Artykuł metodologiczny

Walidacja sekwencjonowania nanoporowego całego genomu na przykładzie wirusa Usutu

DOI:

10.3791/60906

⸱

11 marca 2020

 ,  ,  , 
1ErasmusMC, Department of Viroscience, WHO Collaborating Centre for Arbovirus and Viral Hemorrhagic Fever Reference and Research, Erasmus University Medical Center

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wcześniej sprawdziliśmy protokół sekwencjonowania całego genomu wirusa Usutu (USUV) opartego na amplikonie na platformie sekwencjonowania nanoporowego. W tym miejscu bardziej szczegółowo opisujemy stosowane metody i określamy poziom błędu nanoporowej celi przepływowej R10.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sekwencjonowanie całego genomu może być wykorzystane do scharakteryzowania i śledzenia ognisk wirusowych. Protokoły sekwencjonowania całego genomu oparte na nanoporach zostały opisane dla kilku różnych wirusów. Podejścia te wykorzystują nakładające się podejście oparte na amplikonie, które można wykorzystać do celowania w określonego wirusa lub grupę wirusów spokrewnionych genetycznie. Oprócz potwierdzenia obecności wirusa, sekwencjonowanie może być wykorzystywane do badań epidemiologicznych genomu, śledzenia wirusów i odkrywania pochodzenia, rezerwuarów i sposobów przenoszenia. W przypadku takich aplikacji kluczowe jest zrozumienie możliwych skutków poziomu błędów związanych z używaną platformą. Rutynowe stosowanie w warunkach klinicznych i zdrowia publicznego wymaga, aby było to dokumentowane przy każdej ważnej zmianie w protokole. Wcześniej zatwierdzono protokół sekwencjonowania całego genomu wirusa Usutu na platformie sekwencjonowania nanoporowego (komórka przepływowa R9.4) poprzez bezpośrednie porównanie z sekwencjonowaniem Illumina. W tym miejscu opisujemy metodę zastosowaną do określenia wymaganego pokrycia odczytem, na przykładzie porównania między komórką przepływową R10 a sekwencjonowaniem Illumina.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Szybki rozwój technologii sekwencji trzeciej generacji pozwala nam iść naprzód w kierunku sekwencjonowania w czasie zbliżonym do rzeczywistego podczas epidemii wirusów. Ta szybka dostępność informacji genetycznych może być przydatna do określenia pochodzenia i ewolucji patogenów wirusowych. Złotym standardem w dziedzinie sekwencjonowania nowej generacji są jednak nadal sekwencery drugiej generacji. Techniki te opierają się na specyficznych i czasochłonnych technikach, takich jak amplifikacja klonalna podczas emulsyjnego PCR lub amplifikacja mostka klonalnego. Sekwencery trzeciej generacji są tańsze, ręczne i wyposażone w uproszczone metodologie przygotowania bibliotek. Zwłaszcza niewielki rozmiar urządzenia sekwencyjnego i niska cena zakupu sprawiają, że jest to interesujący kandydat do sekwencjonowania w terenie. Można to było zaobserwować na przykład podczas wybuchu epidemii wirusa Ebola w Sierra Leone oraz podczas trwających dochodzeń w sprawie wybuchu epidemii arbowirusa w Brazylii1,2,3. Jednak zgłaszany wysoki poziom błędów4 może ograniczać aplikacje, w których można zastosować sekwencjonowanie nanoporowe.

Sekwencjonowanie nanoporowe rozwija się szybko. Na rynku regularnie pojawiają się nowe produkty. Przykładami tego są na przykład zestawy do kwadratów 1D, które umożliwiają sekwencjonowanie obu nici cząsteczki DNA, zwiększając w ten sposób dokładność wywoływanych zasad5 oraz opracowanie komórki przepływowej R10, która mierzy zmianę prądu w dwóch różnych instancjach w pore6. Ponadto, ulepszone narzędzia bioinformatyczne, takie jak ulepszenia w basecallingu, poprawią dokładność basecalling7. Jeden z najczęściej używanych basecallerów (np. Albacore) został zaktualizowany co najmniej 12 razy w ciągu 9 miesięcy5. Niedawno producent wypuścił również nowatorski basecaller o nazwie flip-flop, który jest zaimplementowany w domyślnym oprogramowaniu nanopore8. Wszystkie te ulepszenia doprowadzą do uzyskania dokładniejszych sekwencji i zmniejszą liczbę błędów sekwencera nanoporowego.

