Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Inżynieria wewnątrzkomórkowych czujników białek w komórkach ssaków

2.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60878

⸱

28 kwietnia 2020

 ,  ,  , 
1Istituto Italiano di Tecnologia, 2Synthetic Biology Center, Department of Biological Engineering, Massachusetts Institute of Technology

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół inżynierii genetycznie kodowanych wewnątrzkomórkowych czujników-siłowników białkowych. Urządzenie specyficznie wykrywa białka docelowe za pomocą przeciwciał wewnątrzkomórkowych (intrabodies) i reaguje poprzez włączenie wyjścia transkrypcyjnego genów. Zbudowano ogólną ramę, która umożliwia szybką wymianę wewnątrzciał, umożliwiając szybkie wykrycie dowolnego pożądanego białka bez zmiany ogólnej architektury.

Streszczenie

Białka mogą funkcjonować jako biomarkery stanów patologicznych, takich jak choroby neurodegeneracyjne, infekcje czy zespoły metaboliczne. Inżynieria komórek w celu wyczuwania i reagowania na te biomarkery może pomóc w zrozumieniu mechanizmów molekularnych leżących u podstaw patologii, a także w opracowaniu nowych terapii komórkowych. Chociaż opracowano kilka systemów wykrywających białka zewnątrzkomórkowe, brakowało modułowej struktury, którą można łatwo przeprojektować w celu wykrywania różnych białek wewnątrzkomórkowych.

Tutaj opisujemy protokół implementacji modułowej platformy genetycznej, która wykrywa białka wewnątrzkomórkowe i aktywuje określoną odpowiedź komórkową. Urządzenie działa na wewnątrzkomórkowych przeciwciałach lub małych peptydach, aby wyczuć z dużą swoistością interesujące białko, wyzwalając transkrypcyjną aktywację genów wyjściowych za pośrednictwem modułu aktywacyjnego opartego na proteazie TEV (TEVp). TEVp jest proteazą wirusową, która selektywnie rozszczepia krótkie pokrewne peptydy i jest szeroko stosowana w biotechnologii i biologii syntetycznej ze względu na wysoką ortogonalność do miejsca cięcia. W szczególności zaprojektowaliśmy urządzenia, które rozpoznają i reagują na biomarkery białkowe infekcji wirusowych i chorób genetycznych, w tym zmutowaną huntingtynę, proteazę serynową NS3, białka Tat i Nef, aby wykrywać odpowiednio chorobę Huntingtona, wirus zapalenia wątroby typu C (HCV) i wirus ludzkiego niedoboru odporności (HIV). Co ważne, system można ręcznie dostosować do pożądanych wyników funkcjonalnych wejścia-wyjścia, takich jak odczyty fluorescencyjne dla bioczujników, stymulacja prezentacji antygenu w celu odpowiedzi immunologicznej lub inicjacja apoptozy w celu wyeliminowania niezdrowych komórek.

Wprowadzenie

Badanie i modulacja odpowiedzi komórkowych za pomocą kontrolowanych obwodów genowych są głównymi celami biologii syntetycznej1,2,3 dla rozwoju przyszłych narzędzi o odpowiednich zastosowaniach biologicznych lub medycznych w raku4, infekcje5, choroby metaboliczne6, oraz immunologia7.

Przeprogramowanie funkcji komórek w odpowiedzi na określone sygnały wymaga zaprojektowania inteligentnych interfejsów, które łączą wykrywanie zewnętrznych lub wewnątrzkomórkowych zmian dynamicznych (wejście) z dalszym przetwarzaniem, wyzwalając określone wyjście albo do celów diagnostycznych (np. geny reporterowe), albo do zmiany odpowiedzi komórki (terapie). Dane wejściowe wykrywane przez moduł czujnikowy mogą być małymi analitami8, proteins9,10,11 lub microRNAs11,12,13, specyficzne dla wystąpienia lub postępu choroby. Co więcej, złożona regulacja obwodów może być osiągnięta poprzez przetwarzanie wielu informacji wejściowych, zwiększając ścisłą kontrolę nad ekspresją transgenu w odpowiedzi na zdefiniowane warunki14,15,16. Na przykład czujniki oparte na mikroRNA mogą identyfikować określone typy komórek, takie jak komórki nowotworowe, indukując ich klirens z ekspresją genu apoptotycznego13. Ponieważ mikroRNA można łatwo zaimplementować w obwodach syntetycznych w sposób modułowy, stanowią one szeroko stosowany wkład dla genetycznie kodowanych biosensorów12,13,17. Białka są również ważnym biomarkerem mutacji genetycznych, nowotworów i infekcji, a także zgłoszono wiele zewnątrzkomórkowych urządzeń wykrywających białka18,19.

