Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Izolacja i charakterystyka dorosłych fibroblastów i miofibroblastów serca

15.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60909

⸱

12 marca 2020

 ,  ,  , 
1Department of Pathology, Microbiology, and Immunology, Vanderbilt University Medical Center, 2American Red Cross, National Headquarters

W tym artykule

Podsumowanie

Uzyskanie czystej populacji fibroblastów jest kluczowe dla badania ich roli w gojeniu ran i zwłóknieniu. Opisano tutaj szczegółową metodę izolowania fibroblastów i miofibroblastów z nieuszkodzonych i uszkodzonych serc myszy, a następnie scharakteryzowanie ich czystości i funkcjonalności za pomocą immunofluorescencji, RTPCR, sortowania komórek wspomaganego fluorescencją i skurczu żelu kolagenowego.

Streszczenie

Zwłóknienie serca w odpowiedzi na uraz jest fizjologiczną reakcją na gojenie się ran. Podjęto wysiłki w celu zbadania i ukierunkowania na podtypy fibroblastów, które łagodzą zwłóknienie. Jednak badania nad fibroblastami są utrudnione ze względu na brak powszechnie akceptowalnych markerów fibroblastów do identyfikacji fibroblastów w stanie spoczynku, jak i aktywowanych. Fibroblasty są niejednorodną populacją komórek, co utrudnia ich wyizolowanie i scharakteryzowanie. Przedstawiony protokół opisuje trzy różne metody wzbogacania fibroblastów i miofibroblastów z nieuszkodzonych i uszkodzonych serc myszy. Zastosowanie standardowego i niezawodnego protokołu izolacji fibroblastów umożliwi badanie ich roli w homeostazie, a także modulacji zwłóknienia.

Wprowadzenie

Fibroblasty serca, komórki pochodzenia mezenchymalnego, odgrywają znaczącą rolę w utrzymaniu przewodnictwa elektrycznego i sił mechanicznych w sercu, a także w utrzymaniu architektury serca podczas homeostazy1. Po urazie komórki te są aktywowane, rozszerzają się i wytwarzają białka macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM)2. Wiele badań przedklinicznych ujawniło istnienie fibroblastów jako krytycznych regulatorów komórkowych, które utrzymują integralność strukturalną uszkodzonego serca3, a także głównych komórek efektorowych odpowiedzialnych za niekontrolowaną produkcję i odkładanie się białek ECM, co powoduje powstawanie sztywnych blizn i niewydolność serca4. Fibroblasty to niejednorodna grupa komórek, co utrudnia oddzielenie ich funkcji naprawczej od profibrotycznych nieprzystosowawczych właściwości. Niedawno zdefiniowano funkcjonalną heterogeniczność dwóch odrębnych podtypów fibroblastów po uszkodzeniu mięśnia sercowego, co wskazuje na możliwość wyizolowania różnych podtypów fibroblastów i zbadania ich roli w gojeniu się ran5.

Uzyskanie populacji czystych fibroblastów jest kluczowe dla określenia ich funkcjonalnej roli w naprawie i zwłóknieniu. Jednak obecność wielu markerów fibroblastów, które rozpoznają inne typy komórek, sprawia, że trudno jest wyizolować zasadniczo czystą populację fibroblastów6. W kilku eleganckich badaniach opracowano sprytne sposoby izolowania fibroblastów serca od nieuszkodzonego i uszkodzonego mięśnia sercowego. Najpopularniejszą i najbardziej ugruntowaną metodą wzbogacania fibroblastów jest selektywna adhezja po enzymatycznym trawieniu tkankowym7.

Dodatkowo, sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) fibroblastów na podstawie antygenów powierzchniowych komórek zostało pomyślnie opisane8. W badaniu, po trawieniu enzymatycznym, komórki mezenchymalne posortowano jako ujemne pod względem linii (Lin: Ter119−CD45−CD31−) i gp38-dodatnie (gp38+) z serc myszy. Potwierdzono, że komórki Gp38 + ve są fibroblastami na podstawie ich koekspresji col1α1 i innych markerów mezenchymalnych. Chociaż większość trawienia tkanek jest zakończona po wypreparowaniu komory na szalce Petriego, w niedawnym badaniu zbadano użycie bezpośredniej perfuzji enzymatycznej lewej komory igłowej do wyizolowania miocytów i niemiocytów, które obejmują fibroblasty9. W tym przypadku fibroblasty zostały następnie wyizolowane przez selektywną adhezję.

Ten protokół opisuje izolację i wzbogacanie fibroblastów przy użyciu trzech metod. Pierwszą z nich jest znana już metoda polegająca na selektywnej adhezji fibroblastów po trawieniu enzymatycznym. Druga metoda jest stosowana przede wszystkim do izolowania miofibroblastów mięśni gładkich alfa wywołanych urazem. Trzecia metoda polega na sekwencyjnym, magnetycznym zubożeniu trawionej enzymatycznie zawiesiny komórek serca komórek krwiotwórczych i śródbłonka. Po wyczerpaniu fibroblasty/miofibroblasty są izolowane na podstawie obecności antygenu MEFSK4 za pomocą kulek magnetycznych. Ostatnio MEFSK4 został opisany jako antygen obecny zarówno na fibroblastach w stanie spoczynku, jak i aktywowanym, co czyni go odpowiednim markerem do identyfikacji i izolacji fibroblastów. Oczywiście wszystkie opisane tutaj metody mają unikalne ograniczenia. Dlatego zdecydowanie zaleca się sprawdzenie czystości izolowanej populacji komórek za pomocą analizy przepływu, barwienia immunologicznego i półilościowego PCR w czasie rzeczywistym. Jednak metodologie te można rozszerzyć, a dodatkowe markery mogą zostać dodane w celu wykluczenia innych zanieczyszczających populacji przed wykorzystaniem populacji fibroblastów i miofibroblastów do kluczowych eksperymentów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

