Tutaj charakteryzujemy strukturę białek i miejsca interakcji w żywych komórkach za pomocą techniki śladu białkowego, zwanej szybkim fotochemicznym utlenianiem białek w komórce (IC-FPOP).
Artykuł metodologiczny
Charakterystyka białek komórkowych za pomocą szybkiego fotochemicznego utleniania białek w komórce
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Szybkie fotochemiczne utlenianie białek (FPOP) to metoda oznaczania śladów białek rodników hydroksylowych, używana do charakteryzowania struktury i oddziaływań białek. FPOP wykorzystuje laser excimerowy o długości fali 248 nm do fotolizy nadtlenku wodoru wytwarzającego rodniki hydroksylowe. Rodniki te modyfikują oksydacyjnie odsłonięte przez rozpuszczalnik łańcuchy boczne 19 z 20 aminokwasów. Ostatnio metoda ta została zastosowana w żywych komórkach (IC-FPOP) do badania interakcji białek w ich natywnym środowisku. Badanie białek w komórkach odpowiada za stłoczenie międzycząsteczkowe i różne interakcje białkowe, które są zakłócone w badaniach in vitro. Niestandardowy system przepływu pojedynczych komórek został zaprojektowany w celu zmniejszenia agregacji i zatykania komórek podczas IC-FPOP. Ten system przepływu skupia komórki za laserem excimerowym indywidualnie, zapewniając w ten sposób stałe napromieniowanie. Porównując stopień utlenienia wytwarzanego przez FPOP z dostępnością rozpuszczalnika białka obliczoną na podstawie struktury krystalicznej, IC-FPOP może dokładnie zbadać dostępne dla rozpuszczalnika łańcuchy boczne białek.
Wprowadzenie
Ślad białka rodnika hydroksylowego (HRPF) to metoda, która bada dostępność rozpuszczalnika białka poprzez kowalencyjne modyfikacje wytwarzane z rodników hydroksylowych. Kiedy zmienia się struktura białka lub interakcje białkowe, zmienia to ekspozycję aminokwasów na rozpuszczalnik, zmieniając w ten sposób zakres modyfikacji reszt. Dzięki HRPF interakcje białkowe1,2,3 i zmiany konformacyjne białek4,5,6 zostały pomyślnie zbadane in vitro. Istnieje kilka metod, które generują rodniki hydroksylowe do eksperymentów HRPF, jedną z nich jest szybkie fotochemiczne utlenianie białek (FPOP). FPOP został opracowany przez Hambly i Gross w 2005 roku i wykorzystuje laser excimerowy o długości fali 248 nm do wytwarzania rodników hydroksylowych poprzez fotolizę nadtlenku wodoru (H2O2)7.
Niedawno, Espino et al. rozszerzyli zastosowanie FPOP do badania struktury białek w żywych komórkach, metody określanej jako IN-CELL FPOP (IC-FPOP)8. W przeciwieństwie do badań in vitro, badanie białek w komórkach odpowiada za stłoczenie molekularne wraz z różnymi interakcjami białkowymi, które mogą potencjalnie wpływać na strukturę. Ponadto ma tę zaletę, że zapewnia migawkę pełnego proteomu, potencjalnie dostarczając informacji strukturalnych wielu systemów jednocześnie w celu przeprowadzenia biologii strukturalnej całego proteomu. Co więcej, technika ta jest idealna dla białek, które są trudne do zbadania in vitro, takich jak białka błonowe.
Wstępne badania IC-FPOP z powodzeniem zbadały 105 białek pod względem obfitości białek i lokalizacji komórkowej. Aby udoskonalić metodę IC-FPOP, Rinas i in. opracowali system mikroprzepływu dla przepływu pojedynczych komórek9. Ulepszenie oryginalnego systemu przepływu ogranicza agregację komórek i zwiększa dostępną ilośćH2O2dostępną do napromieniowania. W początkowym systemie przepływu komórki zbijające się w rurkach krzemionkowych powodowały zatykanie się i nierównomierne napromieniowanie. Włączenie dwóch strumieni bufora osłonowego hydrodynamicznie skupia komórki, umożliwiając im indywidualny przepływ obok lasera. Włączenie oddzielnej strzykawki doH2O2umożliwia bardziej kontrolowany i zoptymalizowany czas ekspozycji, co pozwala na uzyskanie wyższych stężeńH2O2bez negatywnych skutków. Również ograniczenie czasu inkubacji ogranicza rozkładH2O2przez endogenną katalazę. Dzięki zastosowaniu tego nowego systemu przepływu, liczba wykrytych białek z modyfikacją FPOP wzrosła 13-krotnie, rozszerzając w ten sposób możliwości tej metody w zakresie badania wielu białek w żywych komórkach. W tym protokole opisano ogólny eksperyment IC-FPOP skupiający się na montażu systemu przepływu IC-FPOP.
Protokół
1. Konfiguracja układu przepływowego IC-FPOP
- Aby rozpocząć montaż układu przepływowego, przytnąć kapilarę z topionego krzemienia do odpowiedniego rozmiaru za pomocą kamienia do przecinania. Układ przepływowy IC-FPOP wymaga czterech kapilar o długości 12 cm i jednej o długości 17 cm z średnicą wewnętrzną (ID) 450 µm i średnicą zewnętrzną (OD) 670 µm, dwóch kapilar o długości 24 cm i jednej o długości 40 cm z ID 75 µm i OD 360 µm, oraz na koniec dwóch kapilar o długości 57 cm z ID 150 µm i OD 360 µm.
