Artykuł metodologiczny

Proste, wolne od litografii mikromodelowanie pojedynczych komórek przy użyciu szablonów wycinanych laserowo

DOI:

10.3791/60888

⸱

3 kwietnia 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Stanford Cardiovascular Institute, Stanford University School of Medicine, 2Department of Medicine, Division of Cardiovascular Medicine, Stanford University, 3Institute for Stem Cell Biology and Regenerative Medicine, Stanford University, 4Department of Medicine III, University Hospital Heidelberg, 5German Centre for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Heidelberg/Mannheim

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół wprowadza metodę mikrowzorowania bez litografii, która jest prosta i dostępna dla osób z ograniczonym doświadczeniem w bioinżynierii. Metoda ta wykorzystuje spersonalizowane, wycinane laserowo szablony do mikromodelowania białek macierzy zewnątrzkomórkowej w kształcie interesującym do modulowania morfologii komórek. Procedura mikrowzorcowania została zademonstrowana przy użyciu indukowanych pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Techniki mikrowzorcowania są szeroko stosowane w biologii komórki do badania wpływu kontrolowania kształtu i wielkości komórki na determinację losu komórki w rozdzielczości pojedynczej komórki. Obecne najnowocześniejsze techniki mikromodelowania pojedynczych komórek obejmują miękką litografię i druk mikrokontaktowy, który jest potężną technologią, ale wymaga wyszkolonych umiejętności inżynierskich i pewnego wsparcia w zakresie mikrofabrykacji. Te ograniczenia wymagają bardziej dostępnej techniki. W tym miejscu opisujemy prostą alternatywną metodę wolną od litografii: szablonowe modelowanie pojedynczych komórek. Zapewniamy procedury krok po kroku, w tym projektowanie szablonów, wytwarzanie hydrożelu poliakrylamidowego, wprowadzanie białek na podstawie szablonów oraz powlekanie i hodowlę komórek. Ta prosta metoda może być użyta do utworzenia tablicy składającej się nawet z 2,000 komórek. Pokazujemy wzorzec kardiomiocytów pochodzących z pojedynczych ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) o różnych kształtach komórek, od kwadratu 1:1 do prostokąta przypominającego kardiomiocyty dorosłego 7:1. Ten oparty na szablonie wzór pojedynczej komórki jest wolny od litografii, solidny technicznie, wygodny, niedrogi i, co najważniejsze, dostępny dla osób o ograniczonym zapleczu bioinżynieryjnym.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pojawienie się hiPSC i późniejszy rozwój protokołów ich ukierunkowanego różnicowania na różne typy komórek umożliwiły badanie rozwoju i choroby na poziomie molekularnym i specyficznym dla pacjenta, w szczególności przy użyciu kardiomiocytów iPSC pochodzących od pacjenta (iPSC-CMs) do modelowania kardiomiopatii1,2. Jednak głównym ograniczeniem w badaniu rozwoju i fizjologii przy użyciu systemu iPSC i innych modeli in vitro jest brak ustrukturyzowanego mikrośrodowiska. In situ komórki są poddawane ograniczeniom macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), a także sąsiednich komórek. Szczególny skład biochemiczny i sztywność tych mikrośrodowisk dyktują rozkład przestrzenny komórek, a także dostępne czynniki angażujące się w adhezję komórek. To z kolei wpływa na wewnątrzkomórkowe szlaki sygnałowe, ekspresję genów i determinację losu komórki. Na przykład, mikrowzorzysty iPSC-CM w kształcie dorosłego pręta ma znacznie lepszą zdolność kurczenia się, przepływ wapnia, organizację mitochondriów, elektrofizjologię i tworzenie kanalików poprzecznych3. W ten sposób właściwości mikrośrodowiska są integralną częścią regulacji funkcji komórkowych.