To badanie ściśle przestrzega zaleceń zawartych w Przewodniku dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych National Institutes of Health. Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Vanderbilt zatwierdził protokół (numer protokołu: M1600076-01).

1. Wycięcie serca

  1. Przygotowanie roztworu
    1. Bufor KHB
      1. Za pomocą mieszadła powoli rozpuść 9,4 g proszku buforu Krebs-Henseleit (KHB) w 900 ml wody DDI.
        UWAGA: Bufor wytrąci się, jeśli będzie mieszany zbyt szybko lub zbyt długo. Bufor KHB musi być zimny podczas izolacji fibroblastów.
      2. Dodać 2,9 mM CaCl2 i 24 mM NaHCO3. Doprowadzić pH do 7,2–7,3 i rozcieńczyć do objętości 1 l za pomocądH2O.
      3. Używając sterylnego filtra (0,22 μm), przechowywać w temperaturze 4 °C do 4 tygodni. Przechowywać na lodzie lub w temperaturze 4 °C przez czas izolacji.
    2. Koktajl na trawienie kolagenazy
      1. Przygotuj koktajl trawienny w dniu izolacji fibroblastów. Określ odpowiednią objętość koktajlu trawiennego w zależności od liczby serc; 5 ml koktajlu na 1 serce.
      2. Przygotować mieszankę kolagenazy (patrz tabela materiałów) i DNazę I zgodnie z instrukcjami producenta.
      3. Na 20 ml koktajlu całkowitego wytrawiania dodaj 17,5 μl DNazy I, 180 μl 1 M HEPES i 500 μl kolagenazy do pustej stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
      4. Dodaj wystarczającą objętość roztworu soli Hanka (HBSS) z Ca2+ i Mg2+, aby uzyskać całkowitą objętość 20 ml.
    3. Bufor do lizy krwinek czerwonych (RBC)
      1. Określ całkowitą potrzebną objętość na podstawie liczby serc (5 ml/serce). Rozcieńczyć 10x bufor zapasowy do lizy RBC do 1x przy użyciu dH2O.
    4. Pożywki fibroblastowe: 10% FBS w DMEM F-12
      1. Dodaj 10% FBS do DMEM-F12 z L-glutaminą i HEPES. Dodać 10 μg/ml penicyliny/streptomycyny, 2,5 μg/ml leku przeciwgrzybiczego i 2,5 μg/ml mykoplazmy profilaktycznie (patrz tabela materiałów). Przechowywać w temperaturze 4 °C.
  2. Rozwarstwienie serca
    1. Przygotuj 6-dołkową płytkę na lodzie z 2 ml zimnego KHB na studzienkę, aby przechowywać w niej serca podczas sekcji. Używaj autoklawowanych nożyczek chirurgicznych i kleszczy.
    2. Poddać eutanazji myszy w wieku 12 tygodni lub starszym przez przedawkowanie izofluranu, a następnie zwichnąć szyjkę macicy.
    3. Alternatywnie, w celu aktywowanej izolacji fibroblastów, wywołaj zawał mięśnia sercowego u 12-tygodniowych myszy za pomocą podwiązania tętnic wieńcowych10. Poddaj myszy eutanazji 8-10 dni po urazie.
    4. Spryskaj ciało 70% etanolem i ustaw tak, aby strona brzuszna była skierowana w stronę eksperymentatora. Przypnij lub przytrzymuj przydatki, aby zapobiec zakłóceniom.
    5. Rozetnij skórę brzucha i mięśnie, ale unikaj przebijania wątroby. Przeciąć pionowo w kierunku mostka i ostrożnie otworzyć klatkę piersiową, unikając przebicia serca. Kontynuuj przecinanie klatki piersiowej, aby odsłonić serce.
    6. Za pomocą kleszczy delikatnie unieś serce z klatki piersiowej, odcinając płuca lub nadmiar tkanki przyczepionej na zewnątrz serca. Usunąć komorę i umieścić w jednym dołku z 6-dołkową płytką z zimnym KHB. Kontynuuj sekcję serc w ten sposób, aż wszystkie próbki zostaną wyizolowane.
  3. Enzymatyczna dysocjacja serca
    1. Za pomocą kleszczy kilkakrotnie ściskaj i mieszaj serce w KHB, aby usunąć nadmiar krwi. Przenieś serce na czystą, sterylną płytkę o długości 10cm2. Używając jednego ostrza krawędziowego, szybko zmiel serce na małe kawałki.
    2. Dodaj 1 ml koktajlu na trawienie kolagenazy i kontynuuj mielenie, aż kawałki będą wystarczająco małe, aby można je było przenieść za pomocą mikropipety o pojemności 1 ml. Przenieść próbki do stożkowej probówki o pojemności 50 ml za pomocą mikropipety o pojemności 1 ml. Umyj talerz 2x z 2 ml koktajlu na trawienie kolagenazy.
      UWAGA: Odcięcie części końcówki pipety może pomóc w zebraniu większych kawałków serca, które w przeciwnym razie mogłyby utknąć w końcówce pipety.
    3. Inkubować probówkę stożkową w temperaturze 37 °C przez 30 minut, kołysząc lub mieszając. W razie potrzeby zabezpiecz rurkę. Zawiesić 10x pipetą o pojemności 5 ml do momentu, gdy zawartość stanie się jednorodna, a następnie inkubować probówkę stożkową w temperaturze 37 °C przez 15 minut, obracając ją lub mieszając.
    4. Zawiesić 10x pipetą o pojemności 10 ml do uzyskania jednorodnej konsystencji. Zalać sitko o pojemności 40 μm, zwilżając filtr 1–2 ml buforu KHB na nowej stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Dodaj 25 ml buforu KHB do zawiesiny wytrawiającej, ponownie zawieś i przefiltruj przez zagruntowane sitko komórkowe 40 μm. Zmień filtr w razie potrzeby.
      UWAGA: Gdy filtracja zwalnia, lekkie stukanie w rurkę lub użycie mikropipety o pojemności 1 ml w celu pobrania zawiesiny od spodu filtra może pomóc zawiesinie komórek przejść przez częściowo zablokowane sitko o wielkości 40 μm.
    5. Wirować w temperaturze 400 x g i 4 °C przez 10 minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 1x bufor do lizy RBC (5 ml/serce). Inkubować przez 2 minuty w temperaturze pokojowej (RT).
    6. Odwirować przy 400 x g i RT przez 10 min. Usunąć supernatant, a następnie przemyć przez ponowne zawieszenie osadu w 1 ml buforu KHB.
    7. Dodaj 9 ml buforu KHB i przefiltruj przez zagruntowane sitko komórkowe 40 μm do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Wirować przy 400 x g i RT przez 10 min.
    8. Usunąć supernatant, ponownie zawiesić w 1 ml pożywki z fibroblastami lub PBS i określić liczbę komórek. Fibroblasty można wyizolować trzema różnymi metodami opisanymi poniżej.