UWAGA: Podczas cięcia kapilar krzemionkowych należy delikatnie zdrapać powłokę polimidową i zgiąć kapilarę, aby uzyskać najczystsze cięcie. Należy sprawdzić, czy cięcie jest proste (jest to niezbędne, aby zapobiec powstawaniu zatorów lub wycieków). - Przygotować 15 połączeń, używając tulejek nano-tight (0.0155" ID X 1/16" OD dla kapilar krzemionkowych o OD 360 µm oraz 0.027" ID X 1/16" OD dla kapilar krzemionkowych o OD 670 µm) z nakrętkami super flangeless PEEK 1/4-28 flat-bottom dla 1/16" OD oraz pierścieniami super flangeless w/SST, Tefzel (ETFE), 1/4-28 flat-bottom, dla 1/16" OD. Połączenia wykonać zgodnie z protokołem producenta (Rysunek 1).
- Umieścić 6 małych magnesów cylindrycznych w jednej strzykawce 500 µL. Wypełnić tę strzykawkę, drugą strzykawkę 500 µL oraz dwie strzykawki 5 mL buforem i usunąć pęcherzyki powietrza. Umieścić je w pompie strzykawkowej, jak pokazano na Rysunku 2A.
UWAGA: Strzykawki 5 mL są większe od strzykawek 500 µL, dlatego konieczne jest zastosowanie dystansera, aby jednocześnie i mocno osadzić wszystkie strzykawki na miejscu (Rysunek 2B). - Dokręcić ogranicznik pompy strzykawkowej w taki sposób, aby w strzykawce z komórkami pozostało około 50 µL w momencie zatrzymania silnika. Pozostawi to miejsce dla mieszadeł magnetycznych (Rysunek 2C-D).
OSTROŻNIE: Jeśli pompa strzykawkowa wywrze nacisk na magnesy, zablokują one strzykawkę, co może doprowadzić do jej pęknięcia. - Za pomocą adaptera Luera podłączyć zawór ręczny do każdej strzykawki. Złożyć kapilary krzemionkowe zgodnie z Rysunkiem 3.
UWAGA: Przeciągnąć linię z komórkami i H2O2 przez cały krzyżak na drugą stronę. Następnie wprowadzić ją do kapilary krzemionkowej o ID 450 µm. Bufory osłonkowe w strzykawce 5 mL będą przepływać z większą prędkością niż komórki i H2O2. Dzięki obecności buforów osłonkowych po obu stronach, komórki zostaną hydrodynamicznie skupione w jedną linię w celu naświetlania. - Ustawić układ przepływowy obok lasera. Za pomocą zapalniczki wypalić powłokę krzemionkową na kapilarze o ID 450 µm, aby utworzyć okno do naświetlania laserem.
- Umieścić mieszadło magnetyczne nad strzykawką z komórkami zawierającą sześć magnesów.
- Ustawić pompę strzykawkową na 492.4 µL/min, aby uzyskać końcowy przepływ rzędu 1,083.3 µL/min. Przepuścić bufor przez układ trzy razy, aby go wypłukać i sprawdzić szczelność.
- Skupić wiązkę lasera ekscymerowego na kapilarze krzemionkowej za pomocą soczewki wypukłej. Po ustawieniu ostrości sprawdzić okno naświetlania, umieszczając mały kawałek papieru za kapilarą i włączając laser. Zmierzyć obszar wypalony w wyniku naświetlania. Obliczyć wymaganą częstotliwość lasera, wykorzystując szerokość okna naświetlania i szybkość przepływu, aby uzyskać ułamek wykluczenia równy zero.
UWAGA: Zalecana energia lasera dla eksperymentu IC-FPOP wynosi ≥120 mJ. Aby uzyskać ułamek wykluczenia 0 przy oknie naświetlania 2.58 mm i szybkości przepływu 1083.3 µL/min, częstotliwość musi wynosić 44. Poniżej znajdują się równania niezbędne do obliczenia częstotliwości lasera, jeśli znane są okno naświetlania, szybkość przepływu i ułamek wykluczenia.
gdzie w to objętość w nL, x to szerokość plamki laserowej w mm, y to ID kapilary krzemionkowej w µm, v to objętość całkowita w µL, b to ułamek wykluczenia, a to szybkość przepływu w µL/min, a f to częstotliwość w Hz.
2. Przygotowanie roztworu gaszącego i H2O2
- Przygotować roztwór gaszący zawierający 100 mM N-tert-butylo-alfa-fenylonitronu (PBN) oraz 100 mM N,N'-dimetylotio mocznika (DMTU). Odmierzyć 11 mL roztworu gaszącego dla każdej próbki do probówki stożkowej o pojemności 50 mL.
- Rozcieńczyć H2O2 do stężenia 200 mM. Każda próbka wymaga 500 µL H2O2.
UWAGA: Roztwór gaszący można przygotować dzień wcześniej i przechowywać przez noc w temperaturze 4 °C, chroniąc go przed światłem. H2O2 należy przygotować na świeżo w dniu przeprowadzenia eksperymentu.
3. Zbieranie komórek
- Hodować komórki w kolbie T175 do uzyskania konfluencji na poziomie około 70-90%.
- Usunąć medium i wypłukać buforem.
UWAGA: Typowe stosowane bufory to roztwór soli fosforanowej według Dulbecco (DPBS) lub zrównoważony roztwór soli Hanksa (HBSS) klasy do hodowli komórkowych. - Odczepić komórki, używając trypsyny z EDTA lub skrobaka.
- Po odczepieniu resuspender komórki w 10 mL buforu i policzyć je.
- Odwirować, usunąć bufor oraz trypsynę z EDTA, a następnie resuspender w celu uzyskania stężenia 2 x 106 komórek/mL.
- Odmierzyć aliquoty po 500 µL zawiesiny komórkowej na każdą próbkę.