Poprzednie techniki mikrowzoru opierały się głównie na fotolitografii (Rysunek 1A). W tej technice warstwa światłoczułego polimeru lub fotorezystu jest przędzona na płaskim podłożu z roztworu, tworząc cienką warstwę o grubości około 1 μm. Następnie światło ultrafioletowe (UV) jest nakładane na fotorezystor przez maskę zawierającą pożądany wzór. Ekspozycja na światło ultrafioletowe (UV) zmienia chemicznie fotorezystu, modyfikując jego rozpuszczalność w odpowiednim roztworze wywoływacza, przenosząc pożądany wzór z maski na podłoże. Wiele metod mikrowzorów obejmuje fotolitografię, ponieważ zapewnia ona kontrolę nad projektowaniem wzorów komórek na poziomie od nanometra do mikrometra. Jednak wirowanie fotorezystu jest bardzo wrażliwe na zanieczyszczenia, ponieważ najmniejsze cząsteczki pyłu będą zakłócać rozprowadzanie roztworu w cienkiej warstwie. Fotolitografia musi być zatem przeprowadzana w niezanieczyszczonych obiektach, które są kosztowne w utrzymaniu i wymagają specjalistycznej wiedzy. Ponadto substancje chemiczne stosowane w fotolitografii są często toksyczne dla komórek i mogą denaturować ważne biomolekuły. W związku z tym fotolitografia stwarza poważne przeszkody w wytwarzaniu mikrowzorów do wygodnych zastosowań biologicznych.

W 1994 roku Whitesides i współpracownicy4 pokonali niektóre z wyzwań związanych z fotolitografią, wprowadzając jako pionier zbiór technik zwanych miękką litografią. W miękkiej litografii mikrostrukturalna powierzchnia wykonana z polidimetylosiloksanu (PDMS), przezroczystego, gumopodobnego materiału, jest używana do generowania wzoru białek ECM4. Popularne techniki miękkiej litografii obejmują druk mikrokontaktowy i wzór mikroprzepływowy. W druku mikrokontaktowym, obecnie najpopularniejszej metodzie miękkiej litografii, stempel PDMS pokryty białkami ECM przenosi materiał na powierzchnię w miejscach, z którymi styka się stempel (Rysunek 1B). W modelowaniu mikroprzepływowym mikrostruktury są projektowane na powierzchni PDMS w taki sposób, że po przyciśnięciu stempla do podłoża tworzona jest sieć mikrokanałów, przez które płyny mogą być dostarczane do pożądanych obszarów (Rysunek 1C)5. Miękka litografia ma kilka zalet w porównaniu z fotolitografią. Po mikrowytwarzaniu płytki wzorcowej, stemple PDMS można łatwo powielić bez dalszego wykorzystywania urządzeń w pomieszczeniach czystych. Ponadto brak rozpuszczalników organicznych w procesie miękkiej litografii pozwala na wykorzystanie materiałów polimerowych, takich jak polistyren, zwykle stosowanych w hodowlach komórkowych. Wreszcie, mikrowzory metodami miękkiej litografii nie ograniczają się do płaskich powierzchni. W ten sposób miękka litografia zwiększa dostępność i funkcjonalność wytwarzania mikrowzorów w porównaniu z fotolitografią6. Miękka litografia ma jednak istotne wady. Na przykład początkowy etap trawienia, przy użyciu fotolitografii, jest nadal wymagany do mikrofabrykacji stempla. Ponadto, mikrowzorzec przy użyciu stempla PDMS podlega zmianom w jakości transferu białka na podłoże6. Uniknięcie tych rozbieżności wymaga optymalizacji i spójności nacisku wywieranego na stempel PDMS podczas transferu białka, w przeciwnym razie może dojść do deformacji i zniekształcenia rozmiarów cech form PDMS6. Istnieje również poważny problem związany z wielokrotnym używaniem PDMS ze względu na absorpcję małych cząsteczek7.

Aby uniknąć korzystania z miękkiej fotolitografii i stempli PDMS, opisujemy opartą na szablonach, wolną od litografii metodę mikrowzorcowania pojedynczych komórek, która pokonuje wiele przeszkód związanych z fotolitografią i miękką litografią. W tej metodzie hydrożel poliakrylamidowy jest stosowany jako substrat do inkorporacji białek ECM na podstawie szablonów, co pozwala na selektywne powlekanie pojedynczych hiPSC-CM. Technika ta jest wysoce kompatybilna z materiałami polimerowymi stosowanymi w klasycznych warunkach hodowli komórkowych. Ponadto, przy odpowiednim czyszczeniu i konserwacji, szablony są wielokrotnego użytku i są odporne na degradację i wchłanianie białek podczas procesu mikrofabrykacji. Wreszcie, proces tworzenia wzorów jest technicznie solidny, niedrogi, konfigurowalny i dostępny dla osób bez specjalistycznych umiejętności bioinżynieryjnych. Ta oparta na szablonach technika mikrowzorów została szeroko wykorzystana w naszych ostatnich publikacjach modelujących różne kardiomiopatie8,9,10.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Produkcja szablonów na bazie poliimidu z negatywnym wzorem

