Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wytwarzanie wieloskładnikowych sieci nanorurek lipidowych przy użyciu testu ruchliwości kinezyny ślizgowej

1.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60899

⸱

26 lipca 2021

 , 
1Center for Integrated Nanotechnologies, Sandia National Laboratories

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje proces wytwarzania sieci nanorurek lipidowych za pomocą ślizgającej się ruchliwości kinezyny w połączeniu z gigantycznymi jednopłytkowymi pęcherzykami lipidowymi.

Streszczenie

Sieci nanorurek lipidowych (LNT) reprezentują system modelowy in vitro do badania transportu molekularnego i biofizyki lipidów z uwzględnieniem wszechobecnych kanalików lipidowych znajdujących się w komórkach eukariotycznych. Jednak LNT in vivo są wysoce nierównowagowymi strukturami, które wymagają energii chemicznej i silników molekularnych do montażu, konserwacji i reorganizacji. Ponadto skład LNT in vivo jest złożony i składa się z wielu różnych gatunków lipidów. Typowe metody wytłaczania LNT są zarówno czasochłonne, jak i pracochłonne, a do wymuszonego wyciągania nanorurek z gigantycznych pęcherzyków lipidowych potrzebne są pęsety optyczne, mikrogranulki i mikropipety. Przedstawiono tutaj protokół testu ruchliwości ślizgowej (GMA), w którym wielkoskalowe sieci LNT są szybko generowane z gigantycznych pęcherzyków jednowarstwowych (GUV) przy użyciu ruchliwości mikrotubul zasilanych kinezyną. Korzystając z tej metody, sieci LNT są tworzone z szerokiej gamy preparatów lipidowych, które naśladują złożoność biologicznych LNT, co czyni je coraz bardziej przydatnymi w badaniach in vitro biofizyki lipidów i transportu związanego z błoną. Dodatkowo metoda ta jest w stanie niezawodnie wytworzyć sieci LNT w krótkim czasie (<30 min) przy użyciu powszechnie stosowanego sprzętu laboratoryjnego. Cechy sieci LNT, takie jak długość, szerokość i partycjonowanie lipidów, są również regulowane poprzez zmianę składu lipidowego GUV używanych do wytwarzania sieci.

Wprowadzenie

Wytwarzanie sieci z nanorurek lipidowych (LNT) cieszy się coraz większym zainteresowaniem w badaniach in vitro nierównowagowych struktur lipidowych1,2,3. Komórki wykorzystują kanaliki lipidowe do dyfuzyjnego transportu białek4 i kwasów nukleinowych5, a także komunikacji między komórkami6,7. Retikulum endoplazmatyczne i aparat Golgiego są szczególnie interesujące, ponieważ te organelle związane z błoną są głównymi miejscami syntezy lipidów i białek, a także transportu tych integralnych biomolekuł w cytoplazmie komórki8,9. Błony tych organelli składają się z wielu gatunków lipidów, w tym sfingolipidów, cholesterolu i fosfolipidów10, które ostatecznie pomagają zdefiniować ich funkcjonalność. Tak więc, aby dokładniej replikować i badać te organelle, LNT in vitro muszą być wytwarzane z pęcherzyków o coraz bardziej złożonych preparatach lipidowych11.

Gigantyczne pęcherzyki jednowarstwowe (GUV) są powszechnie używane do badania zachowania błon lipidowych, ponieważ mogą być niezawodnie syntetyzowane ze złożonymi preparatami, które zawierają cholesterol, fosfatydylocholinę (PC), fosfatydyloetanoloaminę (PE), fosfatydyloserynę (PS) i fosfatydyloinozytol (PI)12,13. Opisano tutaj metodę wytwarzania LNT z GUV o różnych formulacjach lipidowych przy użyciu testu ruchliwości ślizgowej (GMA), w którym LNT są wytłaczane w oparciu o pracę wykonaną przez silniki kinezynowe i włókna mikrotubul działające na GUV. W tym systemie białka motoryczne kinezyny zaadsorbowane na powierzchni napędzają biotynylowane mikrotubule, przekształcając energię chemiczną z hydrolizy ATP w użyteczną pracę (w szczególności ekstruzję LNT z biotynylowanych pęcherzyków)11. Powstała w ten sposób sieć LNT stanowi platformę modelową do badania wpływu różnic w fazach lipidowych na zmiany morfologii LNT.