2. Izolacja fibroblastów z zawiesiny pojedynczej komórki

  1. Izolacja fibroblastów: powlekanie różnicowe (Rysunek 1)
    1. Przygotuj płytkę 6-dołkową, dodając 2 ml pożywki fibroblastów na studzienkę i obracając płytkę, aby przykryć dno studzienki.
    2. Zawieś komórki w 1 ml pożywki na serce. Płytka 1 ml zawiesiny komórek na studzienkę, tak aby jedno serce (teoretycznie) było siane na studzienkę. Na przykład sześć serc zostałoby ponownie zawieszonych w 6 ml pożywki, a następnie posianych w sześciu dołkach z 1 ml zawiesiny komórek na studzienkę.
    3. Zakręć płytkę, aby równomiernie rozprowadzić komórki. Dodać dodatkowe 1–2 ml pożywki na studzienkę, aby uzyskać całkowitą objętość do 5 ml na studzienkę i inkubować w temperaturze 37 °C przez 4 godziny.
    4. Fibroblasty zostaną oddzielone przez selektywną adhezję po 4 godzinach. Usuń nieprzyłączone i martwe komórki, usuwając pożywkę. Umyj przyczepione komórki 2 ml PBS i dodaj 2-4 ml sterylnego podłoża fibroblastów do dołka. Inkubować w temperaturze 37 °C aż do zlewu. Zmieniaj nośniki co 2–4 dni.
  2. Izolacja fibroblastów: FACS przy użyciu modelu myszy reporterowej GFP (Rysunek 1)
    1. Bufor FACS
      1. Przygotować 15 ml 5% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) w dPBS bez Ca2+ i Mg2+. Przechowywać na lodzie lub w temperaturze 4°C.
    2. Rozwiązanie blokujące FC
      1. Przygotować 0,5 μl blokera FC (oczyszczony anty-mysz CD16/CD32) w 25 μl FACS (rozcieńczenie 1:50). Wymagane jest 25 μl roztworu blokera FC na próbkę. Przechowywać na lodzie lub w temperaturze 4 °C.
    3. Przygotowanie próbki i barwienie przeciwciał
      UWAGA: Rozcieńczenia przeciwciał można przygotować z wyprzedzeniem, ale może to grozić ekspozycją na światło lub temperaturę.
      1. Przygotować 7AAD lub Ghost dye violet 510, czyli 2x wymagane rozcieńczenie w buforze FACS. Patrz Tabela 1 dla przeciwciał i rozcieńczeń.
      2. Ponownie zawiesić 500 000 świeżo wyizolowanych komórek w 25 μl roztworu blokera FC, aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu regionu przeciwciała FC z receptorem FC. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
      3. Dodać przeciwciało 7AAD lub Ghost dye violet 510 do końcowej objętości 25 μl zawiesiny komórek. Inkubować przez 30–60 minut na lodzie w ciemności.
      4. Przemyć przez ponowne zamieszanie w 1 ml buforu FACS. Wirować przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4°C.
      5. Zawiesić osad w zalecanej objętości próbki cytometrii przepływowej w buforze FACS (300 μl) i przenieść do probówki do cytometrii przepływowej.
    4. Sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS)
      UWAGA: Myszy reporterowe GFP-αSMA były wkładem dr Ivo Kalajzic11. Ta mysz wyraża GFP pod promotorem komórek mięśni gładkich alfa (αSMA). αSMA został użyty jako marker aktywowanych fibroblastów (miofibroblastów)12.
      1. W celu izolacji aktywowanych fibroblastów (αSMA wyrażających miofibroblasty) należy wywołać zawał mięśnia sercowego u 12-tygodniowych myszy GFP-αSMA przez podwiązanie tętnicy wieńcowej. Poświęć myszy 8-10 dni po urazie.
      2. Po zawieszeniu pojedynczych komórek z uszkodzonych serc myszy, sortuj fibroblasty αSMA + ve pod kątem białka zielonej fluorescencji (GFP). Użyj niebarwionych, nieuszkodzonych fibroblastów, aby ustawić sygnał tła w kanale GFP po kompensacji.
      3. Bramka dla żywych komórek GFP + ve przez bramkowanie dla komórek 7AAD-ve / GFP+ve lub Ghost dye fioletowych komórek 510-ve / GFP+ve i sortowanie GFP eksprymujących miofibroblasty αSMA + ve. Zbierz komórki w pożywce z fibroblastami.
  3. Izolacja fibroblastów: izolacja fibroblastów za pomocą kulek magnetycznych (Rysunek 1)
