Opisujemy protokoły oceny stopnia transdukcji przez peptydy penetrujące komórki, wykorzystując systemy obrazowania ex vivo, a następnie zatapianie parafiny, cięcie i konfokalną mikroskopię fluorescencyjną na przykładzie peptydu celującego w serce. W naszym protokole pojedyncze zwierzę może być wykorzystane do uzyskania obu rodzajów oceny obrazowej tych samych narządów, zmniejszając w ten sposób liczbę zwierząt potrzebnych do badań o połowę.
Artykuł metodologiczny
Obrazowanie in vivo skuteczności transdukcji peptydu ukierunkowanego na serce
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Od czasu początkowego opisu domen transdukcji białek, znanych również jako peptydy penetrujące komórki, ponad 25 lat temu, pojawiło się duże zainteresowanie rozwojem tych peptydów, zwłaszcza specyficznych dla komórek, jako nowych wektorów do dostarczania materiałów diagnostycznych i terapeutycznych. Nasze wcześniejsze prace związane z wyświetlaniem fagów zidentyfikowały nowy, niewystępujący naturalnie peptyd o długości 12 aminokwasów, który nazwaliśmy peptydem ukierunkowanym na serce (CTP) ze względu na jego zdolność do transdukcji normalnej tkanki serca in vivo ze szczytowym wychwytem obserwowanym w ciągu zaledwie 15 minut po wstrzyknięciu dożylnym. Podjęliśmy szczegółowe badania biodystrybucji, wstrzykując CTP znakowane fluoroforem cyjaniną 5,5, pozwalając mu krążyć przez różne okresy czasu, oraz eutanazję, utrwalanie i cięcie wielu narządów, a następnie obrazowanie mikroskopem fluorescencyjnym. W niniejszej publikacji szczegółowo opisujemy te procesy, a także obrazowanie ex vivo pobranych narządów za pomocą systemu obrazowania in vivo. Przedstawiamy szczegółowe metodologie i praktyki w zakresie przeprowadzania badań nad transdukcją, a także biodystrybucją na przykładzie CTP.
Wprowadzenie
Błona plazmatyczna komórki jest półprzepuszczalną barierą, która jest niezbędna dla integralności i przetrwania komórki oraz służy do regulowania wnętrza komórki poprzez kontrolowanie ruchu substancji do komórki. Chociaż ma to zasadnicze znaczenie dla przetrwania, stanowi również barierę w dostarczaniu ładunku do komórki. W 1988 roku wykazano, że białko trans-aktywatora transkrypcji (Tat) ludzkiego wirusa niedoboru odporności wnika do hodowanych komórek i promuje ekspresję genów wirusa1,2, przy czym domeny odpowiedzialne za tę transdukcję są ograniczone do bogatego w argininę i lizynę regionu 13-aminokwasowego trzeciej helisy3 Nazwano je peptydami penetrującymi komórki (CPP). Następnie przeprowadzono badania wykazujące zdolność peptydu Tat do przenoszenia funkcjonalnej β-galaktozydazy do wielu typów komórek4. Od czasu wstępnego opisu liczba peptydów penetrujących komórki dramatycznie wzrosła. Te domeny transdukcyjne są naturalnie występującymi lub syntetycznymi krótkimi peptydami, zwykle o długości 6-20 aminokwasów, które są w stanie przenosić funkcjonalne ładunki przez błony komórkowe. Ładunki te mogą obejmować inne małe peptydy, białka o pełnej długości, kwasy nukleinowe, nanocząstki, cząstki wirusowe, cząsteczki fluorescencyjne i radioizotopy5. Początkowe opisane CPP nie były specyficzne dla komórek, przy czym Tat był wychwytywany przez wiele typów komórek, a nawet przekraczał barierę krew-mózg4, co ograniczało jego potencjał terapeutyczny. W celu zidentyfikowania CPP specyficznych dla komórek, badacze przeprowadzili wyświetlanie fagów przy użyciu dużych, dostępnych na rynku bibliotek fagów6. Nasza własna praca z wykorzystaniem kombinatorycznej metodologii wyświetlania fagów in vitro i in vivo doprowadziła do zidentyfikowania CPP o nazwie peptyd ukierunkowany na serce (CTP)7, 12-aminokwasowy, niewystępujący naturalnie peptyd (NH 2-APWHLSSQYSRT-COOH), który celuje w serce ze szczytowym wychwytem po 15 minutach po obwodowym wstrzyknięciu dożylnym8. Stosując immunofluorescencyjną kolokalizację z aktyną, markerem wewnątrzkomórkowym, i wykluczenie lamininy, markera błony komórkowej, wykazaliśmy, że CTP jest internalizowane do kardiomiocytów myszy po wstrzyknięciu dożylnym7. Dodatkowo inkubowaliśmy indukowane przez człowieka pluripotencjalne bicie kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych z podwójnie znakowanym CTP, znakowanym 6-karboksyfluoresceiną na końcu C i rodaminą na końcu N poprzez wiązanie estrowe, które można było odciąć tylko przez esterazy wewnątrzkomórkowe. Szybką akumulację rodaminy do bijących kardiomiocytów zaobserwowano w ciągu 15 minut na mikroskopii konfokalnej8.
