Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Montaż i charakterystyka miceli kompleksu polielektrolitu

10.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60894

⸱

2 marca 2020

 ,  , 
1Pritzker School of Molecular Engineering, The University of Chicago

W tym artykule

Podsumowanie

Dostarczamy protokoły i reprezentatywne dane do projektowania, montażu i charakteryzowania miceli kompleksu polielektrolitowego, nanocząstek typu rdzeń-powłoka tworzonych przez polielektrolity i hydrofilowe naładowane-nienaładowane kopolimery blokowe.

Streszczenie

Micele kompleksu polielektrolitowego (PCM), nanocząstki typu rdzeń-powłoka powstałe w wyniku samoorganizacji naładowanych polimerów w roztworze wodnym, stanowią potężną platformę do badania fizyki oddziaływań polielektrolitu, a także oferują obiecujące rozwiązanie palącego problemu dostarczania terapeutycznych oligonukleotydów in vivo. Opracowanie predykcyjnych zależności struktura-właściwości dla PCM okazało się trudne, częściowo ze względu na obecność silnych pułapek kinetycznych podczas samoorganizacji nanocząstek. W artykule omówiono kryteria wyboru polimerów do budowy PCM oraz przedstawiono protokoły oparte na wyżarzaniu solnym, które umożliwiają montaż powtarzalnych nanocząstek o niskiej polidyspersyjności. Omawiamy również charakterystykę PCM za pomocą rozpraszania światła, rozpraszania promieniowania rentgenowskiego pod małymi kątami i mikroskopii elektronowej.

Wprowadzenie

Gdy przeciwnie naładowane polielektrolity są mieszane w roztworze wodnym, przyrost entropii wynikający z uwolnienia ich przeciwjonów powoduje wymieszanie roztworu na fazę skondensowaną bogatą w polimer i supernatant zubożony w polimer1,2,3,4,5, zjawisko znane jako kompleksowanie polielektrolitów. Jeśli neutralny blok hydrofilowy jest sprzężony z jednym lub obydwoma polielektrolitami, zamiast tego następuje separacja faz w nanoskali (Rysunek 1A). Powstałe w ten sposób samoorganizujące się nanocząstki typu rdzeń-powłoka są różnie określane jako micele kompleksu polielektrolitu (PCM), micele kompleksu polijonowego, kompleksy jonomerów blokowych lub micele z rdzeniem koaceracyjnym przez analogię do micelizacji środków powierzchniowo czynnych, mimo że wszystkie składniki systemu są hydrofilowe6,7. Zdolność PCM do hermetyzacji cząsteczek hydrofilowych, takich jak białka i kwasy nukleinowe, a także szerokie możliwości przestrajania oferowane przez architekturę nośnika kopolimeru blokowego sprawiają, że są one atrakcyjnymi kandydatami do dostarczania cząsteczek terapeutycznych in vivo8,9,10,11,12,13.

Dostarczanie terapeutycznych kwasów nukleinowych do celów komórkowych jest szczególnie ważnym wyzwaniem, dla którego PCM oferują wiele korzyści. Terapeutyczne kwasy nukleinowe (genetyczne DNA, mRNA i oligonukleotydy, takie jak siRNA) mają ogromny potencjał w zakresie poprawy zdrowia ludzkiego, ale muszą pokonać liczne bariery biologiczne i fizyczne, aby wykorzystać ten potencjał14,15,16. Nagie kwasy nukleinowe są rozkładane przez nukleazy surowicy i komórki, są szybko usuwane z krążenia, a ich silny ładunek ujemny utrudnia im przenikanie przez błony komórkowe bez pomocy. Obecne podejścia do pokonywania tych barier obejmują kosztowne modyfikacje chemiczne w celu zapobiegania uszkodzeniom spowodowanym nukleazami i/lub enkapsulacją w różne nanocząstki lipidowe powstałe w wyniku oddziaływań hydrofobowych15,17,18. Chociaż metody te okazały się skuteczne w przypadku miejscowych wstrzyknięć i celowania w wątrobę, stosowanie ogólnoustrojowe wiąże się ze znacznymi ograniczeniami toksyczności, immunogenności i ograniczonej biodystrybucji16. W przeciwieństwie do tego, PCM wykorzystują ujemny ładunek kwasów nukleinowych do ich kondensacji w rdzeniu oddzielonym fazowo, podczas gdy neutralna korona zapewnia barierę steryczną przed degradacją, a także platformę do włączania ligandów w celu zwiększenia celowania lub internalizacji11,19. Badania in vitro i na zwierzętach wykazały, że PCM mogą skutecznie dostarczać różne ładunki kwasów nukleinowych20,21,22,23,24, ale słabości naszej zdolności do przewidywania właściwości PCM, takich jak rozmiar, kształt i stabilność na podstawie właściwości polimerów składowych, utrudniły ich szersze zastosowanie.

Ostatnie prace naszej grupy i innych osób w tej dziedzinie zaczęły rozwiązywać ten problem poprzez rozwijanie relacji struktura-właściwość, a w niektórych przypadkach struktura-właściwość-funkcja dla PCM utworzonych z kwasów nukleinowych i różnych neutralnych kationowo polimerów7,25,26,27. Dwa spójne tematy, które wyłoniły się z tych badań, to znaczenie opracowania dobrze kontrolowanych, powtarzalnych protokołów składania PCM oraz korzyści płynące z zastosowania wielu technik do scharakteryzowania powstałych nanocząstek. Polielektrolity, szczególnie te o dużej gęstości ładunku, takie jak kwasy nukleinowe, oddziałują ze sobą bardzo silnie i wydają się łatwo ulegać kinetycznemu uwięzieniu po zmieszaniu, co powoduje, że preparaty PCM są bardzo wrażliwe na niewielkie zmiany w procedurze i wykazują wysoką polidyspersyjność oraz słabą powtarzalność z partii na partię. Wykazano również, że PCM przyjmują szeroki zakres kształtów i rozmiarów w zależności od konfiguracji na poziomie atomowym ich składników, a uchwycenie tej różnorodności za pomocą dowolnej indywidualnej techniki charakteryzacji jest bardzo trudne, zwłaszcza że niektóre popularne techniki, takie jak dynamiczne rozpraszanie światła (DLS), wymagają założeń dotyczących kształtu cząstek do ich interpretacji.

W tym artykule omawiamy projektowanie i wybór materiałów dla PCM, ze szczególnym uwzględnieniem oligonukleotydów i kationowo-neutralnych kopolimerów diblokowych. Następnie opisujemy protokół wyżarzania solnego, który wykorzystuje wysokie stężenia soli, a następnie powolną dializę, aby uniknąć pułapki kinetycznej podczas montażu PCM. Polielektrolity są mieszane w warunkach o wysokiej zawartości soli, w których przyciąganie elektrostatyczne jest przesiewane, a następnie stężenie soli jest powoli obniżane, aby polielektrolity mogły osiąść w najbardziej korzystnych energetycznie konfiguracjach, analogicznie do procesu powolnego chłodzenia wyżarzania termicznego. Korzystając z tego protokołu, regularnie jesteśmy w stanie osiągnąć wyjątkowo niską polidyspersyjność i wysoką powtarzalność dla oligonukleotydowych PCM7,26. Na koniec opisujemy, w jaki sposób cztery oddzielne techniki pomiarowe mogą być wykorzystane do scharakteryzowania PCM w bardzo szerokim zakresie skal długości, od morfologii zewnętrznej po strukturę wewnętrzną: DLS, wielokątowe rozpraszanie światła (MALS), rozpraszanie promieniowania rentgenowskiego pod małym kątem (SAXS) i transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM). Mamy nadzieję, że te protokoły umożliwią większej liczbie badaczy skuteczne zbadanie możliwości tych interesujących nanocząstek.