  1. Wygeneruj wzór (Rysunek 2A) w formacie .dxf za pomocą oprogramowania do projektowania wspomaganego komputerowo (np. AutoCAD, SolidWorks, Onshape, Adobe Illustrator).
    1. Wygeneruj okrąg (średnica = 22 mm), aby wyznaczyć granicę szablonu.
    2. Narysuj kształt wypełniony bryłą lub żądany wzór.
    3. Dołącz literę chiralną (np. R), aby zaznaczyć przednią stronę szablonów.
      UWAGA: Na przykład generowana jest tablica kwadratów i prostokątów w celu ułożenia wzorów iPSC-CM na poziomie pojedynczej komórki i pary komórek. Pliki projektowe są dostępne (patrz Pliki uzupełniające). Limit rozdzielczości mikrofabrykacji wynosi ~10 μm.
  2. Prześlij projekt do firmy zajmującej się mikrofabrykacją, aby wyciąć laserowo folię poliimidową i wyprodukować szablony (Rysunek 2B,C).

2. Przygotowanie porcji sulfo-SANPAH

UWAGA: Protokół jest zmodyfikowany z Fischer et al.11.

  1. Użyj odpornego na wilgoć kartonowego pudełka do przechowywania próbek (np. 100 dołków, 10 x 10 miejsc na probówki wirówkowe o wymiarach: 13,4 cm x 13,4 cm x 5,1 cm). Oznacz to jako "nazwa/data/sulfo-SANPAH 40 μL/rozpuszczony w 1,200 μL PBS".
  2. Oznacz 50 probówek do mikrowirówek (polipropylen, 1,5 ml) literą "S" na pokrywie.
  3. Weź 4 ml bezwodnego, ekstra suchego dimetylosulfotlenku (DMSO) i sterylnie przefiltruj roztwór za pomocą filtra membranowego (wielkość porów = 0,22 μm) do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
  4. Przygotuj kąpiel z ciekłym azotem i przykryj pokrywką, aby zminimalizować parowanie ciekłego azotu.
  5. Rozpuścić 50 mg sulfo-SANPAH w 2 ml przefiltrowanego DMSO.
  6. Dobrze zawirować, aby całkowicie rozpuścić sulfo-SANPAH w DMSO.
  7. Rozprowadzić 40 μl podwielokrotności roztworu sulfo-SANPAH do sterylnych probówek o pojemności 1,5 ml.
  8. Przenieś probówki do pudełka.
  9. Błyskawiczne zamrażanie probówek w ciekłym azocie przez 5 minut.
  10. Przechowywać podwielokrotności w temperaturze -80 °C.
    UWAGA: Podwielokrotności mogą być używane przez okres do 6 miesięcy bez zmniejszenia wydajności. Podstawowe stężenie sulfo-SANPAH wynosi 25 mg/ml lub 50,77 mM.

3. Sterylizacja narzędzi

  1. Autoklaw z dwoma kleszkami, 24 szklanymi szkiełkami nakrywkowymi (22 x 22 mm, nr 1 lub nr 1,5), jedną żyletką i trzema niestrzępiącymi się chusteczkami chłonnymi.
    UWAGA: Do wykonania 12 konstrukcji hydrożelowych potrzebne są 24 szklane szkiełka nakrywkowe. W każdej konstrukcji powinny znajdować się dwa szkiełka nakrywkowe. Wskazane jest przygotowanie zapasowych szkiełek nakrywkowych.
  2. Umieść dwa kawałki folii parafinowej (4 x 4 cale) w plastikowym pudełku odpornym na etanol (np. pudełku z końcówkami do pipet o pojemności 1,000 μl) i sterylizuj je w świeżym 70% etanolu przez co najmniej 15 minut.