W tym artykule przedstawiamy dwie uzupełniające się metodologie, które mogą być użyte do śledzenia biodystrybucji i potwierdzania specyficznej tkankowo internalizacji CPP na przykładzie CTP. W przypadku tych metodologii zsyntetyzowano CTP, znakowano fluorescencyjnie na końcu N cyjaniną5,5 (CY5,5) i czadowano amidem na końcu C w celu uzyskania większej stabilności peptydów. Dwie stosowane metodologie to fluorescencyjne systemy obrazowania optycznego in vivo i mikroskopia fluorescencyjna skrawków tkanek. Obie metody są bardzo przydatne w badaniu biodystrybucji, wychwytu i eliminacji znakowanych fluorescencyjnie CPP. Przewagą oceny biodystrybucji przy użyciu tych metod w porównaniu z innymi, takimi jak tomografia emisyjna pojedynczych fotonów (SPECT) lub pozytonowa tomografia emisyjna (PET), jest to, że nie ma potrzeby czasochłonnego znakowania radioaktywnego CPP w porównaniu ze znakowaniem fluorescencyjnym, które jest stosunkowo łatwe i rutynowo stosowane we wszystkich zakładach syntezy peptydów. Zastosowanie obrazowania in vivo szybko generuje dane dotyczące biodystrybucji w kontekście żywego systemu, podczas gdy sekcjonowanie dostarcza bardziej szczegółowych informacji na temat wychwytu i lokalizacji peptydów w komórkach poprzez zachowanie szczegółów morfologicznych. Protokół ten można zastosować do wielu różnych narządów i tkanek, takich jak serce, płuca, wątroba, nerki, mózg, śledziona, żołądek, jelito grube, jelito cienkie, mięśnie szkieletowe, kości, jądra/jajniki i oczy.
Protokół
Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu w Pittsburghu zatwierdził wszystkie protokoły na zwierzętach określone w tej publikacji przed podjęciem jakichkolwiek eksperymentów na zwierzętach.
UWAGA: Ten protokół szczegółowo opisuje, jak przeprowadzić badania biodystrybucji ex vivo za pomocą optycznego obrazowania fluorescencyjnego, a następnie badań biodystrybucji in vivo poprzez osadzenie organów w parafinie, sekcję i wykonanie mikroskopii fluorescencyjnej. Chociaż CTP jest używany jako przykład, metodę tę można zastosować do dowolnego znakowanego fluorescencyjnie CPP.
1. Obrazowanie in vivo
- Zsyntetyzuj CTP przy użyciu technik syntezy fazy stałej9,10 z zakładu syntezy peptydów przy użyciu L-aminokwasów z N-końcem znakowanym Cy5.5 i C-końcem amidowym dla zwiększenia stabilności.
UWAGA: Wszystkie zsyntetyzowane CPP powinny być scharakteryzowane za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) i/lub desorpcji/jonizacji laserowej wspomaganej matrycą (MALDI) przed użyciem11. - Sporządzić 1 mM lub 10 mM roztwór podstawowy CTP w dimetylosulfotlenku (DMSO), podwielokrotności, i przechowywać w temperaturze -80 °C, w stanie chronionym przed światłem.
UWAGA: Peptydy są dostarczane w postaci liofilizowanego proszku. Liofilizowany proszek może być przechowywany przez długi czas (6 miesięcy-2 lata) w temperaturze -20 °C, chroniony przed światłem i w warunkach higroskopijnych. W przypadku poddawania w DMSO i przechowywania należy unikać cykli zamrażania i rozmrażania. - Zważ i znieczul 6-tygodniowe samice myszy CD1 za pomocą 2 μl/g masy tkanki roztworu ketaminy/ksylazyny (100 mg/kg ketaminy i 20 mg/kg ksylazyny) podawanego domięśniowo (tylna noga) lub dootrzewnowo (lewy dolny kwadrant).
UWAGA: Roztwory ketaminy/ksylazyny powinny być świeże w dniu użycia. Niewykorzystane ketamina/ksylazyna powinny zostać odpowiednio zutylizowane, a ilości zużyte w stosunku do ilości wyrzuconych powinny być rejestrowane w dzienniku, ponieważ ketamina jest substancją kontrolowaną. Odpowiedni poziom znieczulenia zostanie osiągnięty w ciągu 5-7 minut, co ocenia się na podstawie braku reakcji na uszczypnięcie palca. - Obliczyć dawkę 10 mg/kg Cy5.5-CTP, rozcieńczyć solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) do nie więcej niż 200 μl i wstrzyknąć albo zaoczodoczoczo, albo przez wstrzyknięcie do żyły ogonowej za pomocą strzykawki insulinowej (Rysunek 1A).