Wiele obwodów wykrywających białka zewnątrzkomórkowe opiera się na użyciu zmodyfikowanych receptorów, które wiążą czynnik transkrypcyjny (TF) z błoną, połączoną z miejscem rozszczepienia reagującym na TEVp (TCS). Główną zaletą TEVp jest specyfika rozszczepienia i brak ingerencji w endogenne przetwarzanie białek. W tych systemach TEVp jest łączony z drugim peptydem, który oddziałuje ze zmodyfikowanym receptorem po związaniu cząsteczek zewnątrzkomórkowych. W ten sposób zewnętrzne wejścia indukują rozszczepienie za pośrednictwem TEVp i uwalnianie TF. Systemy, które działają w oparciu o ten mechanizm, to Tango/TEVp18, light-induked20 oraz Modular Extracellular Sensor Architecture (MESA)19. Pomimo postępów w wykrywaniu białek zewnątrzkomórkowych, technologia wykrywania białek wewnątrzkomórkowych w sposób modułowy nigdy wcześniej nie została zrealizowana, z ograniczeniem polegającym na przechodzeniu przez wiele iteracji kompilacji i testów dla pojedynczych urządzeń reagujących na określone białko.

Nasz system jest pierwszą platformą do wewnątrzkomórkowego wykrywania białek21. Modułowość jest gwarantowana przez zastosowanie ciał wewnątrzkomórkowych, które definiują specyficzność dla celu, podczas gdy przeprogramowanie komórki odbywa się za pośrednictwem TEVp. W szczególności jedno ciało wewnętrzne jest związane z błoną i połączone z C-końcem z białkiem fluorescencyjnym mKate, TCS i TF (białko fuzyjne 1); drugi intrabody jest połączony z TEVp i znajduje się w cytozolu (białko fuzyjne 2) (Rysunek 1).

Tak więc, interakcja między dwoma intrabody a docelowym białkiem zachodzi w cytoplazmie i prowadzi do rozszczepienia TCS przez TEVp, co skutkuje translokacją TF do jądra w celu aktywacji funkcjonalnego wyjścia. Urządzenie wykrywająco-aktywujące zostało pomyślnie przetestowane pod kątem czterech wewnątrzkomórkowych białek specyficznych dla choroby: proteazy serynowej NS3 ulegającej ekspresji wirusa HCV22, białek Tat i Nef z zakażenia HIV23,24 oraz zmutowanej huntingtyny (HTT) choroby Huntingtona25. Wyrażenie wyjściowe obejmuje reportery fluorescencyjne, gen apoptozy (hBax)26 i immunomodulatory (XCL-1)27. Wykazaliśmy, że system może również upośledzać patologiczne funkcjonowanie swoich celów. Na przykład, urządzenie reagujące na Nef zakłóca rozprzestrzenianie się infekcji wirusowej poprzez sekwestrację docelowego białka i odwrócenie modulacji w dół receptora HLA-I na zakażonych limfocytach T24. Opisana platforma wykrywająco-aktywująca jest pierwszą tego typu platformą do wykrywania białek wewnątrzkomórkowych i może być potencjalnie zaimplementowana do wykrywania nieprawidłowej ekspresji białek, modyfikacji potranslacyjnych lub epigenetycznych, do celów diagnostycznych i terapeutycznych20.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Zasady projektowania konstrukcji i testowania urządzenia czujnik-siłownik