4. Przygotowanie roztworu prekursora hydrożelu poliakryloamidowego

UWAGA: Protokół jest zmodyfikowany z Lee et al.12.

  1. Rozpuścić 125 mg metakrylanu aminoetylu (AEM) w 36,25 ml wody dejonizowanej w probówce wirówkowej z polipropylenu o pojemności 50 ml przez wirowanie.
  2. Aby przygotować 50 ml roztworu prekursora poliakryloamidu o natężeniu 10 kPa (8–0,15–15 mM), należy wymieszać 10 ml 40% roztworu akryloamidu, 3,75 ml 2% roztworu bis-akrylamidu i 36,25 ml roztworu AEM przygotowanego w kroku 4.1 w nowej probówce wirówkowej z polipropylenu o pojemności 50 ml.
    UWAGA: Końcowe stężenie roztworu prekursora to 8% akrylamidu, 0,15% bis-akrylamidu i 15 mM AEM, który zmierzono sztywność ~ 10 kPa za pomocą mikroskopii sił atomowych. W zależności od interesujących zastosowań tkankowych, sztywność hydrożelu można zmienić, zmieniając stosunek 40% roztworu akrylamidu do 2% roztworu bis-akrylamidu. Na przykład 8% roztwór akryloamidu-0,08% bis-akrylamidu daje hydrożele o natężeniu 3 kPa; 8% roztwór akryloamidu-0,48% bis-akrylamidu daje hydrożele o natężeniu 38 kPa; 8% roztwór akryloamidu-0,48% bis-akryloamidu daje hydrożele o natężeniu 60 kPa. Wskazane jest potwierdzenie sztywności hydrożeli wykonanych z roztworów prekursorów o zmienionych proporcjach.

5. Przygotowanie roztworu fotoinicjatora

  1. Na 1 ml 5% roztworu fotoinicjatora najpierw rozpuść 50 mg proszku 2-hydroksy-4'-(2-hydroksyetoksy)-2-metylopropiofenonu w 700 μl 100% etanolu w 1,5 ml polipropylenowej probówce wirówkowej z pokrywką.
    UWAGA: 2-Hydroksy-4'-(2-hydroksyetoksy)-2-metylopropiofenon nie rozpuszcza się w wodzie. Upewnij się, że proszek całkowicie rozpuścił się w etanolu przez wirowanie.
  2. Po całkowitym rozpuszczeniu 2-hydroksy-4'-(2-hydroksyetoksy)-2-metylopropiofenonu w etanolu przez wirowanie, dodać 300 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do końcowej objętości 1 ml,
    UWAGA: Końcowe stężenie roztworu 2-hydroksy-4'-(2-hydroksyetoksy)-2-metylopropiofenonu wynosi 5%. Zafoliowany 5% roztwór fotoinicjatora jest dobry przez 4 tygodnie w temperaturze 4 °C.

6. Przygotowanie roztworu białka macierzy błony podstawnej

UWAGA: Matryca membrany podstawnej (Tabela Materiałów) jest materiałem wrażliwym na temperaturę. Upewnij się, że pracujesz na lodzie ze schłodzonymi końcówkami i rurkami do pipet, a także lodowatymi roztworami. Nowy zapas matrycy błony podstawnej należy powoli rozmrażać na lodzie w temperaturze 4 °C przez noc.

  1. Przygotować 200 μl roztworu białka macierzy błony podstawnej na konstrukt hydrożelowy. Na 12 konstruktów potrzebne jest 2,4 ml roztworu białka macierzy błony podstawnej. Przygotuj 10% dodatkowego roztworu (np. 2,6 ml).
  2. Dla każdej nowej partii/partii roztworu białka macierzy błony podstawnej należy zoptymalizować współczynnik rozcieńczenia. Po raz pierwszy przetestuj proporcje rozcieńczenia 1:10, 1:20, 1:40, aby znaleźć stosunek rozcieńczenia, który zapewnia najlepsze właściwości do tworzenia wzorów komórek.
    UWAGA: Jeśli roztwór białka macierzy błony podstawnej jest zbyt lepki, utworzy żel na wierzchu szablonu i jest bardziej prawdopodobne, że odklei się podczas usuwania szablonu. Jeśli roztwór białkowy jest zbyt płynny, przeniknie przez otwory we wzorach szablonów, co spowoduje słabą jakość wzoru.
  3. Rozcieńczyć roztwór podstawowy białka macierzy błony podstawnej na lodzie lodowato zimną pożywką Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) lub 1x PBS do zoptymalizowanego stosunku rozcieńczenia powyżej. Na przykład rozcieńczyć 120 μl roztworu podstawowego w 2,4 ml pożywki DMEM/F12 (1:20) i przechowywać na lodzie do późniejszego użycia.