- Pozwól peptydowi krążyć przez określony czas, w zakresie od 15 min do 6 godzin.
- Poddaj mysz eutanazji metodą inhalacyjną o wysokim stężeniu CO2 zgodnie z zaleceniami Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Wykorzystania Zwierząt i otwórz jamę klatki piersiowej za pomocą nożyczek (Rysunek 1B).
- Użyj nożyczek, aby umieścić małe nacięcie w bocznej, wolnej ścianie prawego przedsionka i wstrzyknij 3 ml 10% buforowanego fosforanu formaliny za pomocą igły 26 G w podwójnym celu: perfuzji, mocowania narządów myszy i wypłukiwania czerwonych krwinek (Rysunek 1C).
- Wypreparuj serce, płuca, wątrobę, nerki, śledzionę, jelito grube, jelito cienkie, pęcherz moczowy, jajniki/jądra i mózg i umieść je w indywidualnych dołkach 12-dołkowej płytki do obrazowania optycznego ex vivo (Rysunek 1D).
- Uruchom oprogramowanie do akwizycji obrazów i kliknij przycisk Inicjalizuj, aby przygotować system do obrazowania próbek. Otwórz kreatora obrazowania, wybierz fluorescencję, następnie parę filtrów, a następnie wybierz barwnik Cy5.5 z listy barwników, aby zastosować filtry wzbudzenia 580 nm i emisji 620 nm. Wybierz ręczne ustawienia parametrów ekspozycji, a następnie ustaw pozycję stage na B, ustaw czas ekspozycji na 1 sekundę, ustaw F/stop na 8 i ustaw binning na mały.
UWAGA: Filtry emisji wzbudzenia będą się różnić w zależności od użytej etykiety. Wzbudzenie i emisję używanej etykiety można wprowadzić ręcznie, aby oprogramowanie przypisało filtry wzbudzenia i emisji. Upewnij się, że liczby mieszczą się w przedziale 600-60 000, aby uniknąć nasycenia. W zależności od używanego systemu może być dostępna automatyczna optymalizacja pozyskiwania. Jeśli system ma kompensację do porównywania obrazów uzyskanych przy różnych ustawieniach, można użyć ustawień automatycznych. Jeśli żadna kompensacja nie jest dostępna, ustawienia będą musiały zostać określone, zapisane i używane spójnie we wszystkich próbkach. - Gdy system zostanie całkowicie zainicjowany, ułóż interesujące nas narządy na 12-dołkowej płytce i umieść ją w komorze obrazowania optycznego, upewniając się, że próbki są ułożone zgodnie z oczekiwaniami dla obrazów. Wybierz opcję pobierz, a następnie wybierz lokalizację zapisu obrazów. Informacje o myszy można zapisać w wyskakującym oknie edycji etykiet obrazów.
- Po zobrazowaniu należy wyjąć próbki z komory i przechowywać w 10% buforowanym fosforanie formaliny w objętości co najmniej 20 razy większej niż objętość tkanki w fiolkach scyntylacyjnych z ochroną przed światłem w temperaturze pokojowej (RT).
- Określ ilościowo obrazy, ustawiając jednostki na wydajność promieniowania, a następnie wybierając zwrot z inwestycji 4x3 i dostosowując tak, aby równomiernie dopasować każdą studzienkę do jednego kwadratu zwrotu z inwestycji, a następnie klikając pomiar. Otwórz kartę pomiarów ROI siatki, wybierz eksport i zapisz pomiary jako plik .cvs.
2. Histologia
UWAGA: Wykonaj kroki 1.1−1.8, aby uzyskać różne organy. Alternatywnie, te same narządy, które zostały zobrazowane, można natychmiast umieścić w formalinie i użyć do sekcji, jak opisano poniżej.
- Przechowywać każdy narząd indywidualnie w 10% buforowanym fosforanie formaliny przez co najmniej 48 godzin przed przetworzeniem w celu badania histologicznego.
- Gdy po 48 godzinach narządy zostaną wystarczająco utrwalone, przenieś narządy do kaset do przetwarzania tkanek i osadzania i umieść w maszynie do przetwarzania tkanek (Rysunek 1E).
- Ustaw maszynę przetwórczą tak, aby odwadniała tkankę w 70% etanolu przez 30 minut, a następnie 80% etanolu przez 30 minut, 95% etanolu przez 30 minut, 95% etanolu przez 30 minut, 100% etanolu przez 15 minut, 100% etanolu przez 20 minut, a na końcu 100% etanolu przez 20 minut.
- Oczyść tkankę z ksylenu 2x, pozostawiając 30 minut na każdy zabieg z ksylenem.
- Naciekać oczyszczoną tkankę woskiem parafinowym 4x w temperaturze 60 °C przez 30 minut przy każdym zabiegu.
