Montaż i charakterystyka miceli kompleksu polielektrolitu

Podsumowanie

Dostarczamy protokoły i reprezentatywne dane do projektowania, montażu i charakteryzowania miceli kompleksu polielektrolitowego, nanocząstek typu rdzeń-powłoka tworzonych przez polielektrolity i hydrofilowe naładowane-nienaładowane kopolimery blokowe.

Streszczenie

Micele kompleksu polielektrolitowego (PCM), nanocząstki typu rdzeń-powłoka powstałe w wyniku samoorganizacji naładowanych polimerów w roztworze wodnym, stanowią potężną platformę do badania fizyki oddziaływań polielektrolitu, a także oferują obiecujące rozwiązanie palącego problemu dostarczania terapeutycznych oligonukleotydów in vivo. Opracowanie predykcyjnych zależności struktura-właściwości dla PCM okazało się trudne, częściowo ze względu na obecność silnych pułapek kinetycznych podczas samoorganizacji nanocząstek. W artykule omówiono kryteria wyboru polimerów do budowy PCM oraz przedstawiono protokoły oparte na wyżarzaniu solnym, które umożliwiają montaż powtarzalnych nanocząstek o niskiej polidyspersyjności. Omawiamy również charakterystykę PCM za pomocą rozpraszania światła, rozpraszania promieniowania rentgenowskiego pod małymi kątami i mikroskopii elektronowej.

Wprowadzenie

Gdy przeciwnie naładowane polielektrolity są mieszane w roztworze wodnym, przyrost entropii wynikający z uwolnienia ich przeciwjonów powoduje wymieszanie roztworu na fazę skondensowaną bogatą w polimer i supernatant zubożony w polimer^1,2,3,4,5, zjawisko znane jako kompleksowanie polielektrolitów. Jeśli neutralny blok hydrofilowy jest sprzężony z jednym lub obydwoma polielektrolitami, zamiast tego następuje separacja faz w nanoskali (Rysunek 1A). Powstałe w ten sposób samoorganizujące się nanocząstki typu rdzeń-powłoka są różnie określane jako micele kompleksu polielektrolitu (PCM), micele kompleksu polijonowego, kompleksy jonomerów blokowych lub micele z rdzeniem koaceracyjnym przez analogię do micelizacji środków powierzchniowo czynnych, mimo że wszystkie składniki systemu są hydrofilowe^6,7. Zdolność PCM do hermetyzacji cząsteczek hydrofilowych, takich jak białka i kwasy nukleinowe, a także szerokie możliwości przestrajania oferowane przez architekturę nośnika kopolimeru blokowego sprawiają, że są one atrakcyjnymi kandydatami do dostarczania cząsteczek terapeutycznych in vivo^{8,9,10,11,12,13}.

Dostarczanie terapeutycznych kwasów nukleinowych do celów komórkowych jest szczególnie ważnym wyzwaniem, dla którego PCM oferują wiele korzyści. Terapeutyczne kwasy nukleinowe (genetyczne DNA, mRNA i oligonukleotydy, takie jak siRNA) mają ogromny potencjał w zakresie poprawy zdrowia ludzkiego, ale muszą pokonać liczne bariery biologiczne i fizyczne, aby wykorzystać ten potencjał^14,15,16. Nagie kwasy nukleinowe są rozkładane przez nukleazy surowicy i komórki, są szybko usuwane z krążenia, a ich silny ładunek ujemny utrudnia im przenikanie przez błony komórkowe bez pomocy. Obecne podejścia do pokonywania tych barier obejmują kosztowne modyfikacje chemiczne w celu zapobiegania uszkodzeniom spowodowanym nukleazami i/lub enkapsulacją w różne nanocząstki lipidowe powstałe w wyniku oddziaływań hydrofobowych^15,17,18. Chociaż metody te okazały się skuteczne w przypadku miejscowych wstrzyknięć i celowania w wątrobę, stosowanie ogólnoustrojowe wiąże się ze znacznymi ograniczeniami toksyczności, immunogenności i ograniczonej biodystrybucji¹⁶. W przeciwieństwie do tego, PCM wykorzystują ujemny ładunek kwasów nukleinowych do ich kondensacji w rdzeniu oddzielonym fazowo, podczas gdy neutralna korona zapewnia barierę steryczną przed degradacją, a także platformę do włączania ligandów w celu zwiększenia celowania lub internalizacji^11,19. Badania in vitro i na zwierzętach wykazały, że PCM mogą skutecznie dostarczać różne ładunki kwasów nukleinowych^{20,21,22,23,24}, ale słabości naszej zdolności do przewidywania właściwości PCM, takich jak rozmiar, kształt i stabilność na podstawie właściwości polimerów składowych, utrudniły ich szersze zastosowanie.

Ostatnie prace naszej grupy i innych osób w tej dziedzinie zaczęły rozwiązywać ten problem poprzez rozwijanie relacji struktura-właściwość, a w niektórych przypadkach struktura-właściwość-funkcja dla PCM utworzonych z kwasów nukleinowych i różnych neutralnych kationowo polimerów7^,25,26,27. Dwa spójne tematy, które wyłoniły się z tych badań, to znaczenie opracowania dobrze kontrolowanych, powtarzalnych protokołów składania PCM oraz korzyści płynące z zastosowania wielu technik do scharakteryzowania powstałych nanocząstek. Polielektrolity, szczególnie te o dużej gęstości ładunku, takie jak kwasy nukleinowe, oddziałują ze sobą bardzo silnie i wydają się łatwo ulegać kinetycznemu uwięzieniu po zmieszaniu, co powoduje, że preparaty PCM są bardzo wrażliwe na niewielkie zmiany w procedurze i wykazują wysoką polidyspersyjność oraz słabą powtarzalność z partii na partię. Wykazano również, że PCM przyjmują szeroki zakres kształtów i rozmiarów w zależności od konfiguracji na poziomie atomowym ich składników, a uchwycenie tej różnorodności za pomocą dowolnej indywidualnej techniki charakteryzacji jest bardzo trudne, zwłaszcza że niektóre popularne techniki, takie jak dynamiczne rozpraszanie światła (DLS), wymagają założeń dotyczących kształtu cząstek do ich interpretacji.