UWAGA: Dla każdego wariantu doświadczalnego przygotować minimum 3 próbki poddawane działaniu lasera oraz 3 kontrole bez naświetlania laserem.
4. Wykonanie IC-FPOP
- Napełnij dwie strzykawki 5 mL buforem, strzykawkę 500 µL zawierającą magnesy komórkami, a ostatnią strzykawkę 500 µL H2O2. Włącz mieszadło magnetyczne.
- Dodaj 220 µL dimetylosulfotlenku (DMSO) do jednej porcji roztworu gaszącego, delikatnie wymieszaj i umieść za układem przepływowym, aby zebrać napromieniowane próbki. Dodatek DMSO zahamuje endogenną reduktazę sulfotlenku metioniny.
- Włącz laser, odczekaj 7 s, a następnie włącz układ przepływowy.
- Po zakończeniu przepływu próbki wyłącz laser i delikatnie wymieszaj roztwór gaszący z zebraną próbką. Odstaw ją na bok podczas wykonywania kroków 4.5 i 4.6.
- Napełnij wszystkie cztery strzykawki buforem, w którym zawieszone są komórki, i przepuść go przez układ przepływowy.
- Po zakończeniu płukania układu powtórz kroki 4.1 i 4.2. Uruchom przepływ bez naświetlania. Jest to kontrola bez lasera, służąca do uwzględnienia tła utleniania w komórkach.
- Podczas przepływu kolejnej próbki odwiruj poprzednią próbkę przy 450-800 x g przez 5 min, usuń rozpuszczalnik i resuspenduj w 100 µL buforu do lizy komórek, np. buforu do analizy radioimmunoprecypitacyjnej (RIPA).
- Przenieś próbkę do probówki do mikrocentryfugi i zamroź gwałtownie w ciekłym azocie.
- Po zakończeniu analizy wszystkich próbek rozmontuj układ przepływowy w celu jego oczyszczenia. Wyrzuć zużyte rurki krzemionkowe, a pozostałe połączenia oczyść poprzez sonikację przez 1 h w mieszaninie 50% wody i 50% metanolu. Oczyść strzykawki zgodnie z instrukcjami producenta.
5. Trawienie
- Przeprowadzić trawienie lizatu całych komórek. Rozpocząć od rozmrożenia próbek i ogrzania ich w temperaturze 95 °C przez 10 min.
- Po ogrzaniu schłodzić lizat na lodzie przez 15 min.
- Dodać 25 jednostek nukleazy w celu trawienia DNA i RNA, a następnie inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 min.
- Wirować próbki w wirówce stołowej przy 16 000 x g przez 10 min w temperaturze 4 °C.
- Zebrać nadsącz i przenieść go do czystej probówki do mikrowirówki.
- Oznaczyć stężenie białka za pomocą zestawu do analizy białek.
- Przenieść 20-100 µg próbki do czystej probówki do mikrowirówki i uzupełnić objętość do 100 µL.
- Zredukować próbki za pomocą 20 mM ditiotreitolu (DTT) w temperaturze 50 °C przez 45 min.
- Schłodzić próbki w temperaturze pokojowej przez 15 min.
- Przeprowadzić alkilację za pomocą 20 mM jodoacetamidu (IAA) w temperaturze pokojowej przez 20 min, chroniąc próbki przed światłem.
- Dodać schłodzony wcześniej aceton w stosunku białko:aceton 1:4. Wymieszać próbki i pozostawić w temperaturze -20 °C przez noc.
- Następnego dnia wirować próbki przy 16 000 x g przez 10 min w temperaturze 4 °C.
- Usunąć nadsącz i dodać 50 µL 90% schłodzonego wcześniej acetonu. Wymieszać próbki i odwirować przy 16 000 x g przez 5 min w temperaturze 4 °C.
- Usunąć aceton i pozostawić próbki do wyschnięcia, zostawiając otwarte nakrętki probówek do mikrowirówki i przykrywając je chusteczką bezpyłową. Po wyschnięciu próbek resuspender osad białkowy w buforze Tris 10 mM pH 8.
- Resuspender 20 µg trypsyny w 40 µL buforu Tris 10 mM pH 8. Dodać 2 µg trypsyny (stosunek masowy trypsyna:próbka 1:50). Inkubować próbki w temperaturze 37 °C przez noc.
- Następnego dnia oznaczyć stężenie peptydów za pomocą analizy peptydów. Po pobraniu części próbki do analizy peptydów, zatrzymać trawienie trypsyną poprzez dodanie kwasu mrówkowego do próbek (stężenie końcowe kwasu mrówkowego 5%).
- Po ustaleniu końcowego stężenia peptydów przenieść 10 µg każdej próbki do czystej probówki do mikrowirówki. Zapewnia to analizę tej samej ilości każdej z próbek. Wysuszyć próbkę w wirówce próżniowej. Po wysuszeniu resuspender w 20 µL 0,1% kwasu mrówkowego klasy do spektrometrii mas. Przenieść próbki do fiolek autosamplera.
6. Cieczowa chromatografia z tandemową spektrometrią mas
- Aby zlokalizować modyfikacje FPOP, należy przeanalizować strawiony lizat komórkowy za pomocą analizy LC-MS/MS.
- Jako fazy ruchome należy zastosować 0,1% kwas formiowy w wodzie (A) oraz 0,1% kwas formiowy w acetonitrylu (B).
- Nanieś 0,5 µg próbki na kolumnę pułapkową C18 (5 µm i 100 Å) o wymiarach 180 µm x 20 mm i przemyj próbkę roztworem 99% (A) i 1% (B) przez 15 min.