    1. Bufor równowagi
      UWAGA: Zawsze przygotowuj świeży bufor do izolacji.
      1. Przygotować 0,5% BSA i 2 mM EDTA w PBS. Odgazować bufor, mieszając roztwór, jednocześnie dołączając próżnię do pokrywy pojemnika.
        UWAGA: Mieszanie usuwa nadmiar gazu z roztworu, który jest następnie usuwany przez próżnię, tak aby pęcherzyki nie zatykały kolumny separacyjnej po użyciu.
    2. Znakowanie magnetyczne: Komórki krwiotwórcze CD45+
      1. Odwirować wyizolowane komórki z serc myszy w stężeniu 500 x g przez 5 minut, a następnie usunąć supernatant.
      2. Zawiesić osad komórkowy w 1 ml buforu równoważącego. Policz komórki za pomocą hemocytometru.
      3. Odwirować zawiesinę komórkową jak powyżej i ponownie zawiesić osad komórkowy w 90 μl buforu równoważącego na 1 x10 7 wszystkich komórek. Dodaj 10 μl kulek magnetycznych CD45+ na 1 x10 7 komórek. Dobrze wymieszać i inkubować przez co najmniej 15 minut w temperaturze 4°C.
      4. Przemyć komórki, dodając 2 ml buforu równowagowego na 1 x10 7 komórek, a następnie odwirować przy 500 x g przez 10 minut w temperaturze 4°C.
      5. Usunąć supernatant, policzyć komórki za pomocą hemocytometru i ponownie zawiesić do 1 x10 7 całkowitych komórek w 2 ml buforu równoważącego. Jeśli obecnych jest więcej niż 107 komórek, skaluj bufor liniowo. Przepuść komórki przez filtr 40 μm, aby zapobiec zatykaniu się matrycy kolumny separacyjnej przez agregacje komórek.
    3. Separacja magnetyczna: komórki hematopoetyczne CD45+
      1. Umieścić kolumnę separacyjną w polu magnetycznym odpowiedniego separatora i wyrównać kolumnę z co najmniej 3 ml PBS.
      2. Zebrać nieznakowane komórki w przepływie (FT) i przemyć kolumnę 3x 3 ml buforu równoważącego. Zebrać płuczki za pomocą FT. Usunąć kolumnę z separatora. Umieść kolumnę na stożkowej probówce o pojemności 15 ml.
      3. Wypłukać znakowane magnetycznie komórki CD45+, pipetując 5 ml buforu równoważącego na kolumnę i mocno zanurzając komórki za pomocą tłoka dostarczonego z kolumną.
      4. Odwirować eluent oraz frakcje FT/płuczące przy 500 x g. Policz komórki za pomocą hemocytometru.
    4. Znakowanie magnetyczne i separacja: komórki śródbłonka CD31+
      1. Powtórz protokół dla etykietowania magnetycznego i separacji CD45+ (sekcje 2.3.2–2.3.3), z wyjątkiem użycia kulek magnetycznych CD31+ do inkubacji z FT i przemycia porcji z izolacji CD45+.
    5. Znakowanie magnetyczne i separacja: fibroblasty MEFSK4+
      1. Powtórz protokół dla znakowania magnetycznego CD45+ przy użyciu przeciwciała anty-feeder-APC MEFSK4 zamiast kulek magnetycznych. Odwirować porcje FT i Wash z izolacji CD31+ w temperaturze 500 × g przez 5 minut, a następnie usunąć supernatant. Ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml buforu równoważącego i policzyć komórki za pomocą hemocytometru.
      2. Dodać 10 μl przeciwciała anty-feeder-APC MEFSK4 na 1 x 107 komórek. Inkubować przez co najmniej 15 minut w temperaturze 4 °C.
      3. Przemyć komórki związane z przeciwciałami MEFSK4, dodając 5 ml buforu równowagowego na 1 x 107 wszystkich komórek, a następnie odwirować przy 500 x g przez 5 minut.
      4. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić w kulkach anty-APC, używając tej samej objętości przeciwciała anty-feeder-APC MEFSK4. Inkubować na lodzie przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
      5. Wirować przy 500 x g przez 10 minut. Usunąć supernatant, ponownie zawiesić w 2 ml buforu równoważącego na 1 x10 7 komórek i przystąpić do separacji magnetycznej, jak opisano wcześniej (sekcja 2.3.3). Magnetycznie oddzielone fibroblasty MEFSK4+ve/ CD45-ve/CD31-ve mogą być używane do analiz czystości i innych dalszych zastosowań.

