Artykuł metodologiczny

Charakterystyka białek komórkowych za pomocą szybkiego fotochemicznego utleniania białek w komórce

DOI:

10.3791/60911

⸱

11 marca 2020

 ,  ,  , 
1Department of Pharmaceutical Sciences, University of Maryland Baltimore, 2AIT Bioscience

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj charakteryzujemy strukturę białek i miejsca interakcji w żywych komórkach za pomocą techniki śladu białkowego, zwanej szybkim fotochemicznym utlenianiem białek w komórce (IC-FPOP).

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Szybkie fotochemiczne utlenianie białek (FPOP) to metoda oznaczania śladów białek rodników hydroksylowych, używana do charakteryzowania struktury i oddziaływań białek. FPOP wykorzystuje laser excimerowy o długości fali 248 nm do fotolizy nadtlenku wodoru wytwarzającego rodniki hydroksylowe. Rodniki te modyfikują oksydacyjnie odsłonięte przez rozpuszczalnik łańcuchy boczne 19 z 20 aminokwasów. Ostatnio metoda ta została zastosowana w żywych komórkach (IC-FPOP) do badania interakcji białek w ich natywnym środowisku. Badanie białek w komórkach odpowiada za stłoczenie międzycząsteczkowe i różne interakcje białkowe, które są zakłócone w badaniach in vitro. Niestandardowy system przepływu pojedynczych komórek został zaprojektowany w celu zmniejszenia agregacji i zatykania komórek podczas IC-FPOP. Ten system przepływu skupia komórki za laserem excimerowym indywidualnie, zapewniając w ten sposób stałe napromieniowanie. Porównując stopień utlenienia wytwarzanego przez FPOP z dostępnością rozpuszczalnika białka obliczoną na podstawie struktury krystalicznej, IC-FPOP może dokładnie zbadać dostępne dla rozpuszczalnika łańcuchy boczne białek.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ślad białka rodnika hydroksylowego (HRPF) to metoda, która bada dostępność rozpuszczalnika białka poprzez kowalencyjne modyfikacje wytwarzane z rodników hydroksylowych. Kiedy zmienia się struktura białka lub interakcje białkowe, zmienia to ekspozycję aminokwasów na rozpuszczalnik, zmieniając w ten sposób zakres modyfikacji reszt. Dzięki HRPF interakcje białkowe1,2,3 i zmiany konformacyjne białek4,5,6 zostały pomyślnie zbadane in vitro. Istnieje kilka metod, które generują rodniki hydroksylowe do eksperymentów HRPF, jedną z nich jest szybkie fotochemiczne utlenianie białek (FPOP). FPOP został opracowany przez Hambly i Gross w 2005 roku i wykorzystuje laser excimerowy o długości fali 248 nm do wytwarzania rodników hydroksylowych poprzez fotolizę nadtlenku wodoru (H2O2)7.

Niedawno, Espino et al. rozszerzyli zastosowanie FPOP do badania struktury białek w żywych komórkach, metody określanej jako IN-CELL FPOP (IC-FPOP)8. W przeciwieństwie do badań in vitro, badanie białek w komórkach odpowiada za stłoczenie molekularne wraz z różnymi interakcjami białkowymi, które mogą potencjalnie wpływać na strukturę. Ponadto ma tę zaletę, że zapewnia migawkę pełnego proteomu, potencjalnie dostarczając informacji strukturalnych wielu systemów jednocześnie w celu przeprowadzenia biologii strukturalnej całego proteomu. Co więcej, technika ta jest idealna dla białek, które są trudne do zbadania in vitro, takich jak białka błonowe.

Wstępne badania IC-FPOP z powodzeniem zbadały 105 białek pod względem obfitości białek i lokalizacji komórkowej. Aby udoskonalić metodę IC-FPOP, Rinas i in. opracowali system mikroprzepływu dla przepływu pojedynczych komórek9. Ulepszenie oryginalnego systemu przepływu ogranicza agregację komórek i zwiększa dostępną ilośćH2O2dostępną do napromieniowania. W początkowym systemie przepływu komórki zbijające się w rurkach krzemionkowych powodowały zatykanie się i nierównomierne napromieniowanie. Włączenie dwóch strumieni bufora osłonowego hydrodynamicznie skupia komórki, umożliwiając im indywidualny przepływ obok lasera. Włączenie oddzielnej strzykawki doH2O2umożliwia bardziej kontrolowany i zoptymalizowany czas ekspozycji, co pozwala na uzyskanie wyższych stężeńH2O2bez negatywnych skutków. Również ograniczenie czasu inkubacji ogranicza rozkładH2O2przez endogenną katalazę. Dzięki zastosowaniu tego nowego systemu przepływu, liczba wykrytych białek z modyfikacją FPOP wzrosła 13-krotnie, rozszerzając w ten sposób możliwości tej metody w zakresie badania wielu białek w żywych komórkach. W tym protokole opisano ogólny eksperyment IC-FPOP skupiający się na montażu systemu przepływu IC-FPOP.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Konfiguracja systemu przepływu IC-FPOP

