Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Test opsono-adherencji w celu oceny funkcjonalnych przeciwciał w procesie opracowywania szczepionki przeciwko Bacillus anthracis i innym otoczkowanym patogenom

3.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60873

⸱

19 maja 2020

 ,  ,  , 
1Bacteriology Division, United States Army Medical Research Institute of Infectious Diseases, 2Headquarters Division, United States Army Medical Research Institute of Infectious Diseases, 3Bioqual

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Test opsono-adherencji jest alternatywną metodą do oceny opsono-fagocytarnych metod zabijania, aby ocenić opsoniczne funkcje przeciwciał w procesie opracowywania szczepionek.

Streszczenie

Test adherencji opsono-jest testem funkcjonalnym, który wylicza przywiązanie patogenów bakteryjnych do profesjonalnych fagocytów. Ponieważ do fagocytozy i zabijania wymagane jest przestrzeganie zaleceń lekarskich, test jest metodą alternatywną dla testów zabijania opsonofagocytarnego. Zaletą testu adherencji opsono-adherencji jest możliwość wykorzystania inaktywowanych patogenów i linii komórkowych ssaków, co pozwala na standaryzację w wielu eksperymentach. Zastosowanie inaktywowanego patogenu w teście ułatwia również pracę z czynnikami zakaźnymi o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 3 i innymi zjadliwymi patogenami. W naszej pracy test adherencji opsono-adherencji został wykorzystany do oceny zdolności funkcjonalnej przeciwciał z surowic zwierząt uodpornionych szczepionką na bazie kapsułki wąglika, do indukowania przylegania utrwalonego Bacillus anthracis do mysiej linii komórkowej makrofagów, RAW 264.7. Zautomatyzowana mikroskopia fluorescencyjna została wykorzystana do uchwycenia obrazów prątków przylegających do makrofagów. Zwiększone przestrzeganie zaleceń lekarskich było skorelowane z obecnością przeciwciał antykapsułkowych w surowicy. Naczelne inne niż ludzie, które wykazywały wysokie stężenie przeciwciał w kapsułkach w surowicy, były chronione przed prowokacją wąglikiem. W związku z tym test adherencji opsono-adherencji może być wykorzystany do wyjaśnienia biologicznych funkcji przeciwciał specyficznych dla antygenu w surowicach, do oceny skuteczności kandydatów na szczepionki i innych środków terapeutycznych oraz do służenia jako możliwy korelat odporności.

Wprowadzenie

Rozpoznawanie, przestrzeganie, internalizacja i degradacja patogenu są integralną częścią fagocytozy1, istotnej ścieżki wrodzonej odpowiedzi immunologicznej gospodarza opisanej po raz pierwszy przez Ilyę Metchnikoffa w 1883 roku2,3. Leukocyty fagocytarne, podobnie jak inne komórki układu odpornościowego, są wysoce dyskryminujące w doborze celów; są w stanie odróżnić "zakaźne nie-ja" i "niezakaźne ja" poprzez wzorce molekularne związane z patogenami za pomocą repertuaru receptorów rozpoznawania wzorców (PRR)4,5. Rozpoznanie patogenu przez gospodarza może również nastąpić w przypadku wiązania opsonin gospodarza, takich jak dopełniacz i przeciwciała6. Proces ten, zwany opsonizacją, pokrywa patogen tymi cząsteczkami, zwiększając internalizację po związaniu się z receptorami opsonicznymi (np. receptorami dopełniacza i Fc) na komórkach fagocytarnych6. Aby patogen przylegał do fagocytu, konieczne jest zbiorowe wiązanie wielu receptorów z ich pokrewnymi ligandami. Tylko wtedy adherencja może wyzwolić i podtrzymać kaskady sygnalizacyjne wewnątrz komórki gospodarza, aby zainicjować internalizację6.

Ze względu na znaczenie fagocytozy w usuwaniu patogenów i zapobieganiu infekcjom, patogeny zewnątrzkomórkowe rozwinęły wiele sposobów na zakłócenie tego procesu, aby przedłużyć swoje przetrwanie. Jedną z istotnych strategii jest produkcja anionowej kapsułki polimerowej (np. polisacharydowej lub poliaminokwasowej), która jest antyfagocytarna ze względu na swój ładunek, jest słabo immunogenna i chroni cząsteczki na otoczce bakteryjnej przed PRRs6,7. Patogeny, takie jak Cryptococcus neoformans i Streptococcus pneumoniae, mają kapsułki złożone z polimerów sacharydowych, podczas gdy Staphylococcus epidermidis i niektóre gatunki Bacillus wytwarzają kwas poli-ɣ-glutaminowy (PGGA)7,8. Jeszcze inne patogeny wytwarzają kapsułki, które przypominają niezakaźne ja. Na przykład Streptococcus pyogenes i patogenny szczep B. cereus mają kapsułkę z kwasem hialuronowym, która jest nie tylko antyfagocytarna, ale także może nie być rozpoznawana jako obca przez układ odpornościowy9,10.