Wybór i przygotowanie polimerów
Na właściwości PCM duży wpływ mają właściwości fizyczne i chemiczne polimerów składowych, co sprawia, że wybór polimeru jest krytycznym krokiem w procesie projektowania. Najbardziej dobrze scharakteryzowanymi kopolimerami blokowymi dla PCM kwasów nukleinowych są dibloki liniowe, takie jak poli(lizyna)-poli(glikol etylenowy) (pLys-PEG), ale PCM mogą być tworzone między polielektrolitami a różnymi hydrofilowymi polimerami o neutralnym ładunku, które mogą być generowane w sposób wysokoprzepustowy28. Wybór naładowanej grupy silnie wpływa na stabilność parowania jonów i kształt miceli26, a wykazano, że rozmiar PCM zwiększa się wraz z długością naładowanego bloku5,7,26 (Rysunek 2), co pozwala na dostosowanie właściwości PCM do wymagań pożądanego zastosowania. W przypadku dibloków liniowych stwierdziliśmy, że naładowany blok powinien mieć co najmniej 10 ładunków i być silnie naładowany przy pożądanym pH. Dłuższe naładowane bloki mogą sprzyjać tworzeniu się PCM z oligonukleotydami, takimi jak siRNA, które są trudne do skompleksowania z krótszymi blokami21. Udało nam się zaobserwować powstawanie PCM przy długościach bloków do 200, a literatura opisuje dłuższe polimery. Większa elastyczność jest dostępna w wyborze bloków neutralnych24, ale doświadczenie pokazuje, że bardzo krótkie bloki neutralne prowadzą do agregacji, a nie do tworzenia nanocząstek, a minimalna długość neutralnego bloku wzrasta wraz z długością naładowanego bloku. W przypadku pLys-PEG wymagany jest PEG MW wynoszący co najmniej 3 000–5 000 dla długości pLys poniżej ~50, a większe długości są wymagane w miarę dalszego zwiększania naładowanego bloku. Zwiększona długość neutralnego bloku powoduje zwiększenie rozmiaru PCM, szczególnie grubości powłoki, ze względu na steryczne stłoczenie neutralnych polimerów.

Ten manuskrypt przedstawia protokół przygotowania PCM z liofilizowanych pLys-PEG o wysokiej czystości i oligonukleotydów o znanej ilości, ale powinien być również łatwo adaptowalny do innych systemów. Przetestowaliśmy go z powodzeniem z kilkoma naładowanymi polipeptydami, w tym poliargininą i kwasem poliglutaminowy, a także kilkoma syntetycznymi polielektrolitami, takimi jak kwas poliakrylowy i poli(winylobenzylotrimetyloamon). Opisujemy również przygotowanie PCM ze stosunkiem stechiometrycznym ładunków polielektrolitowych, ale można to łatwo zmodyfikować. Uważamy, że najłatwiej jest pracować w jednostkach koncentracji ładunku (c.c.), które w naturalny sposób również uwzględniają polimery, które nie są w pełni naładowane. Jeśli którykolwiek z polimerów nie jest dobrze scharakteryzowany, należy zadbać o dokładne określenie długości/masy polimeru i upewnić się, że nadmiar soli nie jest obecny poza tym, który jest potrzebny do neutralizacji ładunku przez dializę, na przykład. Przy obliczaniu stężeń należy również uwzględnić obecność zatrzymanej wody. Stężenie kwasu nukleinowego można wygodnie określić ilościowo za pomocą absorbancji przy 260 nm, a przy obliczaniu cc należy wziąć pod uwagę obecność lub brak końcowych fosforanów.

Podczas używania oligonukleotydów jako polianionów, stan hybrydyzacji i struktura chemiczna pomagają określić skłonność do samoorganizacji i cechy wynikowego PCM5,7,26. Ich optymalizacja, w ramach wymagań dotyczących skuteczności biologicznej w przypadku stosowania PCM do dostarczania, zwiększy prawdopodobieństwo powstania pożądanych struktur. Pomocne narzędzia do analizy hybrydyzacji obejmują funkcje MATLAB dla kwasów nukleinowych, NUPACK29 i IDT OligoAnalyzer. Zalecamy przeanalizowanie sekwencji kandydującej, aby zrozumieć siłę wiązania z 1) sobą w formacji spinki do włosów; 2) inna kopia tej samej sekwencji (samościemniacz); oraz 3) do innych oligonukleotydów obecnych w układzie. Temperatury topnienia DNA i RNA dla określonej sekwencji można również obliczyć za pomocą metody najbliższego sąsiada30,31. Wyżarzanie termiczne kwasów nukleinowych (krok 2.3) denaturuje wszelkie resztkowe struktury drugorzędowe w poszczególnych nukleotydach i sprzyja fałdowaniu równowagi.

Charakterystyka i analiza PCM
Dostępnych jest wiele technik charakteryzowania nanocząstek, w tym statyczne i dynamiczne rozpraszanie światła, rozpraszanie elektronów lub neutronów pod małymi kątami oraz mikroskopia elektronowa. W tym artykule przedstawiamy protokoły dla dwóch technik rozpraszania światła, rozpraszania promieniowania rentgenowskiego pod małym kątem i dwóch technik mikroskopii elektronowej.

DLS mierzy autokorelację fluktuacji czasowych w intensywności rozpraszania pod jednym kątem od ruchu Browna próbki. Dopasowanie tych danych może zapewnić promień hydrodynamiczny i polidyspersyjność dla sferycznych miceli (Rysunek 3). Rozpraszanie światła pod wieloma kątami (MALS) mierzy intensywność rozpraszania statycznego pod wieloma kątami. Ta zależność kątowa opisuje kształt nanocząstki, ale jest ograniczona do skal długości dłuższych niż ~50 nm dla światła widzialnego, co ogranicza jej skuteczność dla mniejszych nanocząstek. Obie techniki opierają się na niedopasowaniu współczynnika załamania światła i opisują przede wszystkim zewnętrzne wymiary nanocząstki.

Rozpraszanie promieniowania rentgenowskiego pod małym kątem (SAXS) wykorzystuje promieniowanie rentgenowskie jako sondę rozpraszającą, a ich krótsza długość fali pozwala na pomiary w zakresie ~0,1–100 nm. Dopasowanie obserwowanej intensywności rozpraszania do kąta (konwencjonalnie wyrażonego jako przeniesienie pędu q) dostarcza informacji o morfologii PCM (tj. rozmiarze i kształcie), a także o strukturze wewnętrznej. Jeśli dostępna jest kalibracja intensywności bezwzględnej, a intensywność rozpraszania można ekstrapolować do kąta zerowego, można również oszacować masę PCM i liczbę agregacji32, co czyni SAXS niezwykle wszechstronną i wartościową metodą. Rozpraszanie neutronów pod małym kątem (SANS) jest czułe w podobnym zakresie skal długości, ale jest dostępne tylko w specjalistycznych obiektach i nie zostanie wyraźnie omówione w tym artykule33,34,35.

Ostatnie lata przyniosły pojawienie się stacjonarnych instrumentów SAXS, ale stwierdzamy, że źródła synchrotronowe lepiej nadają się do charakteryzacji PCM, ponieważ ich wyższa intensywność pozwala na znacznie szybsze zbieranie danych dla tych próbek o niskim kontraście. Udostępniamy krótki protokół pozyskiwania danych PCM SAXS na linii badawczej 12-ID-B w Advanced Photon Source (Argonne National Laboratory, USA) z perspektywy użytkownika. Protokół ten powinien mieć zastosowanie do większości źródeł synchrotronowych, ale konsultacja z lokalnym personelem przed zaproponowaniem eksperymentu jest wysoce zalecana. Udostępniamy również protokół redukcji i analizy danych za pomocą Irena36, darmowego zestawu makr napisanych dla Igor Pro. Irena zawiera wszechstronny zestaw formatów do modelowania danych SAXS i pozwala na budowę modeli wieloskładnikowych, które są w stanie opisać złożony profil rozpraszania PCM (patrz Reprezentatywne wyniki, Rysunek 4). Irena posiada również obszerną dokumentację i samouczki dostępne online. Przed przystąpieniem do poniższych procedur zalecamy zapoznanie się z nimi, w szczególności z samouczkiem "Modelowanie danych SAXS z dwiema głównymi populacjami rozpraszaczy".

