Wytwarzanie wieloskładnikowych sieci nanorurek lipidowych przy użyciu testu ruchliwości kinezyny ślizgowej

Podsumowanie

Ten protokół opisuje proces wytwarzania sieci nanorurek lipidowych za pomocą ślizgającej się ruchliwości kinezyny w połączeniu z gigantycznymi jednopłytkowymi pęcherzykami lipidowymi.

Streszczenie

Sieci nanorurek lipidowych (LNT) reprezentują system modelowy in vitro do badania transportu molekularnego i biofizyki lipidów z uwzględnieniem wszechobecnych kanalików lipidowych znajdujących się w komórkach eukariotycznych. Jednak LNT in vivo są wysoce nierównowagowymi strukturami, które wymagają energii chemicznej i silników molekularnych do montażu, konserwacji i reorganizacji. Ponadto skład LNT in vivo jest złożony i składa się z wielu różnych gatunków lipidów. Typowe metody wytłaczania LNT są zarówno czasochłonne, jak i pracochłonne, a do wymuszonego wyciągania nanorurek z gigantycznych pęcherzyków lipidowych potrzebne są pęsety optyczne, mikrogranulki i mikropipety. Przedstawiono tutaj protokół testu ruchliwości ślizgowej (GMA), w którym wielkoskalowe sieci LNT są szybko generowane z gigantycznych pęcherzyków jednowarstwowych (GUV) przy użyciu ruchliwości mikrotubul zasilanych kinezyną. Korzystając z tej metody, sieci LNT są tworzone z szerokiej gamy preparatów lipidowych, które naśladują złożoność biologicznych LNT, co czyni je coraz bardziej przydatnymi w badaniach in vitro biofizyki lipidów i transportu związanego z błoną. Dodatkowo metoda ta jest w stanie niezawodnie wytworzyć sieci LNT w krótkim czasie (<30 min) przy użyciu powszechnie stosowanego sprzętu laboratoryjnego. Cechy sieci LNT, takie jak długość, szerokość i partycjonowanie lipidów, są również regulowane poprzez zmianę składu lipidowego GUV używanych do wytwarzania sieci.

Wprowadzenie

Wytwarzanie sieci z nanorurek lipidowych (LNT) cieszy się coraz większym zainteresowaniem w badaniach in vitro nierównowagowych struktur lipidowych^1,2,3. Komórki wykorzystują kanaliki lipidowe do dyfuzyjnego transportu białek⁴ i kwasów nukleinowych⁵, a także komunikacji między komórkami6^,7. Retikulum endoplazmatyczne i aparat Golgiego są szczególnie interesujące, ponieważ te organelle związane z błoną są głównymi miejscami syntezy lipidów i białek, a także transportu tych integralnych biomolekuł w cytoplazmie komórki^8,9. Błony tych organelli składają się z wielu gatunków lipidów, w tym sfingolipidów, cholesterolu i fosfolipidów¹⁰, które ostatecznie pomagają zdefiniować ich funkcjonalność. Tak więc, aby dokładniej replikować i badać te organelle, LNT in vitro muszą być wytwarzane z pęcherzyków o coraz bardziej złożonych preparatach lipidowych¹¹.

Gigantyczne pęcherzyki jednowarstwowe (GUV) są powszechnie używane do badania zachowania błon lipidowych, ponieważ mogą być niezawodnie syntetyzowane ze złożonymi preparatami, które zawierają cholesterol, fosfatydylocholinę (PC), fosfatydyloetanoloaminę (PE), fosfatydyloserynę (PS) i fosfatydyloinozytol (PI)^12,13. Opisano tutaj metodę wytwarzania LNT z GUV o różnych formulacjach lipidowych przy użyciu testu ruchliwości ślizgowej (GMA), w którym LNT są wytłaczane w oparciu o pracę wykonaną przez silniki kinezynowe i włókna mikrotubul działające na GUV. W tym systemie białka motoryczne kinezyny zaadsorbowane na powierzchni napędzają biotynylowane mikrotubule, przekształcając energię chemiczną z hydrolizy ATP w użyteczną pracę (w szczególności ekstruzję LNT z biotynylowanych pęcherzyków)¹¹. Powstała w ten sposób sieć LNT stanowi platformę modelową do badania wpływu różnic w fazach lipidowych na zmiany morfologii LNT.