  1. Wybierz interesujące Cię białko.
    UWAGA: Zaprojektowaliśmy system dla białek znajdujących się w cytoplazmie lub przemieszczających się między cytoplazmą a innymi przedziałami.
  2. Wybierz dwa wewnątrzciałka wiążące różne epitopy docelowego białka. W naszym badaniu wybraliśmy białka, dla których wewnątrzciała zostały już opracowane i przetestowane28,29,30,31. W przypadku gdy wewnątrzciała nie są dostępne, powinny być nowo opracowane.
    UWAGA: Alternatywą dla intrabody mogą być inne cząsteczki, które oddziałują z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania. Na przykład urządzenie wykrywające Nef zawiera jedno ciało wewnątrztrzonowe (sdAb19) i domenę SH3 kinazy tyrozynowej białka p59fyn32.
  3. Projektowanie in silico plazmidów z sekwencjami DNA kodującymi białka fuzyjne.
    UWAGA: Oprogramowanie do projektowania plazmidów jest dostępne za darmo lub można je kupić.
    1. Generuj sekwencje, które zawierają następujące moduły: znacznik błony, marker fluorescencyjny (np. mKate), intrabody, TCS i TF dla białka fuzyjnego 1 oraz intrabody i TEVp dla białka fuzyjnego 2.
      UWAGA: Zbudowanie nowej architektury opartej na interakcji kilku komponentów wymaga zwrócenia uwagi na parametry, które mogą maksymalizować aktywację sygnału po wykryciu białka docelowego. W szczególności skupiliśmy się na aktywności TEVp i elastyczności białek chimerycznych w celu ułatwienia interakcji białko-białko (Tabela 1). Wszystkie te cechy są określone w poniższych punktach.
    2. Wprowadzić elastyczną domenę łącznikową glicyna-seryna (LD) między wewnątrzciałem TCS i/lub TEVp wewnątrz ciała. LD może mieć różną długość (0, 10 lub 15 aminokwasów-AA).
    3. Białko fuzyjne 1: Zaprojektuj warianty, które obejmują TCS (S) o wysokim powinowactwie lub TCS o niskim powinowactwie (L) w celu regulacji aktywności rozszczepienia TEVp. Ekspresja tego konstruktu jest napędzana przez konstytutywny promotor. Uwzględnij czynnik transkrypcyjny GAL4VP16 na C-końcu TCS, aby umożliwić translokację do jądra po rozszczepieniu TEVp.
      UWAGA: Użyliśmy promotora hEF1a, ale można wybrać inne promotory składowe.
    4. Białko fuzyjne 2: Użyj konstytutywnego (hEF1a) lub indukowanego doksyklicyną (pTET), aby dostroić transkrypcję TEVp. Użyj domeny degradacji (DD) regulowanej przez osłonę małych cząsteczek, aby modulować stabilność białka.
      UWAGA: Potencjalnie można wybrać inne indukowalne systemy, które dostrajają ekspresję białek.
    5. Wyjście: Umieść gen reporterowy za promotorem UAS, który reaguje na czynnik transkrypcyjny GAL4VP16. Wybierz wyjście zgodnie z zastosowaniem urządzenia (np. białko fluorescencyjne, cytokina itp.).
  4. Wykonuj klonowanie przy użyciu dowolnej preferowanej strategii. Tutaj zbudowaliśmy plazmidy za pomocą technologii golden gate lub gateway.
  5. Przetestuj różne konfiguracje urządzenia w żądanych liniach komórkowych za pomocą transfekcji przejściowej. Kotransfekcja komórek z otrzymanymi plazmidami dla białek fuzyjnych 1 i 2 oraz fluorescencyjnego genu reporterowego, takiego jak UAS-EYFP. Białko fuzyjne 1 zawiera białko czerwonej fluorescencji (mkate) używane jako marker transfekcji.
    UWAGA: Zacznij od prostych do transfekcji linii komórkowych, takich jak HEK293FT komórki, aby przetestować urządzenia.
    1. Transfekcja w komórkach HEK293FT. Wysiewaj 2 x 105 komórek na 24-dołkową płytkę z 500 μl DMEM. Komórki transfekcyjne o całkowitej zawartości DNA 300 ng za pomocą odczynnika do transfekcji, mieszać wirowo i inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut.
      1. Umieścić komórki w inkubatorze o temperaturze 37 °C/5% CO2 . Dodać świeżą pożywkę hodowlaną 24 godziny po transfekcji.
    2. Transfekcja w komórkach Jurkat. Użyj 3 x 105 komórek w 500 μl pożywki do hodowli komórkowych RPMI na płytce 24-dołkowej. Elektroporację należy wykonać zgodnie z instrukcją producenta. Na każdą próbkę należy użyć 2-4 μg całkowitego DNA. Dodać 500 μl świeżej pożywki do hodowli komórkowych 24 godziny po transfekcji.
      1. Podczas elektroporacji umieść komórki i DNA na lodzie. Następnie umieścić komórki w inkubatorze o temperaturze 37 °C/5% CO2 .
        UWAGA: W zależności od konkretnego zastosowania urządzenia można wybrać różne linie komórkowe i metody transfekcji.
  6. Pozyskiwanie obrazów mikroskopowych w celu uzyskania jakościowego zrozumienia funkcjonalności urządzenia. Potwierdź lokalizację błonową białka fuzyjnego 1, wykrywając sygnał fluorescencyjny (mkate) w pobliżu błony komórkowej. Wizualizacja wyjścia fluorescencyjnego (EYFP) w obecności lub braku (kontrola ujemna-NC) białka docelowego.
    1. Użyj systemu obrazowania komórek wyposażonego w kostki świetlne Tx Red i GFP, aby wykryć białka fluorescencyjne mKate i EYFP. Użyj obiektywu 10x lub 20x.
      UWAGA: Używaj komórek nietransfekowanych, aby upewnić się, że nie ma autofluorescencji.
  7. Analiza transfekcji za pomocą cytometrii przepływowej (FACS).
    UWAGA: Patrz Protokół 2 w celu przygotowania próbki.
    1. Oceń urządzenia w obecności białka docelowego. Stwórz matrycę eksperymentalną, która łączy warianty białka fuzyjnego 1 i 2, modulując TEVp za pomocą (i) konstytutywnego promotora hEf1a, (ii) indukowanego doksycykliną promotora TET i (iii) tarczy zapewniającej stabilność białka. Dodać doksycyklinę i osłonę w stężeniach (0-1000 nM).
    2. Wykonaj analizę FACS, aby porównać indukcję fałdowania EYFP między próbkami z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania lub bez niego.
      UWAGA: Najwyższa indukcja krotności odpowiada największej czułości wejściowej w trybie ON (obecność białka docelowego) w porównaniu z trybem OFF (brak białka docelowego).
  8. Przetestuj funkcjonalność urządzenia w odniesieniu do pożądanych aplikacji.
    1. Uruchom analizę FACS, aby zmierzyć poziomy białek wyjściowych lub apoptozy lub inne odpowiednie testy.
    2. Wykonaj analizę RT PCR, jeśli część wyjściowa urządzenia reguluje poziomy ekspresji docelowych genów. Oblicz 2-ddCT w odniesieniu do genu utrzymania domu (GAPDH lub równoważny) i porównaj krotną zmianę ekspresji wyjściowej w trybach ON i OFF.