7. Produkcja hydrożelu

  1. Umieść lampę stołową UV (365 nm, 4 mW/cm2) w okapie bezpieczeństwa biologicznego.
  2. Wysterylizowane folie parafinowe należy umieścić w kroku 3.2 i całkowicie wysuszyć w sterylnych warunkach. Jeśli folie parafinowe nie są całkowicie suche, użyj systemu zasysania próżniowego, aby usunąć resztki cieczy. Umieść sześć autoklawowanych szkiełek nakrywkowych z kroku 3.1 na każdej folii parafinowej za pomocą autoklawowanych kleszczyków.
  3. Przygotować sieciowany promieniami UV roztwór prekursora poliakryloamidu, rozcieńczając 5% roztwór fotoinicjatora (etap 5.2) roztworem prekursora poliakryloamidu (etap 4.2) w probówce wirówkowej z polipropylenu o pojemności 50 ml. W przypadku 5 ml usieciowanego promieniami UV roztworu prekursora poliakryloamidu należy dodać 50 μl 5% roztworu fotoinicjatora do 5 ml roztworu prekursora poliakrylamidu.
  4. Przefiltruj roztwór prekursora z kroku 7.3 za pomocą jednostki filtrującej o pojemności 50 ml i wielkości porów 0,22 μm do sterylizacji.
    UWAGA: Zawsze przygotowuj świeży roztwór prekursora.
  5. Dozować 200 μl roztworu prekursora poliakryloamidu z kroku 7.4 na każde szkiełko nakrywkowe o wymiarach 22 x 22 mm na pokrytej parafiną szalce Petriego i ostrożnie przykryć kolejnym szkiełkiem nakrywkowym o wymiarach 22 x 22 mm na wierzchu, aby umieścić roztwór pomiędzy (Rysunek 3A).
    UWAGA: Folię parafinową stosuje się w celu uniknięcia rozlania i zamknięcia roztworu prekursora między szkiełkami nakrywkowymi.
  6. Umieść szalkę Petriego zawierającą szkiełko nakrywkowe z kroku 7.5 pod lampą UV i fotopolimeryzuj hydrożele poliakrylamidowe przez 5 minut (Rysunek 3B).
    UWAGA: Jeśli powierzchnia nie jest biała, absorbancja UV powierzchni zmniejsza skuteczność fotosieciowania. Pokrycie białym papierem niebiałej powierzchni jest ważne, aby zminimalizować utratę intensywności promieniowania UV. Aby chronić się przed promieniowaniem UV, przykryj lampę folią aluminiową i załóż okulary chroniące przed promieniowaniem UV.
  7. Ostrożnie odczep jedną pokrywę od drugiej za pomocą żyletki, używając dźwigni (Rysunek 3C).
    UWAGA: Hydrożel zwykle przykleja się do górnego szkiełka nakrywkowego. Zachowaj szczególną ostrożność podczas odłączania szkiełka nakrywkowego od miękkiego hydrożelu, ponieważ istnieje prawdopodobieństwo, że pęknie.
  8. Napełnij jednorazowy zbiornik polipropylenowy PBS. Przenieść kompozyty hydrożelowo-nakrywkowe do zbiornika zawierającego PBS w celu płukania hydrożeli w PBS przez 5 minut. Po spłukaniu umieść hydrożelową konstrukcję z powrotem na folii parafinowej na szalce Petriego.