Krótko mówiąc, białka motoryczne kinezyny są wprowadzane do komory przepływowej w roztworze zawierającym kazeinę, co umożliwia adsorpcję silników na szklanej powierzchni komory. Następnie biotynylowane mikrotubule w roztworze zawierającym ATP przepływają przez komorę i mogą związać się z silnikami kinezynowymi i rozpocząć ruchliwość. Następnie do komory wprowadza się roztwór streptawidyny i pozostawia do niekowalencyjnego związania się z mikrotubulami. Na koniec GUV zawierające biotynylowany lipid są wprowadzane do komory i wiążą się z mikrotubulami pokrytymi streptawidyną, a następnie wytłaczają LNT, tworząc sieci na dużą skalę w ciągu 15–30 minut. Ta metoda tworzy duże, rozgałęzione sieci LNT przy użyciu standardowego sprzętu laboratoryjnego i odczynników przy niskich kosztach11.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie roztworów zapasowych mikrotubul

OSTROŻNIE: Przez cały czas trwania procedury należy zawsze nosić okulary ochronne, rękawiczki i fartuch laboratoryjny.

  1. Przygotować bufor 5x BRB80: dodać 24,19 g PIPES (kwas piperazyno-N,N′-bis[2-etanosulfonowy]) oraz 0,38 g EGTA (kwas etylenoglikol-bis[β-aminoetylowy eter]-N,N,N′,N′-tetraoctowy) do szklanej butelki o pojemności 1 L. Dodać 1 mL 1 M MgCl2 i dostosować pH do 6,9 za pomocą KOH. Dopełnić wodą dejonizowaną do objętości końcowej 50 mL.
  2. Przygotować roztwór stokowy GTP o stężeniu 10 mM: odważyć 52 mg GTP i zawiesić w 1 mL wody destylowanej. Rozdzielić roztwór 10 mM na alykwoaty po 20 µL i przechowywać w temperaturze -20 °C.
  3. Przygotować roztwór GPEM: zmieszać 20 µL 5x BRB80, 10 µL roztworu 10 mM GTP, 100 µL 10% glicerolu oraz 60 µL wody dejonizowanej. Rozdzielić roztwór GPEM na alykwoaty po 10 µL i przechowywać w temperaturze -20 °C.
  4. Przygotować roztwór mikrotubul poprzez rekonstytucję komercyjnie dostępnej, liofilizowanej tubuliny (po jednej fiolce tubuliny biotynylowanej, znakowanej fluorescencyjnie oraz nieznakowanej) w zimnym (4 °C) roztworze GPEM do stężenia stokowego 5 mg/mL.
  5. Przeprowadzić polimeryzację mikrotubul, mieszając 4 µL tubuliny biotynylowanej, 4 µL tubuliny znakowanej fluorescencyjnie oraz 24 µL tubuliny nieznakowanej (wszystkie o stężeniu 5 mg/mL), aby uzyskać stosunek 1:1:6 przy objętości końcowej 32 mL. Przechowywać na lodzie. Rozdzielić mieszaninę tubuliny na alykwoaty po 2 µL i przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu użycia.
    UWAGA: Efektywna polimeryzacja wymaga, aby stężenie tubuliny było równe lub wyższe od stężenia krytycznego (5 mg/mL)14. W tym przypadku dobór stosunku tubulin został zoptymalizowany tak, aby uzyskać wystarczające stężenie tubuliny biotynylowanej do efektywnego wiązania streptawidyny i GUV, a także wystarczające stężenie tubuliny fluorescencyjnej do charakterystyki mikroskopowej.