3. Analiza czystości i funkcjonalności izolowanej populacji fibroblastów

  1. Analiza czystości populacji FACS: analiza komórek αSMA-GFP (Rysunek 2)
    1. Ponownie zawiesić świeżo wyizolowane komórki w 25 μl roztworu blokera Fc, aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu przeciwciał. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    2. Opcjonalnie: dodać 25 μl 7AAD lub Ghost dye violet 510 do zawiesiny komórek. Inkubować przez 30–60 minut na lodzie w ciemności.
    3. Przemyć przez ponowne zamieszanie w 1 ml buforu FACS. Wirować przy 500 x g przez 5 min.
    4. Zawiesić osad w 50 μl buforu FACS. Dodaj przeciwciała CD31-PE, CD45-APC i AN2/NG2 bezpośrednio do zawiesiny komórkowej. Inkubować przez 15 minut na lodzie (tabela 1).
    5. Przemyć przez ponowne zamieszanie w 1 ml buforu FACS. Wirować przy 400 x g przez 5 min.
    6. Dodać przeciwciało drugorzędowe AlexaFluor 405 przeciwko szczurom osła do komórek znakowanych niesprzężonym przeciwciałem pierwszorzędowym. Inkubować przez 30 minut na lodzie.
    7. Przemyć przez ponowne zamieszanie w 1 ml buforu FACS. Wirować przy 400 x g przez 5 min.
    8. Zawiesić osad w zalecanej objętości próbki cytometrii przepływowej buforu FACS (300 μl) i przenieść do znakowanej probówki do cytometrii przepływowej w celu analizy przepływu.
      UWAGA: Analiza FACS mająca na celu scharakteryzowanie ekspresji antygenu MEFSK4 na izolowanych fibroblastach opisano w punkcie 3.3.
  2. Analiza czystości fibroblastów: immunofluorescencja (Rysunek 3A)
    1. Wysiewaj 30 000 pierwotnych fibroblastów (P0-P1) na basenie na szkiełkach nakrywkowych umieszczonych na 24-dołkowej płytce i hoduj do 80% zlewania się. Lub zagęścić posortowane komórki CD45 + i CD31 + (30 000 komórek na dołek) na szkiełku nakrywkowym za pomocą cytospiny w ilości 400 x × g (metoda stosowana do bezpośredniego i równomiernego osadzania komórek na szkiełku nakrywkowym w płytce 24-dołkowej).
    2. Utrwalić komórki zimnym acetonem przez 15 min. Przemyć 3x razy PBS.
    3. Blokuj szkiełka w 10% koziej surowicy. Inkubować szkiełka z pierwszorzędowymi przeciwciałami przez noc (Tabela 2).
    4. Umyj szkiełka 3x w PBS. Inkubować przeciwciała drugorzędowe przez 2 godziny (tabela 2).
    5. Przeciwbejkowanie przesuwa się i montuje za pomocą jednej kropli DAPI w nośnikach montażowych o powolnym blaknięciu.
  3. Analiza czystości populacji FACS: sondowanie MEFSK4 (Rysunek 3B)
    1. Ponownie zawiesić świeżo wyizolowane komórki w 25 μl roztworu blokera FC, aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu przeciwciał. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    2. Opcjonalnie: dodać 25 μl 7AAD lub Ghost dye violet 510 do zawiesiny komórek. Inkubować przez 30–60 minut na lodzie w ciemności.
    3. Przemyć przez ponowne zamieszanie w 1 ml buforu FACS. Wirować przy 500 x g przez 5 min.
    4. Zawiesić osad w 50 μl buforu FACS. Dodaj przeciwciało MEFSK4 bezpośrednio do zawiesiny komórkowej. Inkubować przez 15 minut na lodzie (tabela 1).
    5. Przemyć przez ponowne zamieszanie w 1 ml buforu FACS. Wirować przy 400 x g przez 5 min.
    6. Dodaj szczurzą IgG-APC do komórek (Tabela 1). Inkubować przez 30 minut na lodzie.
    7. Przemyć przez ponowne zamieszanie w 1 ml buforu FACS. Wirować przy 400 x g przez 5 min.
    8. Zawiesić osad w zalecanej objętości próbki cytometrii przepływowej w buforze FACS (300 μl) i przenieść do probówki do cytometrii przepływowej w celu analizy przepływu.
  4. Analiza czystości fibroblastów: półilościowy rtPCR w czasie rzeczywistym (Rysunek 3C)
    1. Izolacja RNA i półilościowa PCR w czasie rzeczywistym
    2. Po wzbogaceniu fibroblastów wyizoluj RNA za pomocą zestawu do izolacji RNA (patrz tabela materiałów). Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta.
    3. Zakończ syntezę pierwszej nici DNA przy użyciu zestawu do syntezy cDNA (patrz tabela materiałów), postępując zgodnie z instrukcjami producenta.
    4. Wykonaj półilościowy PCR5.