Krótko mówiąc, białka motoryczne kinezyny są wprowadzane do komory przepływowej w roztworze zawierającym kazeinę, co umożliwia adsorpcję silników na szklanej powierzchni komory. Następnie biotynylowane mikrotubule w roztworze zawierającym ATP przepływają przez komorę i mogą związać się z silnikami kinezynowymi i rozpocząć ruchliwość. Następnie do komory wprowadza się roztwór streptawidyny i pozostawia do niekowalencyjnego związania się z mikrotubulami. Na koniec GUV zawierające biotynylowany lipid są wprowadzane do komory i wiążą się z mikrotubulami pokrytymi streptawidyną, a następnie wytłaczają LNT, tworząc sieci na dużą skalę w ciągu 15–30 minut. Ta metoda tworzy duże, rozgałęzione sieci LNT przy użyciu standardowego sprzętu laboratoryjnego i odczynników przy niskich kosztach¹¹.

Protokół

1. Przygotowanie podstawowych roztworów mikrotubul

UWAGA: Okulary ochronne, rękawice i fartuch laboratoryjny powinny być zawsze noszone przez cały czas trwania protokołu.

1. Przygotować 5x bufor BRB80: dodać 24,19 g PIPEZ (piperazyno-N,N′-bis[kwas 2-etanosulfonowy]) i 0,38 g EGTA (glikol-etylen-bis[β-aminoetylowy eter]-N,N,N′,N′-tetraoctowy) do szklanej butelki o pojemności 1 l. Dodać 1 ml 1 M MgCl₂ i dostosować pH do 6,9 za pomocą KOH. Dodaj wodę dejonizowaną, aby doprowadzić roztwór do końcowej objętości 500 ml.
2. Przygotować 100 mM zapasu roztworu GTP: zważyć 52 mg GTP i zawiesić w 1 ml wody destylowanej. Podzielić 100 mM roztwór na 20 μl porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C.
3. Przygotuj roztwór GPEM: wymieszaj 200 μl 5x BRB80, 10 μl 100 mM roztworu GTP, 100 μl 100% glicerolu i 600 μl wody dejonizowanej. Podzielić roztwór GPEM na 100 μl porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C.
4. Przygotować roztwór mikrotubul, odtwarzając fiolki z dostępną w handlu, liofilizowaną tubuliną (po jednej fiolce biotynylowanej, znakowanej fluorescencyjnie i nieznakowanej) w zimnym (4 °C) roztworze GPEM do stężenia podstawowego 5 mg/ml.
5. Przeprowadzić polimeryzację mikrotubul, mieszając 4 μl tubuliny biotynylowanej, 4 μl tubuliny znakowanej fluorescencyjnie i 24 μl tubuliny nieznakowanej (wszystkie w stężeniach 5 mg/ml), aby uzyskać stosunek 1:1:6 przy końcowej objętości 32 ml. Trzymaj go na lodzie. Podzielić mieszaninę tubuliny na 2 μl porcji i przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu, gdy będzie potrzebna.
   UWAGA: Wydajna polimeryzacja wymaga, aby stężenie tubuliny było równe lub wyższe od stężenia krytycznego (5 mg/mL)¹⁴. W tym przypadku wybór stosunku tubuliny jest zoptymalizowany pod kątem wystarczającego stężenia biotynylowanej tubuliny, aby skutecznie wiązać streptawidynę i GUV, a także wystarczającego stężenia tubuliny fluorescencyjnej do charakterystyki mikroskopowej.