2. Przygotowanie gigantycznych pęcherzyków jednowarstwowych (GUV)

  1. Przygotowanie filmu agarozowego
    UWAGA: Niniejszy protokół został opracowany na podstawie pracy Greene i wsp.15.
    1. Przygotować 1% (m/v) roztwór, mieszając 1 g agarozy w 10 ml wody dejonizowanej w kolbie Erlenmeyera o pojemności 250 ml. Roztwór agarozy podgrzewać w standardowej kuchence mikrofalowej przez 1–2 min.
      UWAGA: Roztwór stanie się przezroczysty, gdy agaroza całkowicie się rozpuści. Pozostawić roztwór do ostygnięcia do 65–75 °C przed użyciem.
    2. Wykonaj cięcie 1,000 µL końcówka do pipety do pobrania 30–400 µL roztworu agarozy na szklaną lamellkę o wymiarach 25 mm x 25 mm. Przytrzymując krawędź lamellki palcami w rękawiczkach, użyć innego 1,000 µL końcówka pipety do równomiernego rozprowadzenia roztopionej agarozy na szkiełku nakrywce.
      UWAGA: Utrzymanie agarozy w temperaturze 65–75 °C pozwoli na efektywne rozprowadzenie na powierzchni szkiełka nakrywki.
    3. Wysuszyć pokrywki szkiełce pokryte agarozą w 37 °C do inkubatora co najmniej na 2 h, po czym agaroza stanie się przezroczysta. Przechowywać szkiełka podstawowe, kładąc powierzchnię pokrytą agarozą stroną górną do góry na czystej powierzchni, takiej jak papier beztkaninowy lub folia woskowa, w temperaturze pokojowej (RT).
  2. Formulacja lipidowa
    1. Odzyskać lipidy rozpuszczone w chloroformie z -20 °C z zamrażarki i umieść je w dygestorium chemicznym, aż osiągną temperaturę pokojową.
    2. Oblicz objętość roztworu zapasowego każdego komponentu lipidowego potrzebną do przygotowania formulacji, korzystając z poniższego wzoru:
      Równanie obliczania objętości lipidów, V_lipid = mol% * n * M^-1, w analizie biochemicznej.
      Gdzie: Vlipid jest objętością lipidów do użycia, mol % to procent molowy składnika lipidowego, n jest całkowitą liczbą moli lipidów wykorzystanych w formulacji, a M jest stężeniem lipidów w jednostkach molowych.
      UWAGA: Na przykład, w przypadku użycia formulacji zawierającej 45 mol% 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocholiny (DOPC) z roztworem zapasowym o stężeniu 12,72 mM i 1 mikromolą całkowitej ilości lipidów w formulacji, objętość roztworu zapasowego DOPC użytego w formulacji wyniosłaby:
      Obliczenia V<sub>lipid</sub>, równanie objętości lipidów w mikrolitrach, formuła naukowa.
    3. Wymieszaj lipidy w wyliczonym stosunku w szklanej fiolce w dygestorium chemicznym.
    4. Pipeta 30 µL roztworu lipidów na pokrywki szkiełkowe powlekane agarozy na podgrzanej płycie grzejnej, ustawionej powyżej temperatury topnienia nasyconego składnika lipidowego formulacji (np. 50 °C płyta grzejna do lipidów z Tm z 40 °C).
    5. Rozprowadzić roztwór po błonie agarozowej kolistymi ruchami, używając długiej krawędzi igły 18 G, aż do momentu odparowania chloroformu i utworzenia jednorodnej warstwy lipidów. Podczas wykonywania tego kroku trzymać krawędź szkiełka nakrywki w rękawiczkach.
      UWAGA: Należy uważać, aby nie uszkodzić igłą warstwy agarozy.
    6. Umieść szkiełko nakrywowe z warstwą agarozy i filmu lipidowego w przykrytej folią aluminiową płytce Petriego, stroną z filmem skierowaną do góry, a następnie umieść płytkę Petriego w deskryptorze próżniowym na co najmniej 2 h w celu usunięcia pozostałości rozpuszczalnika.
  3. W międzyczasie należy przygotować 560 mM roztwór sacharozy, mieszając 1,92 g sacharozy z 10 ml wody dejonizowanej.
    UWAGA: Stężenie roztworu sacharozy zależy od osmolarności buforu, w którym rozcieńczane są GUV. Zazwyczaj osmolarność roztworu sacharozy nie powinna być o więcej niż 10% większa od osmolarności buforu, w którym GUV będą rozcieńczane, a konkretnie buforu do badania motywności (patrz krok 3.1).
  4. Tworzenie GUV
    1. Przyklej komorę z warstwą klejącą do szkiełka nakrywkowego pokrytego warstwą lipidową, delikatnie dociskając komorę do szkiełka z warstwą lipidową skierowaną ku górze, tak aby zapewnić szczelne połączenie.
    2. Dodaj 400 µL roztworu sacharozy o stężeniu 560 mM (przygotowanego w kroku 2.3) do komory. 
    3. Umieść szkiełko nakrywkę w komorze wilgotnościowej i zamknij pokrywkę.
    4. Umieść komorę wilgotnościową na podgrzanej płytce grzejnej ustawionej na temperaturę powyżej punktu topnienia nasyconego komponentu lipidowego formulacji.
    5. Pozostawić pęcherzyki do formowania się przez co najmniej 1 h przed etapem odzyskiwania.
      UWAGA: Formowanie się pęcherzyków można sprawdzić za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z użyciem obiektywu powietrznego 40x.