Wirus Usutu (USUV) jest przenoszonym przez komary arbowirusem z rodziny Flaviviridae i ma dodatnio niciowy genom RNA składający się z około 11 000 nukleotydów. USUV atakuje głównie puszczyki mszarne i kosy9,10, chociaż inne gatunki ptaków są również podatne na infekcję USUV11. Ostatnio USUV zidentyfikowano również u gryzoni i ryjówek, chociaż ich potencjalna rola w przenoszeniu wirusa pozostaje nieznana12. U ludzi bezobjawowe infekcje zostały opisane u dawców krwi13,14,15,16, podczas gdy infekcje USUV były również związane z zapaleniem mózgu lub zapaleniem opon mózgowo-rdzeniowych17,18. W Holandii USUV po raz pierwszy wykryto u dzikich ptaków w 2016 roku10, a u bezobjawowych dawców krwi w 2018 roku14. Od czasu pierwszego wykrycia USUV, w kolejnych latach zgłaszano wybuchy epidemii, a nadzór, w tym sekwencjonowanie całego genomu, jest obecnie w toku w celu monitorowania pojawiania się i rozprzestrzeniania arbowirusa w populacji, która wcześniej nie była w stanie tego zrobić.

Podobnie jak opisano dla innych wirusów, takich jak wirus Ebola, wirus Zika i wirus żółtej gorączki3,19,20, opracowaliśmy zestaw starterów do sekwencjonowania na całej długości USUV21. To podejście oparte na reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) pozwala na odzyskanie pełnej długości genomów USUV z wysoce zanieczyszczonych przez gospodarza typów próbek, takich jak próbki mózgu, w próbkach o wartości Ct wynoszącej około 32. Korzyści płynące z podejścia sekwencjonowania opartego na amplikonach to wyższa czułość w porównaniu z sekwencjonowaniem metagenomicznym oraz wyższa swoistość. Ograniczenia w stosowaniu podejścia opartego na amplikonie polegają na tym, że sekwencje powinny być podobne, aby zaprojektować startery pasujące do wszystkich szczepów oraz że startery są projektowane w oparciu o naszą obecną wiedzę na temat różnorodności wirusa.

Biorąc pod uwagę ciągły rozwój i ulepszenia w sekwencjonowaniu trzeciej generacji, istnieje potrzeba regularnego oceniania poziomu błędów sekwencera. W tym miejscu opisujemy metodę oceny wydajności nanoporów bezpośrednio w porównaniu z sekwencjonowaniem Illumina na przykładzie USUV. Ta metoda jest stosowana do sekwencji generowanych za pomocą najnowszej komórki przepływowej R10, a wywołanie podstawowe jest wykonywane przy użyciu najnowszej wersji przerzutnika basecaller.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Lista narzędzi programowych, które mogą być używane: usearch v11.0.667; muscle v3.8.1551; porechop 0.2.4; cutadapt 2.5; minimap2 2.16-r922; samtools 1.9; trimmomatic 0.39; bbmap 38.33; pik v3.13.1; kma-1.2.8