8. Koniugacja białek

  1. Przygotuj wiaderko na lód i wstępnie schłodzić PBS.
    UWAGA: Na sześć hydrożeli potrzeba 1 200 μl zimnego PBS.
  2. Wyjąć podwielokrotność sulfo-SANPAH (1 fiolka = 6 żeli).
    UWAGA: W razie potrzeby ilość stosowanego sulfo-SANPAH można zmniejszyć po optymalizacji.
  3. Dodać 1 200 μl zimnego PBS do fiolki z podwielokrotnością sulfo-SANPAH i mieszać, pipetując w górę i w dół.
  4. Dozować 200 μl sulfo-SANPAH na warstwę parafinową na szalce Petriego i przykryć kompozytem hydrożel-szkiełko nakrywkowe z hydrożelem kontaktującym się z sulfo-SANPAH (Rysunek 3D).
    UWAGA: Sulfo-SANPAH jest bardzo podatny na wodę z powodu hydrolizy. Świeżo rozmrozić w temperaturze -80 °C bezpośrednio przed użyciem. Nie używaj ponownie ani nie zamrażaj żadnych resztek.
  5. Wystawić hydrożel na działanie lampy UV o długości fali 365 nm, 4 mW/cm2 przez 5 minut, aby aktywować sulfo-SANPAH.
    UWAGA: Po ekspozycji sulfo-SANPAH zmieni kolor z pomarańczowego na brązowy (Rysunek 3E). Jeśli hydrożel zmieni kolor na brązowy, oznacza to pomyślną aktywację grupy azydku fenylu sulfo-SANPAH i włączenie sulfo-SANPAH do hydrożelu. Bezpośrednio przejdź do kroków 8,6−8,9 w ciągu maksymalnie 10 minut, ponieważ aktywność sulfo-SANPAH będzie spadać.
  6. Uzupełnij jednorazowy zbiornik polipropylenowy świeżym PBS. Po aktywacji sulfo-SANPAH przenieść aktywowane hydrożele i szybko przepłukać hydrożele w zbiorniku PBS w celu usunięcia niezwiązanego sulfo-SANPAH.
    UWAGA: Długie pranie może skutkować niską wydajnością koniugacji białek.
  7. Po szybkim spłukaniu umieść hydrożelowe szkiełka nakrywkowe na folii parafinowej na szalkach Petriego i ostrożnie przetrzyj hydrożele sterylnymi, niestrzępiącymi się chusteczkami.
    UWAGA: Pozostały PBS na wierzchu hydrożelu spowoduje wyciek roztworu białka macierzy błony podstawnej przez szablon, a zbyt intensywne suszenie doprowadzi do pęknięcia hydrożelu po usunięciu szablonu z powodu zbyt dużej przyczepności do szablonu.
  8. Umieść szablon na wierzchu hydrożeli i przetrzyj autoklawowanymi, niestrzępiącymi się chusteczkami, aby zapewnić szczelne uszczelnienie między szablonem a hydrożelem (Rysunek 3F).
  9. Ostrożnie dozować 200 μl rozcieńczonego roztworu białka macierzy błony podstawnej przygotowanego z kroku 6.3 (Rysunek 3G) na wierzchu. Pozostawić na noc w inkubatorze (37 °C).
    UWAGA: Gdy kontakt szablon-hydrożel jest ścisły, a stężenie roztworu białka macierzy błony podstawnej jest optymalne, roztwór białka macierzy błony podstawnej zostanie odizolowany i pozostanie na wierzchu szablonu (Rysunek 3H). Czas inkubacji można skrócić po optymalizacji. Teoretycznie można go skrócić do 30 min – 2 h.
  10. Następnego dnia przenieś hydrożele na płytkę 6-dołkową i całkowicie zanurz je w PBS.
    UWAGA: Zaleca się odklejenie szablonu z zanurzeniem PBS na szkiełku nakrywkowym, aby zapobiec rozdarciu i przywieraniu hydrożelu do szablonu.
  11. Ostrożnie usuń szablon za pomocą autoklawowanej pęsety, nie rozrywając hydrożelu. Ponownie zawiesić dobrze za pomocą DMEM, włóż wzorzyste hydrożele z powrotem do inkubatora i pozostaw je na noc w celu sprawdzenia pod kątem zanieczyszczeń.
  12. Jeśli podłoże pozostaje czyste, hydrożele są gotowe do użycia do powlekania komórek. Zoptymalizuj gęstość posiewu komórek i czas inkubacji, aby umożliwić adhezję komórek do odpowiednich zastosowań.
    UWAGA: W przypadku modelowania pojedynczych komórek hiPSC-CM, wysiewaj i inkubuj przez noc. Do wysiewu zalecane są następujące liczby komórek: 30 000, 60 000 i 90 000 komórek/studzienkę. Umieszczanie zbyt wielu komórek prowadzi do więcej niż jednej komórki na wzór. Zaleca się sitko do komórek, aby odcedzić inne niż pojedyncze komórki przed wysiewem komórek.
  13. Następnego dnia obserwuj przyczepianie się i rozprzestrzenianie komórek oraz zmień pożywkę, aby pozbyć się oderwanych komórek.