Koniugacja kapsułki z białkami nośnikowymi przekształca je ze słabych, niezależnych od T antygenów w wysoce immunogenne antygeny zależne od T, które mogą indukować wysokie miana przeciwciał antykapsułkowych w surowicy11,12. Strategia ta jest stosowana w przypadku licencjonowanych szczepionek przeciwko S. pneumoniae, Haemophilus influenzae i Neisseria meningitides11. Aktywność opsoniczna przeciwciał antykapsułkowych była powszechnie oceniana za pomocą testów zabijania opsonofagocytarnego (OPKA)13,14,15,16. Testy te sprawdzają, czy funkcjonalne przeciwciała mogą wywoływać fagocytozę i zabijanie14. Jednak stosowanie OPKA z zakaźnymi patogenami, takimi jak Tier 1 Biological Select Agents and Toxins (BSAT), w tym B. anthracis17, jest niebezpieczne i stanowi zagrożenie dla bezpieczeństwa; Testy te wymagają intensywnego obchodzenia się z wybranym środkiem. Postępowanie z wybranymi czynnikami może odbywać się tylko w laboratoriach o ograniczonym poziomie bezpieczeństwa biologicznego 3 (BSL-3); Praca w tych obszarach wymaga długotrwałych procedur operacyjnych ze względu na liczne środki ostrożności, których należy przestrzegać. Laboratoria BSL-3 zazwyczaj nie są również wyposażone w specjalistyczny sprzęt używany do pracy OPKA, taki jak mikroskopy i cytometry. W związku z tym opracowaliśmy alternatywny test oparty na użyciu inaktywowanych bakterii18,19. Nazywamy to testem adherencji opsonowej (OAA), który nie jest zależny od internalizacji i zabijania jako wyników testu; Zamiast tego przyleganie opsonizowanych inaktywowanych patogenów jest używane jako wskaźnik fagocytozy. Mechanistycznie rzecz biorąc, OAA jest odpowiednim substytutem, ponieważ przyleganie występuje a priori i jest ściśle związane z internalizacją i zabijaniem wewnątrzkomórkowym. Z punktu widzenia bezpieczeństwa biologicznego OAA jest preferowana, ponieważ wymaga minimalnego obchodzenia się z czynnikiem zakaźnym, eksperymentalnie trwa krócej niż OPKA i może być wykonywana w laboratoriach BSL-2 po wyprodukowaniu i przeniesieniu zapasu inaktywowanego patogenu.

Pokazujemy wykorzystanie OAA do zbadania opsonicznej funkcji przeciwciał anty-kapsułkowych znalezionych w surowicach naczelnych (NHP) zaszczepionych koniugatem kapsułki [tj. PGGA z B. anthracis sprzężonego z kompleksem białek błony zewnętrznej (OMPC) Neisseria meningitides]20. Pączki opsonizowane w surowicy inkubowano z przylegającą linią komórkową makrofagów myszy, RAW 264.7. Po utrwaleniu monowarstwę komórkową i przylegające pałeczki zobrazowano za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Przyleganie bakterii wzrosło, gdy pałeczki inkubowano z surowicą NHP zaszczepionych koniugatem kapsułki w porównaniu z serum20. Przestrzeganie zaleceń korelowało z przeżywalnością wąglika challenge20,21. W ten sposób zastosowanie OAA charakteryzowało funkcję przeciwciał antykapsułkowych i znacznie ułatwiło testowanie naszego kandydata na szczepionkę.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Zgodnie z Ustawą o Dobrostanie Zwierząt, polityką Publicznej Służby Zdrowia oraz innymi federalnymi ustawami i przepisami dotyczącymi zwierząt i eksperymentów z udziałem zwierząt, opisane tutaj badania zostały przeprowadzone zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt. Ośrodek, w którym przeprowadzono te badania, jest akredytowany przez Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care, International i przestrzega zasad określonych w Przewodniku dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych, National Research Council, 201124.

1. Hodowla i utrzymanie linii komórkowej, RAW 264.7

UWAGA: Następujące procedury muszą być wykonywane z zachowaniem technik aseptycznych.