- Używając kolumny analitycznej C18 (5 µm i 125 Å) o wymiarach 75 µm x 30 cm, przeprowadź metodę rozdziału analitycznego z przepływem 0,300 µL/min, rozpoczynając od 3% (B) przez jedną minutę, a następnie zwiększając stężenie do 10% (B) w czasie od 1 do 2 min. Następnie zwiększ stężenie do 45% (B) w czasie od 2 do 100 min, a potem do 100% (B) w czasie od 100 do 110 min. Oczyść kolumnę, utrzymując 100% (B) od 110 do 115 min. Rekondycjonuj kolumnę, zmniejszając stężenie do 3% (B) w czasie od 115 do 116 min i utrzymując 3% (B) od 116 do 130 min.
- Ustaw metodę akwizycji MS na rozdzielczość 60 000 z zakresem skanowania m/z od 375 do 1500. Ustaw wartość docelową automatycznej kontroli wzmocnienia (AGC) na 5,0 x 105 z maksymalnym czasem wtrysku 50 ms.
- Podczas akwizycji MS wybierz jony prekursorowe o stanach ładunku 2-6 do izolacji poprzez akwizycję zależną od danych (DDA) z oknem izolacji 1,2 m/z i czasem cyklu 4 s. Wybierz peptydy z progiem intensywności 5,0 x 104 do aktywacji HCD z znormalizowaną energią ustawioną na 32%. Wyklucz peptydy po jednej akwizycji MS/MS przez 60 s. Ustaw rozdzielczość MS/MS na 15 000 z wartością docelową AGC 5,0 x 104 i maksymalnym czasem wtrysku 35 ms.
7. Przetwarzanie danych
- Przeszukaj pliki RAW w dostępnym oprogramowaniu do analizy białek, korzystając z odpowiedniej bazy danych białek oraz właściwego enzymu trawiennego. W tym przypadku użyj bazy Swiss-Prot Homo Sapiens i trypsyny.
- Ustaw zakres przeszukiwania masy prekursorów od 350 do 5 000 Da oraz tolerancję masy wynoszącą 10 ppm. Dopuszczalna jest maksymalnie 1 pominięta lokalizacja cięcia, a długość peptydów powinna mieścić się w przedziale od 6 do 144 aminokwasów. Ograniczenia te ułatwiają przeszukiwanie bazy danych.
- Ustaw maksymalną tolerancję masy jonów fragmentacyjnych na 0,02 Da, przyjmując karbamidometylację (+57,021) jako modyfikację statyczną oraz wszystkie modyfikacje FPOP z 17 aminokwasów jako modyfikacje dynamiczne (Rysunek 4 przedstawia przykład schematu analizy białek wykorzystanego do wykrywania modyfikacji FPOP).
UWAGA: Modyfikacje FPOP seryny i treoniny nie są uwzględnione w przeszukiwaniu ze względu na ich niższą reaktywność z rodnikami hydroksylowymi. - Przeprowadź przeszukiwanie z wykorzystaniem bazy decoy przy współczynniku fałszywych odkryć (FDR) wynoszącym 1% i 5%.
- Po zakończeniu przeszukiwania plików oblicz stopień modyfikacji FPOP. Otwórz program Proteome Discoverer 2.2 i wyeksportuj informacje o sekwencji, lokalizacjach modyfikacji, numerze dostępowym białka, pliku widma, obfitości prekursora oraz czasie retencji. Oblicz stopień modyfikacji zgodnie z równaniem 4:
Pole EIC zmodyfikowane to pole chromatograficzne konkretnego peptydu z modyfikacją rodnikiem hydroksylowym. Pole EIC to całkowite pole chromatograficzne obszarów zmodyfikowanych i niezmodyfikowanych tego konkretnego peptydu. Stopień utleniania oblicza się w próbkach poddanych i niepoddanych naświetlaniu. Próbka bez naświetlania (kontrola) uwzględnia wszelkie tło utleniania, które mogło występować w komórkach przed i po ekspozycji na H2O2. Wartości kontrolne odejmuje się od próbek naświetlanych, aby wyizolować modyfikacje specyficzne dla FPOP.
Wyniki
IC-FPOP jest metodą footprintingu służącą do badania oddziaływań białkowych w żywych komórkach. W systemie przepływowym IC-FPOP czas ekspozycji na H2O2 jest ograniczony do około 3 s, co pozwala na zastosowanie wyższych stężeń H2O2 bez szkodliwych konsekwencji dla komórek. System przepływowy zawiera również dwa strumienie buforu osłonowego, który hydrodynamicznie skupia komórki w centrum rurki, tworząc pojedynczy strumień komórek poddawanych jednorodnemu naświetlaniu (Rysunek 5)9. Obrazowanie fluorescencyjne ortogonalnych przekrojów YZ (Rysunek 5A) wykazuje wyraźną separację buforu osłonowego (zawierającego fluorofor FITC) od zawiesiny komórkowej (zawierającej fluorofor TMRM). Aby podkreślić tę separację, na Rysunku 5B oraz Rysunku 5C przedstawiono trójwymiarowe średnie mapy ciepła odpowiednio dla roztworu buforu osłonowego i zawiesiny komórkowej, co ilustruje minimalne mieszanie się obu roztworów.
Zastosowanie systemu przepływowego dla pojedynczych komórek zwiększa liczbę białek zmodyfikowanych utleniająco 13-krotnie (Rycina 6A)9. W tej metodzie białka w wielu przedziałach komórkowych ulegają znakowaniu, przy czym najczęściej spotykane są białka błonowe, cytoplazmatyczne oraz białka jądrowe8,9. Aby upewnić się, że białka zostały zmodyfikowane w nienaruszonych komórkach, wykonano obrazy fluorescencyjne komórek traktowanych CellROX po podaniu H2O2 i napromieniowaniu (Rycina 6B)8. Stabilność komórek w trakcie procesu znakowania dodatkowo potwierdza skuteczność IC-FPOP w badaniu białek w ich naturalnym środowisku komórkowym. Dzięki zastosowaniu tandemowej spektrometrii mas modyfikacje te można przypisać do konkretnych aminokwasów w białku. Rycina 7 przedstawia modyfikację zachodzącą podczas IC-FPOP wraz z odpowiadającym jej chromatogramem jonów wyekstrahowanych. Przesunięcie zaobserwowane w chromatogramie jonów wyekstrahowanych odpowiada zmianie hydrofobowości spowodowanej utlenioną metioniną w zmodyfikowanym peptydzie.