2. Przygotowanie próbki do analizy metodą cytometrii przepływowej

  1. Przeprowadzić analizę ilościową urządzeń białkowych za pomocą cytometru przepływowego (FACS) 48 godzin po transfekcji.
    1. Odessać pożywkę DMEM i przepłukać HEK293FT komórki 300 μl PBS. Dodać 100 μl trypsyny i pozostawić w inkubatorze o temperaturze 37 °C/5% CO2 na 2-4 minuty.
      UWAGA: Komórki Jurkata nie wymagają trypsyny.
    2. Dodaj 400 μl pożywki DMEM bez czerwieni fenolowej i ponownie zawieś komórki, aby uniknąć tworzenia się grudek. Transfer w probówkach FACS.
    3. Użyj cytometru przepływowego wyposażonego w lasery 405, 488 i 561 nm.
    4. Zbierz 30 000 – 100 000 zdarzeń wybranych z populacji żywych komórek przy użyciu następujących ustawień cytometru: laser 488 nm i filtr pasmowoprzepustowy 530/30 nm dla EYFP/EGFP, laser 561 nm i filtr 610/20 nm dla mKate oraz laser 405 nm, filtr 450/50 dla EBFP.
      UWAGA: Aby skonfigurować cytometr przepływowy, dołącz komórki nietransfekowane i komórki transfekowane pojedynczymi białkami fluorescencyjnymi.
    5. Wykonaj analizę pobranych próbek za pomocą preferowanego oprogramowania (np. oprogramowania DIVA, Flowjo lub metody TASBE33).