3. Przygotowanie zapasów i odczynników do testu motywności

  1. Przygotowanie roztworu zapasu kazeiny
    1. Do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml dodać 3 g suchej kazeiny, następnie dodać 30 ml buforu 1x BRB80 i mieszać aż do uzyskania lepkości roztworu. Wirować probówkę przy 15 0 x g przez 30 min.
    2. Przenieść supernatant do kolejnej 50 ml stożkowatej probówki wirówkowej i usunąć pellet. Przefiltrować roztwór przez 1 µm filtr strzykawkowy, zbierając roztwór do stożkowatej probówki o pojemności 50 ml. Przefiltruj roztwór przez 0.2 µm przefiltrować, zbierając roztwór do probówki stożkowej o pojemności 50 ml.
    3. Wyznaczyć stężenie białka, mierząc absorbancję przy 280 nm za pomocą spektrofotometru UV-Vis i kuwety kwarcowej.
    4. Oblicz stężenie kazeiny w mg/ml, korzystając z następującego wzoru:
      Wzór na stężenie białka, analiza spektroskopowa UV-Vis, równanie wyznaczania stężenia.
    5. Rozcieńczyć roztwór do stężenia 20 mg/mL w 1x BRB80, podzielić na 100 µL alikwoty i przechowywać w temperaturze -20 °C.
  2. Przygotuj roztwór zapasowy oksydazy glukozowej (2 mg/mL), mieszając 2 mg oksydazy glukozowej z 1 mL buforu 1x BRB80. Podziel na 100 µL podzielić na alikwoty i przechowywać w temperaturze -20 °C.
  3. Przygotować roztwór zapasowy katalazy (0,8 mg/ml), mieszając 0,8 mg katalazy z 1 ml 1x BRB80. Podzielić na 100 µL podzielić na aalikwoty i przechowywać w temperaturze -20 °C.
  4. Przygotować 2 M roztwór glukozy, zawieszając 0,3 g D-glukozy w 1 ml zdejonizowanej wody. Podzielić na 100 µL podzielić na aliquoty i przechowywać w temperaturze -20 °C.
  5. Przygotuj stok 10 mM DTT, rozpuszczając 0,015 g DTT w 1 ml wody dejonizowanej. Podziel na 100 µL podzielić na aalikwoty i przechowywać w temperaturze -20 °C.
  6. Przygotować 10 mM roztwór zapasu Mg-ATP, suspendując 0,05 g ATP dwusodowego w 1 ml 10 mM roztworu MgCl2.2Podzielić na 100 µL rozdzielić na alikwoty i przechowywać w temperaturze -20 °C.
  7. Przygotować 10 mM roztwór Mg-AMP-PNP, zawieszając 0,05 g AMP-PNP w 1 ml 10 mM roztworu MgCl2.2następnie podzielić na 100 µL podzielić na alikwoty i przechowywać w temperaturze -20 °C.
  8. Przygotuj 10 mM roztwór Trolox, dodając 25,03 mg Trolox do 1 ml metanolu, a następnie przechowuj w temperaturze -20 °C.
  9. Przygotować roztwór streptawidyny o stężeniu 10 mg/ml, dodając 1 mg streptawidyny do 100 µL pożywki BRB80, a następnie podzielić na 2 µL podzielić na alykwoyty i przechowywać w temperaturze -80°C °C.
  10. Przygotować BRB90CAT poprzez wymieszanie 200 µL z 5x BRB80, 20 µL roztworu kazeiny, 10 µL roztworu MgATP, 10 µL Trolox, 5 µL roztworu paklitakselu i 765 µL wody destylowanej. Przechowywać w 4 °C.
  11. Przygotować roztwór do badania ruchliwości, mieszając 192 µL z BRB80CAT, 2 µL roztworu D-glukozy, 2 µL roztworu oksydazy glukozowej, 2 µL roztworu DTT oraz 2 µL roztworu katalazy. Przechowywać w 4 °C.
  12. Przygotuj 1 µM roztwór kinezyny poprzez rozcieńczenie roztworu zapasu kinezyny w buforze BRB80CAT (np. 2 µL 50 mM roztworu kinezyny w 98 µL z BRB80CAT) i przechowywać w 4 °C.  
  13. Przygotuj 10 µg/mL roztwór mikrotubul poprzez rozcieńczanie 10 µL stabilizowanych mikrotubul w 90 µL w temperaturze pokojowej BRB80CAT. Przechowywać w temperaturze pokojowej.
  14. Przygotuj 10 µg/mL roztwór streptawidyny poprzez dodanie 0.1 µL roztworu streptawidyny o stężeniu 10 mg/ml w 99.9 µL roztworu do badania ruchomości. Przechowywać w 4 °C.
  15. Przygotować 12-krotny roztwór GUV poprzez rozcieńczenie 5 µL stoku GUV do 55 µL roztworu do badania ruchomości. Przechowywać w 4 °C.
  16. Polimeryzacja tubuliny w mikrotubule
    1. Pobrać wcześniej przygotowaną 2 µL alikwot tubuliny z -80 °C zamrażarkę (przygotowaną w kroku 1.5) i umieścić w 37 °C kąpiel wodna przez 30 min.
    2. Przygotować 2 mM roztwór paklitakselu, dodając 1,71 mg paklitakselu do 1 ml bezwodnego DMSO, a następnie podzielić na 10 µL alikwoty i przechowywać w temperaturze -20 °C.
    3. Przygotuj świeżą porcję buforu BRB80T poprzez zmieszanie 99.5 µL 1x BRB80 z 0.5 µL 2 mM paklitakselu. Podgrzać 100 µL z BRB80T do 37 °C w kąpieli wodnej.
    4. Po 30 min dodać 100 µL buforu BRB80T do porcji tubuliny w celu stabilizacji mikrotubul. Przechowywać w temperaturze pokojowej.