1. Projekt podkładu

  1. Zacznij od pobrania lub pobrania zestawu odpowiednich referencyjnych sekwencji całego genomu z publicznych lub prywatnych zbiorów danych. Na przykład, pobierz wszystkie pełne genomy USUV (taxid64286) z bazy danych NCBI22. USUV koduje genom składający się z około 11 000 nukleotydów, więc pobiera tylko sekwencje o długości sekwencji 8 000-12 000 nukleotydów. W tym celu należy użyć następującego wpisu wyszukiwania:
    - taxid64286[Organizm:noexp] I 8000[SLEN]:12000[SLEN].
    1. Kliknij Wyślij do | Kompletny zapis | Plik; użyj Format = FASTA i utwórz plik.
  2. Aby zmniejszyć rozmiar zestawu sekwencji referencyjnych, usuń zduplikowane sekwencje lub sekwencje z ponad 99% identycznością nukleotydów ze zbioru danych. Zrób to za pomocą szybkiej opcji klastra z usearch23. W wierszu poleceń wpisz:
    - usearch -cluster_fast All_USUV.fasta -id 0.99 -centroids All_USUV_dedup.fasta
  3. Aby wygenerować startery, sekwencje muszą być wyrównane. Odbywa się to za pomocą MUSCLE24. W wierszu poleceń wpisz:
    - muscle -in All_USUV_dedup.fasta -out All_USUV_dedup_aligned.fasta -log log_muscle.txt
    UWAGA: Konieczne jest ręczne sprawdzenie wyrównania w celu sprawdzenia rozbieżności. W razie potrzeby można je ręcznie skorygować, a końce można przyciąć zgodnie z długością większości sekwencji całego genomu.
  4. Primal służy do tworzenia roboczego wyboru starterów, które mogą być użyte do sekwencjonowania amplikonów o pełnej długości19. Prześlij wyrównanie na pierwotną stronę internetową (http://primal.zibraproject.org/) i wybierz preferowaną długość amplikonu oraz długość nakładania się różnych amplikonów. Przejdź do primal.zibraproject.org, wypełnij nazwę schematu, prześlij wyrównany plik fasta, wybierz długość amplikonu, rozmiar zakładki i wygeneruj schemat.
  5. Dopasuj pełny zestaw dostępnych kompletnych sekwencji USUV (nie zestaw zmniejszony lub zdeduplikowany). W wierszu poleceń wpisz:
    - muscle -in All_USUV.fasta -out All_USUV_aligned.fasta -log log_muscle.txt
    UWAGA: Odwzoruj wygenerowane startery względem pełnego wyrównania (nie używaj zdeduplikowanego wyrównania), ręcznie popraw błędy i uwzględnij maksymalnie 5 pozycji startera zwyrodnieniowego.

2. Multipleksowy PCR

  1. Wykonaj multipleksową reakcję PCR przy użyciu zaprojektowanych starterów oraz sekwencjonowania nanoporowego i Illumina. Multipleksowy PCR dla USUV został przeprowadzony zgodnie z poprzednim opisem19,21.
  2. Wykonaj wywołanie podstawowe za pomocą przerzutnika w wersji 3.0.6.6+9999d81.