3. Charakterystyka urządzenia czujnik-siłownik HCV

  1. Wybierz intrabody do wykrycia białka NS3. scFv35 i scFv162 wiążą się z dwoma różnymi epitopami i dlatego zostały wybrane.
  2. Projektowanie i testowanie wariantów urządzenia reagującego na NS3 zgodnie z uzasadnieniem opisanym w kroku 1.3 (np. białko fuzyjne 1: znacznik błonowy, mKate, pojedynczy fragment łańcucha wewnątrz ciała scFv35, LD0, TCS-L i TF GAL4VP16; Białko fuzyjne 2: pojedynczy fragment łańcucha wewnątrztrzonowy scFv162, LD0 i TEVp; Wyjście: UAS-EYFP lub UAS-hBax (apoptoza); NS3 (zob. tabela 2)).
  3. Przetestuj konstrukcje w HEK293FT komórkach.
    UWAGA: Dla każdego eksperymentu należy ustawić kontrolę ujemną, która polega na dostarczeniu urządzenia i kwantyfikacji wyjściowej w przypadku braku białka będącego przedmiotem zainteresowania.
    1. Zbadać urządzenia pod kątem TEVp pod konstytutywnym promotorem w obecności lub bez NS3. Przeprowadzić transfekcję białka fuzyjnego 1 (etap 1.3.3), białka fuzyjnego 2 (etap 1.3.4) i etapu wyjściowego EYFP (1.3.5) w komórkach HEK293FT, jak opisano w kroku 1.5.1. Analizować próbki 48 godzin po transfekcji, mierząc reporter fluorescencyjny (EYFP) za pomocą cytometrii przepływowej (Protokół 2).
    2. Oceń interakcję wewnątrzciało-NS3 przez kolokalizację mKate i BFP przy użyciu białka fuzyjnego BFP-NS3. Komórki transfekcyjne z białkiem fuzyjnym 1, które zawiera mKate, oraz z BFP-NS3. 48 godzin po transfekcji obserwuj komórki pod mikroskopem konfokalnym (obiektyw 63x) w celu zbadania kolokalizacji białek fluorescencyjnych.
      UWAGA: Użyj BFP (nie połączonego z NS3) jako kontroli negatywnej. W tym stanie BFP powinien wykazywać rozproszoną lokalizację komórkową i nie powinien współlokalizować się z mKate związanym z błoną.
    3. Przetestować urządzenia pod kątem TEVp pod promotorem pTET w obecności lub bez NS3. Porównaj EYFP w przypadku braku i obecności NS3. Komórki kotransfekcyjne z białkiem fuzyjnym 1 (etap 1.3.3), białkiem fuzyjnym 2 (etap 1.3.4) i wyjściem EYFP (etap 1.3.5) przy użyciu protokołu opisanego w kroku 1.5.1. Transfekcje wykonuje się w obecności lub braku NS3. Analizować próbki 48 godzin po transfekcji, mierząc reporter fluorescencyjny (EYFP) za pomocą cytometrii przepływowej (Protokół 2).
  4. Zabijanie komórek testowych sterowane przez urządzenie NS3.
    1. Zastąp wynik EYFP genem apoptozy hBax.
    2. Powtórz krok 3.3.3. Zebrać komórki 48 godzin po transfekcji i przemyć PBS przed rozpoczęciem testu.
    3. Wykonaj test apoptozy z aneksyną V sprzężoną z błękitem pacyficznym. Komórki barwione markerem apoptotycznym anektyną V (sprzężoną z 2,5 μl błękitu pacyficznego) rozcieńczone w buforze wiążącym (stosunek objętości 1:20) przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
    4. Analizuj komórki za pomocą cytometrii przepływowej. Oblicz poziom apoptozy w populacji jako liczbę komórek dodatnich w kolorze pacyficzno-niebieskim (Aneksyna V).