- Zanurz w parafinie za pomocą metalowych form. Napełnij formę stopioną parafiną (utrzymywaną w temperaturze 65 °C) i przenieś na zimną płytę. Gdy parafina na dnie formy zacznie krzepnąć, umieść narząd w parafinie (Rysunek 1F).
- Umieść oznaczoną kasetę na wierzchu formy jako podkład i przepełnij stopioną parafiną. Pozostawić do ostygnięcia, aż stwardnieje. Następnie przechowuj blok w zamrażarce o temperaturze -20 °C przez noc, pozwalając woskowi na dalsze kurczenie się w celu łatwego wyjęcia z form.
UWAGA: Bloki mogą być teraz przechowywane w RT z ochroną przed światłem. - Przygotować łaźnię wodną o temperaturze 38 °C z wodą destylowaną. Ustaw mikrotom o kącie nachylenia ostrza 6° i grubości przekroju 10 μm.
- Zamontuj bloki tkanek w mikrotomie i rozpocznij cięcie, aż do uzyskania skrawków zawierających tkankę. Następnie umieść klocki twarzą do dołu w wodzie na 5 minut lub do momentu, gdy tkanka wchłonie trochę wilgoci (np. gdy w bloku pojawi się cienki biały kontur tkanki [Rysunek 1G]).
UWAGA: Ostrze należy często wymieniać, aby zapewnić jakość sekcji. - Umieść tkankę na płaskim bloku lodu na 10 minut, a następnie umieść ją z powrotem w mikrotomie w tej samej orientacji, co w kroku 2.9. Zacznij robić sekcje i pozwól, aby obcięte sekcje utworzyły długie wstęgi po 6−10 sekcji każda. Wyrzuć nieoptymalne taśmy parafinowe, aż zostanie wyprodukowana wysokiej jakości taśma o długości wystarczającej do zakrycia szkiełka. Zoptymalizuj cięcie, dostosowując prędkości cięcia, nawilżenie tkanek i temperaturę kąpieli wodnej, aby uniknąć ścinania lub marszczenia skrawków tkanki.
UWAGA: Odcinki, które mają, z których wypadła tkanka, rozdarcia w tkance lub napięte zmarszczki i fałdy w tkance należy wyrzucić. - Ostrożnie wybierz wysokiej jakości wstążkę za pomocą kleszczyków o krawędziach i unosić się na powierzchni łaźni wodnej o temperaturze 38 °C. Pozostaw skrawki na powierzchni, aż się wygładzą, uważając, aby nie pozostawić ich zbyt długo, aby zapobiec rozpadowi parafiny i rozdarciu sekcji.
- Umieść spłaszczone sekcje na powierzchni czystych szkiełek podstawowych. Umieść szkiełka w piekarniku o temperaturze 65 °C na 30 minut, aby wosk się rozpuścił.
UWAGA: Szkiełka te mogą być przechowywane w RT z ochroną przed światłem. - Odparafinować szkiełka w ksylenie 3x, 10 min na każdy zabieg.
- Ponownie uwodnić tkankę w 100% etanolu przez 5 minut, następnie 95% etanolu przez 5 minut, 70% etanolu przez 5 minut, 50% etanolu przez 5 minut, a na koniec 1x soli fizjologicznej buforowanej trisem (TBS) przez 5 minut (Rysunek 1H). Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na noc.
UWAGA: Szkiełka te mogą być przechowywane przez długi czas w temperaturze pokojowej, o ile są chronione przed światłem. - Zamontuj szkiełka z szkiełkami nakrywkowymi za pomocą 125 μl podłoża montażowego zawierającego 4′,6-diamidyn-2-fenyloindol (DAPI), jądrowej sondy fluorescencyjnej (Rysunek 1I). Suche szkiełka przez noc w RT, chronione przed światłem.
UWAGA: Wysuszone szkiełka można przechowywać przez długi czas w temperaturze 4 °C, chronić przed światłem. - Preparaty obrazowe przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej.
UWAGA: Należy unikać nasyconych obrazów, ponieważ nie są one przydatne ilościowo. Regulację ustawień ekspozycji i wzmocnienia można obniżyć, aby uniknąć nasycenia. Należy pamiętać, aby używać tych samych ustawień we wszystkich porównywanych próbkach. Unikaj wybielania tkanki, ograniczając czas ekspozycji.