  5. Analiza funkcjonalności fibroblastów: test kurczliwości żelu kolagenowego (Rysunek 4)
    1. Roztwór kolagenu
      1. Przygotuj 20 mM HEPES i 44 mM NaHCO3 w DMEM. Dodaj 1,67 mg kolagenu szczurzego typu 1 na 1 ml DMEM z HEPES i NaHCO3.
    2. DMEM uzupełniony TGFβ
      1. Przygotuj 10% FBS w DMEM uzupełniony antybiotykami i środkami przeciwgrzybiczymi. Dodać TGFβ do końcowego stężenia 1 ng/ml.
    3. Mieszanina komórkowo-kolagenowa i posiewanie
      1. Przygotować zawiesinę komórek (P3-P5) i określić wymaganą objętość, aby uzyskać 3,3 x 105 komórek.
      2. Dodaj objętość zawiesiny z 3,3 x 105 komórek do wystarczającej ilości roztworu kolagenu, aby uzyskać 1 ml całkowitej objętości.
        UWAGA: Stężenie kolagenu szczurzego typu 1 powinno teraz wynosić 1,5 mg/ml.
      3. Na płytce 48-dołkowej wysiew 300 μl mieszanki komórkowo-kolagenowej na dołek (~1 x 105 komórek/dołek). Inkubować w temperaturze 37 °C przez 15–20 minut, aż do zżelowania się.
      4. Użyj igły 30 G, aby oddzielić żel od ścianek studzienki. Dodać 600 μl TGFβ i DMEM uzupełnionego FBS do każdego dołka. Płyty pamięciowe na skanerze refleksyjnym w 24 h i 48 h.
        UWAGA: Wszystkie eksperymenty immunofluorescencyjne przeprowadzono na maszynie do cytometrii przepływowej wyposażonej w trzy lasery (405 nm, 488 nm i 640 nm). Dane zostały pozyskane za pomocą oprogramowania do pozyskiwania danych przepływowych (Tabela materiałów). Dalsza analiza danych została przeprowadzona przy użyciu oprogramowania do analizy danych przepływowych. AlexaFluor 405 i Ghost Dye Violet 510 zostały wzbudzone laserem 405 nm i zebrane za pomocą filtra odpowiednio 450/50 BP i 525/50 BP. GFP i PE zostały wzbudzone przez laser o długości fali 488 nm i zebrane za pomocą filtrów odpowiednio 530/30 BP i 575/26 BP. APC lub AlexaFluor 647 był wzbudzany przez laser 640 nm i zbierany za pomocą filtra 670/14 BP. Wszystkie doświadczenia z sortowaniem komórek przeprowadzono na maszynie do cytometrii przepływowej (Tabela Materiałów) wyposażonej w cztery lasery (405 nm, 488 nm, 561 nm i 640 nm). 7-AAD wzbudzono za pomocą lasera o długości fali 561 nm i zebrano za pomocą filtra 670/14 BP. GFP i Ghost Dye Violet 510 zostały zebrane przy użyciu tych samych kombinacji laser/filtr, jak opisano powyżej. We wszystkich eksperymentach sortowania wykorzystano dyszę 100 um z konfiguracją ciśnienia 17 psi w celu zwiększenia żywotności komórek docelowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Schemat bramowania przepływu demonstrujący izolację miofibroblastów z wykorzystaniem myszy reporterowych αSMA-GFP
W modelu mysim reporterowym αSMA-GFP w nieuszkodzonych sercach nie stwierdzono komórek GFP+; dlatego posłużyły one do ustanowienia bramki dla sygnału tła kanału GFP po kompensacji (Rysunek 2). Komórki αSMA+ zostały wyselekcjonowane na podstawie ekspresji GFP z uszkodzonej lewej komory 10 dni po MI. Niewielki odsetek komórek śródbłonka (k...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Fibroblasty to niejednorodna grupa komórek, identyfikowana za pomocą zróżnicowanego zestawu markerów. Markery białkowe, które zostały wykorzystane do identyfikacji fibroblastów, to receptor domeny dyskoidyny 2 (DDR2), fibronektyna, wimentyna, kolagen I i III oraz Thy1 15,16,17,18,19,20. Podczas gdy wimentyna była używana do i...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy pragną podziękować Dr. Ivo Kalajzic za myszy αSMA-GFP. Badania przedstawione w tej publikacji były wspierane przez Narodowy Instytut Ogólnych Nauk Medycznych Narodowych Instytutów Zdrowia (NIH) w ramach nagrody numer R01GM118300 (SS), Narodowy Instytut Obrazowania Biomedycznego i Bioinżynierii NIH w ramach nagrody numer R21EB019509 (P.P.Y.) oraz Grant Rozwoju Naukowca Amerykańskiego Towarzystwa Kardiologicznego w ramach nagrody o numerze 17SDG33630187 (SS). Analizy cytometrii przepływowej przeprowadzono w VUMC Flow Cytometry Shared Resource, który jest wspierany przez Vanderbilt Ingram Cancer Center (P30 CA68485) i Vanderbilt Digestive Disease Research Center (DK058404).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