4. Charakterystyka czujnika-aktywatora HIV reagującego na Nef

  1. Wybierz intrabody, które wiążą się z Nef. Wybrano jednodomenowe wewnątrzcielesne sdAb19 i SH3, ponieważ wiążą się one z różnymi epitopami.
    UWAGA: SH3 nie jest wewnątrzciałem, ale domeną kinazy tyrozynowej białka p59fyn, która fizjologicznie oddziałuje z Nef.
  2. Projektowanie i testowanie wariantów urządzenia reagującego na Nef zgodnie z uzasadnieniem opisanym w kroku 1.3 (np. białko fuzyjne 1: znacznik błonowy, mKate, sdAb19, LD0, TCS-L i GAL4-VP16; Białko fuzyjne 2: SH3, LD0 i TEVp; Wyjście: UAS-EYFP; Nef (zob. tabela 3)).
  3. Przetestuj urządzenia w HEK293FT i limfocytach T Jurkat.
    UWAGA: Dla każdego eksperymentu ustalamy kontrolę ujemną, czyli dostarczenie urządzenia i kwantyfikację wyjściową w przypadku braku białka będącego przedmiotem zainteresowania
    1. Transfekcja HEK293FT: Postępować zgodnie z procedurą opisaną w kroku 1.5.1 w przypadku obecności lub braku Nef.
    2. Transfekcja limfocytów T Jurkat: Postępuj zgodnie z procedurą opisaną w kroku 1.5.2 w przypadku obecności lub braku Nef.
    3. 48 godzin po transfekcji przeanalizować próbki za pomocą cytometru przepływowego, jak opisano w protokole 2.
  4. Zakażenie komórek Jurkata szczepami HIV LAI w celu wykrycia wirusa HIV.
    1. Zapasy wirusa należy przygotować co najmniej 48 godzin przed eksperymentem. Użyj wirusa uzyskanego z transfekcji komórek HEK-293T z zakaźnymi klonami molekularnymi (program odczynników NIH AIDS) i odczynników komercyjnych zgodnie z instrukcjami producenta. Zagęścić wirusa po 40 godzinach przez ultrawirowanie przez 1 godzinę, 64 074 x g, 4°C na 20% sacharozy, aby uniknąć białek wolnych od cząstek wirusa. Miano zapasów wirusa z HIV-1 p24 ELISA.
    2. Zakażone komórki szczepami HIV-1 za pomocą 500 ng inokulum p24. 40 godzin po zakażeniu określić ilościowo odsetek zakażonych komórek, wykrywając białko wirusowe p24 za pomocą sprzężonego przeciwciała KC57-FITC i wykonując analizę cytometrii przepływowej.
    3. Wybarwić komórki za pomocą skoniugowanych przeciwciał AlexaFluor 647 klonu W6/32 przeciwko HLA-A, B, C. Napraw komórki i przeanalizuj na cytometrze przepływowym. Nef pośredniczył w zmniejszaniu modulacji HLA-I w limfocytach T Jurkat w obecności lub bez czujnika białka.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Architektura do modułowego wykrywania białek wewnątrzkomórkowych
Jak pokazano na Rysunek 1, urządzenie składa się z: 1) wnętrza 1 połączonego z markerem fluorescencyjnym na uwięzi membranowej (mKate) i miejscem cięcia TEVp (TCS), a następnie aktywatora transkrypcji GAL4VP16 (TF); 2) wewnątrzciałowy 2 połączony z proteazą TEV (TEVp), wolny w cytozolu; 3) syntetyczny promotor reagujący na GAL4VP16, napędzający ekspresję genu reporterowego. Modułowość jest gwarantowana prze...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Do niedawna badanie komórek w oparciu o środowisko wewnątrzkomórkowe odbywało się za pomocą systemów opracowanych de novo dla konkretnych celów. Niniejszy protokół opisuje przykład najnowszego podejścia inżynierii komórkowej do wykrywania i uruchamiania białek w jednym urządzeniu, które można szybko dostosować do nowych pożądanych biomarkerów.