W tym artykule omawiamy projektowanie i wybór materiałów dla PCM, ze szczególnym uwzględnieniem oligonukleotydów i kationowo-neutralnych kopolimerów diblokowych. Następnie opisujemy protokół wyżarzania solnego, który wykorzystuje wysokie stężenia soli, a następnie powolną dializę, aby uniknąć pułapki kinetycznej podczas montażu PCM. Polielektrolity są mieszane w warunkach o wysokiej zawartości soli, w których przyciąganie elektrostatyczne jest przesiewane, a następnie stężenie soli jest powoli obniżane, aby polielektrolity mogły osiąść w najbardziej korzystnych energetycznie konfiguracjach, analogicznie do procesu powolnego chłodzenia wyżarzania termicznego. Korzystając z tego protokołu, regularnie jesteśmy w stanie osiągnąć wyjątkowo niską polidyspersyjność i wysoką powtarzalność dla oligonukleotydowych PCM^7,26. Na koniec opisujemy, w jaki sposób cztery oddzielne techniki pomiarowe mogą być wykorzystane do scharakteryzowania PCM w bardzo szerokim zakresie skal długości, od morfologii zewnętrznej po strukturę wewnętrzną: DLS, wielokątowe rozpraszanie światła (MALS), rozpraszanie promieniowania rentgenowskiego pod małym kątem (SAXS) i transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM). Mamy nadzieję, że te protokoły umożliwią większej liczbie badaczy skuteczne zbadanie możliwości tych interesujących nanocząstek.

Wybór i przygotowanie polimerów
Na właściwości PCM duży wpływ mają właściwości fizyczne i chemiczne polimerów składowych, co sprawia, że wybór polimeru jest krytycznym krokiem w procesie projektowania. Najbardziej dobrze scharakteryzowanymi kopolimerami blokowymi dla PCM kwasów nukleinowych są dibloki liniowe, takie jak poli(lizyna)-poli(glikol etylenowy) (pLys-PEG), ale PCM mogą być tworzone między polielektrolitami a różnymi hydrofilowymi polimerami o neutralnym ładunku, które mogą być generowane w sposób wysokoprzepustowy²⁸. Wybór naładowanej grupy silnie wpływa na stabilność parowania jonów i kształt miceli²⁶, a wykazano, że rozmiar PCM zwiększa się wraz z długością naładowanego bloku^5,7,26 (Rysunek 2), co pozwala na dostosowanie właściwości PCM do wymagań pożądanego zastosowania. W przypadku dibloków liniowych stwierdziliśmy, że naładowany blok powinien mieć co najmniej 10 ładunków i być silnie naładowany przy pożądanym pH. Dłuższe naładowane bloki mogą sprzyjać tworzeniu się PCM z oligonukleotydami, takimi jak siRNA, które są trudne do skompleksowania z krótszymi blokami²¹. Udało nam się zaobserwować powstawanie PCM przy długościach bloków do 200, a literatura opisuje dłuższe polimery. Większa elastyczność jest dostępna w wyborze bloków neutralnych²⁴, ale doświadczenie pokazuje, że bardzo krótkie bloki neutralne prowadzą do agregacji, a nie do tworzenia nanocząstek, a minimalna długość neutralnego bloku wzrasta wraz z długością naładowanego bloku. W przypadku pLys-PEG wymagany jest PEG MW wynoszący co najmniej 3 000–5 000 dla długości pLys poniżej ~50, a większe długości są wymagane w miarę dalszego zwiększania naładowanego bloku. Zwiększona długość neutralnego bloku powoduje zwiększenie rozmiaru PCM, szczególnie grubości powłoki, ze względu na steryczne stłoczenie neutralnych polimerów.

Ten manuskrypt przedstawia protokół przygotowania PCM z liofilizowanych pLys-PEG o wysokiej czystości i oligonukleotydów o znanej ilości, ale powinien być również łatwo adaptowalny do innych systemów. Przetestowaliśmy go z powodzeniem z kilkoma naładowanymi polipeptydami, w tym poliargininą i kwasem poliglutaminowy, a także kilkoma syntetycznymi polielektrolitami, takimi jak kwas poliakrylowy i poli(winylobenzylotrimetyloamon). Opisujemy również przygotowanie PCM ze stosunkiem stechiometrycznym ładunków polielektrolitowych, ale można to łatwo zmodyfikować. Uważamy, że najłatwiej jest pracować w jednostkach koncentracji ładunku (c.c.), które w naturalny sposób również uwzględniają polimery, które nie są w pełni naładowane. Jeśli którykolwiek z polimerów nie jest dobrze scharakteryzowany, należy zadbać o dokładne określenie długości/masy polimeru i upewnić się, że nadmiar soli nie jest obecny poza tym, który jest potrzebny do neutralizacji ładunku przez dializę, na przykład. Przy obliczaniu stężeń należy również uwzględnić obecność zatrzymanej wody. Stężenie kwasu nukleinowego można wygodnie określić ilościowo za pomocą absorbancji przy 260 nm, a przy obliczaniu cc należy wziąć pod uwagę obecność lub brak końcowych fosforanów.

Podczas używania oligonukleotydów jako polianionów, stan hybrydyzacji i struktura chemiczna pomagają określić skłonność do samoorganizacji i cechy wynikowego PCM5^,7,26. Ich optymalizacja, w ramach wymagań dotyczących skuteczności biologicznej w przypadku stosowania PCM do dostarczania, zwiększy prawdopodobieństwo powstania pożądanych struktur. Pomocne narzędzia do analizy hybrydyzacji obejmują funkcje MATLAB dla kwasów nukleinowych, NUPACK²⁹ i IDT OligoAnalyzer. Zalecamy przeanalizowanie sekwencji kandydującej, aby zrozumieć siłę wiązania z 1) sobą w formacji spinki do włosów; 2) inna kopia tej samej sekwencji (samościemniacz); oraz 3) do innych oligonukleotydów obecnych w układzie. Temperatury topnienia DNA i RNA dla określonej sekwencji można również obliczyć za pomocą metody najbliższego sąsiada^30,31. Wyżarzanie termiczne kwasów nukleinowych (krok 2.3) denaturuje wszelkie resztkowe struktury drugorzędowe w poszczególnych nukleotydach i sprzyja fałdowaniu równowagi.

Charakterystyka i analiza PCM
Dostępnych jest wiele technik charakteryzowania nanocząstek, w tym statyczne i dynamiczne rozpraszanie światła, rozpraszanie elektronów lub neutronów pod małymi kątami oraz mikroskopia elektronowa. W tym artykule przedstawiamy protokoły dla dwóch technik rozpraszania światła, rozpraszania promieniowania rentgenowskiego pod małym kątem i dwóch technik mikroskopii elektronowej.