  1. Aby rozpocząć montaż systemu przepływowego, przytnij stopioną krzemionkę za pomocą kamienia łupliwego na wymiar. System przepływu IC-FPOP wymaga czterech 12 cm i jednej 17 cm stopionej krzemionki o średnicy wewnętrznej (ID) 450 μm i średnicy zewnętrznej (OD) 670 μm, dwóch 24 cm i jednej 40 cm o ID 75 μm i OD 360 μm, a na koniec dwóch 57 cm o ID 150 μm i OD 360 μm.
    UWAGA: Podczas cięcia rurki krzemionkowej delikatnie zeskrob powłokę poliimidową i zegnij ją, aby uzyskać najczystsze cięcie. Sprawdź, czy jest to proste cięcie (jest to konieczne, aby upewnić się, że nie tworzą się żadne zatory ani wycieki).
  2. Skonfiguruj 15 połączeń za pomocą nanoszczelnych tulei (0,0155" ID X 1/16" OD dla rurek krzemionkowych o średnicy zewnętrznej 360 μm i 0,027" ID X 1/16" OD dla rurek krzemionkowych o średnicy zewnętrznej 670 μm) z nakrętką super bezkołnierzową PEEK 1/4-28 z płaskim dnem dla średnicy zewnętrznej 1/16" i super bezkołnierzową tuleją z pierścieniem SST, Tefzel (ETFE), 1/4-28 z płaskim dnem, do średnicy zewnętrznej 1/16". Skonstruuj połączenia zgodnie z protokołem producenta (Rysunek 1).
  3. Umieść 6 małych cylindrycznych magnesów w jednej strzykawce o pojemności 500 μl. Napełnij tę strzykawkę wraz z kolejną strzykawką o pojemności 500 μl i dwiema strzykawkami o pojemności 5 ml z buforem i usuń powietrze. Pozycja na pompie strzykawkowej, jak pokazano na Rysunek 2A.
    UWAGA: Strzykawki o pojemności 5 ml są większe niż strzykawki o pojemności 500 μl, dlatego do jednoczesnego dokręcenia wszystkich strzykawek na miejscu potrzebna jest przekładka (Rysunek 2B).
  4. Dokręcić korek pompy strzykawki tak, aby w strzykawce z komórkami pozostało około 50 μl, gdy silnik się zatrzyma. Pozostawi to miejsce na mieszadła magnetyczne. (Rysunek 2C-D).
    UWAGA: Jeśli pompa strzykawkowa wywiera nacisk na magnesy, zablokują one strzykawkę i mogą spowodować jej pęknięcie.
  5. Za pomocą adaptera Luer podłączyć zawór ręczny do każdej strzykawki. Zmontuj rurkę krzemionkową, jak pokazano w Rysunek 3.
    UWAGA: Przeciągnij linię z komórkami + H2O2 przez krzyż na drugą stronę. Następnie włóż go do rurki krzemionkowej o średnicy wewnętrznej 450 μm. osłonki w strzykawce o pojemności 5 ml będą płynąć szybciej niż komórki iH2O2. Dzięki osłonowym po obu stronach, ogniwa zostaną hydrodynamicznie skoncentrowane w jednej linii do napromieniowania.
  6. System przepływu pozycji obok lasera. Za pomocą zapalniczki wypal powłokę krzemionkową na rurce o średnicy wewnętrznej 450 μm, aby stworzyć okno do naświetlania laserowego.
  7. Umieść mieszadło magnetyczne nad strzykawką zawierającą sześć magnesów.
  8. Ustawić pompę strzykawkową na 492,4 μl/min, aby uzyskać końcowe natężenie przepływu 1 083,3 μl/min. Przepłynąć bufor przez system trzy razy, aby przepłukać system i sprawdzić, czy nie ma wycieków.
  9. Ustaw ostrość laser excimerowy na rurkach krzemionkowych za pomocą wypukłej soczewki. Po ustawieniu ostrości przetestuj okno napromieniania, umieszczając mały kawałek papieru za rurką krzemionkową i włącz laser. Zmierz obszar spalony w wyniku napromieniowania. Oblicz wymaganą częstotliwość lasera, używając okna napromieniowania i natężenia przepływu, aby uzyskać frakcję wykluczenia równą zero.
    UWAGA: Zalecana energia lasera do eksperymentu IC-FPOP wynosi ≥120 mJ. Aby uzyskać frakcję wykluczenia równą 0 przy oknie napromieniowania 2,58 mm i natężeniu przepływu 1083,3 μl/min, częstotliwość musi wynosić 44. Poniżej znajdują się równania, które są potrzebne do obliczenia częstotliwości lasera, jeśli znane jest okno napromieniowania, natężenie przepływu i frakcja wykluczenia.
    figure-protocol-1
    gdzie w to objętość w nL, x to szerokość plamki lasera w mm, y to ID rurki krzemionkowej w μm, v to całkowita objętość w μl, b to frakcja wykluczenia, a to natężenie przepływu w μl / min, a f to częstotliwość w Hz.