3. Analiza danych w celu wygenerowania sekwencji konsensusu na podstawie danych nanoporowych

  1. Kilka próbek można multipleksować w jednym przebiegu sekwencjonowania nanoporowego. Po wykonaniu przebiegu sekwencji zdemultipleksuj dane nanoporowe. W tym celu użyj Porechop25. Aby zapobiec zanieczyszczeniu i zwiększyć dokładność, użyj flagi require_two_barcodes. W wierszu poleceń wpisz:
    - porechop -i Run_USUV.fastq -o Run_USUV_demultiplex --require_two_barcodes
  2. Po demultipleksowaniu usuń sekwencje starterów (wskazane w pliku Primers_Usutu.fasta w obu orientacjach) za pomocą cutadapt26. Ponadto usuń sekwencje o długości krótszej niż 75 nukleotydów. Startery muszą zostać usunięte, ponieważ mogą wprowadzać sztuczne odchylenia w sekwencji konsensusu. W wierszu poleceń wpisz:
    - cutadapt -b plik:Primers_USUV.fasta -o BC01_trimmed.fastq BC01.fastq -m 75
  3. Demultipleksowane odczyty sekwencji mogą być odwzorowywane na panelu odrębnych szczepów referencyjnych za pomocą minimap227, a sekwencja konsensusu może być generowana za pomocą samtools28. Postępuj zgodnie z poniższym przykładem, który pokazuje procedurę wyrównania opartego na odniesieniach i generowanie sekwencji konsensusu dla jednej próbki: BC01. W wierszu poleceń wpisz:
    - minimap2 -ax map-ont Random_Refs_USUV.fasta BC01_trimmed.fastq > BC01.bam
    - >samtools sortuj BC01.bam > BC01_sorted.bam
    - >bcftools mpileup -Ou -f Random_Refs_USUV.fasta BC01_sorted.bam | bcftools call -mv -Oz -o BC01.vcf.gz
    - Indeks bcftools BC01.vcf.gz
    - cat Random_Refs_USUV.fasta | Konsensus BCFtools BC01.vcf.gz > BC01_consensus.FASTA
  4. W przypadku wyrównań opartych na odniesieniach konieczne jest stosowanie ściśle powiązanej sekwencji odniesienia. W związku z tym należy przeprowadzić wyszukiwanie BlastN z wygenerowaną sekwencją konsensusu, aby zidentyfikować najbliższy szczep referencyjny. Następnie powtórz wyrównanie oparte na odniesieniu z najbliższym odkształceniem odniesienia jako odniesieniem (kroki 3.3 i 3.4). W wierszu poleceń wpisz:
    - minimap2 -ax map-ont Ref_USUV_BC01.fasta BC01_trimmed.fastq > BC01_ref.bam
    - >Samtools sortują BC01_ref.bam > BC01_sorted_ref.bam
    - >bcftools mpileup -Ou -f Ref_USUV_BC01.fasta BC01_sorted_ref.bam | bcftools call -mv -Oz -o BC01_ref.vcf.gz
    - Indeks bcftools BC01_ref.vcf.gz
    - Kot Ref_USUV_BC01.fasta | Konsensus BCFtools BC01_ref.vcf.gz > BC01_ref_consensus.FASTA

4. Analiza danych Illumina

  1. Sekwencje te są automatycznie demultipleksowane po sekwencjonowaniu. Jakość odczytów można kontrolować za pomocą trimmomatic29. W przypadku sekwencji Illumina z parowanymi końcami należy użyć powszechnie używanego średniego wyniku odcięcia PHRED wynoszącego 33 i minimalnej długości odczytu 75, aby uzyskać dokładne odczyty o wysokiej jakości. W wierszu poleceń wpisz:
    - trimmomatic PE -phred33 9_S9_L001_R1_001.fastq.gz 9_S9_L001_R2_001.fastq.gz 9_1P.fastq 9_1U.fastq 9_2P.fastq 9_2U.fastq PROWADZENIE:3 KOŃCOWE:3 OKNO ŚLIZGOWE:3:15 MINLEN:75
  2. Usuń startery (wskazane w pliku Primers_Usutu.fasta w obu orientacjach), ponieważ mogą one wprowadzać sztuczne odchylenia, używając cutadapt26. Ponadto usuń sekwencje o długości krótszej niż 75 nukleotydów za pomocą poniższych poleceń. W wierszu poleceń wpisz:
    - cutadapt -b o 9_1P_trimmed.fastq -p 9_2P_trimmed.fastq 9_1P.fastq 9_2P.fastq -m 75
  3. Przed złożeniem de novo odczyty sekwencji można znormalizować w celu równomiernego pokrycia całego genomu. Jest to niezbędne, ponieważ asemblery de novo, takie jak SPAdes, biorą pod uwagę pokrycie odczytu podczas montażu odczytów sekwencyjnych. Normalizuj odczyty do pokrycia odczytu 50 przy użyciu BBNorm z pakietu BBMap30. W wierszu poleceń wpisz:
    - bbmap/bbnorm.sh target=50 w=9_1P_trimmed.fastq in2=9_2P_trimmed.fastq out=Sample9_FW_norm.fastq out2=Sample9_RE_norm.fastq
  4. Znormalizowane odczyty są de novo składane przy użyciu SPAdes31. Ustawienia domyślne są używane do montażu przy użyciu wszystkich różnych kmerów (21, 33, 55, 77, 99 i 127). W wierszu poleceń wpisz:
    - spades.py -k 21,33,55,77,99,127 -o Próbka9 -1 Próbka9.qc.f.fq -2 Próbka9.qc.r.fq
  5. Mapowanie QC odczytuje względem uzyskanej sekwencji konsensusu za pomocą minimap2 i programów takich jak Geneious, Bioedit lub Ugene do nadzorowania wyrównania. Ważne jest, aby sprawdzić początek i koniec kontigu.
    1. Dopasuj odczyty QC do uzyskanego sekwencjonowania konsensusu za pomocą minimap2.
    2. Zaimportuj wyrównanie w Geneious/Bioedit/UGene.
    3. Ręcznie sprawdzaj, poprawiaj i selekcjonuj, zwłaszcza początek i koniec genomu.