  1. Podgrzewać płodową surowicę bydlęcą (FBS) w łaźni wodnej o temperaturze 56 °C przez 30 minut w celu dezaktywacji dopełniacza.
    UWAGA: Czas inaktywacji wynoszący 30 minut rozpoczyna się, gdy FBS osiągnie 56 °C. Aby monitorować temperaturę, podgrzej podobną objętość wody w zlewce w tej samej łaźni wodnej. Gdy woda osiągnie 56 °C, rozpocznij 30-minutowe odliczanie do FBS. Alternatywnie FBS, który został inaktywowany termicznie, jest również dostępny na rynku.
  2. Przygotuj pożywkę dla komórek RAW 264.7, łącząc 90% DMEM z wysoką glukozą i 10% inaktywowanym termicznie FBS (v/v). Dodać L-glutaminę do końcowego stężenia 6 mM.
    UWAGA: DMEM z wysoką glukozą zawiera 4 mM L-glutaminy. Suplementacja L-glutaminy do 6 mM sprzyja konsekwentnemu wzrostowi komórek. W celu zapobieżenia zanieczyszczeniu można dodać 100 j./ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny. Można również wykorzystać inną popularną linię komórek mysich, J774A.1, która jest hodowana w podobnych warunkach.
  3. Zamrożoną fiolkę z komórkami rozmrozić w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i wyjąć z łaźni, gdy tylko się rozpuści. Dodać zawartość w asepcie do 5 ml kompletnego podłoża w stożkowej probówce. Dwukrotnie odwróć stożkową rurkę i wiruj z prędkością 300 x g przez 5 minut, aby uzyskać granulki.
  4. Zassać pożywkę za pomocą sterylnej pipety Pasteura podłączonej do próżni w celu usunięcia środka zamrażającego. Zawiesić osad komórkowy w 5 ml świeżej pożywki.
  5. Przenieść zawiesinę do kolby lub szalki poddanej działaniu kultury tkankowej. Dodaj tyle podłoża, aby całkowicie pokryć dno kolby i zawiruj, aby równomiernie rozprowadzić komórki. Wskaż numer przejścia rozpoczynający się od cyfry "1".
  6. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w obecności 5% CO2 i wilgotności aż do osiągnięcia zbiegu 95–100%. Sprawdzaj komórki codziennie pod mikroskopem, począwszy od drugiego dnia inkubacji. Nie pozwól, aby komórki osiągnęły >100% zbieżności, ponieważ spowoduje to uniesienie się komórek i obumarcie.
    UWAGA: Czas potrzebny do osiągnięcia zbiegu zależy od liczby żywych komórek, które zostały posiane, oraz od obszaru wzrostu kolby. Dlatego rozsądnie jest codziennie sprawdzać komórki.
  7. Subkultura komórkowa poprzez skrobanie i rozcieńczanie zapasu komórkowego w świeżej pożywce, co pozwala na co najmniej dwa dni wzrostu między skrobaniem. Zwiększ liczbę przejść o 1 z każdą subkulturą.
    UWAGA: Przejście i natychmiastowe skrobanie następnego dnia spowoduje z czasem szybszą utratę ogólnego przylegania komórek. Komórki RAW 264.7 powinny być używane tylko do około pasażu 15.
  8. Aby pokryć komórki RAW 264.7 do testu OAA, zastąp je świeżą pożywką i użyj skrobaka do komórek, aby delikatnie zeskrobać komórki z kolby. Pipetuj w górę i w dół, aby rozbić grudki komórek i ułatwić ich liczenie.
    UWAGA: Tradycyjna metoda subkulturowania RAW 264.7 polega na skrobaniu. Z naszego doświadczenia wynika, że stosowanie trypsyny powoduje, że komórki RAW 264.7 z czasem tracą przyczepność szybciej niż w przypadku skrobania.
  9. Aby policzyć komórki, rozcieńczyć równe objętości komórek i roztwór błękitu trypanowego. Załadować 10 μl na hemocytometr. Obserwuj i policz liczbę żywych komórek, które wykluczają barwnik, za pomocą odwróconego mikroskopu złożonego z soczewką obiektywową 10x.
  10. Płytka 1,4 x 104 żywe komórki na studzienkę w 96-dołkowej płaskiej płycie dna szklanej o grubości 0,15 μm (płytka #1). Pozwól komórkom rosnąć przez 3 dni. Wymień zużyte podłoże na dzień przed wykonaniem OAA.
    UWAGA: Po 3 dniach inkubacji liczba komórek powinna wynosić około 5 x 104 / dołek.  

2. Hodowla i preparaty bakteryjne

UWAGA: Gatunek bakterii użyty w tym protokole to zamknięty w kapsułkach zjadliwy szczep, B. anthracis Ames. Wszystkie manipulacje z tym gatunkiem wymagają odpowiednich poświadczeń bezpieczeństwa biologicznego i ochrony oraz muszą być wykonywane w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II lub III znajdującej się w laboratorium BSL-3. Postępuj zgodnie z instytucjonalnymi procedurami operacyjnymi dotyczącymi pracy BSL-3 i stosowania środków ochrony osobistej podczas obchodzenia się z bakteriami.