Uszkodzenia spowodowane promieniowaniem są problemem dla rozpraszania promieniowania rentgenowskiego, ale można zastosować kilka środków, aby je zminimalizować. W szczególności zalecamy stosowanie konfiguracji komory przepływowej z pompą strzykawkową i próbką PCM przepływającą podczas pozyskiwania danych, a nie szczelną kapilarą. To również znacznie upraszcza odejmowanie tła. Sugerujemy również wielokrotne naświetlanie przepływającej próbki zamiast jednej dłuższej, aby ograniczyć strumień, który widzi każda pojedyncza objętość próbki i umożliwić porównanie danych dotyczących ekspozycji w celu zidentyfikowania wszelkich uszkodzeń.

W przeciwieństwie do technik rozpraszania, które zazwyczaj wymagają dopasowania do interpretacji, transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM) zapewnia rzeczywisty obraz wizualny nanocząstek w przestrzeni poprzez przepuszczenie wiązki elektronów przez próbkę i projekcję obrazu na ekranie scyntylacyjnym (Rysunek 5). W tym artykule przedstawiamy protokoły dla dwóch technik TEM. Cryo TEM zamraża próbki miceli w cienkiej warstwie szklistego lodu, zachowując konformację strukturalną przy minimalnej ilości obcych substancji, optymalna dla miceli o promieniu ≤ ~ 100 nm. Barwienie ujemne TEM wykorzystuje sól metali ciężkich (np. uranu) do otoczenia próbki po jej wysuszeniu na powierzchni siatki. Gęste barwienie rozproszy więcej elektronów niż próbka, dodając kontrast i tworząc negatywny obraz próbki. Cryo TEM jest zalecany do obrazów o wysokiej jakości. Jest to jednak bardziej kosztowne, czasochłonne i może nie zapewniać wystarczającego kontrastu. Gdy jest to problem, należy użyć próbek barwionych ujemnie. Przykłady każdego z nich są pokazane w Rysunek 5.

Każda z tych technik opisuje nieco inne aspekty nanocząstek, z różnymi mocnymi i ograniczonymi stronami. Rozpraszanie światła jest łatwo dostępne i często jest najszybszym podejściem, ale ma znaczne ograniczenia w zakresie rozdzielczości rozmiaru i kształtu. SAXS może dostarczać informacje w szerokim zakresie długości przy rozsądnie wysokiej przepustowości, ale wymaga specjalistycznego sprzętu do pozyskiwania danych, a także modelowania do ich interpretacji. Obrazy TEM są łatwe do interpretacji, ale mogą mieć ograniczony kontrast i z natury mają niską przepustowość. Nasze doświadczenie pokazuje, że stosowanie wielu technik charakterystyki znacznie zwiększa ilość informacji, które można uzyskać o właściwościach PCM i upraszcza interpretację zestawów danych uzyskanych z każdego z nich z osobna. Na przykład w ramach SAXS i TEM badane jest przede wszystkim gęste jądro PCM, podczas gdy rozpraszanie światła informuje o ogólnych wymiarach nanocząstki. W ten sposób połączenie ich pozwala na pomiar zarówno wielkości rdzenia, jak i korony. Zdolność TEM do pozyskiwania obrazów rzeczywistej przestrzeni kosmicznej może dostarczyć podstawowych danych o prawdziwości, aby umożliwić wybór odpowiednich formatów do modelowania danych SAXS, które w przeciwnym razie mogłyby być niejednoznaczne. W tym artykule opisano protokoły dla wszystkich czterech technik, a przykładowy proces ich użycia do scharakteryzowania nieznanej próbki znajduje się w sekcji Dyskusja.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie materiałów

  1. Odważyć liofilizowany polimer diblock i dodać wodę do objętości zbliżonej do wymaganej dla roztworu zapasu o stężeniu końcowym 10 mg/mL. Mieszać w vortexie z maksymalną prędkością przez 2 min.
  2. Poddać sonikacji przez 5 min. Bardzo długie polimery diblock mogą wymagać dodatkowej sonikacji. Roztwór zapasu powinien być całkowicie przejrzysty i jednorodny.
  3. Dostosować pH do wartości 7,4, używając NaOH lub HCl w razie potrzeby. Dopełnić wodą do objętości końcowej. Roztwory pLys-PEG są dość stabilne, jednak w celu dłuższego przechowywania należy je trzymać w lodówce i sprawdzić pH przed użyciem. Liofilizacja jest preferowana nad zamrażaniem.
  4. Resuspendować liofilizowany oligonukleotyd (lub oligonukleotydy) do pożądanej koncentracji zapasu, zazwyczaj stężenie molekularne 2–5 mM dla długości 50 nt lub krótszych. Dokładnie wymieszać w vortexie, aby zapewnić pełne rozpuszczenie.
  5. Obliczyć stężenia molowe, korzystając z masy cząsteczkowej lub długości, zgodnie z opisem we Wstępie.
  6. Obliczyć molowe stężenia ładunku (c.c.), gdzie

Wzór na obliczenie stężenia chemicznego: c.c. = (stężenie molowe) × (ładunek).

Ładunek polielektrolitu to liczba naładowanych monomerów, natomiast ładunek kwasu nukleinowego to liczba zasad pomniejszona o 1, przy założeniu braku fosforylacji. Należy pamiętać, że dwuniciowe DNA będzie miało dwa razy więcej ładunków na cząsteczkę w porównaniu do jednoniciowego DNA.

  1. Przygotować rozcieńczony roztwór zapasowy o stężeniu 20 mM dla każdego polimeru.

2. Przygotowanie miceli polielektrolitowych kwasów nukleinowych

  1. W probówce do mikrocentryfugi o pojemności 1.5 mL wymieszać następujące składniki do uzyskania całkowitej objętości 280 μL:
    1. 200 μL wody wolnej od nukleaz (wody ultrapure dla PCM nie zawierających kwasów nukleinowych).
    2. 40 μL 10x fosforanu buforu solnego (PBS, 137 mM chlorku sodu, 10 mM fosforanu, pH 7.4 po rozcieńczeniu do 1x) lub innego odpowiedniego buforu37.
    3. 40 μL oligonukleotydu o stężeniu 20 mM. W przypadku oligonukleotydów dwuniciowych dodać po 20 μL każdej nici o stężeniu 20 mM.
  2. Inkubować roztwór oligonukleotydów przez 5 min w temperaturze 70 °C. Jeśli obliczona temperatura topnienia dla oligonukleotydów jest wyższa, należy odpowiednio zwiększyć temperaturę. Należy pamiętać, że RNA ulega degradacji w podwyższonych temperaturach, dlatego ten etap nie powinien być dłuższy w przypadku obecności RNA lub innych wrażliwych komponentów.
  3. Studzić przez 15 min. Dodać 40 μL diblocku o stężeniu 20 mM, a następnie natychmiast wymieszać w vortexie przez 20 s z maksymalną prędkością. Inkubować przez 5 min w temperaturze pokojowej (RT).
  4. Przeprowadzić wyżarzanie solne.
    1. Dodać 80 μL 5 M chlorku sodu, aby uzyskać końcowe stężenie 1 M NaCl i końcową objętość 400 μL. Wymieszać w vortexie przez 10 s z maksymalną prędkością.
    2. Inkubować przez 10 min w temperaturze pokojowej, a następnie nanieść do kartridży do dializy. Należy pamiętać, że podane granice odcięcia masy cząsteczkowej (MWCO) są określone dla białek globularnych i nie będą dokładne dla polimerów liniowych. Stwierdzono, że kartridż o MWCO 2k zapobiega utracie próbki i zapewnia stopniowe zmiany siły jonowej.
    3. Przygotować kąpiele do dializy.
      1. Obliczyć wymaganą objętość kąpieli do dializy:
        Równanie do obliczenia objętości próbki w układzie doświadczalnym; obejmuje 400 µL/próbkę i współczynnik 300x.
      2. Wymieszać 10x PBS (lub inny wybrany bufor), 5 M NaCl oraz wodę ultrapure, aby uzyskać końcowy roztwór 1x PBS i 0.5 M NaCl, a także dwa roztwory 1x PBS.
    4. Napełnić kartridże do dializy.
      1. Oznaczyć kartridże markerem permanentnym. Namoczyć kartridże w buforze przez co najmniej 2 min w celu hydratacji membran.
      2. Zdjąć nasadkę, obracając ją przeciwnie do ruchu wskazówek zegara. Nanieść próbkę za pomocą końcówki do pipety do nakładania żelu. Usunąć nadmiar powietrza, delikatnie ściskając membrany. Nałożyć nasadkę.
      3. Umieścić kartridże w kąpieli do dializy zawierającej 1x PBS i 0.5 M chlorku sodu. Kartridże powinny pływać, z obiema membranami wystawionymi na działanie kąpieli. W razie potrzeby można zastosować pływaki z pianki.
    5. Dializa
      1. Inkubować przez 24 h, mieszając powoli za pomocą magnetycznego mieszadła.
      2. Przenieść kartridże do nowej kąpieli z 1x PBS lub innym wybranym buforem roboczym. Inkubować przez 24 h, mieszając powoli za pomocą magnetycznego mieszadła. Powtórzyć ten etap.
    6. Odzyskać próbkę.
      1. Wyjąć kartridże z kąpieli. Zdjąć nasadkę i odzyskać próbkę za pomocą końcówki do pipety do nakładania żelu. Należy pamiętać, że odzyskana objętość może być większa niż początkowe 400 μL z powodu pęcznienia membrany. Zapisać odzyskaną objętość, jeśli niewielkie rozcieńczenie jest istotne.
      2. Przenieść próbkę do czystej probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1.5 mL. PCM przygotowane w ten sposób powinny być stabilne przez kilka miesięcy w warunkach chłodniczych, pod warunkiem uniknięcia kontaminacji nukleazami.