2. Przygotowanie gigantycznych pęcherzyków jednowarstwowych (GUV)

1. Preparat filmu agarozowego
   UWAGA: Ten protokół jest zaadaptowany z Greene et al.¹⁵.
   1. Przygotować 1% roztwór w/v, mieszając 1 g agarozy w 100 ml wody dejonizowanej w 250 ml kolby Erlenmeyera. Użyj standardowej kuchenki mikrofalowej, aby podgrzać roztwór agarozy przez 1–2 minuty
      UWAGA: Roztwór stanie się przezroczysty po całkowitym rozpuszczeniu agarozy. Przed użyciem pozostawić roztwór do ostygnięcia do temperatury 65–75 °C.
   2. Za pomocą wyciętej końcówki pipety o pojemności 1 000 μl odpipetuj 300–400 μl roztworu agarozy na szklane szkiełko nakrywkowe o wymiarach 25 mm x 25 mm. Przytrzymując krawędź szkiełka nakrywkowego palcami w rękawiczkach, użyj kolejnej końcówki pipety o pojemności 1 000 μl, aby równomiernie rozprowadzić stopioną agarozę na szkiełku nakrywkowym.
      UWAGA: Utrzymanie agarozy w temperaturze 65–75 °C pozwoli na efektywne rozprowadzenie na powierzchni szkiełka nakrywkowego.
   3. Szkiełka nakrywkowe pokryte agarozą suszyć w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez co najmniej 2 godziny, po czym agaroza stanie się przezroczysta. Szkiełka nakrywkowe należy przechowywać, umieszczając powierzchnię pokrytą agarozą skierowaną do góry na czystej powierzchni, takiej jak niestrzępiący się papier lub folia na bazie wosku, w temperaturze pokojowej (RT).
2. Preparat lipidowy
   1. Pobrać lipidy rozpuszczone w chloroformie z zamrażarki o temperaturze -20 °C i umieścić je w dygestorii chemicznej, aż osiągną temperaturę cieplną.
   2. Obliczyć objętość zapasu lipidów każdego składnika lipidowego potrzebnego do formulacji, stosując następujący wzór:
      
      gdzie: V_lipid jest objętością lipidu do wykorzystania, mol % jest procentem molowym składnika lipidowego, n jest całkowitą liczbą moli lipidu użytego w postaci użytkowej, a M jest stężeniem lipidu w jednostkach molowych.
      UWAGA: Na przykład, w przypadku stosowania preparatu zawierającego 45% mol. 1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfocholiny (DOPC) o stężeniu roztworu podstawowego 12,72 mM i 1 mikromolu całkowitej zawartości lipidów w preparacie, objętość materiału wyjściowego DOPC użytego w postaci użytkowej wynosi:
      
   3. Wymieszać lipidy ze sobą w obliczonym stosunku w szklanej fiolce w dygestorium chemicznym.
   4. Pobrać pipetą 30 μl roztworu lipidów na szkiełka nakrywkowe pokryte agarozą na wstępnie podgrzanej płycie grzejnej, która jest ustawiona powyżej temperatury topnienia nasyconego składnika lipidowego preparatu (np. płyta grzejna o temperaturze 50 °C dla lipidu o T_m 40 °C).
   5. Rozprowadzić roztwór na błonie agarozy okrężnymi ruchami, używając dłuższej krawędzi igły o sile 18 G, aż chloroform odparuje i utworzy się jednolita warstwa lipidu. Wykonując tę czynność, przytrzymaj krawędź szkiełka nakrywkowego palcami w rękawiczkach.
      UWAGA: Należy uważać, aby nie uszkodzić warstwy agarozy za pomocą igły.
   6. Umieścić szkiełko nakrywkowe z warstwą agarozy i filmem lipidowym na pokrytej folią aluminiową szalce Petriego, stroną z folią skierowaną do góry, a następnie umieścić szalkę Petriego w eksykatorze próżniowym na co najmniej 2 godziny w celu usunięcia pozostałości rozpuszczalnika.
3. W międzyczasie przygotuj 560 mM roztwór sacharozy, mieszając 1,92 g sacharozy z 10 ml wody dejonizowanej.
   UWAGA: Stężenie roztworu sacharozy zależy od osmolarności buforu, w którym rozcieńczane są GUV. Zazwyczaj osmolarność roztworu sacharozy nie powinna być większa niż 10% niż bufor, w którym GUV zostaną rozcieńczone, w szczególności bufor ruchliwości (patrz krok 3.11).
4. Formacja GUV
   1. Przyklej komorę adhezyjną do szkiełka nakrywkowego pokrytego folią lipidową, delikatnie dociskając komorę kleju do szkiełka nakrywkowego pokrytego lipidami, tak aby film lipidowy był skierowany do góry, zapewniając szczelne uszczelnienie.
   2. Dodać 400 μl 560 mM roztworu sacharozy (przygotowanego w kroku 2.3) do komory.
   3. Umieść szkiełko nakrywkowe w komorze wilgotnościowej i zamknij pokrywę.
   4. Umieść komorę wilgotnościową na rozgrzanej płycie grzejnej ustawionej powyżej temperatury topnienia nasyconego składnika lipidowego preparatu.
   5. Pozostawić pęcherzyki do wytworzenia się przez ≥1 godzinę przed wyzdrowieniem.
      UWAGA: Tworzenie się pęcherzyków można sprawdzić za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z soczewką obiektywu powietrznego 40x.