Wyniki
Stosując niniejszy protokół, trzem myszom podano dawkę 10 mg/kg Cy5.5-CTP poprzez wstrzyknięcie zaocznojamowe (Rycina 1A). Po 15 min cyrkulacji peptydu myszy zostały uśmiercone w komorze z CO2, otwarto klatkę piersiową poprzez nacięcie w linii pośrodkowej mostka, nacięto prawy przedsionek serca, a następnie przeprowadzono utrwalanie perfuzyjne myszy przy użyciu 3 mL 10% fosforanowej formaliny buforowanej (Rycina 1B,C). Po utrwaleniu wypreparowano serce, płuca, wątrobę, nerki, śledzionę oraz mózg i ułożono je na płytce 12-dołkowej do obrazowania fluorescencyjnego ex vivo (Rycina 1D oraz Rycina 2A). Trzy myszy kontrolne, którym nie podano wstrzyknięć, również poddano perfuzji, sekcji i obrazowaniu (Rycina 1B−D oraz Rycina 2B). Dane fluorescencji uzyskane dla każdego zestawu organów można porównać, ponieważ wartości zliczania zostały przekształcone na wydajność promieniowania (radiant efficiency), czyli względną jednostkę fluorescencji oprogramowania do obrazowania. Dane te można poddać kwantyfikacji, aby uzyskać zarówno obrazy jakościowe, jak i dane ilościowe dla każdego analizowanego organu (Rycina 2C) w różnych punktach czasowych na potrzeby badań biodystrybucji. Autofluorescencję różnych organów w odpowiedzi na różne długości fal wzbudzenia przedstawiono na Rycynie 3A−E. Krótsze długości fal wzbudzenia, takie jak w przypadku ulepszonego zielonego białka fluorescencyjnego (EGFP), wiążą się z wyższą autofluorescencją, szczególnie w wątrobie i mózgu, niż długości fal wzbudzenia w zakresie dalekiej czerwieni (Cy5.5) lub bliskiej podczerwieni (Cy7) (Rycina 3). Obrazowane organy utrwalano w 10% fosforanowej formalinie buforowanej w temperaturze pokojowej przez co najmniej 48 h, a następnie przeniesiono do kaset do procesowania i zatapiania tkanek (Rycina 1E). Organy przetworzono i zapiarafinowano w procesorze tkanek, umieszczono w formach wypełnionych parafina, zamrożono na platformie o temperaturze -20 °C i przechowywano przez noc w -20 °C (Rycina 1F). Próbki poddano sekcjonowaniu (Rycina 1G) i traktowano wymianą roztworów w celu rehydratacji tkanki (Rycina 1H). Przygotowane preparaty zamontowano następnie przy użyciu fluorescencyjnego medium montującego z DAPI (Rycina 1I). Po wyschnięciu, zazwyczaj przez noc, preparaty obrazowano za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Reprezentatywne obrazy każdego organu z myszy przedstawiono na Rycynie 4A. Obrazy z różnych organów pozyskano przy użyciu identycznych ustawień, aby umożliwić porównanie między myszami oraz przeprowadzenie kwantyfikacji (Rycina 4B).
Rysunek 1: Pobieranie organów myszy do optycznego obrazowania fluorescencyjnego ex vivo i krojenia. (A) Mysz typu dzikiego po podaniu CTP-Cy5.5 drogą retroskrabinową. (B) Mysz poddana sekcji z otwartą klatką piersiową i przeciętym prawym przedsionkiem w celu utrwalania perfuzyjnego. (C) Wstrzyknięcie do serca 3 mL 10% buforowanego formalinu fosforanowego w celu utrwalenia perfuzyjnego zwierzęcia. (D) Pobranie wybranych organów i rozmieszczenie ich na płytce 12-dołkowej do optycznego obrazowania fluorescencyjnego. (E) Serce umieszczone w kasecie i poddane obróbce w procesorze do tkanek. (F) Serce zatopione w parafinie. (G) Serce krojone na mikrotomie. (H) Deparafinizacja preparatów poprzez serię wymian roztworów. (I) Przykrycie skrawków szkiełkami przy użyciu DAPI. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 2: Reprezentatywne obrazy organów leczonych i kontrolnych. (A) Organy myszy leczonej dawką 10 mg/kg CTP-Cy5.5. (B) Organy z nieleczonej myszy kontrolnej. (C) Ilościowe oznaczenie fluorescencji dla każdego zestawu organów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 3: Narządy nieleczonej myszy obrazowane przy różnych długościach fal wzbudzenia i emisji w celu wykazania, że dłuższe długości fal generują mniejszą autofluorescencję. (A) Cy7: 740−790. (B) Cy5.5: 660−710. (C) Cy5: 620−670. (D) Cy3: 520−570. (E) EGFP: 480−520. Aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.