5. Określanie wymaganego pokrycia odczytem w celu skompensowania profilu błędu w sekwencjonowaniu nanoporowym przy użyciu danych Illumina jako złotego standardu

  1. Sekwencja Select odczytuje odwzorowanie na jeden amplikon, w tym przypadku amplikon 26. Następnie zmapuj odczyty nanoporów względem tego amplikonu za pomocą minimapy2. Użyj Samtools, aby wybrać tylko mapowanie odczytów do amplicon 26 i przekonwertować plik bam na fastq. W wierszu poleceń wpisz:
    - minimap2 -ax map-ont -m 150 Amplicon26.fasta BC01_trimmed.fastq > BC01.bam
    - >samtools view -b -F 4 BC01.bam > BC01_mapped.bam
    - >Samtools Bam2FQ BC01_mapped.bam | seqtk seq - -> BC01_mapped.fastq
  2. Losowo wybrane podzbiory, na przykład 200 sekwencji, odczytuje tysiąc razy. Na przykład zmiana go na 10 spowoduje losowy wybór tysiąc razy podzbioru 10 odczytów sekwencji. Skrypt jest dostarczany jako plik uzupełniający 1. W wierszu poleceń wpisz:
    - Język Python Random_selection.py
  3. Wszystkie losowo wybrane odczyty sekwencji są wyrównywane do amplikonu 26. Użyj KMA32, aby odwzorować odczyty sekwencji i natychmiast wygenerować sekwencję konsensusu. Użyj zoptymalizowanych ustawień sekwencjonowania nanoporowego, wskazywanych przez flagę -bcNano. W wierszu poleceń wpisz:
    - kma index -i Amplicon26.fasta
    - dla pliku w random_sample*; do
    - sampleID=${plik%.fastq}
    - kma -i ${sampleID}.fastq -o ${sampleID} -t_db Amplicon26.fasta -mem_mode -mp 5 -mrs 0.0 -bcNano
    - Gotowe
  4. Sprawdź wygenerowane sekwencje konsensusu w wierszu poleceń za pomocą:
    - kot *.fsa > All_genomes.fsa
    - >minimap2 -ax map-ont Amplicon26.fasta All_genomes.fsa > All_genomes.bam
    - >Samtools sortują All_genomes.bam > All_genomes_sorted.bam
    - >Samtools Statystyki All_genomes_sorted.bam > stats.txt
    1. Poziom błędów jest wyświetlany w stats.txt pod nagłówkiem Poziom błędów #mismatches / bazy zmapowane. Wyświetl go na ekranie za pomocą następującego polecenia:
      - grep ^SN stats.txt | cut -f 2-
    2. Ilość indeli jest wyświetlana pod nagłówkiem #Indels na cykl. Wyświetl go na ekranie za pomocą następującego polecenia:
      - grep ^IC stats.txt | cut -f 2-

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niedawno wydano nową wersję wersji komórki przepływowej (R10), która oferowała ulepszenia dla basecallera używanego do konwersji elektronicznego sygnału prądu na sekwencje DNA (tzw. flip-flop basecaller). W związku z tym przeprowadziliśmy ponowne sekwencjonowanie USUV z tkanki mózgowej sowy z dodatnim wynikiem USUV, która została wcześniej zsekwencjonowana na komórce przepływowej R9.4 i na instrumencie Illumina Miseq21. W tym miejscu opisaliśmy metodę zastosowaną do określenia wymaganego pokrycia odczytem dla wiarygodnego wywołania konsensusu poprzez bezpośrednie porównanie z sekwencjonowaniem Illumina.