DLS mierzy autokorelację fluktuacji czasowych w intensywności rozpraszania pod jednym kątem od ruchu Browna próbki. Dopasowanie tych danych może zapewnić promień hydrodynamiczny i polidyspersyjność dla sferycznych miceli (Rysunek 3). Rozpraszanie światła pod wieloma kątami (MALS) mierzy intensywność rozpraszania statycznego pod wieloma kątami. Ta zależność kątowa opisuje kształt nanocząstki, ale jest ograniczona do skal długości dłuższych niż ~50 nm dla światła widzialnego, co ogranicza jej skuteczność dla mniejszych nanocząstek. Obie techniki opierają się na niedopasowaniu współczynnika załamania światła i opisują przede wszystkim zewnętrzne wymiary nanocząstki.

Rozpraszanie promieniowania rentgenowskiego pod małym kątem (SAXS) wykorzystuje promieniowanie rentgenowskie jako sondę rozpraszającą, a ich krótsza długość fali pozwala na pomiary w zakresie ~0,1–100 nm. Dopasowanie obserwowanej intensywności rozpraszania do kąta (konwencjonalnie wyrażonego jako przeniesienie pędu q) dostarcza informacji o morfologii PCM (tj. rozmiarze i kształcie), a także o strukturze wewnętrznej. Jeśli dostępna jest kalibracja intensywności bezwzględnej, a intensywność rozpraszania można ekstrapolować do kąta zerowego, można również oszacować masę PCM i liczbę agregacji³², co czyni SAXS niezwykle wszechstronną i wartościową metodą. Rozpraszanie neutronów pod małym kątem (SANS) jest czułe w podobnym zakresie skal długości, ale jest dostępne tylko w specjalistycznych obiektach i nie zostanie wyraźnie omówione w tym artykule^33,34,35.

Ostatnie lata przyniosły pojawienie się stacjonarnych instrumentów SAXS, ale stwierdzamy, że źródła synchrotronowe lepiej nadają się do charakteryzacji PCM, ponieważ ich wyższa intensywność pozwala na znacznie szybsze zbieranie danych dla tych próbek o niskim kontraście. Udostępniamy krótki protokół pozyskiwania danych PCM SAXS na linii badawczej 12-ID-B w Advanced Photon Source (Argonne National Laboratory, USA) z perspektywy użytkownika. Protokół ten powinien mieć zastosowanie do większości źródeł synchrotronowych, ale konsultacja z lokalnym personelem przed zaproponowaniem eksperymentu jest wysoce zalecana. Udostępniamy również protokół redukcji i analizy danych za pomocą Irena³⁶, darmowego zestawu makr napisanych dla Igor Pro. Irena zawiera wszechstronny zestaw formatów do modelowania danych SAXS i pozwala na budowę modeli wieloskładnikowych, które są w stanie opisać złożony profil rozpraszania PCM (patrz Reprezentatywne wyniki, Rysunek 4). Irena posiada również obszerną dokumentację i samouczki dostępne online. Przed przystąpieniem do poniższych procedur zalecamy zapoznanie się z nimi, w szczególności z samouczkiem "Modelowanie danych SAXS z dwiema głównymi populacjami rozpraszaczy".

Uszkodzenia spowodowane promieniowaniem są problemem dla rozpraszania promieniowania rentgenowskiego, ale można zastosować kilka środków, aby je zminimalizować. W szczególności zalecamy stosowanie konfiguracji komory przepływowej z pompą strzykawkową i próbką PCM przepływającą podczas pozyskiwania danych, a nie szczelną kapilarą. To również znacznie upraszcza odejmowanie tła. Sugerujemy również wielokrotne naświetlanie przepływającej próbki zamiast jednej dłuższej, aby ograniczyć strumień, który widzi każda pojedyncza objętość próbki i umożliwić porównanie danych dotyczących ekspozycji w celu zidentyfikowania wszelkich uszkodzeń.

W przeciwieństwie do technik rozpraszania, które zazwyczaj wymagają dopasowania do interpretacji, transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM) zapewnia rzeczywisty obraz wizualny nanocząstek w przestrzeni poprzez przepuszczenie wiązki elektronów przez próbkę i projekcję obrazu na ekranie scyntylacyjnym (Rysunek 5). W tym artykule przedstawiamy protokoły dla dwóch technik TEM. Cryo TEM zamraża próbki miceli w cienkiej warstwie szklistego lodu, zachowując konformację strukturalną przy minimalnej ilości obcych substancji, optymalna dla miceli o promieniu ≤ ~ 100 nm. Barwienie ujemne TEM wykorzystuje sól metali ciężkich (np. uranu) do otoczenia próbki po jej wysuszeniu na powierzchni siatki. Gęste barwienie rozproszy więcej elektronów niż próbka, dodając kontrast i tworząc negatywny obraz próbki. Cryo TEM jest zalecany do obrazów o wysokiej jakości. Jest to jednak bardziej kosztowne, czasochłonne i może nie zapewniać wystarczającego kontrastu. Gdy jest to problem, należy użyć próbek barwionych ujemnie. Przykłady każdego z nich są pokazane w Rysunek 5.

Każda z tych technik opisuje nieco inne aspekty nanocząstek, z różnymi mocnymi i ograniczonymi stronami. Rozpraszanie światła jest łatwo dostępne i często jest najszybszym podejściem, ale ma znaczne ograniczenia w zakresie rozdzielczości rozmiaru i kształtu. SAXS może dostarczać informacje w szerokim zakresie długości przy rozsądnie wysokiej przepustowości, ale wymaga specjalistycznego sprzętu do pozyskiwania danych, a także modelowania do ich interpretacji. Obrazy TEM są łatwe do interpretacji, ale mogą mieć ograniczony kontrast i z natury mają niską przepustowość. Nasze doświadczenie pokazuje, że stosowanie wielu technik charakterystyki znacznie zwiększa ilość informacji, które można uzyskać o właściwościach PCM i upraszcza interpretację zestawów danych uzyskanych z każdego z nich z osobna. Na przykład w ramach SAXS i TEM badane jest przede wszystkim gęste jądro PCM, podczas gdy rozpraszanie światła informuje o ogólnych wymiarach nanocząstki. W ten sposób połączenie ich pozwala na pomiar zarówno wielkości rdzenia, jak i korony. Zdolność TEM do pozyskiwania obrazów rzeczywistej przestrzeni kosmicznej może dostarczyć podstawowych danych o prawdziwości, aby umożliwić wybór odpowiednich formatów do modelowania danych SAXS, które w przeciwnym razie mogłyby być niejednoznaczne. W tym artykule opisano protokoły dla wszystkich czterech technik, a przykładowy proces ich użycia do scharakteryzowania nieznanej próbki znajduje się w sekcji Dyskusja.