Rycina 4: Transdukcja serca, płuc, wątroby i nerek po wtryskiwaniu dożylnym u myszy. Myszy typu dzikiego otrzymały wtrysk 10 mg/kg Cy5.5-CTP lub peptydu randomowego (RAN-Cy5.5), a następnie zostały poddane eutanazji w określonych punktach czasowych. (A) Szczytowa transdukcja tkanki serca wystąpiła w 15 min, z następującym stałym spadkiem fluorescencji w czasie. Odnotowano pewien pobór kapilarny w płucach oraz silną transdukcję w wątrobie, a także w kapilarach kłębuszkowych nerek, co sugeruje nerkowy mechanizm wydalania. (B) Ilościowe oznaczenie intensywności fluorescencji wykazuje znacznie większy pobór CTP-Cy5.5 przez serce w porównaniu z RAN-Cy5.5. Pasek skali = 500 µm. Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Zahid i wsp.8. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Dyskusja
Modele zwierzęce są niezbędne do przedklinicznego opracowywania leków na każdym etapie procesu, począwszy od identyfikacji nowych CPP, poprzez badania biodystrybucji, mechanizm transdukcji, aż po ostateczne testy skuteczności dostarczonego ładunku przy użyciu tych nowych CPP jako wektorów. Istnieje wiele powszechnie stosowanych metod oceny biodystrybucji, takich jak histologia, obrazowanie medycyny nuklearnej (SPECT i PET) oraz obrazowanie optyczne in vivo12. Metody obrazowania jądrowego mogą być kłopotliwe ze względu na ograniczoną dostępność systemów SPECT i PET dla małych zwierząt, a także możliwość wytwarzania koniugatów znakowanych radioaktywnie i leków, co wymaga specjalistycznej wiedzy radiochemika. Natomiast etykiety fluorescencyjne są znacznie prostsze i mogą być opłacalne w obsłudze. Opisany w artykule protokół pozwala na szybką analizę biodystrybucji przy użyciu wielu metod. Fluorescencyjne obrazowanie optyczne całego narządu ex vivo pozwala na natychmiastowe porównanie fluorescencji w różnych tkankach i grupach badanych oraz może określić wychwyt narządowy i czas do szczytowego wychwytu w narządzie będącym przedmiotem zainteresowania w sposób półilościowy. Ilościowa histologia tkanek wymaga bardziej rozległego przetwarzania w celu leczenia, cięcia, obrazowania i analizowania tkanek, ale dostarcza więcej danych na poziomie mikroskopowym i jest obecnie standardową techniką. Warto zauważyć, że bezpośrednie, ilościowe porównanie obu technik nie jest możliwe, ponieważ autofluorescencja obserwowana przy każdej technice dla różnych narządów i długości fal wzbudzenia różni się znacznie.
Ważną częścią tego protokołu jest wybór odpowiedniego fluoroforu do oznaczania potencjalnych CPP do eksperymentów. Jednym z potencjalnych problemów jest nakładanie się widm, co może być problematyczne, gdy potrzebnych jest wiele fluoroforów. Fluorescencyjne media montażowe DAPI i Cy5.5 nie mają nakładających się widm. Jednak w przypadku niektórych zastosowań, w których potrzebnych jest wiele fluoroforów, należy dokładnie rozważyć ryzyko nakładania się spektralnego. W zależności od stosowanego systemu, wybór fluoroforów może być ograniczony. Dlatego kluczowa jest wiedza na temat możliwości systemu. Fluorescencyjne systemy optyczne najlepiej sprawdzają się w przypadku fluoroforów dalekiej czerwieni lub bliskiej podczerwieni ze względu na wysoką absorpcję tkankową krótszych fal13. Fluorofory z zakresu wzmocnionego białka zielonej fluorescencji mają poważne ograniczenie, ponieważ na długości fali wzbudzenia obserwuje się znaczną autofluorescencję narządów, szczególnie w tkance mózgu i wątroby. W zależności od warunków eksperymentu, niektórych fluoroforów najlepiej unikać. Niektóre rozpuszczalne w wodzie fluorofory organiczne mają silną interakcję z dwuwarstwami lipidowymi, co może powodować wyniki fałszywie dodatnie. W związku z tym wskazane jest podjęcie kroków w celu ustalenia, czy fluorofor ma silne powinowactwo do tkanki będącej przedmiotem zainteresowania14. Kolejnym czynnikiem, który należy wziąć pod uwagę, jest wybór odpowiedniej metody koniugacji fluoroforu, który może być ważnym parametrem wpływającym na wyniki. CPP mogą być znakowane fluorescencyjnie na końcu N lub C poprzez wiązanie kowalencyjne między N-końcem peptydu a grupą karboksylową barwnika, taką jak Cy5.5-NHS. Należy zachować ostrożność, ponieważ mechanizm transdukcji większości CPP nie jest szczegółowo poznany, a koniugacja na jednym końcu może wpływać na mechanizm wychwytu bardziej niż na drugim końcu. Inną możliwością znakowania CPP jest biotynylacja N-końca w celu sprzężenia z fluorescencyjnie znakowaną streptawidyną. Stosowanie tej strategii ma tę wygodę, że pozwala na wykorzystanie różnych fluorescencyjnych koniugatów streptawidyny. Jednak możliwym ograniczeniem tej strategii jest to, że kompleks biotyna-streptawidyna jest dużym konstruktem, który może potencjalnie zakłócać transdukcję.