Aby sprawdzić, czy modyfikacje FPOP badają dostępność rozpuszczalnika wewnątrz komórek, aktynę znakowaną wewnątrzkomórkowo porównano zarówno z badaniem footprintingu in vitro, jak i z różnymi strukturami krystalicznymi aktyny (Rysunek 8)8. Aktyna znakowana wewnątrzkomórkowo jest przedstawiona na Rysunku 8A, który wykazuje porównywalny stopień utleniania z badaniem in vitro przeprowadzonym przez Guan i współpracowników10 (Rysunek 8B), co pozwala stwierdzić, że aktyna wykazuje podobną dostępność rozpuszczalnika zarówno w badaniach wewnątrzkomórkowych, jak i in vitro. Aby dodatkowo potwierdzić, że IC-FPOP bada dostępność rozpuszczalnika aktyny, stopień modyfikacji FPOP porównano z dostępnością rozpuszczalnika znakowanych reszt obliczoną na podstawie dwóch struktur krystalicznych aktyny (Rysunek 8C). Korelacja ta dowodzi, że IC-FPOP skutecznie bada dostępność rozpuszczalnika białka monomerycznego.
Rycina 1: Jak prawidłowo konstruować tuleje ferulowe. (A) Przed dokręceniem należy dopasować do siebie ferule, rurkę kwarcową i tuleję. (B) Dokręć wszystkie elementy razem. (C) Produktem końcowym będzie ferula mocno dokręcona do tulei. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.
Rysunek 2: Konfiguracja systemu przepływowego IC-FPOP. (A) Zdjęcie w pełni zmontowanego systemu przepływowego IC-FPOP ustawionego obok lasera. (B) Przykład dystansera niezbędnego do zwiększenia średnicy zewnętrznej strzykawek 500 µL w celu skutecznego wspólnego dokręcenia wszystkich strzykawek. (C) Reprezentatywne zdjęcia pokazujące przestrzeń wymaganą dla mieszadeł magnetycznych. (D) Zatkory są niezbędne do zatrzymania pompy strzykawkowej bez uszkadzania strzykawek. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 3: Schemat układu przepływowego opracowanego dla IC-FPOP. Niebieskie linie reprezentują rurki kwarcowe o średnicy wewnętrznej (ID) 450 µm i zewnętrznej (OD) 670 µm, czerwone linie mają ID 150 µm i OD 360 µm, a pomarańczowe linie mają ID 75 µm i OD 360 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.
Rycina 4: Oprogramowanie do analizy białek wykorzystane do wykrywania modyfikacji FPOP. Typowy schemat przepływu z odpowiadającymi mu modyfikacjami wyszukiwanymi w każdym węźle. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 5: System przepływu pojedynczych komórek hydrodynamicznie skupia komórki w jeden strumień. (A) Ortogonalny stos YZ obrazujący trójwymiarowe skupienie analizowanej komórki (czerwony, fluorofor TMRM) otoczonej buforem osłonowym (zielony, fluorofor FITC). Trójwymiarowa mapa ciepła średniej intensywności buforu osłonowego (B) i analizowanej komórki (C). Niższe intensywności są zaznaczone kolorem niebieskim, a najwyższe kolorem czerwonym (B-C). Rysunek zmodyfikowano na podstawie pracy Rinas et al.9 Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.
Rysunek 6: Zastosowanie systemu przepływowego IC-FPOP drastycznie zwiększa liczbę białek zmodyfikowanych przez FPOP w komórkach pobranych z układu.** (A) Porównanie utlenionych białek zidentyfikowanych z zastosowaniem i bez zastosowania systemu przepływowego. System przepływowy pozwolił na identyfikację 1391 białek zmodyfikowanych przez FPOP, podczas gdy bez systemu przepływowego zidentyfikowano jedynie 105 białek, przy czym 58 zmodyfikowanych białek było wspólnych dla obu metod. Rysunek został zmodyfikowany na podstawie pracy Rinas i wsp.9 (B) Obrazowanie fluorescencyjne komórek traktowanych CellROX po zabiegu IC-FPOP wykazuje, że komórki pozostają nienaruszone po znakowaniu oksydacyjnym. Komórki obrazowano przy użyciu wielofotonowego mikroskopu Olympus Fluoview FV1000 MPE przy 665 nm. Przedstawiony obraz to pojedynczy przekrój. Rysunek został zmodyfikowany na podstawie pracy Espino i wsp.8 Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 7: Przykłady tandemowych widm MS/MS powstających podczas IC-FPOP. Widma jonów produktowych (MS/MS) (A) peptydy niemodyfikowanego oraz (B) utlenienia wykrytego w reszcie M8 w tym peptydzie. Reprezentatywny EIC (C) peptydy niemodyfikowanego oraz (D) peptydy modyfikowanego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 8: IC-FPOP jest skuteczne w badaniu dostępności rozpuszczalnika białek. (A) Stopień modyfikacji dla 9 utlenionych modyfikacyjnie peptydów z aktyny. Wartości przedstawiono jako średnie plus i minus odchylenie standardowe (n = 3). (B) Modyfikacja peptydów aktyny utlenionych in vitro za pomocą radiolizy synchrotronowej według Guan i wsp.10 (C) Korelacja modyfikacji FPOP pozostałości z SASA w stanie zwartym (trójkąty, przerywana linia trendu) i otwartym (koła, ciągła linia trendu) aktyny. Rysunek został zmodyfikowany na podstawie pracy Espino i wsp.8 Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Dyskusja