Ten pionierski system wykrywa białka wewnątrzkomórkowe i zapewnia określony sygnał wyjściowy do wykrywania lub neutralizowania choroby. Zaletą tej klasy...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Istituto Italiano di Tecnologia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AlexaFluor 647 mysi klon przeciwciała anty-ludzkiego HLA-A, B, C W6/32Biolegend311414
Przeciwciała Aneksyna VLifeTechnologiesA35122Marker apoptozy
AttracteneQiagen301005Odczynnik do transfekcji
BD Falcon Probówki okrągłodenneBD Biosciences352053FACS
DoksycyklinaClonetech-Hodowla komórkowa: Leki
Zmodyfikowana pożywka Eagle firmy DulbeccoCellgro10-013-CMHodowla komórkowa: Średni
system obrazowania komórek Evos TechnologiażyciaEVOS M5000Systemy obrazowania; Zakaźne klony molekularne
Oprogramowanie FACSDiva8 OprogramowanieBD Biosciences659523FACS
Szybkie SYBR Green Master MixThermoFisher Scientific4385612reakcja qPCR
FBS (Fetal Bovin Serum)Atlanta BIOS11050Hodowla komórkowa: Medium
Gateway SystemLifeTechnologies-Budowaplazmidu
Golden Gate Własnakonstrukcja plazmidu
HEK 293FTInvitrogenR70007Hodowla komórkowa:
System klonowania infuzjiClonetech638920Budowa plazmidu
Odczynnik JetPRIMETransfekcja Polyplus 114-15Odczynnik do transkonfekcji
Jurkat CellsATCCTIB-152Hodowla komórkowa: Komórki
L-GlutaminaSigma-AldrichG7513-100MLHodowla komórkowa: Średnia
Lipofektamina LTX z odczynnikiem Plus OdczynniktransfekcjiThermo Fisher Scientific15338030
Cytometr przepływowy LSR Fortessa (405, 488 i 561  lasery nm)BD Biosciences649225Cytometr przepływowy
MicroAmp Szybka optyczna 96-dołkowa płytka reakcyjna (0,1 i thinsp; mL)ThermoFisher Scientific4346907reakcja qPCR
System transfekcji neonowejTechnologie życiaMPK10025Odczynnik do transfekcji
Aminokwasy endogenneHyCloneSH3023801Hodowla komórkowa: Pożywka
Opti-MEM I zredukowana pożywka surowicyTechnologie życia31985070Pożywka transfekcyjna
Penicylina/StreptomycynaSigma-AldrichP4458-100MLHodowla komórkowa: Średni
zestaw do odwrotnej transkrypcji QuantiTect Zestaw transkryptazyQiagen205313Rev
RNeasy Mini KitZestaw do ekstrakcji RNAQiagen74106
RPMI-1640ATCC ATCC 30­ 2001Hodowla komórkowa: Średnia
tarczaClonetech632189Hodowla komórkowa: Leki
Koraliki SpheroTech RCP-30-5-ASpherotechRCP-30-5A-2Konfiguracja kompensacji
StepOnePlus 7500 Szybka maszynaApplied Biosystems4351106reakcji qPCR
komórek do