3. Przygotowanie zapasów i odczynników do oznaczania ruchliwości

1. Przygotowanie wywaru kazeiny
   1. Dodaj 3 g suchej kazeiny do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml, a następnie dodaj 30 ml 1x BRB80 i obracaj, aż roztwór stanie się lepki. Odwirować probówkę o sile 15 000 x g przez 30 minut.
   2. Przenieść supernatant do innej stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i wyrzucić osad. Przefiltrować roztwór przez filtr strzykawkowy 1 μm, zbierając roztwór do stożkowej fiolki o pojemności 50 ml. Przefiltrować roztwór przez filtr 0,2 μm, zbierając roztwór do stożkowej fiolki o pojemności 50 ml.
   3. Oznaczyć stężenie białka, mierząc absorbancję przy 280 nm za pomocą spektrofotometru UV-Vis i kuwety kwarcowej.
   4. Obliczyć stężenie kazeiny w mg/ml, korzystając z następującego wzoru:
      
   5. Rozcieńczyć roztwór do 20 mg/ml w 1x BRB80, podzielić na 100 μl porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C.
2. Przygotować roztwór podstawowy oksydazy glukozowej (2 mg/ml), mieszając 2 mg oksydazy glukozowej z 1 ml 1x BRB80. Podzielić na 100 μl porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C.
3. Przygotować roztwór podstawowy katalazy (0,8 mg/ml), mieszając 0,8 mg katalazy z 1 ml 1x BRB80. Podzielić na 100 μl porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C.
4. Przygotować 2 M roztwór glukozy, zawieszając 0,3 g D-glukozy w 1 ml wody dejonizowanej. Podzielić na 100 μl porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C.
5. Przygotuj 100 mM zapasu DTT, zawieszając 0,015 g DTT w 1 ml wody dejonizowanej. Podzielić na 100 μl porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C.
6. Przygotować 100 mM Mg-ATP, zawieszając 0,055 g disodowego ATP w 1 ml roztworu 100 mM MgCl₂. Podzielić na 100 μl porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C.
7. Przygotować 100 mM roztwór Mg-AMP-PNP, zawieszając 0,055 g AMP-PNP w 1 ml roztworze 100 mM MgCl₂, następnie podzielić na 100 μl podwielokrotności i przechowywać w temperaturze -20 °C.
8. Przygotować 100 mM roztwór leku Trolox przez dodanie 25,03 mg leku Trolox do 1 ml metanolu i przechowywać w temperaturze -20 °C.
9. Przygotować 10 mg/ml roztworu streptawidyny, dodając 1 mg streptawidyny do 100 μl BRB80, następnie podzielić na 2 μl porcji i przechowywać w temperaturze -80 °C.
10. Przygotuj BRB90CAT, mieszając 200 μl 5x BRB80, 20 μl roztworu kazeiny, 10 μl roztworu MgATP, 10 μl Troloxu, 5 μl roztworu paklitakselu i 765 μl wody DI. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
11. Przygotować roztwór ruchliwości, mieszając 192 μl BRB80CAT, 2 μl roztworu D-glukozy, 2 μl roztworu oksydazy glukozowej, 2 μl roztworu DTT i 2 μl roztworu katalazy. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
12. Przygotować roztwór kinezyny o stężeniu 1 μM, rozcieńczając podstawowy roztwór kinezyny w BRB80CAT (np. 2 μl 50 mM roztworu kinezyny w 98 μl BRB80CAT) i przechowywać w temperaturze 4 °C.
13. Przygotować roztwór mikrotubul o stężeniu 10 μg/ml, rozcieńczając 10 μl ustabilizowanych mikrotubul w 90 μl BRB80CAT o temperaturze pokojowej. Sklep w RT.
14. Przygotować roztwór streptawidyny o stężeniu 10 μg/ml, dodając 0,1 μl roztworu streptawidyny o stężeniu 10 mg/ml w 99,9 μl roztworu o ruchliwości. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
15. Przygotuj 12-krotny roztwór GUV, rozcieńczając 5 μl bulionu GUV w 55 μl roztworu o ruchliwości. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
16. Polimeryzacja tubuliny do mikrotubul
    1. Pobrać wcześniej przygotowaną porcję tubuliny o pojemności 2 μl z zamrażarki w temperaturze -80 °C (przygotowanej w kroku 1.5) i umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 30 minut.
    2. Przygotować 2 mM roztwór paklitakselu, dodając 1,71 mg paklitakselu do 1 ml bezwodnego DMSO, podzielić na 10 μl podwielokrotności i przechowywać w temperaturze -20 °C.
    3. Świeżo przygotuj BRB80T, mieszając 99,5 μl 1x BRB80 z 0,5 μl 2 mM paklitakselu. Podgrzej 100 μL BRB80T do 37 °C w łaźni wodnej.
    4. Po 30 minutach dodać 100 μl BRB80T do podwielokrotności tubuliny w celu ustabilizowania mikrotubul. Sklep w RT.

