair analysis for drug detection. Therapeutic Drug Monitoring. 28 (3), 442-446 (2006).
  16. Barroso, M., Gallardo, E., Vleira, D. N., Lopez-Rivadulla, M., Queiroz, J. A. Hair: a complementary source of bioanalytical information in forensic toxicology. Bioanalysis. 3 (1), 67-79 (2011).
  17. Gandhi, M., et al. Atazanavir concentration in hair is the strongest predictor of outcomes on antiretroviral therapy. Clinical Infectious Diseases. 52 (10), 1267-1275 (2011).
  18. Koss, C. A., et al. Hair concentrations of antiretrovirals predict viral suppression in HIV-infected pregnant and breastfeeding Ugandan women. AIDS. 29 (7), 825-830 (2015).
  19. Pintye, J., et al. Brief Report: Lopinavir Hair Concentrations Are the Strongest Predictor of Viremia in HIV-Infected Asian Children and Adolescents on Second-Line Antiretroviral Therapy. Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes (JAIDS). 76 (4), 367-371 (2017).
  20. Baxi, S. M., et al. Nevirapine Concentration in Hair Samples Is a Strong Predictor of Virologic Suppression in a Prospective Cohort of HIV-Infected Patients. PLoS One. 10 (6), 0129100(2015).
  21. Gandhi, M., et al. Antiretroviral concentrations in hair strongly predict virologic response in a large HIV treatment-naive clinical trial. Clinical Infectious Diseases. 5, 1044-1047 (2019).
  22. Gerona, R., et al. Simultaneous analysis of 11 medications for drug resistant TB in small hair samples to quantify adherence and exposure using a validate LC-MS/MS panel. Journal of Chromatography B. 1125, 121729(2019).
  23. Metcalfe, J., et al. Association of anti-tuberculosis drug concentration in hair and treatment outcomes in MDR- and XDR-TB. European Respriatory Journal Open Research. 5 (2), (2019).
  24. Metcalfe, J. Z., O'Donnell, M. R., Bangsberg, D. R. Moving Beyond Directly Observed Therapy for Tuberculosis. PLoS Medicine. 12 (9), 1001877(2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Analiza pr bek w osamonitorowanie st enia lek w terapeutycznychilo ciowe oznaczanie wielu analityt wbez ekstrakcji do fazy sta ejekstrakcja metanolowaizotopologowy standard wewn trznywalidacja krzywej kalibracyjnejbezpo rednio nadzorowana terapia

Powiązane artykuły