  1. Przygotować bulion z naparu z serca mózgu (BHI), rozpuszczając 37 g proszku BHI w 1 l wody i sterylizując w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 15 minut. Przechowuj bulion w temperaturze otoczenia.
  2. Przygotować 8% roztwór wodorowęglanu sodu w wodzie i wysterylizować za pomocą strzykawki filtrującej 0,20 μm. Przechowywać roztwór w temperaturze 4 °C i zużyć w ciągu 1 dnia.
  3. Wymieszaj 8 g bulionu odżywczego, 3 g ekstraktu drożdżowego i 15 g agaru w 1 l wody, aby przygotować płytki agarowe NBY. Autoklaw w temperaturze 121 °C przez 15 min. Wlać do szalek Petriego i pozostawić do zestalenia. Przechowywać talerze w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Płytki agarowe NBY mogą być wykonane z wodorowęglanem sodu lub bez. Dodanie wodorowęglanu sodu do bulionu i płytek agarowych indukuje wzrost kolonii śluzów składających się z kapsułkowanych pałeczek. Końcowe stężenie wodorowęglanu sodu zarówno w środowisku ciekłym, jak i stałym wynosi 0,8%.
  4. Przygotuj bulion hodowlany dla B. anthracis, mieszając 50% autoklawowanego bulionu BHI, 40% FBS i 10% roztworu wodorowęglanu sodu (v / v).
    UWAGA: Ten bulion został opracowany do wytwarzania krótkich łańcuchów zamkniętych w kapsułkach pałeczek.
  5. Przygotuj płytkę wzorcową B. anthracis, rozsypując ją w celu wyizolowania na płytce agarowej NBY z wywaru z zarodników na jeden dzień przed hodowlą w bulionie. Inkubować w temperaturze 37 °C.
  6. Zaszczepić 30 ml bulionu hodowlanego w wentylowanej kolbie o pojemności 250 ml kilkoma koloniami B. anthracis.
    UWAGA: Określony stosunek objętości do powierzchni bulionu, jak określono tutaj, jest potrzebny do wytworzenia maksymalnie kapsułkowanych pałeczek.
  7. Wstrząśnij kulturą bulionową przy 125 obr./min, 37 °C z 20% CO2 i wilgotnością przez 18–24 h.
    UWAGA: Uprawa B. anthracis w temperaturach wyższych niż 37 °C może hamować produkcję kapsułek.
  8. Stosować barwienie negatywowe tuszem indyjskim, aby zapewnić wystarczającą enkapsulację i to, że pałeczki są w krótkich łańcuchach (1–5 pałeczek / łańcuch) przed utrwaleniem (patrz punkt 3).
  9. Aby oznaczyć jednostki tworzące kolonie (CFU), należy seryjnie rozcieńczyć 100 μl kultury w stosunku 1:10 w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i rozcieńczyć kultury na płytkach agarowych z krwią owczą. Inkubować przez 12–18 godzin w temperaturze 37 °C. Policz jtk i oznacz liczbę bakterii na ml hodowli.
    UWAGA: Liczenie można również przeprowadzić za pomocą hemocytometru pod mikroskopem po utrwaleniu bakterii. Nie jest to jednak zalecane, ponieważ pałeczki są trudne do zauważenia w małym powiększeniu.
  10. Dodać 16% paraformaldehydu (PF) do całej objętości kultury bakteryjnej o końcowym stężeniu 4% PF, aby utrwalić pałeczki. Powoli mieszać na wytrząsarce w temperaturze otoczenia przez 7 dni.
    UWAGA: Siedmiodniowa inkubacja w 4% PF opiera się na instytucjonalnej standardowej procedurze operacyjnej USAMRIID do utrwalania pałeczek wegetatywnych.
  11. Aby usunąć utrwalacz i sprawdzić sterylność, należy trzykrotnie przemyć 4 ml (10% objętości) utrwalonej zawiesiny bakteryjnej w stożkowej probówce o pojemności 50 ml przez odwirowanie przy ≥3000 x g przez 45 minut i przy użyciu 30 ml / przemycie z PBS. Pozostałą próbkę przechowywać w 4% PF w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Po granulowaniu osad bakteryjny jest puszysty ze względu na obecność kapsułki. Uważaj, aby nie naruszyć pelletu podczas prania. Konieczne jest usunięcie wszystkich utrwalaczy, aby nie przeszkadzały one w badaniu żywotności. W razie potrzeby zwiększ liczbę prań.
  12. W celu zbadania żywotności zaszczepić 40 ml bakteryjnej pożywki hodowlanej (np. bulionu BHI) 4 ml przemytej zawiesiny (≤ 10% objętości bulionu) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 7 dni. Sprawdź gęstość optyczną przy 600 nm przed i po 7 dniach, aby zmierzyć zmętnienie.
  13. Po 7 dniach inkubacji w kulturze bulionowej ≥100 μl bulionu należy umieścić na płytce agarowej i inkubować przez kolejne 7 dni. Jeśli nie obserwuje się wzrostu zmętnienia ani wzrostu na płytkach, oryginalna kultura jest uważana za sterylną i może zostać przeniesiona do laboratorium BSL-2.
    UWAGA: Federal Select Agent Program22 nakazuje, aby inaktywowany B. anthracis mógł być przenoszony z laboratoriów BSL-3 tylko po wykazaniu całkowitej sterylności próbki. Badanie żywotności inaktywowanego B. anthracis polega na hodowli 10% próbki w bulionie przez 7 dni, a następnie hodowli na stałym podłożu przez kolejne 7 dni22,23. Postępuj zgodnie z wytycznymi instytucji, aby otrzymać zgodę na transfer po ustaleniu sterylności.

3. Barwienie ujemne i mikroskopia świetlna do obserwacji enkapsulacji i łańcuchów prątków

  1. Wymieszaj 5 μl zawiesiny bakteryjnej z 2 μl tuszu indyjskiego na szkiełku mikroskopowym. Umieść szkło nakrywkowe o grubości 1 lub 1,5 μm na wierzchu zawiesiny, nie tworząc pęcherzyków.
    UWAGA: Do uszczelnienia szkła nakrywkowego na szkiełku można użyć lakieru do paznokci.
  2. Obserwuj zawiesinę bakteryjną za pomocą soczewki obiektywu olejowego od 40x do 100x pod mikroskopem świetlnym. Upewnij się, że pałeczki są otoczone kapsułkami, obserwując strefę odstępu (kapsułka nie obejmuje atramentu indyjskiego) otaczającą każdą bakterię i że łańcuchy prątków są krótkie.

4. Oznakowanie FITC bakterii

  1. Rozpuścić izotiocyjanian fluoresceiny (FITC) w dimetylosulfotlenku w stężeniu 2 mg/ml.
  2. Zmierz objętość inaktywowanego materiału bakteryjnego.
  3. Umyj bulion 3x w PBS, aby usunąć utrwalacz.
  4. Dodać roztwór FITC o końcowym stężeniu 75 μg/ml. Mieszaninę powoli mieszać przez 18–24 h w temperaturze 4 °C.
  5. Trzykrotnie umyj bakterie, granulując w ≥3000 x g, 45 minut i używając 30 ml PBS/pranie, aby usunąć nadmiar FITC. Upewnij się, że puszysty pellet nie jest naruszony podczas prania. Ponownie zawiesić pałeczki w PBS w tym samym woluminie początkowym.
  6. Porcję i przechowywać pałeczki w mikroprobówkach w temperaturze -20 °C do momentu użycia. Nie zamrażaj/nie rozmrażaj pałeczek wiele razy, ponieważ pałeczki mogą stracić kapsułkę.