2. Wykonaj gaszenie i H2O2

  1. Przygotować hartowanie zawierające 100 mM N-tert-butylo-alfa-fenylonitronu (PBN) i 100 mM N,N'-dimetylotiomocznik (DMTU). Podamy 11 ml roztworu do każdej próbki w stożkowej probówce o pojemności 50 ml.
  2. RozcieńczyćH2O2 do 200 mM. Każda próbka wymaga 500 μlH2O, O2,
    UWAGA: Hartowanie można wykonać dzień wcześniej i przechowywać w temperaturze 4 °C przez noc, chronić przed światłem. H2O2 powinny być świeże w dniu eksperymentu.

3. Zbieraj komórki

  1. Hoduj komórki w kolbie T175 do około 70-90% konfluencji.
  2. Usuń podłoże i spłucz buffer.
    UWAGA: Typowymi do użycia są sól fizjologiczna buforowana fosforanami Dulbecco (DPBS) klasy hodowli komórkowej lub zrównoważony roztwór soli Hanka (HBSS).
  3. Odłącz komórki za pomocą trypsyny-EDTA lub skrobaka.
  4. Po odłączeniu ponownie zamieszać w 10 ml buforu i policzyć komórki.
  5. Odkręć w dół, usuń bufor i trypsynę-EDTA, a następnie ponownie zawieś, aby uzyskać 2 x 106 komórek/ml.
  6. Podwielokrotność 500 μl komórek na próbkę.
    UWAGA: Dla każdego warunku należy wykonać co najmniej 3 próbki lasera i 3 bez kontroli laserowych.

4. Wykonywanie IC-FPOP

  1. Napełnij dwie strzykawki o pojemności 5 ml buforem, strzykawkę o pojemności 500 μl zawierającą magnesy z komórkami, a końcową strzykawkę o pojemności 500 ml roztworemH2O2. Włącz mieszadło magnetyczne.
  2. Dodać 220 μl dimetylosulfotlenku (DMSO) do jednej podwielokrotności hartowania, delikatnie wymieszać i umieścić za systemem przepływu w celu zebrania napromieniowanych próbek. Dodatek DMSO hamuje endogenną reduktazę sulfotlenku metioniny.
  3. Włącz laser, odczekaj 7 sekund, a następnie włącz system przepływowy.
  4. Gdy próbka zakończy przepływ, wyłącz laser i delikatnie wymieszaj hartowanie z pobraną próbką. Umieść go z boku podczas kroków 4.5 i 4.6.
  5. Napełnij wszystkie cztery strzykawki buforem, w którym zawieszone są komórki, i przepuść go przez system przepływowy.
  6. Po zakończeniu płukania systemu powtórz kroki 4.1 i 4.2. Rozpocznij przepływ bez napromieniowania. Jest to kontrola bez lasera, aby uwzględnić utlenianie tła w komórkach.
  7. Podczas pracy następnej próbki odwiruj poprzednią próbkę przy 450-800 x g przez 5 minut, usuń rozpuszczalnik i ponownie zawieś w 100 μl buforu do lizy komórek, takiego jak bufor do testu radioimmunoprecypitacyjnego (RIPA).
  8. Przenieść próbkę do probówki mikrowirówkowej i błyskawicznie zamrozić w ciekłym azocie.
  9. Gdy wszystkie próbki zakończą pracę, zdemontuj system przepływu w celu oczyszczenia. Wyrzuć zużyte rurki krzemionkowe i wyczyść wszystkie inne połączenia przez sonikację przez 1 godzinę w 50% wodzie: 50% metanolu. Strzykawki należy czyścić zgodnie z instrukcjami producenta.