4. Test ruchliwości ślizgu (GMA)

1. Przygotować komorę przepływową, umieszczając na szkiełku dwa paski taśmy dwustronnej oddalone od siebie o 5 mm. Powtarzaj ten proces, aż trzy warstwy taśmy obejmą każdy pasek.
2. Umieść szkiełko nakrywkowe na wierzchu taśmy, a następnie delikatnie dociśnij interfejs szkiełka nakrywkowego/taśmy pęsetą lub pisakiem, aby zapewnić wystarczającą przyczepność.
   UWAGA: Kanał powinien mieć 5 mm szerokości i 25 mm długości i 300 mm wysokości.
3. Pobrać pipetą 30 μl 1 mm roztworu kinezyny (przygotowanego w kroku 3.12) do komory przepływowej i pozostawić do inkubacji przez 5 minut
   UWAGA: Kazeina tworzy dwuwarstwę na powierzchni szkiełka nakrywkowego/szkiełka i ułatwia przymocowanie ogona kinezyny do powierzchni.
4. Odpipetować 30 μl roztworu mikrotubul o stężeniu 10 μg/ml (przygotowanym w kroku 3.13) do celi przepływowej, używając chusteczki laboratoryjnej delikatnie dociśniętej do przeciwległego końca kanału przepływowego w celu ułatwienia wymiany roztworu. Inkubować przez 5 minut.
5. Przemyć komorę przepływową 1x–3x 1x roztworem o ruchliwości w temperaturze pokojowej (przygotowanym w kroku 3.11).
   UWAGA: W tym momencie można zastosować mikroskopię fluorescencyjną z użyciem obiektywu powietrznego 40x, aby potwierdzić przyczepienie i ruchliwość mikrotubul. Mikrotubule wyglądają jak fluorescencyjne włókna (o długości kilkudziesięciu mikronów) poruszające się (ślizgające się) po powierzchni z prędkością ~0,5 μm/s (Rysunek 1).
6. Odpipetować 30 μl roztworu streptawidyny o stężeniu 10 μg/ml (przygotowanym w kroku 3.14) do komory przepływowej za pomocą chusteczki laboratoryjnej delikatnie dociśniętej do przeciwległego końca kanału przepływowego, aby ułatwić wymianę roztworu. Inkubować przez 10 minut.
7. Przelej 30 μl 12x roztworu GUV (przygotowanego w kroku 3.15) do strumienia za pomocą chusteczki laboratoryjnej delikatnie dociśniętej do przeciwległego końca kanału przepływowego, aby ułatwić wymianę roztworu. Inkubować przez 30 minut.
8. Dodać 2 μl 100 mM AMP-PNP roztworu (przygotowanego w kroku 3.7), aby zatrzymać ruchliwość, a następnie uszczelnić komorę szczeliwem.