5. Opsonizacja bakteryjna

  1. Podgrzewać dezaktywować niewielką objętość surowic testowych (z NHP) w temperaturze 56 °C przez 30 minut w bloku grzewczym.
  2. Rozmrozić i przemyć bakterie znakowane FITC za pomocą PBS 2x przez granulowanie w ilości 15000 x g przez 3–5 minut. Ponownie zawiesić w PBS w tej samej objętości początkowej.
  3. W 96-dołkowej okrągłej płytce dolnej (płytka #2) seryjnie rozcieńczyć surowice testowe w pożywce komórkowej. Na kolejnej okrągłej płytce dennej z 96 dołkami (płytka #3) dodaj 10 μl rozcieńczonych surowic testowych do każdego dołka.
    UWAGA: Na każdej płytce PBS i normalne surowice małpie zostały włączone zamiast rozcieńczonych surowic testowych jako kontrole ujemne. Wybraliśmy również jedną surowicę testową jako kontrolę pozytywną, aby wygenerować krzywą standardową w celu normalizacji wszystkich testów wykonanych w różnych dniach. Surowica do badania kontrolnego dodatniego została wybrana arbitralnie, ponieważ było jej dużo.
  4. Na talerz #3 dodaj 10 μl świeżo rozpuszczonego dopełniacza dla młodego królika.
    UWAGA: Po rozpuszczeniu wyrzucić pozostały zestaw małego królika; Nie zamrażać ponownie i nie rozmrażać.
  5. Do tabliczki #3 dodaj odpowiednią objętość pałeczek znakowanych FITC dla wielokrotności infekcji 1:20. Na przykład dodaj wolumin zawierający 5 x 104 x 20 pałeczek dla 5 x 104 komórek. Uzupełnij każdą studzienkę na płytce #3 odpowiednią objętością pożywki komórkowej, aby uzyskać łącznie 105 μL.
    UWAGA: Płytka #1, która zawiera komórki, otrzymuje 100 μL opsonizowanych bakterii, a pozostałe 5 μL to objętość pustki. Przetestowaliśmy każde rozcieńczenie badanych surowic w dwóch egzemplarzach.
  6. Inkubować płytkę #3 w temperaturze 37 °C przez 30 minut w obecności 5% CO2 z wilgotnością w celu opsonizacji pałeczek.

6. Test adherencji i fluorescencyjne znakowanie komórek ssaków

  1. Przed użyciem należy utrzymywać wszystkie odczynniki w temperaturze 37 °C.
  2. Umieść płytkę #1, która zawiera przylegające komórki, na bloku grzewczym o temperaturze 37 °C.
  3. Użyj pipety wielokanałowej, aby usunąć zużyte podłoże ze studzienek i szybko zastąp je 100 μl opsonizowanych bakterii z płytki #3. Upewnij się, że podczas pipetowania w studzienkach nie powstały pęcherzyki. Inkubować płytkę #1 w temperaturze 37 °C z 5% CO2 i wilgotnością przez 30 minut w celu przestrzegania zaleceń.
  4. Umyj każdą studzienkę 5x 150 μl PBS na wierzchu bloku grzewczego o temperaturze 37 °C, aby usunąć nieprzyczepione pałeczki.
    UWAGA: Należy zachować ostrożność, aby komórki nie zostały przypadkowo rozproszone podczas prania.
  5. Rozcieńczyć 16% PF PBS w stosunku 1:4, aby uzyskać 4% PF. Utrwalić komórki 4% PF przez 1 godzinę, dodając 150 μl do każdej studzienki. Umyj komórki 2x PBS.
  6. Wymieszaj 2 μl HCS (badanie przesiewowe o wysokiej zawartości) barwienia krwinkami pomarańczy w 10 ml PBS. Dodać 150 μl tego roztworu barwiącego do utrwalonych komórek i inkubować przez 30 minut w temperaturze otoczenia.
  7. Umyj studzienki 2x za pomocą PBS.
  8. Przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu uzyskania mikroskopii.

7. Mikroskopia

UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, zautomatyzowany mikroskop fluorescencyjny o wysokiej przepustowości ułatwi obrazowanie dla OAA. Jeśli zautomatyzowany system nie jest dostępny, obrazy fluorescencyjne przylegających pałeczek można wykonać ręcznie21. W tym badaniu20, przylegające pałeczki i monowarstwy komórek zostały zobrazowane za pomocą systemu laserowej mikroskopii skaningowej Zeiss 700 ze specjalistycznym sprzętem; nasz system składał się z mikroskopu odwróconego Zeiss Axio Observer Z1 wyposażonego w stolik automatyczny, modułu Definite Focus, obiektywu 40 x NA 0,6, kamery Axio Cam HRc oraz oprogramowania Zen 2012 (Blue Edition). Uzyskane obrazy są obrazami szerokokątnymi, a nie konfokalnymi. Poniższy protokół ma na celu podstawową konfigurację mikroskopu, która ma zastosowanie do różnych zautomatyzowanych systemów mikroskopowych.