5. Podsumowanie

  1. Trawić lizat komórkowy w całości. Rozpocząć od rozmrożenia próbek i podgrzewać w temperaturze 95 °C przez 10 minut.
  2. Po podgrzaniu schłodzić lizat na lodzie przez 15 min.
  3. Dodaj 25 jednostek nukleazy do trawienia DNA i RNA i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
  4. Wirować próbki za pomocą wirówki stołowej o masie 16 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  5. Zebrać supernatant i przenieść go do czystej probówki do mikrowirówki.
  6. Sprawdź stężenie białka za pomocą zestawu do oznaczania białek.
  7. Przenieść 20-100 μg próbki do czystej probówki do mikrowirówki i doprowadzić do 100 μl.
  8. Próbki należy redukować za pomocą 20 mM ditiotreiotolu (DTT) w temperaturze 50 °C przez 45 minut.
  9. Schładzać próbki w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
  10. Alkilat z 20 mM jodoacetamidem (IAA) w temperaturze pokojowej przez 20 minut, chroniony przed światłem.
  11. Dodaj wstępnie schłodzony aceton w proporcji 1:4 białko: aceton. Wymieszać próbki i umieścić na noc w temperaturze -20 °C.
  12. Następnego ranka należy wirować próbki o masie 16 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  13. Usunąć supernatant i dodać 50 μl 90% wstępnie schłodzonego acetonu. Wymieszać próbki i odwirowywać w temperaturze 16 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  14. Usuń aceton i pozostaw próbki do wyschnięcia, pozostawiając otwarte nasadki mikrowirówki z niestrzępiącą się chusteczką zakrywającą górę. Po wysuszeniu próbek ponownie zawiesić osad białkowy z 10 mM buforem Tris o pH 8.
  15. Zawiesić 20 μg trypsyny w 40 μl 10 mM buforu Tris o pH 8. Dodać 2 μg trypsyny (stosunek masy do masy 1 trypsyny: 50 próbki). Próbki należy inkubować w temperaturze 37 °C przez noc.
  16. Następnego ranka sprawdź stężenie peptydu za pomocą testu peptydowego. Po usunięciu próbki do testu peptydowego należy wygasić trawienie trypsyny, dodając kwas mrówkowy do próbek (końcowe stężenie wynosi 5% kwasu mrówkowego).
  17. Po ustaleniu końcowego stężenia peptydu przenieść 10 μg każdej próbki do czystej probówki do mikrowirówki. Gwarantuje to, że analizowana jest taka sama ilość każdej próbki. Wysuszyć próbkę za pomocą wirówki próżniowej. Po wysuszeniu zawiesić 20 μl 0,1% kwasu mrówkowego o spektrometrii mas. Przenieść próbki do fiolek z automatycznym podajnikiem próbek.

6. Chromatografia cieczowa z tandemową spektrometrią mas

  1. Aby zlokalizować modyfikacje FPOP, należy przeanalizować strawiony lizat komórkowy za pomocą analizy LC-MS/MS.
  2. Użyj ruchomych faz 0,1% kwasu mrówkowego w wodzie (A) i 0,1% kwasu mrówkowego w acetonitrylu (B).
  3. Załadować 0,5 μg próbki do kolumny wychwytującej C18 (5 μm i 100 A) o wymiarach 180 μm x 20 mm i przemywać próbkę 99% (A) i 1% (B) przez 15 minut.
  4. Używając kolumny analitycznej C18 (5 μm i 125 A) o wymiarach 75 μm x 30 cm, uruchom metodę separacji analitycznej z natężeniem przepływu 0,300 μl/min, zaczynając od 3% (B) przez jedną minutę, a następnie zwiększ do 10% (B) od 1-2 min. Następnie rampa do 45% (B) od 2-100 min, a następnie 100% (B) od 100-110 min. Wyczyść kolumnę, przytrzymując 100% (B) przez 110-115 min. Zregeneruj kolumnę, zmniejszając ją do 3% (B) od 115-116 min i utrzymując na poziomie 3% (B) od 116-130 min.
  5. Ustaw metodę akwizycji MS tak, aby miała rozdzielczość 60 000 z zakresem skanowania m/z 375-1500. Ustaw docelową automatyczną kontrolę wzmocnienia (AGC) na 5.0 x 105 z maksymalnym czasem wtrysku 50 ms.
  6. Podczas akwizycji MS należy wybrać jony prekursorowe o stanach naładowania 2-6 do izolacji za pomocą akwizycji zależnej od danych (DDA) z oknem izolacji 1,2 m/z i czasem cyklu 4 s. Wybierz peptydy o progu intensywności 5,0 x 104 do aktywacji HCD ze znormalizowaną energią ustawioną na 32%. Wykluczyć peptydy po akwizycji 1 MS/MS przez 60 s. Ustaw rozdzielczość MS/MS na 15 000 z docelowym AGC 5,0 x 104 i maksymalnym czasem wstrzykiwania 35 ms.