4. Analiza ruchu ślizgowego (GMA)

  1. Przygotować komorę przepływową, naklejając dwa paski dwustronnej taśmy przedzielone odstępem 5 mm na szkiełko przedmiotowe. Powtarzać ten proces, aż każdy pasek będzie składał się z trzech warstw taśmy.
  2. Położyć szkiełko nakrywkę na taśmie, a następnie delikatnie docisnąć miejsce styku szkiełka nakrywek z taśmą za pomocą pęsety lub długopisu, aby zapewnić odpowiednią adhezję.
    UWAGA: Kanał powinien mieć wymiary: 5 mm szerokości, 25 mm długości i 30 mm wysokości.
  3. Nanieść pipetą 30 µL roztworu kinezyny o stężeniu 1 mm (przygotowanego w kroku 3.12) do komory przepływowej i inkubować przez 5 min.
    UWAGA: Kazeina tworzy dwuwarstwę na powierzchni szkiełka nakrywki/szkiełka przedmiotowego, co ułatwia przytwierdzenie ogona kinezyny do powierzchni.
  4. Nanieść pipetą 30 µL roztworu mikrotubul o stężeniu 10 µg/mL (przygotowanego w kroku 3.13) do komory przepływowej, używając chusteczki laboratoryjnej delikatnie dociskanej do przeciwległego końca kanału przepływowego, aby ułatwić wymianę roztworu. Inkubować przez 5 min.
  5. Przemyć komorę przepływową 1x–3x 1x roztworem do badania motylości w temperaturze pokojowej (przygotowanym w kroku 3.1).  
    UWAGA: Na tym etapie można zastosować mikroskopię fluorescencyjną z obiektywem powietrznym 40x, aby potwierdzić przytwierdzenie i motylość mikrotubul. Mikrotubule widoczne są jako fluorescencyjne filamenty (o długości dziesiątek mikronów) przemieszczające się (ślizgające się) po powierzchni z prędkością ~0.5 μm/s (Rycina 1).
  6. Nanieść pipetą 30 µL roztworu streptawidyny o stężeniu 10 µg/mL (przygotowanego w kroku 3.14) do komory przepływowej, używając chusteczki laboratoryjnej delikatnie dociskanej do przeciwległego końca kanału przepływowego, aby ułatwić wymianę roztworu. Inkubować przez 10 min.
  7. Wprowadzić do przepływu 30 µL 12x roztworu GUV (przygotowanego w kroku 3.15), używając chusteczki laboratoryjnej delikatnie dociskanej do przeciwległego końca kanału przepływowego, aby ułatwić wymianę roztworu. Inkubować przez 30 min.
  8. Dodać 2 µL roztworu AMP-PNP o stężeniu 10 mM (przygotowanego w kroku 3.7), aby zatrzymać motylość, a następnie uszczelnić komorę uszczelniaczem.