Protokół

1. Przygotowanie materiałów

1. Odważyć liofilizowany polimer dwublokowy i dodać wodę do objętości bliskiej wymaganej dla roztworu podstawowego o końcowym stężeniu 10 mg/ml. Wiruj z maksymalną prędkością przez 2 minuty.
2. Sonikuj przez 5 minut. Bardzo długie dibloki mogą wymagać dodatkowej sonikacji. Roztwór podstawowy powinien wydawać się całkowicie przezroczysty i jednorodny.
3. W razie potrzeby dostosuj pH do 7,4 za pomocą NaOH lub HCl. Dodaj wodę do końcowej objętości. Roztwory pLys-PEG są dość stabilne, ale powinny być przechowywane w lodówce do dłuższego przechowywania, a przed użyciem należy sprawdzić pH. Liofilizacja jest lepsza niż zamrażanie.
4. Zawiesić liofilizowane oligonukleotydy o pożądanym stężeniu podstawowym, zwykle o stężeniu molekularnym 2–5 mM dla długości 50 nt lub mniejszej. Dokładnie wymieszać, aby zapewnić całkowite rozpuszczenie.
5. Obliczyć stężenia molowe za pomocą masy cząsteczkowej lub długości, jak opisano we Wprowadzeniu.
6. Obliczać stężenia ładunku molowego (c.c.), gdzie

Ładunek polielektrolitu to liczba naładowanych monomerów, podczas gdy ładunek kwasu nukleinowego to liczba zasad minus 1, przy założeniu braku fosforylacji. Należy pamiętać, że dwuniciowe DNA będzie miało dwa razy więcej ładunków na cząsteczkę w porównaniu z jednoniciowym DNA.

7. Utworzyć rozcieńczony materiał w temperaturze 20 mM c.c. dla każdego polimeru.

2. Przygotowanie miceli polielektrolitowej kwasu nukleinowego

1. W probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml wymieszać następujące składniki do całkowitej objętości 280 μl:
   1. 200 μL wody wolnej od nukleaz (woda ultraczysta dla PCM nie zawierających kwasów nukleinowych).
   2. 40 μL 10x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS, 137 mM chlorku sodu, 10 mM fosforanu, pH 7,4 po rozcieńczeniu do 1x) lub innego odpowiedniego buforu³⁷.
   3. 40 μL oligonukleotydu o stężeniu 20 mM c.c. W przypadku dwuniciowych oligonukleotydów dodać 20 μl każdej nici w temperaturze 20 mM c.c.
2. Inkubować roztwór oligonukleotydu przez 5 minut w temperaturze 70 °C. Jeżeli obliczona temperatura topnienia oligonukleotydów jest wyższa, temperaturę należy odpowiednio zwiększyć. Należy pamiętać, że RNA ulega degradacji w podwyższonych temperaturach, więc ten krok nie powinien trwać dłużej, jeśli obecny jest ten lub inne wrażliwe składniki.
3. Schłodzić przez 15 minut. Dodać 40 μl 20 mM c.c. diblock, a następnie natychmiast wirować przez 20 s z maksymalną prędkością. Inkubować 5 minut w temperaturze pokojowej (RT).
4. Wykonaj wyżarzanie solne.
   1. Dodać 80 μl 5 M chlorku sodu, aby uzyskać końcowe stężenie 1 M NaCl i końcową objętość 400 μl. Wirować przez 10 s z maksymalną prędkością.
   2. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej, a następnie załadować do wkładów dializacyjnych. Należy pamiętać, że podane wartości graniczne masy cząsteczkowej są wyznaczane dla białek globularnych i nie będą dokładne dla polimerów liniowych. Okazuje się, że wkład 2k MWCO pozwala uniknąć utraty próbki, a także zapewnia stopniowe zmiany siły jonowej.
   3. Przygotuj kąpiele dializacyjne.
      1. Oblicz objętość potrzebnej kąpieli dializacyjnej:
         
      2. Wymieszaj 10x PBS (lub inny pożądany bufor), 5 M NaCl i ultraczystą wodę, aby uzyskać końcowy roztwór 1x PBS i 0,5M NaCl, a także dwa roztwory 1x PBS.
   4. Załaduj wkłady dializacyjne.
      1. Oznacz wkłady markerem permanentnym. Namocz wkłady w buforze na co najmniej 2 minuty w celu uwodnienia membran.
      2. Zdejmij nakrętkę, przekręcając ją w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara. Załaduj próbkę za pomocą końcówki pipety z żelem. Usuń nadmiar powietrza, delikatnie ściskając membrany. Wymień nasadkę.
      3. Umieścić wkłady w 1x PBS, 0,5 M łaźni dializacyjnej chlorku sodu. Wkłady powinny unosić się na wodzie, przy czym obie membrany powinny być wystawione na działanie kąpieli. W razie potrzeby można użyć pływaków piankowych.
   5. dializa
      1. Inkubować przez 24 godziny, powoli mieszając za pomocą mieszadła magnetycznego.
      2. Przenieś wkłady do nowej kąpieli z 1x PBS lub innym pożądanym buforem roboczym. Inkubować przez 24 godziny, powoli mieszając za pomocą mieszadła magnetycznego. Powtórz ten krok.
   6. Odzyskać próbkę.
      1. Wyjmij wkłady z wanny. Zdejmij nakrętkę i odzyskaj próbkę za pomocą końcówki pipety z żelem. Należy pamiętać, że odzyskana objętość może być wyższa niż początkowe 400 μl z powodu pęcznienia błony. Zapisać odzyskaną objętość, jeśli niewielkie rozcieńczenie stanowi problem.
      2. Umieść próbkę w czystej probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Tak przygotowane PCM powinny być stabilne przez kilka miesięcy w lodówce, pod warunkiem, że uniknięto zanieczyszczenia nukleazą.