9. Czyszczenie używanych szablonów

  1. Aby usunąć resztki białek matrycy z użytych szablonów, zanurz szablony w roztworze enzymatycznym (tabela materiałów) na 10 minut w temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Enzym należy dobrać w zależności od użytych białek macierzy. W przypadku bogatego w kolagen roztworu białka macierzy użyj kolagenazy. Zalecana jest również 10-15 minutowa ultrasonizacja w roztworze enzymu.
  2. Odessać roztwór i uzupełnić 10% wybielaczem. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Spłukać 3x PBS.
  4. Przechowywać w 70% etanolu w temperaturze 4 °C do momentu użycia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wykazano wytwarzanie szablonów zawierających tablicę kwadratów lub prostokątów (Rysunek 4A). Postępując zgodnie z tym protokołem, uzyskaliśmy wzorzyste wyspy białkowe macierzy (Rysunek 4B i Rysunek 5A) oraz komórki ( Rysunek 4C). Nieoptymalne stężenie roztworu białka matrycowego doprowadziło do nieoptymalnego wzorca (Rysunek 5B). Bardzo ważne jest, aby użyć przedniej strony szablonu. Jeśli używana jest tylna strona szablon...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy metodę mikromodelowania opartą na szablonach bez litografii, która umożliwia skuteczne modelowanie przylegających komórek. W tym protokole demonstrujemy modelowanie hiPSC-CM w różnych proporcjach długości do szerokości poprzez mikromodelowanie wysp białkowych macierzy błony podstawnej na hydrożelach poliakrylamidowych z fizjologicznie lub patologicznie istotnymi sztywnościami tkanek lub podłożach elastomerowych na bazie krzemu. Metoda ta jest stosunkowo prosta i wysoce dostępna dla wszystkich badaczy, w tym tyc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez staż podoktorski od Stanford Child Health Research Institute (CHRI) i National Institute of Health (1F32HL142205-01) dla S.L, NIH Office of Director's Pioneer Award (LM012179-03), American Heart Association Established Investigator Award (17EIA33410923), Stanford Cardiovascular Institute, Hoffmann and Schroepfer Foundation oraz Stanford Division of Cardiovascular Medicine, Wydział Medycyny do SMW, nagrody od Narodowego Instytutu Zdrowia (UG3 TR002588, P01 HL141084, R01 HL126527, R01 HL113006, R01 HL123968) i Programu Badań nad Chorobami Związanymi z Tytoniem (TRDRP 27IR-0012) dla J.C.W., Amerykańskie Towarzystwo Kardiologiczne (AHA) Stypendium Podoktorskie (18POST34030106) dla H.Y oraz stypendium Hengstberger dla T.S. Dziękujemy dr Andrew Olsenowi ze Stanford Neuroscience Microscopy Service za wsparcie obrazowania konfokalnego mikrowzorzystego hiPSC-CM. Dziękujemy H.Y. za pierwszy projekt szablonu, produkcję, mikrowzór pojedynczej komórki iPSC-CM na szkiełku nakrywkowym pokrytym hydrożelem poliakrylamidowym oraz wstępne obrazowanie konfokalne struktury sarkomerowej jednokomórkowych mikrowzorów iPSC-CM.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Chlorowodorek metakrylanu 2-aminoetylu (proszek)Sigma-Aldrich516155
Roztwór akrylamidu 40% (roztwór)Sigma-AldrichA-4058-100mL
Laboratoryjna lampa UV 365 nmUVP UVP95-0042-07, XX-15L
Płytka hodowlana BioFlexFLEXCELL INTERNATIONAL CORPORATION, Burlington, NCPłytka 6-dołkowa z podłożem z elastomeru krzemowego
Roztwór bis-akrylamidu 2% (roztwór)Sigma-AldrichM1533-25mL
Kwadratowe okulary nakrywkowe Corning, nr 2, W i razy; L 22 mm i razy; 22 mmSigmaCLS285522
Irgacure (2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenon) (proszek)Sigma-Aldrich410896
MatrigelCorning356231roztwór białkowy macierzy błony podstawnej
Methyl sulwolfide, 99.7+%, Extra Dry, AcroSeal, ACROS OrganicsAcros Organics326881000
Millex (13mm) filter unit z membraną DuraporeMilliporeSLGV013SL
Millipore 50mL Steriflip (0,22 µ m)Szablony Fisher ScientificSCGP00525
Potomacniestandardowy projekt
Sulfo-SANPAHThermoFisher Scientific22589
TrypLE Select 10xThermoFisher ScientificA1217702Enzym używany do czyszczenia szablonów