Opracowano kilka technik opartych na spektrometrii mas w celu badania struktury białek i kompleksów białko-ligand w sposób obejmujący cały proteom w całych komórkach lub lizatach komórkowych. Techniki te obejmują między innymi stabilność białek na podstawie szybkości utleniania (SPROX), termiczne profilowanie proteomu (TPP), sieciowanie chemiczne (XL-MS) i ślad białka rodnika hydroksylowego (HRPF). Każda technika ma unikalne ograniczenia i zalety w porównaniu ze sobą, które zostały szeroko przeanalizowane12. Każda z tych metod została wykorzystana w biologii strukturalnej całego proteomu w celu wyjaśnienia struktury białek i ostatecznie ich funkcjonowania w złożonym środowisku komórkowym. IC-FPOP to technika HRPF, która wykorzystuje rodniki hydroksylowe do oksydacyjnej modyfikacji łańcuchów bocznych aminokwasów odsłoniętych na rozpuszczalnik, badając strukturę białka i interakcje białko-ligand w żywotnych komórkach13. IC-FPOP jest ulepszeniem początkowego HRPF w żywych komórkach, które wykorzystywały chemię Fentona do generowania rodników w skali minutowej14. W tym badaniu zmiany strukturalne w integralnym białku błonowym w odpowiedzi na obniżenie pH lub siły jonowej buforu udało się scharakteryzować z dobrym pokryciem oksydacyjnym białka. W porównaniu z chemią Fentona, IC-FPOP jest znacznie szybszy, modyfikując białka w skali mikrosekundowej, umożliwiając w ten sposób badanie natywnej konformacji białek.
Kluczowym testem dla IC-FPOP jest potwierdzenie żywotności komórek po ekspozycji naH2O2. Używając 40 cm linii mieszającej, komórki inkubuje się wH2O2przez około 3 s przed napromienianiem. Czas ten można regulować, zmieniając długość tej rurki krzemionkowej. Warto zauważyć, że chociaż zastosowanie błękitu trypanowego do badania żywotności komórek pokazuje, że integralność komórek jest utrzymywana po inkubacjiH2O2, komórki mogą potencjalnie być pod wpływem stresu wpływającego na szlaki sygnałowe, które oddziałują zH2O2. Na szczęście krótki czas inkubacji jest szybszy niż synteza białek, co daje pewność, że obecne białka nie są indukowane przezH2O2.
Kolejnym ważnym krokiem jest potwierdzenie prawidłowego montażu układu przepływowego. Po zmontowaniu upewnij się, że nie ma wycieków po przepłukaniu systemu żądanym buforem. Jeśli występują nieszczelności, upewnij się, że rurka krzemionkowa została prawidłowo przycięta i przylega do tulejki, aby zapewnić prawidłowe uszczelnienie po dokręceniu. Wszystkie części są dokręcane ręcznie, więc nie są potrzebne żadne narzędzia. Podczas każdego eksperymentu IC-FPOP upewnij się, że mieszadła magnetyczne w strzykawce komórkowej pozostają w ruchu. To małe poruszenie ogranicza liczbę komórek, które osiadają na dnie strzykawki, ale nie jest wystarczająco ostre, aby ścinać komórki. Po jednym uruchomieniu w strzykawce pozostaje około 50 μl komórek. Zawsze upewnij się, że rozcieńczyłeś to na etapie płukania, aby ograniczyć liczbę komórek, które przenoszą się do następnego eksperymentu. Zaleca się użycie strzykawki ze świeżymi komórkami, jeśli porównuje się leczenie wieloma komórkami. Istotne jest również dobranie odpowiedniego buforu dla badanych komórek. Niektóre wygaszają rodnik hydroksylowy, co prowadzi do mniejszej liczby modyfikacji białek. Xu i wsp. wykazali, że niektóre powszechnie stosowane skracają czas życia rodnika hydroksylowego11. DPBS i HBSS są powszechnymi używanymi w eksperymentach IC-FPOP.
Po IC-FPOP zoptymalizuj protokół trawienia w oparciu o potrzebne parametry. Ponieważ FPOP wytwarza nieodwracalne modyfikacje kowalencyjne, jest wystarczająco dużo czasu na dokładne trawienie i oczyszczanie bez utraty pokrycia etykietą. Zawsze testuj i normalizuj stężenie białka, aby równomierne stężenia peptydów były ładowane do tandemowej spektrometrii mas. Na koniec należy pamiętać, że immunoprecypitacji nie można wykonać w połączeniu z IC-FPOP. Jeśli modyfikacja FPOP jest ukierunkowana na region interakcji, powinowactwo przeciwciała zostanie obniżone. Aby pomóc w identyfikacji modyfikacji FPOP, etapy separacji metodą chromatografii 2D wykazały ponad trzykrotnie większą liczbę wykrytych utlenionych peptydów15.