3. Dynamiczne rozpraszanie światła

1. Aby zapewnić warunki wolne od pyłu, powinny być dokładnie przefiltrowane (przefiltrowane 3x przez strzykawkę 0,22 μm lub filtr próżniowy), a naczynia szklane dokładnie oczyszczone między próbkami. Ważne jest również, aby przed przeprowadzeniem pomiaru upewnić się, że próbka osiągnęła równowagę termiczną.
2. Rozcieńczyć próbkę PCM do 0,2 mM c.c. (10x w przypadku korzystania z protokołu opisanego powyżej) żądanym buforem roboczym i załadować do odpowiedniej kuwety. Używamy kuwety o małej objętości, która wymaga ~200 μL próbki po rozcieńczeniu.
3. Ustaw pozycję detektora DLS na 90°.
4. Dostosuj moc lasera i/lub tłumik tak, aby szybkość zliczania wynosiła 100 000–200 000 zliczeń na sekundę (cps), jeśli to możliwe. Można stosować szybkości zliczania tak niskie, jak 10 kc/s, ale może być konieczne wydłużenie czasu pomiaru w celu uzyskania dobrych statystyk (krok 4.1). Należy unikać wyższych wskaźników zliczania, ponieważ wielokrotne rozpraszanie zakłóci pomiar.
5. Zbieraj dane przez 1 minutę. Szybkość zliczania powinna być stała przez cały czas pozyskiwania; Jeśli nie, oznacza to, że jakiś składnik próbki lub przyrządu nie osiągnął jeszcze równowagi.
6. Sprawdź dane autokorelacji. Długoterminowa linia bazowa powinna być bardzo płaska, a krzywa autokorelacji powinna być gładka, z minimalnym rozproszeniem, jak pokazano na rysunku Rysunek 3A. Dryft linii bazowej wskazuje na brak równowagi, a szum w danych można poprawić, pozyskując więcej danych.
7. Dopasuj funkcję autokorelacji.
   1. Użyj REPES^38,39, aby wykonać regularną odwrotną transformację Laplace'a, aby uzyskać rozkład czasów relaksacji i współczynnik dyfuzji, D. Metoda ta następnie oblicza promień hydrodynamiczny, R_h, przy użyciu równania Stokesa-Einsteina:
      
      Rysunek 1B przedstawia reprezentację R_h i Rysunek 3B pokazuje wynik REPES.
   2. Alternatywnie możesz użyć innych metod, w tym CONTIN^40,41 (alternatywny algorytm regularyzacji) lub nieujemnego dopasowania metodą najmniejszych kwadratów (NNLS). Spójne wyniki z wielu metod dopasowania są znakiem rozpoznawczym wysokiej jakości danych. Należy zauważyć, że analiza kumulacyjna (standardowa w wielu instrumentach) daje niefizyczne wartości dla multimodalnych rozkładów rozmiaru/długości.

4. Rozpraszanie światła pod wieloma kątami

UWAGA: Intensywność rozpraszania światła w funkcji kąta może być mierzona na różnych instrumentach. Uzyskaliśmy dobre wyniki zarówno przy użyciu instrumentów opartych na goniometrach, jak i instrumentów z wieloma detektorami, działających w trybie wsadowym.

1. Dostosuj stężenie PCM i intensywność oświetlenia, aby zapewnić wystarczający sygnał/szum w porównaniu z próbką tylko buforową pod każdym kątem, bez nasycania jakiegokolwiek detektora. Te ostatnie można przetestować, przygotowując próbki o różnych współczynnikach rozcieńczenia i sprawdzając liniowość intensywności w funkcji stężenia (przy założeniu minimalnej interakcji między PCM).
2. Rejestruj szybkość rozpraszania światła od 15° do 135° przez 1 minutę dla każdego kąta. Jeśli próbka i przyrząd są odpowiednio zrównoważone, szybkość rozpraszania będzie stała w czasie pomiaru.
3. Wykreśl znormalizowaną szybkość rozpraszania, Isin(θ), w porównaniu z q, gdzie I jest szybkością rozpraszania. q jest wektorem rozpraszania (przenoszenia pędu fotonu) zdefiniowanym przez

gdzie η = współczynnik załamania rozpuszczalnika, θ = kąt pomiaru, a λ = długość fali źródła światła. Rysunek 4 pokazuje wykres intensywności rozpraszania MALS.