Fluorescencyjne systemy obrazowania optycznego są skuteczną strategią skutecznego porównywania fluorescencji w różnych narządach i zabiegach, ale nie są w stanie uzyskać ilościowego pomiaru bezwzględnych stężeń w tkance. Wynika to z efektów rozpraszania światła w tkance, które są dodatkowo potęgowane przez naturalnie występującą różnorodność rozmiarów i gęstości tkanek oraz różnice w unaczynieniu, ze zmiennym rozpraszaniem fluorescencji. Autofluorescencja tkanek może być również czynnikiem, ze względu na naturalnie występujące źródła biochemiczne, takie jak kolagen, lub źródła dietetyczne, takie jak chlorofil w żywności13.
Histologia jest najczęściej stosowaną metodą pomiaru biodystrybucji i może być potencjalnie wykorzystana do dokładnego pomiaru i porównania wychwytu w różnych tkankach w czasie. Dzięki tej metodzie unika się problemów z rozpraszaniem światła, ponieważ wszystkie tkanki są cięte na tę samą grubość15. Główną zaletą tej metody jest możliwość dołączenia dodatkowych znaczników fluorescencyjnych po sekcji immunologicznej. Chociaż dodanie innego fluoroforu może sprawić, że obrazowanie będzie trudniejsze, zastosowanie znaczników fluorescencyjnych może być przydatne do lokalizacji CPP w określonych przedziałach wewnątrzkomórkowych, takich jak lizosomy lub mitochondria. Przeciwciało można zastosować w eksperymencie mikroskopii konfokalnej w celu określenia, czy transdukowany kandydat na CPP kolokalizuje się ze strukturą będącą przedmiotem zainteresowania, co może pokazać potencjał CPP jako czynnika dostarczającego. Jednym z ograniczeń tej metody jest to, że przygotowanie preparatów z próbek narządów może być czasochłonne, pracochłonne i podatne na błędy ludzkie12,15. Podczas obrazowania preparatów należy uważać, aby nie obrazować tego samego miejsca zbyt długo, aby uniknąć fotowybielania. Niektóre fotowybielanie będzie nieuniknione, w zależności od wrażliwości fluoroforu. Na każdym etapie niniejszego protokołu należy dołożyć starań, aby chronić próbki przed światłem otoczenia i odpowiednio je przechowywać16. Zalecamy przechowywanie preparatów w temperaturze 4 °C, w stanie chronionym przed światłem, do przyszłego obrazowania.
Dostępnych jest wiele metod pomiaru biodystrybucji kandydującego CPP, które wymagają specjalistycznego sprzętu i mogą dać porównywalne wyniki, chociaż mogą wymagać bardziej złożonego znakowania CPP. Protokół opisany w tym artykule wykorzystuje dwie kompatybilne metody do wydajnego generowania danych o biodystrybucji w kontekście żywego systemu, umożliwiając jednocześnie uzyskanie bardziej szczegółowych informacji na temat internalizacji peptydów w komórkach z tej samej próbki, zmniejszając w ten sposób liczbę zwierząt potrzebnych do badania o połowę. Metody te zostały wykorzystane do wygenerowania powyższych danych, które pokazują, że obie metody mogą być stosowane sekwencyjnie u tego samego zwierzęcia oraz jakość danych generowanych przez każdą z nich. Nasze wyniki podkreślają również niemożność bezpośredniego skorelowania wyników między tymi dwiema technikami w sposób ilościowy.
Oświadczenia
M.Z. i Paul D. Robbins (University of Minnesota, Minnesota, MN, USA) posiadają patent na zastosowanie peptydu ukierunkowanego na serce jako wektora sercowego (domena celowania w białko specyficzne dla serca, U.S. Patent Serial No. 9,249,184). M.Z. pełni również funkcję dyrektora naukowego i zasiada w zarządzie startupu Vivasc Therapeutics Inc. i posiada w nim znaczne udziały w przyszłości.