  1. Inkubować płytkę #1 w temperaturze otoczenia przez 30 minut. Włączyć mikroskop i związany z nim sprzęt.
    UWAGA: Aklimatyzacja w temperaturze otoczenia zapobiega tworzeniu się kondensatu na szklanej płytce podczas obrazowania. Ponadto zapobiega rozogniskowaniu spowodowanemu zmianą temperatury.
  2. Umieść płytkę na stole montażowym i skup się na komórkach, używając jasnego pola lub kontrastu fazowego.
  3. Wybierz format 96 dołków jako ustawienie płytki. Wybierz ustawienia kanału.
    UWAGA: Szczytowa długość fali wzbudzenia i emisji FITC wynosi 495/519 nm; barwienie pomarańczowokomórkowe HCS ma długości fali 556 i 572 nm. Inne fluorofory mogą być używane w zależności od filtrów dostępnych w mikroskopie.
  4. Wybierz ustawienie na Tryb kafelków. Wskaż liczbę obrazów, które mają zostać pobrane.
    UWAGA: Funkcja kafelkowania umożliwia uchwycenie wielu lokalizacji w dołku próbki i może być ustawiona tak, aby uzyskiwać obraz w formacie kafelkowym lub losowym. Zobrazowaliśmy 10 losowych obszarów na studnię.
  5. Zmień tryb akwizycji na "czarno-biały" lub "monochromatyczny" i binning ≥ 2x2.
    UWAGA: Ustawienie binningu z 1x1 na 2x2 lub 4x4 zwiększyłoby szybkość mikroskopii, ale skutkowałoby również niższą rozdzielczością obrazu. W przypadku OAA wystarczy użyć tych ustawień, ponieważ test zlicza zarówno makrofagi, jak i przylegające bakterie.
  6. Włącz autofokus lub moduł ostrości. Wskaż, jak często ma być wykonywana funkcja autofokusa. Włącz funkcję stosu Z, jeśli jest dostępna. Wskaż liczbę stosów Z, które uchwycą grubość monowarstwy komórek i przylegających pałeczek.
    UWAGA: Wybrana liczba stosów Z wydłuży czas mikroskopii, ale zapewni, że obraz z prawidłową ostrością zostanie wykonany na każdym stosie Z.
  7. Wyznacz folder plików, w którym chcesz zapisywać obrazy. Uruchom program do automatycznego obrazowania.

8. Gromadzenie i analiza danych

  1. Policz liczbę przylegających pałeczek i komórek ssaków na obrazie. Policz każdy łańcuch pałeczek jako jedną bakterię.
  2. Wykreślić prątki/komórki surowicy i miana w badaniu kontroli dodatniej (np. rozcieńczenie 1:10 to 10 jednostek miana) w celu wygenerowania krzywej wzorcowej w odpowiednim programie statystycznym.
  3. Przeanalizować surowicę testu kontroli dodatniej przy użyciu dopasowania krzywej regresji nieliniowej. Następnie przeanalizować pozostałe próbki, używając krzywej wzorcowej surowicy do badania kontroli dodatniej w celu wyznaczenia odpowiednich mian.
    UWAGA: Zwykle najdokładniej jest wybrać rozcieńczenia próbki w pobliżu środka krzywej wzorcowej podczas określania mian.
  4. Obliczyć średnią geometryczną próbek z każdej grupy szczepionkowej. Oblicz wartości P- mian przekształconych logarytmicznie przez analizę ANOVA o najmniejszej istotnej różnicy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W tej sekcji przedstawiono reprezentatywne mikrografie zebrane podczas eksperymentu OAA wraz z wynikami wykazującymi, że OAA może być wykorzystywany do badania funkcji biologicznych przeciwciał. W tym przypadku test został z powodzeniem zastosowany do oceny skuteczności kandydata na szczepionkę przeciw wąglikowi. Kluczowe jest zweryfikowanie stanu enkapsulacji prątków, ponieważ brak lub niewielka ilość otoczki powoduje ich przyleganie do komórek gospodarza, co generuje wysokie tło. Rysunek 1...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Wykazano, że szczepionki oparte na kapsułkach są skuteczne przeciwko wielu patogenom bakteryjnym, a wiele z nich jest dopuszczonych do stosowania u ludzi 25,26,27. Szczepionki te działają poprzez wytwarzanie przeciwciał skierowanych do kapsułki, a wiele z tych badań wykorzystuje OPKA do pokazania funkcji opsonofagocytarnych przeciwciał 13,14,16,28,29.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają powiązań komercyjnych ani innych, które mogłyby powodować konflikt interesów.

Podziękowania

J. Chua, D. Chabot i A. Friedlander zaprojektowali procedury opisane w manuskrypcie. J. Chua i T. Putmon-Taylor przeprowadzili eksperymenty. D. Chabot przeprowadził analizę danych. J. Chua napisał rękopis.

Autorzy dziękują Kyle'owi J. Fittsowi za doskonałą pomoc techniczną.

Praca była wspierana przez grant CBM przyznany przez Defense Threat Reduction Agency. VAXBT.03.10.RD.015, numer planu 921175.