5. Charakterystyka sieci LNT

  1. Przenieś komorę przepływową pod mikroskop odwrócony w celu wykonania obrazowania.
  2. Wybierz odpowiedni zestaw filtrów w zależności od długości fal fluorescencyjnych zastosowanych lipidów lub tubuliny. Na przykład, przy użyciu lipidów znakowanych Texas Red, zastosuj filtr wzbudzenia 560 nm/25 nm oraz filtr emisji 607 nm/36 nm.
  3. Użyj obiektywu immersyjnego 10x, aby ustawić ostrość na powierzchni szkiełka nakrywowego.
  4. Wykonaj obrazowanie sieci LNT za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.
    UWAGA: LNT to struktury liniowe wyprowadzane z większych pęcherzyków. LNT są znacznie mniejsze niż GUV i wykazują słabsze sygnały fluorescencji. Dlatego, aby obrazować LNT, należy odpowiednio dostosować czas ekspozycji i kontrast. Regulacje te prowadzą również do prześwietlenia GUV, dlatego zaleca się, aby lamellarność i separację faz w GUV charakteryzować niezależnie.
  5. Ustaw ostrość mikroskopu na interesującą sieć i wykonaj standardowy obraz lub obraz mozaikowy (tiled image).
  6. Dostosuj czas ekspozycji i neutralne filtry gęstości, aby obrazować LNT i zminimalizować nasycenie ekspozycji GUV. Pozyskaj obrazy zarówno w kanale czerwonym, jak i zielonym.
    UWAGA: W tym przypadku kanał czerwony umożliwia wizualizację lipidów Texas-Red, natomiast kanał zielony umożliwia wizualizację mikrotubul (np. lipidów Oregon Green i barwników HiLyte48).
  7. Stwórz obraz kompozytowy poprzez nałożenie na siebie kanałów czerwonego i zielonego (Rysunek 1).
  8. Charakteryzacja sieci LNT poprzez pomiar długości LNT
    1. Otwórz pozyskane obrazy w programie do analizy obrazu, takim jak ImageJ.
    2. Skalibruj skalę mikroskopu, korzystając z funkcji set scale, wprowadź współczynnik konwersji pikseli na mm i kliknij OK.
      UWAGA: Współczynnik konwersji zależy od mikroskopu, obiektywu i kamery; można go wyznaczyć za pomocą płytki kalibracyjnej do mikroskopu. Jest on zazwyczaj wyrażony w pikselach/mm.
    3. Użyj narzędzia Multipoint line tool, aby zmierzyć długość nanorurek, zaczynając od macierzystego GUV. Naciśnij Ctrl +M, aby zmierzyć długość.
    4. Kontynuuj pomiar długości poszczególnych rurek, postępując zgodnie z powyższymi krokami. Narzędzie do przetwarzania obrazu zapisze każdy nowy pomiar w oknie wyników.
    5. Naciśnij Ctrl + D po narysowaniu każdej linii, aby śledzić, które rurki zostały już zmierzone.
  9. Pomiar grubości LNT (Rysunek 2)
    1. Otwórz obraz w programie ImageJ i wybierz funkcję Threshold w zakładce Image .
    2. Kliknij Apply, aby zastosować próg.
    3. Narysuj prostokąt o znanej długości nad wybraną rurką (piksele czarne mają wartość 0, a piksele czerwone wartość 255).
    4. Zmierz zintegrowaną gęstość obszaru.
    5. Podziel gęstość przez długość (w pikselach) LNT, aby uzyskać grubość (w pikselach).
      UWAGA: Pomiary grubości można porównywać między obrazami tylko wtedy, gdy ustawienia obrazowania i próg są ustawione identycznie.
  10. Wyznaczanie rozdziału lipidów w węzłach LNT (Rysunek 3)
    1. Otwórz obraz w programie ImageJ.
    2. Użyj narzędzia Line , aby narysować linię nad wybranym węzłem.
    3. Zmierz intensywność węzła w kanałach Oregon Green i Texas Red.
    4. Przesuń linię na LNT i zmierz intensywność LNT w kanałach Oregon Green i Texas Red.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Sieci LNT (Rysunek 4) wykonano zgodnie z opisanym protokołem, który wykorzystuje pracę generowaną przez transport mikrotubul za pomocą kinezyny do wyciskania LNT z GUV. W skrócie, GUV przygotowano metodą rehydratacji żelu agarozowego przy użyciu roztworu sacharozy, a mikrotubule spolimeryzowano w roztworze GPEM i ustabilizowano w BRB80T. Następnie do komory przepływowej wprowadzono motory kinezynowe, tworząc aktywną warstwę motorów na powierzchni szkiełka podstawowego. Po wprowadzeniu mikrot...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Sieci LNT są użytecznym narzędziem do badań in vitro właściwości błon i transportu biomolekuł, takich jak białka transbłonowe. Co więcej, wykorzystanie złożonych preparatów lipidowych do wytwarzania sieci LNT umożliwia prowadzenie bardziej istotnych biologicznie badań. W innych badaniach produkcyjnych wykorzystano albo 1) proste preparaty lipidowe i pęcherzyki wielopłytkowe, albo 2) bardziej kłopotliwe techniki ruchliwości do wytworzenia sieci z GUV składających się ze złożonych preparatów lipidowych. Opisana tutaj metod...