3. Dynamiczne rozpraszanie światła

  1. Aby zapewnić warunki wolne od pyłu, bufory należy starannie przefiltrować (3-krotnie przez filtr strzykawkowy lub próżniowy o rozmiarze 0,22 μm), a szkło laboratoryjne dokładnie wyczyścić pomiędzy próbkami. Ważne jest również upewnienie się, że próbka osiągnęła równowagę termiczną przed przystąpieniem do pomiaru.
  2. Rozcieńczyć próbkę PCM do stężenia 0,2 mM (10-krotnie, jeśli stosowany jest opisany powyżej protokół) przy użyciu odpowiedniego buforu roboczego i nanieść do odpowiedniej kuwety. Stosujemy kuwetę o małej objętości, która wymaga ok. 200 μL rozcieńczonej próbki.
  3. Ustawić pozycję detektora DLS na 90°.
  4. Dostosować moc lasera i/lub tłumik tak, aby szybkość zliczania wynosiła od 100 000 do 200 000 zliczeń na sekundę (cps), jeśli to możliwe. Można stosować szybkości zliczania tak niskie jak 10 kcps, ale czas pomiaru może wymagać wydłużenia w celu uzyskania dobrej statystyki (krok 4.1). Należy unikać wyższych szybkości zliczania, ponieważ wielokrotne rozproszenie zakłóci pomiar.
  5. Zbierać dane przez 1 min. Szybkość zliczania powinna być stała przez cały czas akwizycji; w przeciwnym razie wskazuje to, że jakiś komponent próbki lub instrumentu nie osiągnął jeszcze równowagi.
  6. Przeanalizować dane autokorelacyjne. Linia bazowa dla długich czasów powinna być bardzo płaska, a krzywa autokorelacji gładka, z minimalnym rozproszeniem, jak pokazano na Rysunku 3A. Dryft linii bazowej wskazuje na brak równowagi, a szumy w danych można zredukować poprzez zebranie większej ilości danych.
  7. Dopasować funkcję autokorelacji.
    1. Użyć REPES38,39 do przeprowadzenia zregularizowanej odwrotnej transformaty Laplace'a w celu uzyskania rozkładu czasów relaksacji i współczynnika dyfuzji, D. Metoda ta oblicza następnie hydrodynamiczny promień, Rh, korzystając z równania Stokesa-Einsteina:
      Wzór na promień hydrodynamiczny \( R_h = k_B T / 6 \pi \eta D \), koncepcja fizyczna, równanie.
      Rysunek 1B przedstawia reprezentację Rh, a Rysunek 3B pokazuje wynik z programu REPES.
    2. Alternatywnie można zastosować inne metody, w tym CONTIN40,41 (alternatywny algorytm regularyzacji) lub dopasowanie metodą najmniejszych kwadratów nieujemnych (NNLS). Spójne wyniki z wielu metod dopasowania są oznaką wysokiej jakości danych. Należy pamiętać, że analiza kumlantów (standardowa w wielu instrumentach) daje wartości niefizyczne dla multimodalnych rozkładów rozmiaru/długości.

4. Wielokątne rozpraszanie światła

UWAGA: Intensywność rozpraszania światła w zależności od kąta może być mierzona za pomocą różnych instrumentów. Uzyskaliśmy dobre wyniki, korzystając zarówno z instrumentów opartych na goniometrze, jak i z instrumentów z wieloma detektorami, pracujących w trybie seryjnym.

  1. Dostosuj stężenie PCM oraz natężenie oświetlenia, aby zapewnić odpowiedni stosunek sygnału do szumu w porównaniu z próbką zawierającą sam bufor pod wszystkimi kątami, unikając jednocześnie nasycenia detektora. Tę ostatnią kwestię można sprawdzić, przygotowując próbki o różnych stopniach rozcieńczenia i weryfikując liniowość zależności natężenia od stężenia (przy założeniu minimalnych oddziaływań między cząsteczkami PCM).
  2. Zarejestruj szybkość rozpraszania światła w zakresie od 15° do 135°, mierząc każdą wartość przez 1 min na kąt. Jeśli próbka i instrument są odpowiednio wyrównane termicznie, szybkość rozpraszania będzie stała w czasie pomiaru.
  3. Przedstaw wykres znormalizowanej szybkości rozpraszania, Isin(θ), w funkcji q, gdzie I oznacza szybkość rozpraszania. q to wektor rozpraszania (transfer pędu fotonu) zdefiniowany jako

Równanie wektora rozproszenia q=4πηsin(θ/2)/λ dla analizy dyfrakcji rentgenowskiej.

gdzie η = współczynnik załamania światła rozpuszczalnika, θ = kąt pomiaru, a λ = długość fali źródła światła. Rycina 4 przedstawia wykres intensywności rozpraszania MALS.