Podziękowania
M.Z. i K.S.F. są wspierani przez American Heart Association Scientist Development Award 17SDG33411180, oraz przez grant przyznany w ramach Pitt Innovation Challenge (PInCh®), przez Instytut Nauk Klinicznych i Translacyjnych na Uniwersytecie w Pittsburghu.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 10% buforowany fosforan formaliny | ThermoFisher | SF100-4 | |
| 10x Sól fizjologiczna buforowana Tris (TBS) | ThermoFisher | BP2471-1 | |
| 12-dołkowa płytka do hodowli komórkowych | ThermoFisher | 353043 | |
| 1x TBS Roztwór | 10x TBS rozcieńcza się w stosunku 1:10 wodą dejonizowaną. Roztwór ten można przechowywać w temperaturze pokojowej. | ||
| 20 ml fiolki scyntylacyjne | Wheaton | 334173 | |
| 26G Igły | Becton Dickinson | 305110 | |
| 28G 0,5ml Strzykawki insulinowe | Becton Dickinson | 329461 | |
| 3 ml Strzykawka | Becton Dickinson | 309657 | |
| CD1 Myszy | Charles River | 022 | 6 do 12 tygodniowe albinosy, samice myszy |
| Szkło | nakrywkoweThermoFisher | 12-544-14 | |
| Cy5.5-CTP-amid | Przygotowany w drodze syntezy peptydów, sprzężony z fluoroforem Cy5.5 i oczyszczony za pomocą HPLC. Liofilizowany proszek jest odtwarzany w DMSO w stężeniu 10mM. Po rozpuszczeniu przechowywać w temperaturze -80 stopni Celsjusza. | ||
| Dapi Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| Dumont #5 Kleszcze | Narzędzia do nauki | 99150-20 | |
| cienkie nożyczki do | |||
| Ketamina HCl 100 mg / ml | KetaVed | NDC 50989-161-06 | |
| Ketamina HCl jest mieszana z ksylazyną 1:1 w celu uzyskania roztworu podstawowego zawierającego 50 mg / ml ketaminy i 10 mg / ml ksylazyny. To rozwiązanie jest świeże przed każdym użyciem. | |||
| Leica RM2235 Mikrotom obrotowy | Leica | RM2235 | |
| Preparaty mikroskopowe | ThermoFisher | B9992000TN | |
| Paraplast X-TRA | Sigma | P3808-1KG | |
| Perkin Elmer Lumina S5 IVIS | Perkin Elmer | CLS148588 | |
| Sparkle Środek do czyszczenia soczewek optycznych | ThermoFisher | NC0090079 | |
| Tissue-Tek Processing/ Kasety do zatapiania | ThermoFisher | NC9499605 | |
| Maszyna do przetwarzania Tissue-Tek VIP | Tissue-Tek | VIP 5A-F1 | |
| Ksylazyna 20 mg / ml | AnaSed | NDC 59399-110-20 | |
| Ksyleny | ThermoFisher | X5-4 |
Bibliografia
- Green, M., Loewenstein, P. M. Autonomous functional domains of chemically synthesized human immunodeficiency virus tat trans-activator protein. Cell. 55 (6), 1179-1188 (1988).
- Frankel, A. D., Pabo, C. O. Cellular uptake of the tat protein from human immunodeficiency virus. Cell. 55 (6), 1189-1193 (1988).
- Derossi, D., Joliot, A. H., Chassaing, G., Prochiantz, A. The third helix of the Antennapedia homeodomain translocates through biological membranes. Journal of Biological Chemistry. 269 (14), 10444-10450 (1994).
- Schwarze, S. R., Ho, A., Vocero-Akbani, A., Dowdy, S. F. In vivo protein transduction: delivery of a biologically active protein into the mouse. Science. 285 (5433), 1569-1572 (1999).
- Zahid, M., Robbins, P. D. Cell-type specific penetrating peptides: therapeutic promises and challenges. Molecules. 20 (7), 13055-13070 (2015).
- Zahid, M., Robbins, P. D. Identification and characterization of tissue-specific protein transduction domains using peptide phage display. Methods in Molecular Biology. 683, 277-289 (2011).
- Zahid, M., et al. Identification of a cardiac specific protein transduction domain by in vivo biopanning using a M13 phage peptide display library in mice. PLoS One. 5 (8), e12252(2010).
- Zahid, M., et al. Cardiac Targeting Peptide, a Novel Cardiac Vector: Studies in Bio-Distribution, Imaging Application, and Mechanism of Transduction. Biomolecules. 8 (4), E147(2018).
- Amblard, M., Fehrentz, J. A., Martinez, J., Subra, G. Methods and protocols of modern solid phase Peptide synthesis. Molecular Biotechnology. 33 (3), 239-254 (2006).
- Katritzky, A. R., Yoshioka, M., Narindoshvili, T., Chung, A., Johnson, J. V. Fluorescent labeling of peptides on solid phase. Organic and Biomolecular Chemistry. 6 (24), 4582-4586 (2008).
- Prabhala, B. K., Mirza, O., Hojrup, P., Hansen, P. R. Characterization of Synthetic Peptides by Mass Spectrometry. Methods in Molecular Biology. 1348, 77-82 (2015).
- Arms, L., et al. Advantages and Limitations of Current Techniques for Analyzing the Biodistribution of Nanoparticles. Frontiers in Pharmacology. 9, 802(2018).
- Leblond, F., Davis, S. C., Valdes, P. A., Pogue, B. W. Pre-clinical whole-body fluorescence imaging: Review of instruments, methods and applications. Journal of Photochemistry and Photobiology. 98 (1), 77-94 (2010).
- Hughes, L. D., Rawle, R. J., Boxer, S. G. Choose your label wisely: water-soluble fluorophores often interact with lipid bilayers. PLoS One. 9 (2), e87649(2014).
- McGowan, J. W., Bidwell, G. L. 3rd The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules. Journal of Visualized Experiments. (118), e54987(2016).
- Waters, J. C. Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy. Journal of Cell Biology. 185 (7), 1135-1148 (2009).
Przedruki i uprawnienia