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Sandia National Laboratories to wielozadaniowe laboratorium zarządzane i obsługiwane przez National Technology & Engineering Solutions of Sandia, LLC., spółkę zależną należącą w całości do Honeywell International, Inc., dla amerykańskiej Narodowej Administracji Bezpieczeństwa Jądrowego Departamentu Energii (DOE) na podstawie umowy DE-NA-0003525. W artykule opisano obiektywne wyniki techniczne i analizę. Wszelkie subiektywne poglądy lub opinie, które mogą zostać wyrażone w artykule, niekoniecznie reprezentują poglądy Departamentu Energii Stanów Zjednoczonych lub rządu Stanów Zjednoczonych.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Departament Energii Stanów Zjednoczonych, Biuro Podstawowych Nauk Energetycznych, Wydział Nauk Materiałowych i Inżynierii (BES-MSE). Syntezę kinezyny i mikroskopię fluorescencyjną przeprowadzono w ramach projektu użytkownika (ZIM) w Center for Integrated Nanotechnologies, Office of Science User Facility działającym dla Biura Nauki Departamentu Energii Stanów Zjednoczonych (DOE).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
100x/1.4 Obiektyw immersyjny z aperturą numerycznąOlympus1-U2B836Olympus UPlanSApo 100x/1.40 Obiektyw olejowy z korektą nieskończoności, gwint RMS
Odległość robocza 0,12 mm
Filtr 3,0 NDOlympusFiltr o neutralnej gęstości
AMP-PNPSigma-AldrichA2647(β,γ-imidoadenozyna 5′-trifosforan)
ATPSigma-AldrichA7699Hydrat soli disodowej adenozyno-5'-trifosforanu Zestaw filtrów BioXtra
Brightline Pinkel DA/FI/TR/Cy5/Cy7-5X-A000SemrockLED-DA/FI/TR/Cy5/Cy7-5X-A-000
Zestaw filtrów BrightLine Pinkel, zoptymalizowany pod kątem DAPI, FITC, TRITC, Cy5 i Cy7 i inne podobne fluorofory, oświetlone źródłami światła na bazie diod LED
KazeinaSigma-Aldrich22090Hydrolizat kazeiny do mikrobiologii
KatalazaSigma-AldrichC9322Katalaza z wątroby bydlęcej
ChloroformSigma-Aldrich288306Chloroform bezwodny zawiera 0,5-1,0% etanolu jako stabilizator
CholesterolAvanti700000Pcholesterol (wełna owcza, >98%) (proszek)
D-GlukozaSigma-AldrichG7021D-(+)-Glukoza w proszku, BioReagent, odpowiedni do hodowli komórek, odpowiedni do hodowli komórek owadów, odpowiedni do hodowli komórek roślinnych, ≥ 99,5%
DOPCAvanti850375C1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfocholina (w chloroformie)
DOPE-BiotynaAvanti870282C1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamina-N-(biotynyl) (sól sodowa)
DPPCAvanti850355P1,2-dipalmitoilo-sn-glicero-3-fosfocholina (proszek)
DPPE-BiotynaAvanti870285P1,2-dipalmitoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamino-N-(biotynyl) (sól sodowa)
DTTSigma-Aldrich43816Roztwór DL-ditiotreitolu 1 M
EGTASigma-AldrichE4378EGTA, Kwas egtazynowy, Kwas etyleno-bis(oksyetylenonitrolo)tetraoctowy, Eter glikolowy, kwas diaminotetraoctowy,
Oksydaza glukozowaSigma-AldrichG6125Oksydaza glukozowa z Aspergillus niger
typu II, ≥ 10 000 jednostek/g substancji stałych (bez dodatku tlenu)
GlicerolFisherG33Glicerol (certyfikowany ACS), Fisher Chemical
GTPSigma-AldrichG8877Hydrat soli sodowej 5′-trifosforanu guanozyny
IX-81 Mikroskop OlympusOlympus N/AIX81 Mikroskop odwrócony firmy Olympus
KOHSigma-Aldrich1050121000Potas Wodorotlenek
chlorku magnezuSigma-AldrichM10281,00 M roztwór chlorku magnezu
Orca Flash 4.0 Aparat cyfrowyHamamatsuC13440-20CUORCA-Flash 4.0 V3 Cyfrowa kamera CMOS
Oregon Green-DHPEInvitrogenO12650Oregon Green 488 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine
PaklitakselThermoFisherP3456Paklitaksel (odpowiednik Taxolu) - wyłącznie do użytku naukowego
RURYSigma-AldrichP6757Kwas 1,4-piperazynodietaniosulfonowy, Piperazyna-1,4-bis(kwas 2-etanosulfonowy), Piperazyna-N,N′-bis(kwas 2-etanosulfonowy)
Texas Red-DHPEInvitrogenT1395MPTexas Red 1,2-dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine,
Trolox soli trietyloamonowej
Sigma-Aldrich238813(±)-Kwas 6-hydroksy-2,5,7,8-tetrametylochromano-2-karboksylowy
Tubulina,cytoszkieletT333PBiałko tubuliny (biotyna) mózg świni
Tubulina, Hy-Lite 488CytoszkieletTL488MBiałko tubuliny (fluorescencyjne HiLyte 488) mózg świni
Tubulina, nieznakowanycytoszkieletT240Białko tubuliny mózg świni
biotyny