Używając nowszej komórki przepływowej w połączeniu z przerzutnikiem basecaller, pokazujemy, że 40-krotne pokrycie odczytu daje identyczne wyniki w porównaniu do sekwencjonowania Illumina. Pokrycie odczytem 30x daje wskaźnik błędu 0,0002%, co odpowiada jednemu błędowi na każde 585 000 sekwencjonowanych nukleotydów, podczas gdy pokrycie odczytu 20x daje jeden błąd na każde 63 529 zsekwencjonowanych nukleotydów. Pokrycie odczytu 10x powoduje jeden błąd na każde 3 312 zsekwencjonowanych nukleotydów, co oznacza, że ponad trzy nukleotydy na pełny genom USUV są nazywane nieprawidłowymi. Przy odczycie powyżej 30x nie zaobserwowano żadnych indeli. Pokrycie odczytem 20x skutkowało wykryciem jednej pozycji indel, podczas gdy pokrycie odczytem 10x skutkowało indelami w 29 pozycjach. Przegląd poziomu błędów przy użyciu różnych punktów odcięcia pokrycia odczytem przedstawiono w tabeli 1.

szt. wzrost rozmiar
PokryciaIteracja błędów 1Iteracja współczynnika błędów 1Produkty:Iteracja błędów 2Iteracja współczynnika błędów 2Produkty:Iteracja błędów 3Iteracja współczynnika błędów 3Produkty:
10×1000,0274%4Rozdział 1160,0297%Rozdział 18Rozdział 1100,0282%7
20×40,0010%060,0015%170,0018%0
30-krotnycyfra arabska0,0005%000,0000%000,0000%0
40-krotny00,0000%000,0000%000,0000%0
50×00,0000%000,0000%000,0000%0

Tabela 1: Przegląd poziomu błędów sekwencjonowania nanoporowego. Każda iteracja reprezentuje tysiąc losowych próbek.

Plik uzupełniający 1: Losowy wybór. Kliknij tutaj, aby wyświetlić ten plik (kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać).

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sekwencjonowanie nanoporowe stale się rozwija i dlatego istnieje zapotrzebowanie na metody monitorowania poziomu błędów. W tym miejscu opisujemy przepływ pracy w celu monitorowania wskaźnika błędów sekwencera nanoporowego. Może to być przydatne po zwolnieniu nowej komórki przepływu lub jeśli zostaną zwolnione nowe wersje wywołania bazowego. Może to być jednak również przydatne dla użytkowników, którzy chcą skonfigurować i zweryfikować własny protokół sekwencjonowania.

Różne programy i narzędzia do osiowania mogą dawać różne wyniki33. W tym manuskrypcie staraliśmy się wykorzystać ogólnodostępne pakiety oprogramowania, które są powszechnie używane i które mają przejrzystą dokumentację. W niektórych przypadkach preferowane mogą być narzędzia komercyjne, które zazwyczaj mają bardziej przyjazny dla użytkownika interfejs, ale trzeba za nie zapłacić. W przyszłości metoda ta może być zastosowana do tej samej próbki w przypadku wprowadzenia dużych modyfikacji w technologii sekwencyjnej lub oprogramowaniu do wywoływania baz Preferencyjnie powinno się to robić po każdej aktualizacji basecallera lub flowcell, jednak biorąc pod uwagę szybkość obecnego rozwoju, można to również zrobić dopiero po dużych aktualizacjach.

Zmniejszenie poziomu błędów w sekwencjonowaniu pozwala na multipleksowanie większej liczby próbek. W ten sposób sekwencjonowanie nanoporowe jest coraz bliższe zastąpienia konwencjonalnych PCR w czasie rzeczywistym w testach diagnostycznych, co ma już miejsce w przypadku diagnostyki wirusa grypy. Ponadto zmniejszenie poziomu błędu zwiększa użyteczność tej techniki sekwencjonowania, na przykład do określania mniejszych wariantów i do wysokoprzepustowego, bezstronnego sekwencjonowania metagenomicznego.