5. Rozpraszanie promieniowania rentgenowskiego pod małym kątem

1. Akwizycja danych
   1. Przygotować próbki PCM zgodnie z powyższym opisem przy stężeniu ładunku 2 mM dla oligonukleotydowych PCM w celu obfitego rozproszenia powyżej tła. W przypadku PCM pozbawionych ciężkich atomów (np. fosforu w kwasach nukleinowych) mogą być wymagane wyższe stężenia. Gęstości długości rozproszenia można oszacować za pomocą kalkulatorów, takich jak SASSIE⁴².
   2. W celu zminimalizowania uszkodzeń spowodowanych promieniowaniem poprzez wymiatanie wolnych rodników, należy dodać glicerol ze stężonego (np. 50%) roztworu podstawowego, tak aby roztwór miceli zawierał 1% (v/v) glicerolu. Należy pamiętać, że czysty glicerol jest bardzo lepki i trudny do dokładnego zmierzenia. Zdecydowanie zaleca się rozcieńczanie wodą lub buforem.
   3. Przygotuj dużą objętość buforu roboczego z 1% glicerolem do użycia jako monitor w tle.
   4. Przygotować aparaturę do pomiaru przepływu specyficzną dla linii badawczej i skalibrować detektor. W protokole wykorzystano kwarcową kapilarnę o średnicy 3 mm podłączoną do sterowanej komputerowo pompy strzykawkowej o małej średnicy i minimalnej długości rurki polietylenowej. W tej konfiguracji wymagana jest minimalna objętość ~140 μl na próbkę.
   5. Określ parametry ekspozycji próbki. Optymalna ekspozycja będzie się różnić w zależności od intensywności wiązki, czułości detektora oraz stężenia, siły rozpraszania i podatności próbki na uszkodzenia, ale celem jest wystawienie próbki na działanie minimalnego strumienia wymaganego do uzyskania wystarczającej intensywności rozpraszania w zakresie q zainteresowania.
   6. W przypadku oligonukleotydów/pLys-PEG PCM, 30-krotna ekspozycja 0,2 s z częstotliwością powtarzania 1 Hz zapewnia dobrą jakość danych przy niewielkich zauważalnych uszkodzeniach. W przypadku nowych próbek pomocna może być następująca procedura:
      1. Przygotuj próbki PCM w różnych stężeniach (np. 10–10 000 μM c.c.).
      2. Zaczynając od stężenia pośredniego, naprzemiennie PCM i próbki zawierające tylko bufor o różnym czasie ekspozycji. Poniżej znajduje się procedura gromadzenia i redukcji danych. Przykładowy sygnał powinien mieć dobre statystyki (mały błąd statystyczny lub płynna zmienność w poprzek q). Jeśli statystyki są słabe, czas ekspozycji może się wydłużyć.
      3. Przykładowy sygnał powinien być również wyraźnie odróżnialny od tła w zakresie q będącym przedmiotem zainteresowania. Oblicz i wykreśl stosunek (sygnał do tła)/tła w funkcji q, aby określić stosunek sygnału do tła. Jeśli stosunek sygnału do tła jest niski, stężenie próbki należy zwiększyć.
      4. Sprawdź, czy intensywność rozpraszania (znormalizowana do stężenia) jest niezależna od stężenia próbki, uzyskując dane przy wyższych i niższych stężeniach, w razie potrzeby skalując czas ekspozycji. Oddziaływania międzycząsteczkowe (najbardziej prawdopodobna przyczyna zależności od stężenia) będą najbardziej wyraźne w niskim zakresie q.
   7. Uzyskaj dane dla próbek PCM i tła (tj. buforu z glicerolem).
      1. Uruchomić pompę strzykawkową, aby przesunąć próbkę przez kapilarę. Dopuszczalny jest ruch dwukierunkowy lub jednokrotny, ale należy zachować ostrożność w celu wyizolowania każdej próbki (np. poprzez wprowadzenie pęcherzyka powietrza między próbki). Próbki mogą być odzyskane i mogą być ponownie wykorzystane, jeśli nie obserwuje się uszkodzeń spowodowanych promieniowaniem.
      2. Po rozpoczęciu przepływu uruchom opisany powyżej program ekspozycji na promieniowanie rentgenowskie i akwizycji danych. Należy zadbać o to, aby ekspozycja wiązki zakończyła się przed przepływem płynu.
   8. Po każdej próbce należy przeprowadzić uśrednianie azymutalne i wykreślić razem profile 1D (tj. intensywność w funkcji q) dla każdej ekspozycji. Powinny być one identyczne pod względem błędu statystycznego. Zmiana sygnału w czasie może wskazywać na uszkodzenie przez promieniowanie.
      1. Izolowane profile anomalne mogą wskazywać na obecność mikropęcherzyków. Jeśli pęcherzyki są często obserwowane, pomocne może być zmniejszenie natężenia przepływu.
   9. Uśrednij profile rozpraszania 1D.
   10. Często zbieraj dane dla próbek tylko buforowych (raz na 4–5 próbek PCM) i porównuj je w czasie. Zwiększony sygnał z próbek tylko buforowych wskazuje, że kapilara może być zanieczyszczona próbką uszkodzoną przez promieniowanie.
       1. Po zauważeniu zanieczyszczenia umyj kapilarę wybielaczem i rozważ skrócenie czasu ekspozycji, jeśli to możliwe.
2. Redukcja i analiza danych za pomocą Ireny
   1. Importowanie zestawów danych ASCII miceli i tła (SAS/Import i eksport danych/Import danych ASCII SAS).
   2. Odejmij rozpraszanie tła od przykładowych danych. Zazwyczaj najwyższe wartości q (np. q > 0,5) wskazują na niekoherentne rozpraszanie od rozpuszczalnika dominującego w sygnale. Skalowanie danych tła w celu dopasowania do danych próbki w tym zakresie q usuwa wszelkie zmiany wynikające ze zmienności intensywności wiązki i stężenia próbki.
      1. Wykreślić próbkę i tło razem w skali logarytmicznej. Sprawdź płaską intensywność przy wysokim q (SAS/Manipulacja danymi/Manipulacja danymi I). Oblicz stosunek próbki do tła (Dane1/Dane 2), wykreśl na liniowej skali logarytmicznej i sprawdź asymptotę o wysokiej jakości.
      2. Oblicz średni stosunek (próbka/tło) w tym zakresie q (użyj niestandardowego makra lub skopiuj/wklej do arkusza kalkulacyjnego z przeglądarki danych).
      3. Korzystając z makra Manipulowanie danymi, przeskaluj tło (np. Modyfikuj dane 2) przy użyciu współczynnika obliczonego powyżej i wykreśl stosunek sygnału odjętego od tła do tła w funkcji q ([Dane1-Dane2]/Dane2), sprawdzając, czy teraz asymptoty do zera przy wysokim q. Zapisz ten stosunek; Powinien być oddalony o <1–2% od 1,0 dla każdej próbki.
      4. Wykreśl sygnał odjęty od tła (Dane1-Dane2) w funkcji q i zapisz dane pod nową nazwą. Nie nadpisuj oryginalnych danych.
      5. Jeśli dane o wysokim q nie są dostępne, użyj współczynnika skalowania 1 do odejmowania tła, ale należy pamiętać, że niedokładności mogą zostać wprowadzone w zakresach q, w których stosunek sygnału do tła jest mały.
   3. Otwórz makro Modelowanie (SAS/Modeling), a następnie załaduj i wykreśl dane odjęte w tle (Data cntrls/Dodaj dane). Nie skaluj w tym makrze.
   4. Najpierw znajdź przybliżony model zewnętrznej powierzchni PCM (rozmiar/kształt miceli):
      1. W obszarze Kody danych wybierz niski lub umiarkowany zakres q (np. ~0,003A-1 < q < ~0,1Å-1). Jeśli oscylacje są widoczne, uwzględnij je.
      2. Wybierz współczynnik kształtu odpowiedni dla danych. Nachylenie przy niskim q wskazuje na kształt nanocząstek, który można również zweryfikować za pomocą TEM i/lub MALS. Użyj modelu sferoidalnego Schulza-Zimma (q⁰), cylindrycznego (^q-1) lub elastycznego cylindra (^q-2). Irena dostarcza narzędzia do dopasowywania praw potęgowych (SAS/Support Tools dla wykresów i tabel).
      3. W obszarze Model cntrls wybierz pierwszą populację rozpraszającą (1P) i upewnij się, że jest ona jedyną używaną (zaznacz pole wyboru Użyć?).
      4. Wybierz Rozmiar dla Model i wybierz żądany Typ dystrybucji i Współczynnik kształtu. Ustaw początkowe parametry wyszukiwania, wprowadzając wartości w polach Skala, Średni rozmiar i Szerokość, a następnie kliknij przycisk Oblicz model, aby narysować wynikowy współczynnik kształtu.
         UWAGA: Elastyczny cylinder można dodać jako format użytkownika i pobrać ze strony https://usaxs.xray.aps.anl.gov/software/irena. Parametry 1 i 2 odpowiadają odpowiednio długości cylindra i długości Kuhna.
      5. Po znalezieniu rozsądnych parametrów kliknij przycisk Dopasuj model, aby wykonać nieliniowe dopasowanie metodą najmniejszych kwadratów do danych. Model rozkładu rozmiaru podaje średni promień i szerokość.
         Aby obliczyć polidyspersyjność (PDI), użyj
         