odczynniki
Aceton
Przeciwgrzybicze (amfoterycyna B-rozpuszczona; Fungizone)Sigma AldrichA9528
Albumina seromy bydlęcej (BSA)Sigma9048-46-8
cytrynianu
chlorku
Mieszanka kolagenazy (Liberase Blendzyme 3 TH)Roche Applied Science
DAPI
DDI woda
Woda
DMEM-F12 z technologiami L-Glutaminy i HEPESLife11330057
Dnazy I(20U/mL)BioRad7326828
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami Dulbecco (dPBS) bez Ca2+ i Mg2+Gibco13190-144
70% bloker FC na etanol
(oczyszczony anty-mysie CD16/CD32)Tonbo Biosciences70-0161
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Technologie życia16000044
10% kozia surowica
Zbilansowany roztwór soli Hanka (HBSS) z Ca2+ i Mg2+Corning21-023-CV
1M HEPESCorning25-060-Ci
Krebs-Henseleit Bufor w proszkuSigmaK3753
Mycoplasma profilaktyczny (Plasmocin)Invivogenant-mpp
Penicylina/StreptomycynaThermo Fisher Scientific15140122
1x Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)
10x Bufor do lizy czerwonych krwinekMiltenyi130-094-183
Nośnikmontażowy o spowolnionym blaknięciu
Azydek
sodu Wodorowęglan
TGFβ
Trypanowa niebieska plama (0,4%)Gibco15250-061
Typ 1 Szczurzy kolagen
Przeciwciała
7AAD (zapas: 1 mg/ml roztwór w DMSO)Sondy molekularneA1310rozcieńczenie = 1:1000; RRID =
CD45-APCBD Bioscience559864rozcieńczenie = 1:200; RRID = AB_398672
CD31-PEBD Bioscience553373rozcieńczenie = 1:200; RRID = AB_394819
CD31BD Biosciences553370rozcieńczenie = 1:250; RRID = AB_394816
CD45BD Biosciences553076rozcieńczenie = 1:250; RRID = AB_394606
COL 1α 1MD Bioproducts203002rozcieńczeniu = 1:1000; RRID =
Barwnik duchowy fioletowy 510 (Formulacja: 1 uL/test w DMSO)Tonbo Biosciences13-0870rozcieńczenie = 1:1000; RRID =
sondy molekularneanty-mysie Alexa Fluor 488Rozcieńczenie A11029= 1:200; RRID = AB_138404
Koza anty-króliczo-Cy3Southern Biotech4050-02rozcieńczenie = 1:200; RRID = AB_2795952
Kozioł anty-królik-FITCJackson Immunoresearch Laboratories711-165-152rozcieńczenie = 1:200; RRID = AB_2307443
sondy molekularneprzeciw szczurom Alexa Fluor 488A11006rozcieńczenie = 1:200; RRID = AB_2534074
Koza przeciw szczurom Alexa Fluor 647Thermo-FisherA21247rozcieńczenie = 1:200; RRID = AB_141778
PeriostinSanta CruzSC67233rozcieńczenie = 1:100; RRID = AB_2166650
VimentinSigma AldrichV2258rozcieńczenie = 1:200; RRID = AB_261856
&alfa;-aktyna mięśni gładkich (&alfa;SMA)Sigma AldrichA2547rozcieńczenie = 1:1000; RRID = AB_476701
Białko specyficzne dla fibroblastów 1 (FSP1)Milipor 07-227407-2274rozcieńczenie = 1:100; RRID = AB_10807552
Kulki magnetyczne CD45Miltenyi Biotec130-052-301
CD31 Koraliki magnetyczneMiltenyi Biotec130-087-418
Ogniwa antypodajnikowe-APC (MEFSK4)Miltenyi Biotec130-102-900rozcieńczenie = 1:100; RRID = AB_2660619
kulki anty-APCMiltenyi Biotec130-090-855
IgG-APC SzczurMiltenyi Biotec130-103-034rozcieńczenie = 1:100; RRID = AB_2661598
Osioł anty-szczur Alexa Fluor405Abcamab175670rozcieńczenie = 1:100
anty-AN2/NG2Miltenyi Biotec130-097-455rozcieńczenie = 1:11; RRID = AB_2651235
Inne materiały
0,22 &mikro; m FiltrThermo Scientific723-2520
10 cm2 Naczynie do hodowli komórkowychCorning430167
10 mL PipetaFisherbrand13-678-11E
40 µ m Sitko do komórekFisherbrand22363547
5 ml PipetaFisherbrand13-678-11D
50 ml Rurka stożkowaFalcon352070
Płytka 6-dołkowaCorning3506
Probówki do cytometrii przepływowejFalcon352058
Rocker
Ostrze jednoostrzowePAL62-0177
Nożyczki
GFP-αSMA Reporter Myszy
Separator MACS Pole
Kolumna
Szkiełka
Qaigen Rneasy Mini KitQaigen74104
Zestaw do całkowitej izolacji mikro roztworówAmbionAM1931
Zestaw do syntezy cDNA BioRad iScriptBioRad1708891
48-dołkowa płytka
30G Igła
3 Laserowa cytometria przepływowa (BD LSRFortessa)BD Biosciences
4 Przepływ laserowy Maszyna do cytometrii (BD FACSAria III)przepływie BD Biosciences
(BD FACSDiva Software v8.0a)BD Biosciences
(oprogramowanie FlowJo)BD Biosciences
Bufor wapniaDIsoduKozie Kozie chirurgicznemagnetyczneseparacyjna MACSnakrywkowe wodnych Oprogramowanie do pozyskiwania danych o Oprogramowanie do analizy danych przepływu