Opinie, interpretacje, wnioski i rekomendacje są opiniami autorów i niekoniecznie są popierane przez armię amerykańską. Treść tej publikacji niekoniecznie odzwierciedla poglądy lub politykę Departamentu Obrony, a wzmianka o nazwach handlowych, produktach komercyjnych lub organizacjach nie oznacza poparcia ze strony rządu Stanów Zjednoczonych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,20 &mikro; m filtr strzykawkowy (25 mm, regenerowana celuloza)Corning, Corning, Nowy Jork431222
strzykawka 10 ml (końcówka Luer-Lok)BD, Franklin Lakes, NJ302995
15 i mikro; 96 dołków czarne płytki (płytka #1 do obrazowania)In Vitro Scientific, Sunnyvale, CAP96-1-N
16% paraformaldehydMikroskopia elektronowa Science, Hatfield, PA15710
75 cm kw. kolba poddana hodowli tkankowejCorning, Corning, NY430641
Agar (proszek)Sigma-Aldrich, St. Louis, MOA1296
Uzupełnienie małego królikaCedarlane Labs, Burlington, NCCL3441
Ekstrakt z drożdży baktoBD, Iskry, MD288620
BBL Napar z serca mózgu (BHI)BD, Iskry, MD211059
Płytki z agarem z krwią (TSA z krwią owczą)Remel, Lenexa, KSR01198
Skrobak do komórekSarstedt, Newton, NC83.183
Płytki do hodowli komórkowych Costar 96 dołków (płytki #2 i 3 do rozcieńczeń)Corning, Corning, NY3596
Szkło nakrywkoweMikroskopia elektronowa Science, Hatfield, PA72200-10
Bulion odżywczy DifcoBD, Iskry, MD234000
Zmodyfikowany Eagle Medium firmy Dulbecco (DMEM), wysoka glukozaGibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA11965-092zawiera 4500 mg/L glukozy, 4 mM L-glutaminy, Phenol Red
EVOS FL Auto Cell Imaging System (mikroskop fluorescencyjny)Life Technologies, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MAAMAFD1000
SurowicabydlęcaHyklon, GE Healthcare Life Sciences, South Logan, UTSH30071.03nie napromieniowany promieniami gamma, nie inaktywowany termicznie
Izotiocyjanian fluoresceinyInvitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MAF143
HCS Cell Mask Orange Cell StainInvitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MAHemocytometr H32713
(ulepszony Neubauer)Hausser Scientific, Horsham, PA3900
Indie Roztwór atramentuBD, Sparks, MD261194
L-glutamina (200 mM)Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham MA25030081pożywka uzupełniająca z dodatkowym 2mM L-glutaminą
Nikon Eclipse TE2000-U (odwrócony mikroskop złożony)Nikon Instruments, Melville, NYTE2000
PBS bez wapnia i magnezuLonza, Walkersville, MD17-516F
Roztwór penicyliny i streptomycyny, 100xHyklon, GE Healthcare Life Sciences, South Logan, UTSV30010
szalki Petriego (100 x 15 mm)Falcon, Corning, Durham, NC351029do płytek agarowych
Linia komórkowa makrofagów RAW 264.7 (Tib47)ATCC, Manassas, VAATCC TIB-71
SlajdyVWR, Radnor, PA16004-422
Wodorowęglan soduSigma-Aldrich, St. Louis, MOS5761
Roztwór błękitu trypanowego (0,4%)Sigma-Aldrich, St. Louis, MOT8154
Laserowa mikroskopia skaningowa Zeiss 700 (mikroskop konfokalny)Carl Zeiss Microimaging, Thornwood, Nowy Jork4109001865956000