         Podobnie jak w przypadku każdej procedury dopasowania nieliniowego, może być konieczne dostosowanie zakresu danych (obszar q) i parametrów początkowych w celu uzyskania stabilnego, fizycznie uzasadnionego dopasowania.
      6. Po uzyskaniu rozsądnego dopasowania zapisz je (Przechowuj w notebooku/Przechowuj w folderze).
   5. Następnie należy zamodelować rozproszenie poszczególnych polimerów w rdzeniu PCM. Można to uchwycić za pomocą modelu prawa potęgowego (np. ^q-2 dla idealnych łańcuchów, ^q-5/3 dla spuchniętych łańcuchów itp.). Irena realizuje to za pomocą modelu Beaucage⁴³:
      
      gdzie P jest prawem potęgowym, a G i B są prefaktorami.
      1. Dostosuj elementy sterujące danymi tak, aby obejmowały cały zakres q i ponownie wydrukuj model (Oblicz model). Zazwyczaj nadmierne rozpraszanie obserwuje się w zakresie od umiarkowanego do wysokiego q (np. q > ~0,1A-1).
      2. Użyj kontrolek danych, aby wybrać zakres q, w którym obserwuje się nadmierne rozpraszanie (>10 razy więcej niż w modelu współczynnika kształtu).
      3. Dodaj drugą populację rozpraszającą (2P) i upewnij się, że jest to jedyna używana populacja (odznacz Użyć? dla 1P).
      4. Wybierz Ujednolicony poziom dla modelu. B i P są istotnymi parametrami. Użyj narzędzi wspomagających kreślenie lub makra Dopasuj P/B między csrs, aby uzyskać wstępne przypuszczenie dla tych parametrów, a następnie dostosuj współczynniki Guiniera G i R_g, aby upewnić się, że model nie przewiduje nadmiernego rozpraszania przy niskim q.
      5. Jeśli chodzi o współczynnik kształtu, wykonaj dopasowanie nieliniowe i zapisz parametry oraz model.
   6. Następnie, jeśli pik dyfrakcyjny jest obecny, jak w Rysunek 4, dodaj trzeci model dla piku dyfrakcyjnego w zakresie q zainteresowania (q = ~0,22 ^A-1 w tym przypadku).
   7. Po uzyskaniu przybliżonych wartości dopasowania dla poszczególnych populacji rozpraszających włącz wszystkie trzy razem (wybierz Użyj? dla każdej z nich) i zoptymalizuj łączne dopasowanie.
   8. Sprawdź, czy każda wartość jest fizycznie uzasadniona. Wynikiem tej procedury powinien być model złożony, który dobrze opisuje dane SAXS w szerokim zakresie skal rozmiarów, jak pokazano na rysunku Rysunek 4. Zapisz dopasowanie za pomocą przycisku Przechowuj w folderze, aby zapisać je w Igor.

6. Transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM)

1. Kriogeniczny TEM
   1. Zaznacz siatkę. Jako alternatywę polecamy folię nośną z włókna węglowego holey na standardowej siatce TEM lub lacey carbon. W obu przypadkach otwory między węglem zapewnią obszar obrazowania z czystego szklistego lodu i próbki, bez filmu.
   2. Umieść siatkę stroną z włókna węglowego do góry w aparacie do rozładowywania jarzenia na czystym szkiełku podstawowym. Owinięcie szkiełka folią laboratoryjną może pomóc w obsłudze siatki. Unikaj dotykania środka siatki pęsetą i zawsze ściskaj w pobliżu krawędzi siatki.
   3. Odsłoń siatkę na 30 s.
   4. Przygotuj robota do witryfikacji do osadzania próbki.
      1. Ustaw na 100% wilgotności i RT i dodaj bibułę. Przygotuj kąpiele w ciekłym etanie i ciekłym azocie u podstawy robota. Zapoznaj się z samouczkami i filmami online, aby uzyskać dodatkową pomoc w przygotowaniu i użyciu robota do witryfikacji.
   5. Rozcieńczyć próbkę 5x.
   6. Za pomocą pęsety o negatywnym działaniu dostarczonej z robotem do witryfikacji podnieś siatkę, a następnie przymocuj pęsetę do robota i wsuń pęsetę do komory.
   7. Będąc w robocie, dodaj 4 μl próbki po węglowej stronie siatki za pomocą pipety przez otwór z boku maszyny.
   8. Inkubować przez 4 minuty.
   9. Za pomocą robota osusz 3–5 s bibułą filtracyjną.
   10. Robot witryfikacyjny zanurzy siatkę w ciekłym etanie.
   11. Wyjmij pęsetę i przenieś siatkę do ciekłego azotu i do pojemnika do przechowywania, który również powinien znajdować się pod ciekłym azotem. Proces ten utrwala próbkę w cienkiej warstwie szklistego lodu. Na tym etapie zminimalizuj czas, jaki siatka spędza na wydostawaniu się ciekłego etanu lub ciekłego azotu.
   12. Schłodzić uchwyt próbki kriogenicznej za pomocą ciekłego azotu. Utrzymuj Dewara i zbiornik pełny.
   13. Gdy będziesz gotowy do obrazowania, załaduj siatkę na uchwyt próbki kriogenicznej. Utrzymuj próbkę pod ciekłym azotem lub przez krótki czas w ekstremalnie zimnej parze azotu tuż nad powierzchnią cieczy.
   14. Wyobraź sobie siatkę przy napięciu 120 kV między 75 kx a 150 kx w cienkim i grubym lodzie, ponieważ micele o różnych rozmiarach mogą preferować określoną grubość lodu.
       1. Ogranicz ekspozycję wiązki, aby uniknąć stopienia lodu i uszkodzenia próbki. Nie ustawiaj ostrości bezpośrednio w miejscu, w którym planujesz obrazować; Skup się w pobliżu. Eksponuj tylko obszar zainteresowania podczas robienia zdjęcia.
       2. Upewnij się, że krople ciekłego etanu odróżniłeś od próbki podczas przeglądania obrazów (patrz Rysunek 5).
2. Konwencjonalny TEM z wykorzystaniem barwienia ujemnego
   1. Przygotuj plamę.
      1. Zagotuj ~10 ml ultraczystej wody. Odważyć 0,1 g mrówczanu uranylu (UFo) do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
      2. Dodaj 5 ml gorącej wody do proszku UFo, aby uzyskać 2% roztwór. Zamknij szczelnie i zawiń w folię aluminiową, aby zablokować światło. Powszechnie stosuje się również 1% barwnik z octanu uranylu.
      3. Wiruj lub energicznie potrząsaj przez 5 minut. Pomocne będzie przymocowanie rurki do wirownika. Przefiltrować przez filtr strzykawkowy 0,2 μm do czystej stożkowej rurki.
      4. Pozostaw do ostygnięcia na 10 minut do temperatury pokojowej. Dodać 25 μl 5M NaOH i natychmiast wirować przez 2 minuty.
         1. Alternatywnie można zamrozić 200 μl podwielokrotności 2% UFo. Gdy produkt jest gotowy do użycia, rozmrozić podwielokrotność, dodać 1 μl 5 M NaOH i wirować przez 2 minuty.
      5. Plamę należy przechowywać zawinięta w folię lub z dala od światła.
   2. Rozcieńczyć próbkę 10x w 1x PBS (lub żądanym buforze).
   3. Wybierz siatkę. Polecamy folię nośną węglową na kratkach miedzianych. Ciemniejsza, bardziej błyszcząca strona siatki to strona pokryta węglem, na której próbka zostanie osadzona i zabarwiona.
   4. Umieść siatkę stroną z włókna węglowego do góry w aparacie do rozładowywania jarzenia na czystym szkiełku podstawowym. Patrz krok 6.1.2.
   5. Odsłoń siatkę na 30 s.
   6. Podnieś siatkę stroną z włókna węglowego nadal skierowaną do góry i przytrzymaj pęsetą o negatywnym działaniu za krawędź siatki, aby zapobiec rozdarciu obszaru obrazowania pośrodku. Odłóż pęsetę tak, aby siatka nadal trzymała karbonową stronę do góry.
   7. Nanieść kroplę próbki o objętości 4 μl na górną (węglową stronę) siatki za pomocą pipety.
   8. Inkubować 4 min.
   9. Mając ~1 minutę do końca, odpipetować 10 μl i 20 μl kropli roztworu UFo na kawałek czystej folii laboratoryjnej.
   10. Użyj bibuły filtracyjnej, aby odsunąć próbkę od krawędzi siatki (kontakt prostopadły), aby uniknąć kontaktu z powierzchnią obrazowania.
   11. Za pomocą pęsety (nadal trzymając siatkę) natychmiast umieść próbkę stroną siatki w dół na kropelce 10 μl UFo, a następnie natychmiast odsiądź płyn (etap mycia). Ważne jest, aby nie dopuścić do wyschnięcia siatki, więc nie zatrzymuj się między krokami.
   12. W podobny sposób nanieść kroplę UFo o objętości 20 μl na siatkę. Przytrzymaj siatkę na UFo przez 40 s. Odkręć płyn i pozostaw siatkę do wyschnięcia.
   13. Obraz suchej sieci przy napięciu 120 kV od 20 000x do 100 000x.
   14. Należy pamiętać o prawidłowej utylizacji wszystkich materiałów skażonych UFo, korzystając z usług instytucji ds. bezpieczeństwa odpadów promieniotwórczych.
   15. W razie potrzeby do obrazów TEM w ImageJ można zastosować poprawę jasności/kontrastu i filtr mediany w celu zmniejszenia szumów tła. Przetwarzanie końcowe powinno być wykonywane jednolicie, tylko w przypadku obrazów, które nie są wykorzystywane do pomiarów ilościowych, takich jak intensywność, i zawsze powinny być raportowane.