5. Charakterystyka sieci LNT

1. Przenieś komorę przepływową do odwróconego mikroskopu w celu obrazowania.
2. Wybierz odpowiedni zestaw filtrów w oparciu o długości fal użytych fluorescencyjnych lipidów lub tubuliny. Na przykład, używając lipidów znakowanych Texas Red, użyj filtra wzbudzenia 560 nm/25 nm i filtra emisyjnego 607 nm/36 nm.
3. Użyj obiektywu olejowego 100x, aby skupić się na powierzchni szkiełka nakrywkowego.
4. Obrazowanie sieci LNT za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.
   UWAGA: LNT są strukturami liniowymi wytłaczającymi się z większych pęcherzyków. LNT są znacznie mniejsze niż GUV i mają słabsze sygnały fluorescencyjne. W związku z tym ekspozycja i kontrast muszą być odpowiednio dostosowane do LNT obrazu. Korekty te prowadzą również do prześwietlenia GUV, dlatego zaleca się, aby lamelarność i separacja faz w GUV były charakteryzowane niezależnie.
5. Skoncentruj mikroskop na interesującej Cię sieci i wykonaj obraz standardowy lub kafelkowy.
6. Dostosuj czas ekspozycji i filtry o neutralnej gęstości, aby zobrazować LNT i zminimalizować nasyconą ekspozycję GUV. Pobieraj obrazy zarówno w kanale czerwonym, jak i zielonym.
   UWAGA: W tym przypadku kanał czerwony umożliwia wizualizację lipidów Texas-Red, podczas gdy kanał zielony umożliwia wizualizację mikrotubul (np. Lipidy Oregon Green i barwniki HiLyte488).
7. Utwórz obraz kompozytowy, nakładając na siebie kanały czerwony i zielony (Rysunek 1).
8. Charakterystyka sieci LNT poprzez pomiar długości LNT
   1. Otwórz uzyskane obrazy za pomocą oprogramowania do analizy obrazów, takiego jak ImageJ.
   2. Skalibruj skalę mikroskopu za pomocą funkcji ustawiania skali, wypełnij piksele współczynnikiem konwersji w mm i kliknij przycisk OK.
      UWAGA: Współczynnik konwersji zależy od mikroskopu, obiektywu i kamery i można go uzyskać za pomocą szkiełka kalibracyjnego mikroskopu. Zazwyczaj jest on wyrażany w pikselach/mm.
   3. Użyj narzędzia Linia wielopunktowa, aby zmierzyć długość nanorurek, zaczynając od macierzystego GUV. Przytrzymaj Ctrl + M, aby zmierzyć długość.
   4. Kontynuuj mierzenie długości poszczególnych rurek, postępując zgodnie z powyższymi krokami. Narzędzie do przetwarzania obrazu zapisze każdy nowy pomiar w oknie wyników.
   5. Przytrzymaj Ctrl + D po narysowaniu każdej linii, aby śledzić, które rury zostały zmierzone.
9. Pomiar grubości LNT (Rysunek 2)
   1. Otwórz obraz w ImageJ i wybierz funkcję Threshold (Próg) na karcie Image (Obraz).
   2. Kliknij przycisk Zastosuj, aby zastosować próg.
   3. Narysuj prostokąt o znanej długości na żądanej rurze (czarne piksele mają wartość 0, a czerwone piksele mają wartość 255).
   4. Zmierz zintegrowaną gęstość obszaru.
   5. Podziel gęstość przez długość (w pikselach) LNT, aby uzyskać grubość (w pikselach).
      UWAGA: Pomiary grubości mogą być porównywane na obrazach tylko wtedy, gdy ustawienia obrazowania i próg są ustawione identycznie.
10. Określanie partycjonowania lipidów w węzłach LNT (Rysunek 3)
    1. Otwórz obraz w ImageJ.
    2. Użyj narzędzia Linia, aby narysować linię nad żądanym węzłem.
    3. Zmierz intensywność węzłów zarówno w kanale Oregon Green, jak i Texas Red.
    4. Przesuń linię do LNT i zmierz intensywność LNT zarówno w kanale Oregon Green, jak i Texas Red.

Wyniki

sieci LNT (Rysunek 4) zostały wytworzone przy użyciu opisanego protokołu, który wykorzystuje pracę wykonaną przez transport kinezyny mikrotubul do wytłaczania LNT z GUV. Krótko mówiąc, GUV przygotowano przy użyciu rehydratacji żelu agarozowego przy użyciu roztworu sacharozy, a mikrotubule polimeryzowano w roztworze GPEM i stabilizowano w BRB80T. Następnie silniki kinezynowe zostały wprowadzone do komory przepływowej, tworząc aktywną warstwę silników na powierzchni szkiełka nakrywkowego. Nast...