Bibliografia

  1. Bouxsein, N. F., Carroll-Portillo, A., Bachand, M., Sasaki, D. Y., Bachand, G. D. A continuous network of lipid nanotubes fabricated from the gliding motility of kinesin powered microtubule filaments. Langmuir. 29 (9), 2992-2999 (2013).
  2. Paxton, W. F., Bouxsein, N. F., Henderson, I. M., Gomez, A., Bachand, G. D. Dynamic assembly of polymer nanotube networks via kinesin powered microtubule filaments. Nanoscale. 7 (25), 10998-11004 (2015).
  3. Leduc, C., et al. Cooperative extraction of membrane nanotubes by molecular motors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (49), 17096-17101 (2004).
  4. Lippincott-Schwartz, J., Roberts, T. H., Hirschberg, K. Secretory protein trafficking and organelle dynamics in living cells. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 16, 557-589 (2000).
  5. Belting, M., Wittrup, A. Nanotubes, exosomes, and nucleic acid-binding peptides provide novel mechanisms of intercellular communication in eukaryotic cells: implications in health and disease. Journal of Cell Biology. 183 (7), 1187-1191 (2008).
  6. Rustom, A., Saffrich, R., Markovic, I., Walther, P., Gerdes, H. H. Nanotubular highways for intercellular organelle transport. Science. 303 (5660), 1007-1010 (2004).
  7. Onfelt, B., Nedvetzki, S., Yanagi, K., Davis, D. M. Cutting edge: Membrane nanotubes connect immune cells. Journal of Immunology. 173 (3), 1511-1513 (2004).
  8. Sciaky, N., et al. Golgi tubule traffic and the effects of brefeldin A visualized in living cells. J Cell Biol. 139 (5), 1137-1155 (1997).
  9. Sprong, H., van der Sluijs, P., van Meer, G. How proteins move lipids and lipids move proteins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2 (7), 504-513 (2001).
  10. Keenan, T. W., Morre, D. J. Phospholipid class and fatty acid composition of golgi apparatus isolated from rat liver and comparison with other cell fractions. Biochemistry. 9 (1), 19-25 (1970).
  11. Imam, Z. I., Bachand, G. D. Multicomponent and Multiphase Lipid Nanotubes Formed by Gliding Microtubule-Kinesin Motility and Phase-Separated Giant Unilamellar Vesicles. Langmuir. 35 (49), 16281-16289 (2019).
  12. Wesolowska, O., Michalak, K., Maniewska, J., Hendrich, A. B. Giant unilamellar vesicles - a perfect tool to visualize phase separation and lipid rafts in model systems. Acta Biochimica Polonica. 56 (1), 33-39 (2009).
  13. Momin, N., et al. Designing lipids for selective partitioning into liquid ordered membrane domains. Soft Matter. 11 (16), 3241-3250 (2015).
  14. Fygenson, D. K., Braun, E., Libchaber, A. Phase diagram of microtubules. Physical Review E. 50, 1579(1994).
  15. Greene, A. C., Sasaki, D. Y., Bachand, G. D. Forming Giant-sized Polymersomes Using Gel-assisted Rehydration. Journal of Visualized Experiments. (111), (2016).
  16. Bachand, M., et al. Directed self-assembly of 1D microtubule nano-arrays. Royal Society of Chemistry Advances. 4 (97), 54641-54649 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Test ruchliwości ślizgowejgigantyczne pęcherzyki jednowarstwoweruchliwość napędzana kinezynąbiofizyka lipidówruchliwość mikrotubulseparacja fazanaliza w programie ImageJrozdział lipidówtransport błonowy
Wytwarzanie wieloskładnikowych sieci nanorurek lipidowych przy użyciu testu ruchliwości kinezyny ślizgowej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.