Kluczowym krokiem w protokole jest to, że muszą być dostępne bliskie, wiarygodne sekwencje referencyjne. Podkłady są oparte na aktualnej wiedzy na temat różnorodności wirusów i mogą wymagać aktualizacji co jakiś czas. Kolejnym krytycznym punktem przy ustalaniu podejścia sekwencjonowania opartego na amplikonie jest zrównoważenie stężenia startera w celu uzyskania równomiernej równowagi głębokości amplikonu. Umożliwia to multipleksowanie większej liczby próbek w serii sekwencyjnej i skutkuje znaczną redukcją kosztów.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca otrzymała dofinansowanie z programu Unii Europejskiej Horyzont 2020 w zakresie badań i innowacji na podstawie umowy o grant nr 643476 (COMPARE).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Koraliki Agencourt AMPure XPBeckman CoulterA63881
dNTPsQiagen201900
FLO-MIN106 R10 flowcellNanoporeR10 flowcell
Zestaw do przygotowania biblioteki KAPA Hyperplus
Ładowanie biblioteki Zestaw koralikówNanoporeEXP-LLB001
Podwiązanie Zestaw do sekwencjonowania 1DNanoporeSQK-LSK109
Natywny zestaw kodów kreskowych 1D 1-12NanoporeEXP-NBD103
Natywny zestaw kodów kreskowych 1D 13-24NanoporeEXP-NBD104
NEB Blunt/TA Ligase Master MixNEBM0367S
NEB Next Moduł szybkiej ligacjiNEBE6056
NEB Next Ultra II Naprawa końcowa / dA-tailing ModułNEBE7546S
Protoscript II Odwrotna transkryptazaNEBM0368X
Q5 Polimeraza o wysokiej wiernościNEBM0491
Zestaw testowy Qubit dsDNA HSThermo FisherQ32851
Losowe starteryPromegaC1181
RNAsin Inhibitor rybonukleazyPromegaN2111
Roche 7962436001