Dyskusja

Sieci LNT są użytecznym narzędziem do badań in vitro właściwości błon i transportu biomolekuł, takich jak białka transbłonowe. Co więcej, wykorzystanie złożonych preparatów lipidowych do wytwarzania sieci LNT umożliwia prowadzenie bardziej istotnych biologicznie badań. W innych badaniach produkcyjnych wykorzystano albo 1) proste preparaty lipidowe i pęcherzyki wielopłytkowe, albo 2) bardziej kłopotliwe techniki ruchliwości do wytworzenia sieci z GUV składających się ze złożonych preparatów lipidowych. Opisana tutaj metod...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
100x/1.4 Obiektyw immersyjny z aperturą numeryczną	Olympus	1-U2B836	Olympus UPlanSApo 100x/1.40 Obiektyw olejowy z korektą nieskończoności, gwint RMS Odległość robocza 0,12 mm
Filtr 3,0 ND	Olympus		Filtr o neutralnej gęstości
AMP-PNP	Sigma-Aldrich	A2647	(β,γ-imidoadenozyna 5′-trifosforan)
ATP	Sigma-Aldrich	A7699	Hydrat soli disodowej adenozyno-5'-trifosforanu Zestaw filtrów BioXtra
Brightline Pinkel DA/FI/TR/Cy5/Cy7-5X-A000	Semrock	LED-DA/FI/TR/Cy5/Cy7-5X-A-000	Zestaw filtrów BrightLine Pinkel, zoptymalizowany pod kątem DAPI, FITC, TRITC, Cy5 i Cy7 i inne podobne fluorofory, oświetlone źródłami światła na bazie diod LED
Kazeina	Sigma-Aldrich	22090	Hydrolizat kazeiny do mikrobiologii
Katalaza	Sigma-Aldrich	C9322	Katalaza z wątroby bydlęcej
Chloroform	Sigma-Aldrich	288306	Chloroform bezwodny zawiera 0,5-1,0% etanolu jako stabilizator
Cholesterol	Avanti	700000P	cholesterol (wełna owcza, >98%) (proszek)
D-Glukoza	Sigma-Aldrich	G7021	D-(+)-Glukoza w proszku, BioReagent, odpowiedni do hodowli komórek, odpowiedni do hodowli komórek owadów, odpowiedni do hodowli komórek roślinnych, ≥ 99,5%
DOPC	Avanti	850375C	1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfocholina (w chloroformie)
DOPE-Biotyna	Avanti	870282C	1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamina-N-(biotynyl) (sól sodowa)
DPPC	Avanti	850355P	1,2-dipalmitoilo-sn-glicero-3-fosfocholina (proszek)
DPPE-Biotyna	Avanti	870285P	1,2-dipalmitoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamino-N-(biotynyl) (sól sodowa)
DTT	Sigma-Aldrich	43816	Roztwór DL-ditiotreitolu 1 M
EGTA	Sigma-Aldrich	E4378	EGTA, Kwas egtazynowy, Kwas etyleno-bis(oksyetylenonitrolo)tetraoctowy, Eter glikolowy, kwas diaminotetraoctowy,
Oksydaza glukozowa	Sigma-Aldrich	G6125	Oksydaza glukozowa z Aspergillus niger typu II, ≥ 10 000 jednostek/g substancji stałych (bez dodatku tlenu)
Glicerol	Fisher	G33	Glicerol (certyfikowany ACS), Fisher Chemical
GTP	Sigma-Aldrich	G8877	Hydrat soli sodowej 5′-trifosforanu guanozyny
IX-81 Mikroskop Olympus		Olympus N/A	IX81 Mikroskop odwrócony firmy Olympus
KOH	Sigma-Aldrich	1050121000	Potas Wodorotlenek
chlorku magnezu	Sigma-Aldrich	M1028	1,00 M roztwór chlorku magnezu
Orca Flash 4.0 Aparat cyfrowy	Hamamatsu	C13440-20CU	ORCA-Flash 4.0 V3 Cyfrowa kamera CMOS
Oregon Green-DHPE	Invitrogen	O12650	Oregon Green 488 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine
Paklitaksel	ThermoFisher	P3456	Paklitaksel (odpowiednik Taxolu) - wyłącznie do użytku naukowego
RURY	Sigma-Aldrich	P6757	Kwas 1,4-piperazynodietaniosulfonowy, Piperazyna-1,4-bis(kwas 2-etanosulfonowy), Piperazyna-N,N′-bis(kwas 2-etanosulfonowy)
Texas Red-DHPE	Invitrogen	T1395MP	Texas Red 1,2-dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, Trolox soli trietyloamonowej
	Sigma-Aldrich	238813	(±)-Kwas 6-hydroksy-2,5,7,8-tetrametylochromano-2-karboksylowy
Tubulina,	cytoszkielet	T333P	Białko tubuliny (biotyna) mózg świni
Tubulina, Hy-Lite 488	Cytoszkielet	TL488M	Białko tubuliny (fluorescencyjne HiLyte 488) mózg świni
Tubulina, nieznakowany	cytoszkielet	T240	Białko tubuliny mózg świni