Bibliografia

  1. Bernardo, D., Marucci, L., Menolascina, F., Siciliano, V. Predicting Synthetic Gene Networks. Synthetic Gene Networks: Methods and Protocols. 813, 57-81 (2012).
  2. Krams, R., et al. Mammalian synthetic biology: emerging medical applications. J. R. Soc. Interface. 12, (2015).
  3. MacDonald, J. T., Siciliano, V. Computational Sequence Design with R2oDNA Designer. Methods in molecular biology. 1651, Clifton, N.J. 249-262 (2017).
  4. Zah, E., Lin, M. -Y., Silva-Benedict, A., Jensen, M. C., Chen, Y. Y. T cells expressing CD19/CD20 bi-specific chimeric antigen receptors prevent antigen escape by malignant B cells. Cancer Immunology Research. 4, 498-508 (2016).
  5. Wu, F., Bethke, J. H., Wang, M., You, L. Quantitative and synthetic biology approaches to combat bacterial pathogens. Current Opinion in Biomedical Engineering. 4, 116-126 (2017).
  6. Ye, H., et al. Pharmaceutically controlled designer circuit for the treatment of the metabolic syndrome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 141-146 (2013).
  7. Caliendo, F., Dukhinova, M., Siciliano, V. Engineered Cell-Based Therapeutics: Synthetic Biology Meets Immunology. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, (2019).
  8. Thaker, M. N., Wright, G. D. Opportunities for synthetic biology in antibiotics: Expanding glycopeptide chemical diversity. ACS Synthetic Biology. 4, 195-206 (2015).
  9. Culler, S. J., Hoff, K. G., Smolke, C. D. Reprogramming cellular behavior with RNA controllers responsive to endogenous proteins. Science. 330, New York, N.Y. 1251-1255 (2010).
  10. Ausländer, S., et al. A general design strategy for protein-responsive riboswitches in mammalian cells. Nature Methods. 11, 1154-1160 (2014).
  11. Cella, F., Siciliano, V. Protein-based parts and devices that respond to intracellular and extracellular signals in mammalian cells. Current Opinion in Chemical Biology. 52, 47-53 (2019).
  12. Miki, K., et al. Efficient Detection and Purification of Cell Populations Using Synthetic MicroRNA Switches. Cell Stem Cell. 16, 699-711 (2015).
  13. Xie, Z., Wroblewska, L., Prochazka, L., Weiss, R., Benenson, Y. Multi-input RNAi-based logic circuit for identification of specific cancer cells. Science. , New York, N.Y. 1307-1311 (2011).
  14. Sun, J., et al. Engineered proteins with sensing and activating modules for automated reprogramming of cellular functions. Nature Communications. 8, 477(2017).
  15. Shigeto, H., et al. Insulin sensor cells for the analysis of insulin secretion responses in single living pancreatic β cells. Analyst. 144, 3765-3772 (2019).
  16. Cella, F., Wroblewska, L., Weiss, R., Siciliano, V. Engineering protein-protein devices for multilayered regulation of mRNA translation using orthogonal proteases in mammalian cells. Nature Communications. 9, (2018).
  17. Siciliano, V., et al. MiRNAs confer phenotypic robustness to gene networks by suppressing biological noise. Nature communications. 4, 2364(2013).
  18. Barnea, G., et al. The genetic design of signaling cascades to record receptor activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 64-69 (2008).
  19. Schwarz, K. A., Daringer, N. M., Dolberg, T. B., Leonard, J. N. Rewiring human cellular input–output using modular extracellular sensors. Nature Chemical Biology. 13, 202-209 (2016).
  20. Wieland, M., Fussenegger, M. Engineering molecular circuits using synthetic biology in mammalian cells. Annual review of chemical and biomolecular engineering. 3, 209-234 (2012).
  21. Siciliano, V., et al. Engineering modular intracellular protein sensor-actuator devices. Nature Communications. 9, 1881(2018).
  22. Lin, C. HCV NS3-4A Serine Protease. , (2006).
  23. Romani, B., Engelbrecht, S., Glashoff, R. H. Functions of Tat: the versatile protein of human immunodeficiency virus type 1. Journal of General Virology. 91, 1-12 (2010).
  24. Basmaciogullari, S., Pizzato, M. The activity of Nef on HIV-1 infectivity. Frontiers in microbiology. 5, 232(2014).
  25. Ross, C. A., Tabrizi, S. J. Huntington's disease: from molecular pathogenesis to clinical treatment. Lancet neurology. 10, 83-98 (2011).
  26. Pfeffer, C. M., Singh, A. T. K. Apoptosis: A Target for Anticancer Therapy. International journal of molecular sciences. 19, 448(2018).
  27. Guzzo, C., et al. The CD8-derived chemokine XCL1/lymphotactin is a conformation-dependent, broad-spectrum inhibitor of HIV-1. PLoS pathogens. 9, 1003852(2013).
  28. Marasco, W. A., LaVecchio, J., Winkler, A. Human anti-HIV-1 tat sFv intrabodies for gene therapy of advanced HIV-1-infection and AIDS. Journal of Immunological Methods. 231, 223-238 (1999).
  29. Gal-Tanamy, M., et al. HCV NS3 serine protease-neutralizing single-chain antibodies isolated by a novel genetic screen. Journal of molecular biology. 347, 991-1003 (2005).
  30. Southwell, A. L., et al. Intrabodies binding the proline-rich domains of mutant huntingtin increase its turnover and reduce neurotoxicity. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 28, 9013-9020 (2008).
  31. Bouchet, J., et al. Inhibition of the Nef regulatory protein of HIV-1 by a single-domain antibody. Blood. 117, 3559-3568 (2011).
  32. Arold, S., et al. The crystal structure of HIV-1 Nef protein bound to the Fyn kinase SH3 domain suggests a role for this complex in altered T cell receptor signaling. Structure. 5, 1361-1372 (1997).
  33. Beal, J. Signal-to-Noise Ratio Measures Efficacy of Biological Computing Devices and Circuits. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 3, 93(2015).
  34. Arold, S., et al. The crystal structure of HIV-1 Nef protein bound to the Fyn kinase SH3 domain suggests a role for this complex in altered T cell receptor signaling. Structure. 5, London, England : 1993. 1361-1372 (1997).
  35. Tyshchuk, O., et al. Detection of a phosphorylated glycine-serine linker in an IgG-based fusion protein. mAbs. 9, 94-103 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

proteaza TEVplatforma genetycznadetekcja oparta na przeciwciałachrozpoznawanie peptydówaktywacja transkrypcyjnachoroba Huntingtonawirus zapalenia wątroby typu Cdetekcja HIV

Ten artykuł został opublikowany

Film wkrótce dostępny

Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.