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Faria, N. R., et al. Establishment and cryptic transmission of Zika virus in Brazil and the Americas. Nature. 546 (7658), 406-410 (2017).
  2. Bonaldo, M. C., et al. Genome analysis of yellow fever virus of the ongoing outbreak in Brazil reveals polymorphisms. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 112 (6), 447-451 (2017).
  3. Faria, N. R., et al. Genomic and epidemiological monitoring of yellow fever virus transmission potential. bioRxiv. , 299842(2018).
  4. Magi, A., Giusti, B., Tattini, L. Characterization of MinION nanopore data for resequencing analyses. Briefings in Bioinformatics. 18 (6), bbw077(2016).
  5. Rang, F. J., Kloosterman, W. P., de Ridder, J. From squiggle to basepair: computational approaches for improving nanopore sequencing read accuracy. Genome Biology. 19 (1), 90(2018).
  6. Nanopore Store, R10 flow cells. , https://store.nanoporetech.com/flowcells/spoton-flow-cell-mk-i-r10.html (2019).
  7. Wick, R. R., Judd, L. M., Holt, K. E. Performance of neural network basecalling tools for Oxford Nanopore sequencing. Genome Biology. 20 (1), 129(2019).
  8. GitHub - nanoporetech/flappie: Flip-flop basecaller for Oxford Nanopore reads. , https://github.com/nanoporetech/flappie (2019).
  9. Lühken, R., et al. Distribution of Usutu Virus in Germany and Its Effect on Breeding Bird Populations. Emerging Infectious Diseases. 23 (12), 1994-2001 (2017).
  10. Cadar, D., et al. Widespread activity of multiple lineages of Usutu virus, Western Europe, 2016. Eurosurveillance. 22 (4), (2017).
  11. Becker, N., et al. Epizootic emergence of Usutu virus in wild and captive birds in Germany. PLoS ONE. 7 (2), (2012).
  12. Diagne, M., et al. Usutu Virus Isolated from Rodents in Senegal. Viruses. 11 (2), 181(2019).
  13. Bakonyi, T., et al. Usutu virus infections among blood donors, Austria, July and August 2017 – Raising awareness for diagnostic challenges. Eurosurveillance. 22 (41), (2017).
  14. Zaaijer, H. L., Slot, E., Molier, M., Reusken, C. B. E. M., Koppelman, M. H. G. M. Usutu virus infection in Dutch blood donors. Transfusion. , trf.15444(2019).
  15. Cadar, D., et al. Blood donor screening for West Nile virus (WNV) revealed acute Usutu virus (USUV) infection, Germany, September 2016. Eurosurveillance. 22 (14), 30501(2017).
  16. Pierro, A., et al. Detection of specific antibodies against West Nile and Usutu viruses in healthy blood donors in northern Italy, 2010–2011. Clinical Microbiology and Infection. 19 (10), E451-E453 (2013).
  17. Pecorari, M., et al. First human case of Usutu virus neuroinvasive infection, Italy, August-September 2009. Euro surveillance: bulletin européen sur les maladies transmissibles = European Communicable Disease Bulletin. 14 (50), (2009).
  18. Simonin, Y., et al. Human Usutu Virus Infection with Atypical Neurologic Presentation, Montpellier, France, 2016. Emerging Infectious Diseases. 24 (5), 875-878 (2018).
  19. Quick, J., et al. Multiplex PCR method for MinION and Illumina sequencing of Zika and other virus genomes directly from clinical samples. Nature Protocols. 12 (6), 1261-1276 (2017).
  20. Quick, J., et al. Real-time, portable genome sequencing for Ebola surveillance. Nature. 530 (7589), 228-232 (2016).
  21. Oude Munnink, B. B., et al. Towards high quality real-time whole genome sequencing during outbreaks using Usutu virus as example. Infection, Genetics and Evolution. 73, 49-54 (2019).
  22. Benson, D. A., Karsch-Mizrachi, I., Lipman, D. J., Ostell, J., Sayers, E. W. GenBank. Nucleic Acids Research. 38 (Database issue), D46-D51 (2010).
  23. Edgar, R. C. Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST. Bioinformatics. 26 (19), 2460-2461 (2010).
  24. Edgar, R. C. MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput. Nucleic Acids Research. 32 (5), 1792-1797 (2004).
  25. GitHub - rrwick/Porechop: adapter trimmer for Oxford Nanopore reads. , https://github.com/rrwick/porechop (2018).
  26. Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet.journal. 17 (1), 10(2011).
  27. Li, H. Minimap2: pairwise alignment for nucleotide sequences. Bioinformatics. 34 (18), 3094-3100 (2018).
  28. Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
  29. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics (Oxford, England). 30 (15), 2114-2120 (2014).
  30. BBMap download | SourceForge.net. , https://sourceforge.net/projects/bbmap/ (2019).
  31. Bankevich, A., et al. SPAdes: a new genome assembly algorithm and its applications to single-cell sequencing. Journal of Computational Biology. 19 (5), 455-477 (2012).
  32. Clausen, P. T. L. C., Aarestrup, F. M., Lund, O. Rapid and precise alignment of raw reads against redundant databases with KMA. BMC Bioinformatics. 19 (1), 307(2018).
  33. Brinkmann, A., et al. Proficiency Testing of Virus Diagnostics Based on Bioinformatics Analysis of Simulated In Silico High-Throughput Sequencing Data Sets. Journal of Clinical Microbiology. 57 (8), (2019).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Sekwencjonowanie wirusa Usutuanaliza wska nika b d w Nanoporewyznaczanie pokrycia odczytamikonfiguracja MinION MinITdemultipleksowanie Porechopusuwanie starter w Cutadaptdopasowanie do sekwencji referencyjnej Minimap2generowanie konsensusu Samtoolsmapowanie Nanopore KMA

Powiązane artykuły