Bibliografia

  1. Walters, M. N., Papadimitriou, J. M. Phagocytosis: a review. CRC Critical Reviews in Toxicology. 5 (4), 377-421 (1978).
  2. Metschnikoff, E. Untersuchurgen uber die intracellulare Verdauung, bei wirbellosen Thieren. Arbeiten aus dem Zoologischen Instituten der Universität Wien. 5, 144(1883).
  3. Tauber, A. I. Metchnikoff and the phagocytosis theory. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (11), 897-901 (2003).
  4. Janeway, C. A. The immune system evolved to discriminate infectious nonself from noninfectious self. Immunology Today. 13 (1), 11-16 (1992).
  5. Kumagai, Y., Akira, S. Identification and functions of pattern-recognition receptors. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 125 (5), 985-992 (2010).
  6. Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. The cell biology of phagocytosis. Annual Review of Pathology. 7, 61-98 (2012).
  7. Candela, T., Fouet, A. Poly-gamma-glutamate in bacteria. Molecular Microbiology. 60 (5), 1091-1098 (2006).
  8. Kocianova, S., et al. Key role of poly-gamma-DL-glutamic acid in immune evasion and virulence of Staphylococcus epidermidis. Journal of Clinical Investigation. 115 (3), 688-694 (2005).
  9. Rothbard, S. Protective effect of hyaluronidase and type-specific anti-M serum on experimental group A Streptococcus infection in mice. Journal of Experimental Medicine. 88 (3), 325-342 (1948).
  10. Oh, S. Y., Budzik, J. M., Garufi, G., Schneewind, O. Two capsular polysaccharides enable Bacillus cereus G9241 to cause anthrax-like disease. Molecular Microbiology. 80 (2), 455-470 (2011).
  11. Knuf, M., Kowalzik, F., Kieninger, D. Comparative effects of carrier proteins on vaccine-induced immune response. Vaccine. 29 (31), 4881-4890 (2011).
  12. Wang, T. T., Lucas, A. H. The capsule of Bacillus anthracis behaves as a thymus-independent type 2 antigen. Infection & Immunity. 72 (9), 5460-5463 (2004).
  13. Vogel, L., et al. Quantitative flow cytometric analysis of opsonophagocytosis and killing of nonencapsulated Haemophilus influenzae by human polymorphonuclear leukocytes. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 1 (4), 394-400 (1994).
  14. Salehi, S., Hohn, C. M., Penfound, T. A., Dale, J. B. Development of an Opsonophagocytic Killing Assay Using HL-60 Cells for Detection of Functional Antibodies against Streptococcus pyogenes. mSphere. 3 (6), 00617-00618 (2018).
  15. Wang, Y., et al. Novel Immunoprotective Proteins of Streptococcus pneumoniae Identified by Opsonophagocytosis Killing Screen. Infection & Immunity. 86 (9), (2018).
  16. Humphries, H. E., et al. Seroprevalence of Antibody-Mediated, Complement-Dependent Opsonophagocytic Activity against Neisseria meningitidis Serogroup B in England. Clinical and Vaccine Immunology. 22 (5), 503-509 (2015).
  17. List of Tier 1 BSAT. , Available from: www.selectagents.gov/ohp-app1.html (2017).
  18. Jansen, W. T., et al. Use of highly encapsulated Streptococcus pneumoniae strains in a flow-cytometric assay for assessment of the phagocytic capacity of serotype-specific antibodies. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 5 (5), 703-710 (1998).
  19. Wang, T. T., Fellows, P. F., Leighton, T. J., Lucas, A. H. Induction of opsonic antibodies to the gamma-D-glutamic acid capsule of Bacillus anthracis by immunization with a synthetic peptide-carrier protein conjugate. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 40 (3), 231-237 (2004).
  20. Chabot, D. J., et al. Protection of rhesus macaques against inhalational anthrax with a Bacillus anthracis capsule conjugate vaccine. Vaccine. 34 (34), 4012-4016 (2016).
  21. Chabot, D. J., et al. Efficacy of a capsule conjugate vaccine against inhalational anthrax in rabbits and monkeys. Vaccine. 30 (5), 846-852 (2012).
  22. Revised FSAP Policy Statement: Inactivated Bacillus anthracis and Bacillus cereus Biovar anthracis. , Available from: www.selectagents.gov/policystatement_bacillus.html (2017).
  23. Chua, J., et al. Formaldehyde and Glutaraldehyde Inactivation of Bacterial Tier 1 Select Agents in Tissues. Emerging Infectious Diseases. 25 (5), 919-926 (2019).
  24. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (Eighth Edition). , Available from: https://grants.nih.gov/grants/olaw/guide-for-the-care-and-use-of-laboratory-animals.pdf (2011).
  25. Durando, P., et al. Experience with pneumococcal polysaccharide conjugate vaccine (conjugated to CRM197 carrier protein) in children and adults. Clinical Microbiology and Infection. 19, Suppl 1 1-9 (2013).
  26. Adams, W. G., et al. Decline of childhood Haemophilus influenzae type b (Hib) disease in the Hib vaccine era. JAMA. 269 (2), 221-226 (1993).
  27. Balmer, P., Borrow, R., Miller, E. Impact of meningococcal C conjugate vaccine in the UK. Journal of Medical Microbiology. 51 (9), 717-722 (2002).
  28. Chen, M., et al. Induction of opsonophagocytic killing activity with pneumococcal conjugate vaccine in human immunodeficiency virus-infected Ugandan adults. Vaccine. 26 (38), 4962-4968 (2008).
  29. Paschall, A. V., Middleton, D. R., Avci, F. Y. Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens. Journal of Visualized Experiments. (146), e59400(2019).
  30. Ezzell, J. W., Welkos, S. L. The capsule of Bacillus anthracis, a review. Journal of Applied Microbiology. 87 (2), 250(1999).
  31. Hanna, P. C., Acosta, D., Collier, R. J. On the role of macrophages in anthrax. Proceedings of the National Academies of Sciences of the United States of America. 90 (21), 10198-10201 (1993).
  32. Fleck, R. A., Romero-Steiner, S., Nahm, M. H. Use of HL-60 cell line to measure opsonic capacity of pneumococcal antibodies. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 12 (1), 19-27 (2005).
  33. Chua, J., Deretic, V. Mycobacterium tuberculosis reprograms waves of phosphatidylinositol 3-phosphate on phagosomal organelles. Journal of Biological Chemistry. 279 (35), 36982-36992 (2004).
  34. Chua, J., et al. pH Alkalinization by Chloroquine Suppresses Pathogenic Burkholderia Type 6 Secretion System 1 and Multinucleated Giant Cells. Infection & Immunity. 85 (1), (2017).
  35. Ober, R. J., Radu, C. G., Ghetie, V., Ward, E. S. Differences in promiscuity for antibody-FcRn interactions across species: implications for therapeutic antibodies. International Immunology. 13 (12), 1551-1559 (2001).
  36. Sorman, A., Zhang, L., Ding, Z., Heyman, B. How antibodies use complement to regulate antibody responses. Molecular Immunology. 61 (2), 79-88 (2014).
  37. Henckaerts, I., Durant, N., De Grave, D., Schuerman, L., Poolman, J. Validation of a routine opsonophagocytosis assay to predict invasive pneumococcal disease efficacy of conjugate vaccine in children. Vaccine. 25 (13), 2518-2527 (2007).
  38. Wolf, J. J. Special Considerations for the Nonclinical Safety Assessment of Vaccines. , Elsevier. 243-255 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

kom rki RAW 264 7mikroskopia fluorescencyjnaznakowanie FITCopsonizacja dope niaczemobrazowanie zautomatyzowaneweryfikacja enkapsulacjibadanie sterylno ciskuteczno szczepionki
Test opsono-adherencji w celu oceny funkcjonalnych przeciwciał w procesie opracowywania szczepionki przeciwko Bacillus anthracis i innym otoczkowanym patogenom
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.