5. Małokątne rozpraszanie rentgenowskie

  1. Pozyskiwanie danych
    1. Przygotować próbki PCM zgodnie z powyższym opisem, stosując stężenie ładunku 2 mM w przypadku oligonukleotydowych PCM, aby uzyskać silne rozpraszanie powyżej poziomu tła. Dla PCM pozbawionych ciężkich atomów (np. fosforu w kwasach nukleinowych) może być wymagane zastosowanie wyższych stężeń. Gęstości długości rozpraszania można oszacować za pomocą kalkulatorów takich jak SASSIE.42.
    2. Aby zminimalizować uszkodzenia radiacyjne poprzez neutralizację wolnych rodników, należy dodać glicerol z roztworu zapasowego o wysokim stężeniu (np. 50%), tak aby roztwór miceli zawierał 1% (v/v) glicerolu. Należy pamiętać, że czysty glicerol jest bardzo lepki, co utrudnia jego dokładne odmierzenie. Zaleca się rozcieńczenie go wodą lub buforem.
    3. Przygotuj dużą objętość buforu roboczego z dodatkiem 1% glicerolu do zastosowania jako monitor tła.
    4. Przygotuj aparat z komorką przepływową specyficzną dla danej linii wiązki i skalibruj detektor. W protokole wykorzystano kapilarę kwarcową o średnicy 3 mm, połączoną z komputerowo sterowaną pompą strzykawkową za pomocą polietylenowej rurki o małej średnicy i minimalnej długości. Minimalna objętość wynosi ok.140 μL przy tej konfiguracji wymagana jest taka ilość na próbkę.
    5. Wyznacz parametry ekspozycji próbki. Optymalna ekspozycja będzie różnić się w zależności od natężenia wiązki, czułości detektora oraz stężenia, siły rozpraszania i podatności na uszkodzenia próbki, jednak celem jest poddanie próbki minimalnemu strumieniowi wymaganemu do uzyskania wystarczającej intensywności rozpraszania w ramach q zakres zainteresowania
    6. W przypadku PCM z oligonukleotydów/pLys-PEG, 30 ekspozycji po 0,2 s przy częstotliwości powtarzeń 1 Hz pozwala na uzyskanie wysokiej jakości danych przy niewielkich, niezauważalnych uszkodzeniach. W przypadku nowych próbek pomocna może być następująca procedura:
      1. Przygotować próbki PCM w zakresie różnych stężeń (np. 10–10,000 μM c.c.).
      2. Zaczynając od stężenia pośredniego, należy naprzemiennie badać próbki PCM oraz próbki zawierające sam bufor, stosując różne czasy ekspozycji. Procedurę akwizycji i redukcji danych przedstawiono poniżej. Sygnał z próbki powinien charakteryzować się dobrą statystyką (małym błędem statystycznym lub łagodną zmiennością w ramach q). W przypadku uzyskania słabej statystyki można zwiększyć czas ekspozycji.
      3. Sygnał próbki powinien być również wyraźnie odróżnialny od tła powyżej q zakres zainteresowania. Obliczyć i narysować wykres stosunku (sygnał–tło)/tło w funkcji q w celu określenia stosunku sygnału do tła. Jeśli stosunek sygnału do tła jest niski, należy zwiększyć stężenie próbki.
      4. Należy zweryfikować, czy intensywność rozpraszania (znormalizowana do stężenia) jest niezależna od stężenia próbki, pozyskując dane dla wyższych i niższych stężeń i w razie potrzeby odpowiednio dostosowując czas ekspozycji. Oddziaływania międzycząsteczkowe (najbardziej prawdopodobna przyczyna zależności od stężenia) będą najbardziej wyraźne przy niskim q zakres
    7. Należy pozyskać dane dla próbek PCM oraz tła (tj. buforu z glicerolem).
      1. Uruchom pompę strzykawkową, aby przemieścić próbkę przez kapilarę. Dopuszczalny jest ruch dwukierunkowy lub jednokierunkowy, jednak należy zadbać o odizolowanie poszczególnych próbek (np. poprzez wprowadzenie pęcherzyka powietrza między nimi). Próbki można odzyskać i ponownie wykorzystać, o ile nie stwierdzono uszkodzeń radiacyjnych.
      2. Po rozpoczęciu przepływu uruchom program ekspozycji rentgenowskiej i akwizycji danych opisany powyżej. Należy zadbać o to, aby ekspozycja na wiązkę zakończyła się przed ustaniem przepływu cieczy.
    8. Po każdej próbce przeprowadź uśrednianie azymutalne i wykreśl profile 1D (tj. intensywność w funkcji To jest błąd. Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia.) dla każdej ekspozycji razem. Powinny być one identyczne w granicach błędu statystycznego. Zmiana sygnału w czasie może wskazywać na uszkodzenia radiacyjne.
      1. Odosobnione anomalne profile mogą wskazywać na obecność mikropęcherzyków. W przypadku częstego występowania pęcherzyków pomocne może być zmniejszenie szybkości przepływu.
    9. Oblicz średnią z jednowymiarowych profili rozproszenia.
    10. Należy często pozyskiwać dane dla próbek zawierających wyłącznie bufor (raz na każde 4–5 próbek PCM) i porównywać je w czasie. Wzrost sygnału w próbkach z samym buforem wskazuje na możliwe zanieczyszczenie kapilary próbką uszkodzoną przez promieniowanie.
      1. W przypadku zauważenia kontaminacji należy przemyć kapilarę wybielaczem i rozważyć skrócenie czasu ekspozycji, jeśli jest to możliwe.
  2. Redukcja i analiza danych z wykorzystaniem oprogramowania Irena
    1. Importuj zestawy danych ASCII dla miceli i tła (SAS/Import danych & eksport/import danych SAS w formacie ASCII).
    2. Odejmij rozproszenie tła z danych próbki. Zazwyczaj najwyższe q wartości (np. q > 0,5) wykazuje, że niespójne rozpraszanie z rozpuszczalnika dominuje w sygnale. Skalowanie danych tła w celu dopasowania ich do danych próbki w tym zakresie q zakres eliminuje wszelkie wariacje wynikające ze zmian natężenia wiązki oraz stężenia próbki.
      1. Nanieś próbkę i tło na ten sam wykres w skali logarytmicznej (log-log). Zweryfikuj stałą intensywność przy wysokich wartościach. q (SAS/Manipulacja danymi/Manipulacja danymi I). Oblicz stosunek próbki do tła (Dane 1/Dane 2), przedstaw na skali liniowo-logarytmicznej i zweryfikuj wysoką-q asymptota