Bibliografia

  1. Ivey, M. J., Tallquist, M. D. Defining the Cardiac Fibroblast. Circulation Journal. 80 (11), 2269-2276 (2016).
  2. Prabhu, S. D., Frangogiannis, N. G. The Biological Basis for Cardiac Repair After Myocardial Infarction: From Inflammation to Fibrosis. Circulatory Research. 119 (1), 91-112 (2016).
  3. Duan, J., et al. Wnt1/betacatenin injury response activates the epicardium and cardiac fibroblasts to promote cardiac repair. EMBO Journal. 31 (2), 429-442 (2012).
  4. Shinde, A. V., Frangogiannis, N. G. Fibroblasts in myocardial infarction: a role in inflammation and repair. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 70, 74-82 (2014).
  5. Saraswati, S., Marrow, S. M. W., Watch, L. A., Young, P. P. Identification of a pro-angiogenic functional role for FSP1-positive fibroblast subtype in wound healing. Nature Communications. 10 (1), 3027(2019).
  6. Kong, P., Christia, P., Saxena, A., Su, Y., Frangogiannis, N. G. Lack of specificity of fibroblast-specific protein 1 in cardiac remodeling and fibrosis. American Journal of Physiology -Heart and Circulatory Physiology. 305 (9), 1363-1372 (2013).
  7. Furtado, M. B., Nim, H. T., Boyd, S. E., Rosenthal, N. A. View from the heart: cardiac fibroblasts in development, scarring and regeneration. Development. 143 (3), 387-397 (2016).
  8. Stellato, M., Czepiel, M., Distler, O., Blyszczuk, P., Kania, G. Identification and Isolation of Cardiac Fibroblasts From the Adult Mouse Heart Using Two-Color Flow Cytometry. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 6, 105(2019).
  9. Ackers-Johnson, M., et al. A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart. Circulatory Research. 119 (8), 909-920 (2016).
  10. Saraswati, S., Marrow, S. M. W., Watch, L. A., Young, P. P. Identification of a pro-angiogenic functional role for FSP1-positive fibroblast subtype in wound healing. Nature Communications. 10 (1), 3027(2019).
  11. Kalajzic, Z., et al. Use of an alpha-smooth muscle actin GFP reporter to identify an osteoprogenitor population. Bone. 43 (3), 501-510 (2008).
  12. Travers, J. G., Kamal, F. A., Robbins, J., Yutzey, K. E., Blaxall, B. C. Cardiac Fibrosis: The Fibroblast Awakens. Circulatory Research. 118 (6), 1021-1040 (2016).
  13. Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 76 (3), 1274-1278 (1979).
  14. Montesano, R., Orci, L. Transforming growth factor beta stimulates collagen-matrix contraction by fibroblasts: implications for wound healing. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 85 (13), 4894-4897 (1988).
  15. Goldsmith, E. C., et al. Organization of fibroblasts in the heart. Developmental Dynamics. 230 (4), 787-794 (2004).
  16. Bagchi, R. A., Lin, J., Wang, R., Czubryt, M. P. Regulation of fibronectin gene expression in cardiac fibroblasts by scleraxis. Cell Tissue Research. 366 (2), 381-391 (2016).
  17. Goodpaster, T., et al. An immunohistochemical method for identifying fibroblasts in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (4), 347-358 (2008).
  18. Chapman, D., Weber, K. T., Eghbali, M. Regulation of fibrillar collagen types I and III and basement membrane type IV collagen gene expression in pressure overloaded rat myocardium. Circulatory Research. 67 (4), 787-794 (1990).
  19. Vasquez, C., Benamer, N., Morley, G. E. The cardiac fibroblast: functional and electrophysiological considerations in healthy and diseased hearts. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 57 (4), 380-388 (2011).
  20. Hudon-David, F., Bouzeghrane, F., Couture, P., Thibault, G. Thy-1 expression by cardiac fibroblasts: lack of association with myofibroblast contractile markers. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 42 (5), 991-1000 (2007).
  21. Kanisicak, O., et al. Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart. Nature Communications. 7, 12260(2016).
  22. Pinto, A. R., et al. Revisiting Cardiac Cellular Composition. Circulatory Research. 118 (3), 400-409 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Izolacja miofibroblast wizolacja kom rekcytometria przep ywowaseparacja magnetycznawysiew r nicowysortowanie kom rek aktywowane fluorescencjmyszy Alpha SMA GFPantygen MEFSK4skurcz kolagenu
Izolacja i charakterystyka dorosłych fibroblastów i miofibroblastów serca
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.