Wyniki

Aby zilustrować opisane powyżej metody charakteryzacji, pokazujemy typowe wyniki dla PCM złożonych z oligonukleotydów i kopolimerów blokowych o różnej długości i składzie chemicznym (Rysunek 1). Rysunek 2 przedstawia przykład tego, jak rozmiar rdzenia PCM (określony na podstawie SAXS i TEM, Rysunek 4 i Rysunek 5) zmieniał się wraz z długością naładowanego bloku. Rysunek 3 pokazuje dane DLS i w...

Dyskusja

Jak wspomniano powyżej, przedstawione tutaj protokoły są napisane z naciskiem na oligonukleotydy jako składnik polianionu i pLys-PEG jako kationowo-obojętny kopolimer blokowy, ale przetestowaliśmy je z różnymi polimerami, takimi jak poli(kwas akrylowy), poliglutaminian i PEG-poli(dimetyloamonian winylobenzylu) i uważamy, że będą one ogólnie stosowane dla większości par polielektrolitów. Jednym z parametrów, który może wymagać optymalizacji, jest stężenie soli używane do wyżarzania, ponieważ powinno być na tyle wysokie, a...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Bibuła filtracyjna o średnicy 70 mm	Whatman	1001-070	Bibuła filtracyjna do odprowadzania wilgoci podczas przygotowywania siatki
Siatka TEM z folii węglowej	Mikroskopia elektronowa Nauki Siatka	TEM	CF200-Cu
Technologia DAWN	Wyatt Instrument	DAWN	MALS
Oligonukleotyd DNA	Zintegrowane DNA Nanotechnologies Inc		Niestandardowy oligonukleotyd
Lacey Carbon Siatka TEM	Mikroskopia elektronowa Nauki	LC200-Cu	Siatka TEM
Metoksy-poli(glikol etylenowy)-blok-poli(chlorowodorek l-lizyny) PEG5k - PLKC50	Alamanda Polymers Inc	mPEG5K-b-PLKC50	Przykładowy kopolimer
blokowy Milli-Q	Millipore Sigma		Ultraczysta woda
NanoDrop	Thermo Scientific		Do pomiaru stężenia kwasów
Pęseta o działaniu ujemnym	Pęseta Dumont	N7	do przygotowania siatki
Parafilm "M"	Bemis Company Inc	PM996	Folia laboratoryjna
Quantifoil Holey Carbon TEM grid	Mikroskopia elektronowa Nauki Q210CR1.3		Siatka TEM
Goniometr badawczy i laserowy system rozpraszania światła	Brookhaven Instruments	Instrument BI-200SM	DLS/MALS
Slide-A-Lyzer G2 2K 0,5 ml	Thermo Scientific Pierce Protein Biology	87723	dializy
o małej objętości Kuweta	Brookhaven Instruments	BI-SVC	do DLS/MALS
Solarus 950 Zaawansowany system plazmowy	Gatan	Solarus 950	System plazmowy do siatek TEM
Talos TEM	FEI	Talos	TEM używany do próbek kriogenicznych
Tecnai Spirit TEM	FEI	Spirit	TEM stosowany do suchych próbek
Mrówczan uranylu	SPI-Chem	16984-59-1	Do ujemnych próbek barwiących dla TEM
Vitrobot	FEI	Robot do witryfikacji Vitrobot do przygotowania kriokraty