      2. Oblicz średni stosunek (próbka/tło) dla tego obszaru q zakres (należy użyć niestandardowego makra lub skopiować i wkleić dane z przeglądarki danych do arkusza kalkulacyjnego).
      3. Używając Manipulacja danymi makro, przeskalowanie tła (np. Modyfikacja danych 2) wykorzystując obliczony powyżej stosunek i wykreślić stosunek sygnału po odjęciu tła do tła w funkcji q ([Dane1-Dane2]/Dane2), weryfikując, że teraz dąży asymptotycznie do zera przy wysokich qZapisz ten stosunek; powinien on wynosić
      4. Wykreśl sygnał po odjęciu tła (Dane1-Dane2) w porównaniu z q i zapisz dane pod nową nazwą. Nie nadpisuj oryginalnych danych.
      5. Jeśli wysoka-q dane są niedostępne; należy zastosować współczynnik skalowania wynoszący 1 do odejmowania tła, przy czym należy mieć na uwadze, że może to wprowadzić nieścisłości w q zakresy, w których stosunek sygnału do tła jest niski.
    3. Otwórz Modelowanie makro, (SAS/Modelowanie), następnie wczytaj i wykreśl dane po odjęciu tła (Kontrola danych/Dodaj dane). Nie skaluj w tym makrze.
    4. W pierwszej kolejności należy znaleźć przybliżony model powierzchni zewnętrznej PCM (rozmiar/kształt miceli):
      1. W Kontrole danychwybrać niską do umiarkowanej q zakres (np. ~0,003 Å)-1 < q < ~0,1 Å-1). Jeśli widoczne są oscylacje, należy je uwzględnić.
      2. Wybierz postać funkcji dopasowania odpowiednią dla danych. Nachylenie przy niskich q jest charakterystyczne dla kształtu nanocząsteczek, co można również zweryfikować za pomocą TEM i/lub MALS. Należy zastosować sferoid Schulza-Zimma (q0), cylinder (q-1), lub elastyczny cylinder (q-2) modele. Irena dostarcza narzędzia do dopasowywania praw potęgowych (SAS/Support Tools dla wykresów i tabel).
      3. W Kontrole modelu, wybierz pierwszą populację rozproszoną (1P) i upewnij się, że jest to jedyna używana wersja (wybierz odpowiednią Zastosowanie? pole wyboru)
      4. Wybierz Rozkład wielkości dla Model i wybrać pożądany Typ rozkładu i Współczynnik formyUstaw parametry początkowe wyszukiwania, wprowadzając wartości w Skala, Średnia wielkośći Szerokość pola i kliknij Obliczenia modelu aby narysować wynikowy współczynnik kształtu.
        UWAGA: Format elastycznego cylindra (Flexible Cylinder) można dodać jako format użytkownika (User Form Factor) i pobrać z https://usaxs.xray.aps.anl.gov/software/irenaParametry 1 i 2 odpowiadają odpowiednio długości cylindra oraz długości Kuhna.
      5. Po ustaleniu odpowiednich parametrów należy kliknąć Dopasowanie modelu w celu wykonania nieliniowego dopasowania metodą najmniejszych kwadratów do danych. Rozkład wielkości model podaje średni promień i szerokość.
        Aby obliczyć indeks polidyspersyjności (PDI), należy zastosować
        Wzór na PDI: (stdev/radius)² = [(width)²/4]/(radius)²; równanie do analizy dyspersji cząstek.
        Podobnie jak w przypadku każdej procedury dopasowania nieliniowego, konieczne może być dostosowanie zakresu danych (q region) oraz parametry początkowe w celu uzyskania stabilnego i fizycznie uzasadnionego dopasowania.
      6. Po uzyskaniu odpowiedniego dopasowania, należy je zapisać (Zapisz w notatniku/Zapisz w folderze).
    5. Następnie należy zamodelować rozpraszanie poszczególnych polimerów wewnątrz rdzenia PCM. Można to ująć za pomocą modelu potęgowego (np. q-2 dla łańcuchów idealnych, q-5/3 (np. dla łańcuchów spuchniętych itp.). Irena wdraża to za pomocą modelu Beaucage'a43:
      Wzór na rozpraszanie pod małym kątem: I(q)=Gexp(-q²Rg²/3)+B[erf(qRg/6¹/²)]³/qP, równanie matematyczne.
      gdzie P oznacza prawo potęgowe, a G i B są współczynnikami.
      1. Dostosuj elementy sterujące danymi tak, aby obejmowały cały q zakres i ponowne wykreślenie modelu (Oblicz model). Zazwyczaj zaobserwowany zostanie nadmierny rozproszenie w zakresie od umiarkowanego do wysokiego q zakres (np. q > ~0,1 Å-1).
      2. Użyj elementów sterujących danymi, aby wybrać q zakres, w którym występuje nadmiarowe rozpraszanie (>obserwuje się 10-krotny model współczynnika kształtu).
      3. Dodaj drugą populację rozpraszania (2P) i upewnij się, że jest to jedyny wybrany element (odznacz Zastosowanie? dla 1P).
      4. Wybierz Poziom ujednolicony dla modelu. B i P są odpowiednimi parametrami. Należy użyć narzędzi wspomagających tworzenie wykresów lub Dopasuj P/B pomiędzy csrs makro służące do uzyskania wstępnego przybliżenia tych parametrów oraz dostrojenia czynników Guiniera G i Rg aby zapewnić, że model nie będzie przewidywał nadmiernego rozpraszania przy niskich q.
      5. W odniesieniu do czynnika kształtu, należy przeprowadzić dopasowanie nieliniowe oraz zapisać parametry i model.
    6. Następnie, jeśli występuje piku dyfrakcyjnego, tak jak w Rysunek 4, dodaj trzeci model piku dyfrakcyjnego w q zakres zainteresowania (q = ~0,22 Å-1 w tym przypadku).
    7. Po uzyskaniu przybliżonych wartości dopasowania dla poszczególnych populacji rozpraszających, włącz wszystkie trzy jednocześnie (wybierz Zastosowanie? (dla każdego) i zoptymalizować dopasowanie łączone.
    8. Należy sprawdzić, czy każda wartość pozostaje fizycznie uzasadniona. Wynikiem tej procedury powinien być model kompozytowy, który dobrze opisuje dane SAXS w szerokim zakresie skal rozmiarów, co zilustrowano w Rysunek 4Zapisz dopasowanie, używając Zapisz w folderze przycisk do zapisywania w programie Igor.

6. Transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM)

  1. Krio-TEM
    1. Wybierz siatkę. Zalecamy folię wspierającą z dziurawego węgla na standardowej siatce TEM lub alternatywnie węgiel typu lacey. W obu przypadkach otwory między węglem zapewnią obszar obrazowania z czystego lodu witryfikowanego i próbki, bez obecności folii.
    2. Umieść siatkę stroną węglową do góry w urządzeniu do glow-discharging na czystym szkiełku przedmiotowym. Owinięcie szkiełka folią laboratoryjną może ułatwić manipulację siatką. Unikaj dotykania pęsetą środka siatki i zawsze chwytaj ją blisko krawędzi.
    3. Poddaj siatkę działaniu urządzenia przez 30 s.
    4. Przygotuj robot do witryfikacji do nanoszenia próbek.
      1. Ustaw wilgotność na 100% i temperaturę pokojową (RT), a następnie dodaj papier do osuszania (blotting paper). Przygotuj kąpiele z ciekłym etanem i ciekłym azotem u podstawy robota. Dodatkowe informacje na temat przygotowania i obsługi robota do witryfikacji znajdują się w tutorialach i filmach online.
    5. Rozcieńcz próbkę 5x.
    6. Używając pęsety z działaniem negatywnym dołączonej do robota do witryfikacji, pobierz siatkę, przyepnij pęsetę do robota i przesuń ją do komory.
    7. Podczas przebywania w robocie, nanieś 4 μL próbki na stronę węglową siatki za pomocą pipety przez otwór w obudowie urządzenia.
    8. Inkubuj przez 4 min.
    9. Za pomocą robota osusz próbkę przez 3–5 s papierem filtracyjnym.
    10. Robot do witryfikacji zanurzy siatkę w ciekłym etanie.
    11. Zdejmij pęsetę i przenieś siatkę do ciekłego azotu, a następnie do pojemnika do przechowywania, który również powinien znajdować się w ciekłym azocie. Proces ten utrwala próbkę w cienkiej warstwie lodu witryfikowanego. Zminimalizuj czas przebywania siatki poza ciekłym etanem lub ciekłym azotem podczas tego kroku.
    12. Ochłodź uchwyt do próbek krio za pomocą ciekłego azotu. Dbaj o to, aby Dewar i zbiornik były pełne.
    13. Gdy będziesz gotowy do obrazowania, załaduj siatkę na uchwyt do próbek krio. Przechowuj próbkę w ciekłym azocie lub przez chwilę w niezwykle zimnych oparach azotu tuż nad powierzchnią cieczy.
    14. Obrazuj siatkę przy napięciu 120 kV przy powiększeniach od 75kx do 150kx w lodzie cienkim i grubym, ponieważ micele o różnych rozmiarach mogą wymagać różnej grubości lodu.
      1. Ogranicz ekspozycję wiązki, aby uniknąć topnienia lodu i uszkodzenia próbki. Nie ustawiaj ostrości bezpośrednio w miejscu planowanego obrazowania; ustawiaj ją w pobliżu. Na obszar zainteresowania naświetlaj tylko podczas przechwytywania obrazu.
      2. Podczas przeglądania obrazów pamiętaj o odróżnieniu kropli ciekłego etanu od próbki (patrz Rysunek 5).
  2. Konwencjonalny TEM z wykorzystaniem barwienia negatywnego
    1. Przygotuj barwnik.
      1. Zagotuj ~10 mL wody ultrapure. Odważ 0,1 g liofilizowanego formatu uranylu (UFo) do probówki stożkowej o pojemności 15 mL.
      2. Dodaj 5 mL gorącej wody do proszku UFo, aby uzyskać 2% roztwór. Szczelnie zamknij i owiń folią aluminiową, aby odciąć dostęp światła. Często stosuje się również 1% roztwór octanu uranylu.
      3. Mieszaj na wstrząsarzu (vortex) lub energicznie potrząsaj przez 5 min. Pomocne będzie przymocowanie probówki do wstrząsarki. Przefiltruj roztwór przez filtr strzykawkowy 0,2 μm do czystej probówki stożkowej.
      4. Pozostaw do ostygnięcia przez 10 min do RT. Dodaj 25 μL 5M NaOH i natychmiast mieszaj na wstrząsarzu przez 2 min.
        1. Alternatywnie można zamrozić alikwoty po 200 μL 2% UFo. Przed użyciem rozmroź alikwot, dodaj 1 μL 5 M NaOH i mieszaj na wstrząsarzu przez 2 min.
      5. Przechowuj barwnik owinięty w folii lub w ciemności.
    2. Rozcieńcz próbkę 10x w 1x PBS (lub innym wybranym buforze).
    3. Wybierz siatkę. Zalecamy folię wspierającą z węgla na siatkach miedzianych. Ciemniejsza, bardziej błyszcząca strona siatki to strona powlekana węglem, na której zostanie naniesiona i zabarwiona próbka.
    4. Umieść siatkę stroną węglową do góry w urządzeniu do glow-discharging na czystym szkiełku przedmiotowym. Patrz krok 6.1.2.
    5. Poddaj siatkę działaniu urządzenia przez 30 s.
    6. Pobierz siatkę tak, aby strona węglowa wciąż była skierowana do góry i trzymaj ją pęsetą z działaniem negatywnym za krawędź, aby nie przerwać obszaru obrazowania w centrum. Odłóż pęsetę, trzymając siatkę nadal stroną węglową do góry.
    7. Nanieś za pomocą pipety kroplę 4 μL próbki na górną stronę (węglową) siatki.
    8. Inkubuj przez 4 min.
    9. Na około 1 min przed końcem inkubacji nanieś pipetą krople 10 μL i 20 μL roztworu UFo na kawałek czystej folii laboratoryjnej.
    10. Użyj papieru filtracyjnego, aby odprowadzić próbkę z krawędzi siatki (kontakt prostopadły), aby uniknąć kontaktu z powierzchnią obrazowania.
    11. Używając pęsety (nadal trzymając siatkę), natychmiast połóż stronę z próbką na kropli 10 μL UFo, a następnie niezwłocznie odprowadź ciecz (krok płukania). Ważne jest, aby nie dopuścić do wyschnięcia siatki, dlatego nie należy przerywać pracy między krokami.
    12. W podobny sposób nanieś kroplę 20 μL UFo na siatkę. Przymaj siatkę na UFo przez 40 s. Odprowadź ciecz i pozwól siatce wyschnąć.
    13. Obrazuj suchą siatkę przy 120 kV przy powiększeniach od 20 000x do 100 000x.
    14. Upewnij się, że wszystkie materiały zanieczyszczone UFo zostaną zutylizowane zgodnie z procedurami bezpieczeństwa instytucji dotyczącymi odpadów promieniotwórczych.
    15. W razie potrzeby do obrazów TEM w programie ImageJ można zastosować korektę jasności/kontrastu oraz filtr medianowy w celu redukcji szumu tła. Postprocessing powinien być wykonywany jednolicie, wyłącznie dla obrazów, które nie są wykorzystywane do pomiarów ilościowych, takich jak intensywność, i zawsze powinien być zgłoszony w opisie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Aby zilustrować opisane powyżej metody charakteryzacji, przedstawiamy typowe wyniki dla PCM złożonych z oligonukleotydów i kopolimerów blokowych o różnych długościach i składzie chemicznym (Rysunek 1). Rysunek 2 prezentuje przykład tego, jak rozmiar rdzenia PCM (wyznaczony na podstawie SAXS i TEM, Rysunek 4 oraz Rysunek 5) zmieniał się w zależności od długości bloku naładowanego. Ry...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Jak wspomniano powyżej, przedstawione tutaj protokoły są napisane z naciskiem na oligonukleotydy jako składnik polianionu i pLys-PEG jako kationowo-obojętny kopolimer blokowy, ale przetestowaliśmy je z różnymi polimerami, takimi jak poli(kwas akrylowy), poliglutaminian i PEG-poli(dimetyloamonian winylobenzylu) i uważamy, że będą one ogólnie stosowane dla większości par polielektrolitów. Jednym z parametrów, który może wymagać optymalizacji, jest stężenie soli używane do wyżarzania, ponieważ powinno być na tyle wysokie, a...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Philowi Griffinowi i Terze Lavoie z Zakładu Charakterystyki Miękkiej Materii i Zaawansowanego Ośrodka Mikroskopii Elektronowej na Uniwersytecie w Chicago. Dziękujemy również Xiaobing Zuo i Soenke Seifert z Advanced Photon Source w Argonne National Laboratory i NIST Center for Hierarchical Materials Design (CHiMaD) za wsparcie. Dziękujemy Jeffowi Tingowi i Michaelowi Lueckheide za ich wkład w tę pracę.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Bibuła filtracyjna o średnicy 70 mmWhatman1001-070Bibuła filtracyjna do odprowadzania wilgoci podczas przygotowywania siatki
Siatka TEM z folii węglowejMikroskopia elektronowa Nauki SiatkaTEMCF200-Cu
Technologia DAWNWyatt InstrumentDAWNMALS
Oligonukleotyd DNAZintegrowane DNA Nanotechnologies IncNiestandardowy oligonukleotyd
Lacey Carbon Siatka TEMMikroskopia elektronowa NaukiLC200-CuSiatka TEM
Metoksy-poli(glikol etylenowy)-blok-poli(chlorowodorek l-lizyny) PEG5k - PLKC50Alamanda Polymers IncmPEG5K-b-PLKC50Przykładowy kopolimer
blokowy Milli-QMillipore SigmaUltraczysta woda
NanoDropThermo ScientificDo pomiaru stężenia kwasów
Pęseta o działaniu ujemnymPęseta DumontN7do przygotowania siatki
Parafilm "M"Bemis Company IncPM996Folia laboratoryjna
Quantifoil Holey Carbon TEM gridMikroskopia elektronowa Nauki Q210CR1.3Siatka TEM
Goniometr badawczy i laserowy system rozpraszania światłaBrookhaven InstrumentsInstrument BI-200SMDLS/MALS
Slide-A-Lyzer G2 2K 0,5 mlThermo Scientific Pierce Protein Biology87723dializy
o małej objętości KuwetaBrookhaven InstrumentsBI-SVCdo DLS/MALS
Solarus 950 Zaawansowany system plazmowyGatanSolarus 950System plazmowy do siatek TEM
Talos TEMFEITalosTEM używany do próbek kriogenicznych
Tecnai Spirit TEMFEISpiritTEM stosowany do suchych próbek
Mrówczan uranyluSPI-Chem16984-59-1Do ujemnych próbek barwiących dla TEM
VitrobotFEIRobot do witryfikacji Vitrobot do przygotowania kriokraty
nukleinowych Kuweta do