Wyzwaniem każdego eksperymentu FPOP jest skomplikowany poziom analizy danych ze względu na możliwe produkty utleniania, które mogą powstać. Dotyczy to zarówno badań wewnątrzkomórkowych, jak i in vitro, ale drastycznie wzrasta wraz z dodatkową złożonością analizy lizatów komórkowych. Wraz z dalszą optymalizacją IC-FPOP powstaje więcej białek o wyższym pokryciu modyfikacji, co sprawia, że analiza staje się bardziej uciążliwa. Ścinająca ilość danych generowanych z pojedynczego eksperymentu IC-FPOP ogranicza użycie ręcznej walidacji, co powoduje, że badacze w większym stopniu polegają na oprogramowaniu. Z tego powodu Rinas i wsp. opracowali strategię oceny ilościowej HRPF przy użyciu Proteome Discoverer (PD)16. Ta metoda wykorzystuje przepływ pracy z wieloma węzłami wyszukiwania na PD w połączeniu z platformą ilościową w arkuszu kalkulacyjnym. Trwają prace nad dalszymi ulepszeniami platformy IC-FPOP w celu zwiększenia liczby zidentyfikowanych peptydów z modyfikacjami FPOP, a także zwiększenia odtwarzalności i dokładności oznaczania ilościowego.
Oświadczenia
Lisa Jones jest wynalazcą patentu na zespół przepływowy do ogniw (numer publikacji: 20180079998).
Podziękowania
Ta praca została wsparta przez nagrodę NSF CAREER Award (MCB1701692) dla LMJ.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Stożkowe probówki wirówkowe 15 ml | Fisher Scientific | 14-959-53A | wystarczy dowolna marka |
| ml gazoszczelna strzykawka, wyjmowana blokada Luer Lock | SGE Analytical Science | 008760 | |
| 50 ml stożkowe probówki wirówkowe | Fisher Scientific | 14-432-22 | wystarczy dowolna marka |
| 500 µ Strzykawki gazoszczelne L SGE: Naprawiono modele Luer-Lok | Fisher Scientific | SG-00723 | |
| Aceton, klasa HPLC | Fisher Scientific | A929-4 | Ilość 4 L nie jest konieczna |
| Acetonitryl z 0,1% kwasem mrówkowym (v / v), klasa LC / MS | Fisher Scientific | LS120-500 | |
| ACQUITY UPLC M-Class Symetria C18 Kolumna pułapki, 100 Å, 5 µ m, 180 i mikro; m x 20 mm, 2G, V/M, 1/opk | Wody | 186007496 | |
| ACQUITY UPLC M-Class System | Wody | ACQUITY UPLC M-Class System | |
| Folia aluminiowa | Fisher Scientific | 01-213-100 | wystarczy dowolna marka |
| Aqua 5 µ m C18 125 i Aring; materiał opakowaniowy | Phenomenex | 04A-4299 | |
| Wirówka | Eppendorf | 022625501 | |
| Delikatne wycieraczki | do zadań Fisher Scientific | 06-666A | |
| Dithiothreiotol (DTT) | AmericanBio | AB00490-00005 | |
| DMSO, Bezwodny | Invitrogen | D12345 | |
| EX350 Laser excimerowy | GAM Laser | EX350 Laser | |
| FEP Rurki 1/16 "OD x 0,020" ID | IDEX Zdrowie i Science | 1548L | |
| Kwas mrówkowy, klasa LC / MS | ZAWÓR Fisher Scientific | A117-50 | |
| HV3-2 | Hamilton | 86728 | |
| Nadtlenek wodoru | Fisher Scientific | H325-100 | wystarczy dowolny 30% nadtlenek wodoru |
| Jodoacetamid (IAA) | ACROS Organics | 122270050 | |
| Legato 210 pompa strzykawkowa | KD Scientific | 788212 | Każda pompa strzykawkowa, która może pomieścić 4, 5 ml strzykawek, pobierać i wydalać płyn oraz mieć sposób na zwietrzałe silnik, powinna działać |
| Luer Adapter żeński Luer na 1/4-28 męski polipropylen | IDEX Zdrowie i ilość Science | P-618L | |
| Metanol, LC/MS Grade | Fisher Scientific | A454SK-4 | 4 L 4 L nie jest konieczna |
| Mikrowirówka | Thermo Scientific | 75002436 | |
| N,N'-dimetylotiomocznik (DMTU) | ACROS Organics | 116891000 | |
| NanoTight Sleeve Zielony 1/16" ID x .0155" ID x 1,6" | IDEX Zdrowie & Science | F-242X | |
| NanoTight Rękaw Żółty 1/16" OD x 0,027" ID x 1,6" | IDEX Zdrowie & Science | F-246 | |
| N-tert-butylo-&alfa;-fenylonitron (PBN) | ACROS Organics | 177350250 | |
| Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer | Thermo Scientific | Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer | instrumenty o wysokiej rozdzielczości (np. Q exactive Orbitrap lub Orbitrap Fusion) mogą być używane |
| PE50-C miernik energii piroelektrycznej | Ophir Optronics | 7Z02936 | |
| Ilościowy kolorymetryczny test peptydowy Pierce | Thermo Scientific | 23275 | |
| Zestaw do oznaczania białek BCA Pierce Rapid Gold | Thermo Scientific | A53225 | |
| Proteaza trypsyny Pierce, klasa MS | Thermo Scientific | 90058 | |
| Uniwersalna nukleaza Pierce do lizy komórek | Fisher Scientific | 88702 | |
| Kamień do rozłupywania Polymicro, 1 "x 1" x 1/32 " | Molex | 1068680064 | wystarczy dowolny obcinak do rurek kapilarnych |
| Elastyczne rurki kapilarne z topionej krzemionki Polymicro, średnica wewnętrzna 150 i mikro; m, Średnica zewnętrzna 360 µ m, TSP150350 | Polymicro Technologies | 1068150024 | |
| Elastyczne rurki kapilarne z topionej krzemionki Polymicro, średnica wewnętrzna 450 i mikro; m, Średnica zewnętrzna 670 µ m, TSP450670 | Polymicro Technologies | 1068150025 | |
| Elastyczne rurki kapilarne z topionej krzemionki Polymicro, średnica wewnętrzna 75 i mikro; m, Średnica zewnętrzna 360 µ m, TSP075375 | Polymicro Technologies | 1068150019 | |