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Burridge, P. W., et al. Chemically Defined and Small Molecule-Based Generation of Human Cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
  2. Sayed, N., Liu, C., Wu, J. C. Translation of Human-Induced Pluripotent Stem Cells: From Clinical Trial in a Dish to Precision Medicine. Journal of the American College of Cardiology. 67 (18), 2161-2176 (2016).
  3. Ribeiro, A. J. S., et al. Contractility of single cardiomyocytes differentiated from pluripotent stem cells depends on physiological shape and substrate stiffness. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (41), 12705-12710 (2015).
  4. Kumar, A., Biebuyck, H. A., Whitesides, G. M. Patterning Self-Assembled Monolayers: Applications in Materials Science. Langmuir. 10 (5), 1498-1511 (1994).
  5. Wilbur, J. L., Kumar, A., Kim, E., Whitesides, G. M. Microfabrication by microcontact printing of self-assembled monolayers. Advanced Materials. 6 (7-8), 600-604 (1994).
  6. Théry, M. Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions. Journal of Cell Science. 123 (24), 4201-4213 (2010).
  7. Toepke, M. W., Beebe, D. J. PDMS absorption of small molecules and consequences in microfluidic applications. Lab on a Chip. 6 (12), 1484-1486 (2006).
  8. Seeger, T., et al. A Premature Termination Codon Mutation in MYBPC3 Causes Hypertrophic Cardiomyopathy via Chronic Activation of Nonsense-Mediated Decay. Circulation. 139 (6), 799-811 (2019).
  9. Lee, J., et al. Activation of PDGF pathway links LMNA mutation to dilated cardiomyopathy. Nature. 572 (7769), 335-340 (2019).
  10. Wu, H., et al. Modelling diastolic dysfunction in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes from hypertrophic cardiomyopathy patients. European Heart Journal. 40 (45), 3685-3695 (2019).
  11. Fischer, R. S., Myers, K. A., Gardel, M. L., Waterman, C. M. Stiffness-controlled three-dimensional extracellular matrices for high-resolution imaging of cell behavior. Nature Protocols. 7 (11), 2056-2066 (2012).
  12. Lee, S., Stanton, A. E., Tong, X., Yang, F. Hydrogels with enhanced protein conjugation efficiency reveal stiffness-induced YAP localization in stem cells depends on biochemical cues. Biomaterials. 202, 26-34 (2019).
  13. Théry, M., Pépin, A., Dressaire, E., Chen, Y., Bornens, M. Cell distribution of stress fibres in response to the geometry of the adhesive environment. Cell Motility. 63 (6), 341-355 (2006).
  14. Kilian, K. A., Bugarija, B., Lahn, B. T., Mrksich, M. Geometric cues for directing the differentiation of mesenchymal stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (11), 4872-4877 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Mikrowzorowanie z u yciem szablonutechnika bezlitograficznawzorowanie pojedynczych kom rekhydro el poliakrylamidowyaktywacja Sulfo SANPAHmacierz b ony podstawnejr nicowanie kardiomiocyt wkom rki pochodz ce z hiPSCkontrola kszta tu kom rekwysokoprzepustowy screening

Powiązane artykuły