Bibliografia

  1. Spruijt, E., Westphal, A. H., Borst, J. W., Cohen Stuart, M. A., van der Gucht, J. Binodal compositions of polyelectrolyte complexes. Macromolecules. 43 (15), 6476-6484 (2010).
  2. van der Gucht, J., Spruijt, E., Lemmers, M., Cohen Stuart, M. A. Polyelectrolyte complexes: bulk phases and colloidal systems. Journal of Colloid and Interface Science. 361 (2), 407-422 (2011).
  3. Priftis, D., Laugel, N., Tirrell, M. Thermodynamic characterization of polypeptide complex coacervation. Langmuir. 28 (45), 15947-15957 (2012).
  4. Fu, J., Schlenoff, J. B. Driving Forces for Oppositely Charged Polyion Association in Aqueous Solutions: Enthalpic, Entropic, but Not Electrostatic. Journal of the American Chemical Society. 138 (3), 980-990 (2016).
  5. Vieregg, J. R., et al. Oligonucleotide-Peptide Complexes: Phase Control by Hybridization. Journal of the American Chemical Society. 140 (5), 1632-1638 (2018).
  6. Voets, I. K., de Keizer, A., Cohen Stuart, M. A. Complex coacervate core micelles. Advances in Colloid and Interface Science. 147-148, 300-318 (2009).
  7. Lueckheide, M., Vieregg, J. R., Bologna, A. J., Leon, L., Tirrell, M. V. Structure-Property Relationships of Oligonucleotide Polyelectrolyte Complex Micelles. Nano Letters. 18 (11), 7111-7117 (2018).
  8. De Kruif, C. G., Weinbreck, F., de Vries, R. Complex coacervation of proteins and anionic polysaccharides. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 9 (5), 340-349 (2004).
  9. Vieregg, J. R., Tang, T. Y. D. Polynucleotides in cellular mimics: Coacervates and lipid vesicles. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 26, 50-57 (2016).
  10. Marciel, A. B., Chung, E. J., Brettmann, B. K., Leon, L. Bulk and nanoscale polypeptide based polyelectrolyte complexes. Advances in Colloid and Interface Science. 239, 187-198 (2017).
  11. Cabral, H., Miyata, K., Osada, K., Kataoka, K. Block Copolymer Micelles in Nanomedicine Applications. Chemical Reviews. 118 (14), 6844-6892 (2018).
  12. Tan, Z., et al. Block Polymer Micelles Enable CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein Delivery: Physicochemical Properties Affect Packaging Mechanisms and Gene Editing Efficiency. Macromolecules. 52 (21), 8197-8206 (2019).
  13. Horn, J. M., Kapelner, R. A., Obermeyer, A. C. Macro- and Microphase Separated Protein-Polyelectrolyte Complexes: Design Parameters and Current Progress. Polymers. 11 (4), 578(2019).
  14. Juliano, R. L. The delivery of therapeutic oligonucleotides. Nucleic Acids Research. 44 (14), 6518-6548 (2016).
  15. Kanasty, R., Dorkin, J. R., Vegas, A., Anderson, D. Delivery materials for siRNA therapeutics. Nature Materials. 12 (11), 967-977 (2013).
  16. Lorenzer, C., Dirin, M., Winkler, A. M., Baumann, V., Winkler, J. Going beyond the liver: progress and challenges of targeted delivery of siRNA therapeutics. Journal of Controlled Release. 203, 1-15 (2015).
  17. Allen, T. M., Cullis, P. R. Liposomal drug delivery systems: from concept to clinical applications. Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (1), 36-48 (2013).
  18. Li, W., Szoka, F. C. Lipid-based nanoparticles for nucleic acid delivery. Pharmaceutical Research. 24 (3), 438-449 (2007).
  19. Miyata, K., Nishiyama, N., Kataoka, K. Rational design of smart supramolecular assemblies for gene delivery: chemical challenges in the creation of artificial viruses. Chemical Society Reviews. 41 (7), 2562-2574 (2012).
  20. Oishi, M., Nagasaki, Y., Itaka, K., Nishiyama, N., Kataoka, K. Lactosylated poly(ethylene glycol)-siRNA conjugate through acid-labile ss-thiopropionate linkage to construct pH-sensitive polyion complex micelles achieving enhanced gene silencing in hepatoma cells. Journal of the American Chemical Society. 127 (6), 1624-1625 (2005).
  21. Christie, R. J., et al. Targeted polymeric micelles for siRNA treatment of experimental cancer by intravenous injection. ACS Nano. 6 (6), 5174-5189 (2012).
  22. Kuo, C. H., et al. Inhibition of atherosclerosis-promoting microRNAs via targeted polyelectrolyte complex micelles. Journal of Materials Chemistry B. 2 (46), 8142-8153 (2014).
  23. Ge, Z., et al. Targeted gene delivery by polyplex micelles with crowded PEG palisade and cRGD moiety for systemic treatment of pancreatic tumors. Biomaterials. 35 (10), 3416-3426 (2014).
  24. Van Bruggen, C., Hexum, J. K., Tan, Z., Dalai, R. J., Reineke, T. M. Nonviral Gene Delivery with Cationic Glycopolymers. Accounts of Chemical Research. 52 (5), 1347-1358 (2019).
  25. Hayashi, K., et al. Influence of RNA Strand Rigidity on Polyion Complex Formation with Block Catiomers. Macromolecular Rapid Communications. 37 (6), 486-493 (2016).
  26. Marras, A. E., Vieregg, J. R., Ting, J. M., Rubien, J. D., Tirrell, M. V. Polyelectrolyte Complexation of Oligonucleotides by Charged Hydrophobic-Neutral Hydrophilic Block Copolymers. Polymers. 11 (1), 83(2019).
  27. Phillips, H. R., et al. Glycopolycation-DNA Polyplex Formulation N/P Ratio Affects Stability, Hemocompatibility, and in Vivo Biodistribution. Biomacromolecules. 20 (4), 1530-1544 (2019).
  28. Ting, J. M., Wu, H., Herzog-Arbeitman, A., Srivastava, S., Tirrell, M. V. Synthesis and Assembly of Designer Styrenic Diblock Polyelectrolytes. ACS Macro Letters. 7 (6), 726-733 (2018).
  29. Zadeh, J. N., et al. NUPACK: Analysis and design of nucleic acid systems. Journal of Computational Chemistry. 32 (1), 170-173 (2011).
  30. Santa Lucia, J. A unified view of polymer, dumbbell, and oligonucleotide DNA nearest-neighbor thermodynamics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (4), 1460-1465 (1998).
  31. Xia, T., et al. Thermodynamic parameters for an expanded nearest-neighbor model for formation of RNA duplexes with Watson-Crick base pairs. Biochemistry. 37 (42), 14719-14735 (1998).
  32. Orthaber, D., Bergmann, A., Glatter, O. SAXS experiments on absolute scale with Kratky systems using water as a secondary standard. Journal of Applied Crystallography. 33 (2), 218-225 (2000).
  33. Srivastava, S., et al. Gel phase formation in dilute triblock copolyelectrolyte complexes. Nature Communications. 8, 14131(2017).
  34. Lindhoud, S., et al. Salt-induced disintegration of lysozyme-containing polyelectrolyte complex micelles. Langmuir. 25 (19), 11425-11430 (2009).
  35. Lindhoud, S., de Vries, R., Schweins, R., Stuart, M. A. C., Norde, W. Salt-induced release of lipase from polyelectrolyte complex micelles. Soft Matter. 5 (1), 242-250 (2009).
  36. Ilavsky, J., Jemian, P. R. Irena: tool suite for modeling and analysis of small-angle scattering. Journal of Applied Crystallography. 42 (2), 347-353 (2009).
  37. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular Cloning: a Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).
  38. Jakeš, J. Regularized positive exponential sum (REPES) program-A way of inverting laplace transform data obtained by dynamic light scattering. Collection of Czechoslovak Chemical Communications. 60 (11), 1781-1797 (1995).
  39. Schillen, K., Brown, W., Johnsen, R. M. Micellar Sphere-to-Rod Transition in an Aqueous Triblock Copolymer System - a Dynamic Light-Scattering Study of Translational and Rotational Diffusion. Macromolecules. 27 (17), 4825-4832 (1994).
  40. Provencher, S. W. Contin - a General-Purpose Constrained Regularization Program for Inverting Noisy Linear Algebraic and Integral-Equations. Computer Physics Communications. 27 (3), 229-242 (1982).
  41. Provencher, S. W. A Constrained Regularization Method for Inverting Data Represented by Linear Algebraic or Integral-Equations. Computer Physics Communications. 27 (3), 213-227 (1982).
  42. Sarachan, K. L., Curtis, J. E., Krueger, S. Small-angle scattering contrast calculator for protein and nucleic acid complexes in solution. Journal of Applied Crystallography. 46 (6), 1889-1893 (2013).
  43. Beaucage, G. Approximations leading to a unified exponential power-law approach to small-angle scattering. Journal of Applied Crystallography. 28 (6), 717-728 (1995).
  44. Marras, A. E., Vieregg, J. R., Ting, J. M., Rubien, J. D., Tirrell, M. V. Materials Data Facility. , 10.18126/M2QW8R (2018).
  45. Modena, M. M., Rühle, B., Burg, T. P., Wuttke, S. Nanoparticle Characterization: What to Measure. Advanced Materials. , (2019).
  46. Mourdikoudis, S., Pallares, R. M., Thanh, N. T. K. Characterization techniques for nanoparticles: comparison and complementarity upon studying nanoparticle properties. Nanoscale. 10 (27), 12871-12934 (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Wyżarzanie solnerozpraszanie światłamałokątowe rozpraszanie rentgenowskiemikroskopia elektronowadynamiczne rozpraszanie światładostarczanie kwasów nukleinowychpolimery naładowanesamoorganizacjacharakterystyka nanocząstek
Montaż i charakterystyka miceli kompleksu polielektrolitu
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.