| Monobasic Fosforan potasu | Fisher Scientific | P382-500 | |
| Proteom Discover 2.2 (oprogramowanie proteomiczne od dołu do góry) | Thermo Scientific | OPTON-30799 | |
| Obrotowe magnetyczne mieszadło bębnowe | V& P Naukowy, Inc. | VP 710D3 | |
| Obrotowe magnetyczne mieszadło bębnowe, zestaw akcesoriów do użytku z pompami strzykawkowymi | V& P Naukowy, Inc. | VP 710D3-4 | |
| Super Tuleja bezkołnierzowa z pierścieniem SST, Tefzel™ (ETFE), 1/4-28 z płaskim dnem, do 1/16" średnicy zewnętrznej | IDEX Health & Science | P-259X | |
| Super Nakrętka bezkołnierzowa PEEK 1/4-28 z płaskim dnem, do 1/16" i 1/32" OD | IDEX Health & Mieszadła Science | P-255X | |
| Super Tumble, średnica 3,35 mm, grubość 0,61 mm | V& P Naukowy, Inc. | VP 722F | |
| Thermo Scientific Pierce RIPA Buffer | Fisher Scientific | PI89900 | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-500 | |
| Upchurch Scientific Krzyże niskociśnieniowe: PEEK | Fisher Scientific | 05-700-182 | |
| Koszulki niskociśnieniowe Upchurch Scientific: PEEK | Fisher Scientific | 05-700-178 | |
| Soczewki sferyczne z krzemionki stopionej UV PLANO-WYPUKŁE | THORLABS | LA4052 | |
| V& P Scientific IncSupplier Diversity Partner TUMBL STIR DISC PARYLENE 1000 | V& P Naukowy, Inc. | VP724F | |
| VHP MicroTight Union do 360 i mikro; m OD | IDEX Zdrowie & Science | UH-436 | |
| Woda z 0,1% kwasem mrówkowym (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | LS118-500 | |
| Woda, LC/MS | Grade Fisher Scientific | W6-4 |
Bibliografia
- Gau, B., Garai, K., Frieden, C., Gross, M. L. Mass spectrometry-based protein footprinting characterizes the structures of oligomeric apolipoprotein E2, E3, and E4. Biochemistry. 50 (38), 8117-8126 (2011).
- Li, Z., et al. High structural resolution hydroxyl radical protein footprinting reveals an extended Robo1-heparin binding interface. Journal of Biological Chemistry. 290 (17), 10729-10740 (2015).
- Zhang, H., Gau, B. C., Jones, L. M., Vidavsky, I., Gross, M. L. Fast photochemical oxidation of proteins for comparing structures of protein− ligand complexes: the calmodulin− peptide model system. Analytical Chemistry. 83 (1), 311-318 (2010).
- Jones, L. M., et al. Complementary MS methods assist conformational characterization of antibodies with altered S-S bonding networks. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 24 (6), 835-845 (2013).
- Kiselar, J. G., Janmey, P. A., Almo, S. C., Chance, M. R. Structural analysis of gelsolin using synchrotron protein footprinting. Molecular & Cellular Proteomic. 2 (10), 1120-1132 (2003).
- Vahidi, S., Stocks, B. B., Liaghati-Mobarhan, Y., Konermann, L. Mapping pH-induced protein structural changes under equilibrium conditions by pulsed oxidative labeling and mass spectrometry. Analytical Chemistry. 84 (21), 9124-9130 (2012).
- Hambly, D. M., Gross, M. L. Laser flash photolysis of hydrogen peroxide to oxidize protein solvent-accessible residues on the microsecond timescale. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 16 (12), 2057-2063 (2005).
- Espino, J. A., Mali, V. S., Jones, L. M. In cell footprinting coupled with mass spectrometry for the structural analysis of proteins in live cells. Analytical Chemistry. 87 (15), 7971-7978 (2015).
- Rinas, A., Mali, V. S., Espino, J. A., Jones, L. M. Development of a Microflow System for In-Cell Footprinting Coupled with Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 88 (20), 10052-10058 (2016).
- Guan, J. Q., Almo, S. C., Reisler, E., Chance, M. R. Structural Reorganization of Proteins Revealed by Radiolysis and Mass Spectrometry: G-Actin Solution Structure Is Divalent Cation Dependent. Biochemistry. 42 (41), 11992-12000 (2003).
- Xu, G., Chance, M. R. Hydroxyl radical-mediated modification of proteins as probes for structural proteomics. Chemical Reviews. 107 (8), 3514-3543 (2007).
- Kaur, U., et al. Proteome-Wide Structural Biology: An Emerging Field for the Structural Analysis of Proteins on the Proteomic Scale. Journal of Proteome Research. 17 (11), 3614-3627 (2018).
- Chea, E. E., Jones, L. M. Analyzing the structure of macromolecules in their native cellular environment using hydroxyl radical footprinting. Analyst. 143 (4), 798-807 (2018).
- Zhu, Y., et al. Elucidating in vivo structural dynamics in integral membrane protein by hydroxyl radical footprinting. Molecular & Cellular Proteomic. 8 (8), 1999-2010 (1999).
- Rinas, A., Jones, L. M. Fast photochemical oxidation of proteins coupled to multidimensional protein identification technology (MudPIT): expanding footprinting strategies to complex systems. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (4), 540-546 (2015).
- Rinas, A., Espino, J. A., Jones, L. M. An efficient quantitation strategy for hydroxyl radical-mediated protein footprinting using Proteome Discoverer. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 408 (11), 3021-3031 (2016).
Przedruki i uprawnienia