7. Przetwarzanie danych

  1. Przeszukaj pliki RAW w dostępnym oprogramowaniu do analizy białek w odpowiedniej bazie danych białek i odpowiednim enzymie trawiennym. Tutaj skorzystaj z bazy danych Swiss-Prot Homo Sapiens i trypsyny.
  2. Ustaw masę prekursora tak, aby wyszukiwała od 350 do 5,000 Da i tolerancję masy 10 ppm. Może być co najwyżej 1 pominięte miejsce rozszczepienia o długości peptydu od 6 do 144 reszt. Te ograniczenia ułatwiają przeszukiwanie baz danych.
  3. Ustaw maksymalną tolerancję masy jonów fragmentacyjnych na 0,02 Da za pomocą karbamidometylu (+57,021) jako modyfikacji statycznej, a wszystkich modyfikacji FPOP z 17 aminokwasów jako modyfikacji dynamicznej (Rysunek 4 to przykład przepływu pracy analizy białek używanego do wykrywania modyfikacji FPOP).
    UWAGA: Modyfikacje FPOP seryny i treoniny nie są objęte poszukiwaniami ze względu na ich niższą reaktywność z rodnikami hydroksylowymi.
  4. Wyszukiwanie za pomocą bazy danych wabików ze współczynnikiem fałszywych wykryć wynoszącym 1% i 5%.
  5. Po zakończeniu wyszukiwania plików oblicz zakres modyfikacji FPOP. Otwórz Proteome Discoverer 2.2, eksportuj sekwencję, lokalizacje modyfikacji, akcesję białek, plik widma, obfitość prekursorów i informacje o czasie przechowywania. Oblicz zakres modyfikacji z równania 4:
    figure-protocol-2
    Zmodyfikowany obszar EIC to obszar chromatograficzny określonego peptydu z modyfikacją rodnika hydroksylowego. Obszar EIC to całkowita powierzchnia chromatograficzna zarówno zmodyfikowanych, jak i niezmodyfikowanych obszarów tego konkretnego peptydu. Stopień utlenienia oblicza się w próbkach z napromienianiem i bez napromieniowania. Próbka z pominięciem napromieniania (kontrola) odpowiada za wszelkie utlenienie tła, które mogło być obecne w komórkach przed i po ekspozycji naH2O2. Kontrole są odejmowane od próbek napromieniowania, aby pomóc wyizolować modyfikacje specyficzne dla FPOP.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

IC-FPOP to metoda badania interakcji białek w żywych komórkach. W układzie przepływu IC-FPOP czas ekspozycji naH2O2jest ograniczony do około 3 s, co gwarantuje wyższe stężeniaH2O2bez szkodliwych konsekwencji dla komórek. System przepływu obejmuje również dwa strumienie bufora osłony, który hydrodynamicznie skupia komórki do środka rurki, wytwarzając pojedynczy przepływ komórek, które są równomiernie napromieniowane (Rysunek 5)9. Obrazowanie fluorescencyjne ortogonalnych obrazów ułożonych w stos YZ (Rysunek 5A) pokazuje wyraźne oddzielenie buforu osłonki (zawierającego fluorofor FITC) od roztworu komórkowego (zawierającego fluorofor TMRM). Aby podkreślić tę separację, Rysunek 5B i Rysunek 5C pokazuje trójwymiarowe średnie mapy cieplne roztworu buforowego osłonki lub roztworu komórkowego, ilustrując minimalne wymieszanie tych dwóch roztworów.

Zastosowanie systemu przepływu pojedynczych komórek zwiększa liczbę białek modyfikowanych oksydacyjnie 13-krotnie (Rysunek 6A)9. W tej metodzie białka w wielu przedziałach komórkowych są znakowane białkami błonowymi, białkami cytoplazmatycznymi i białkami w jądrze, które są najbardziej rozpowszechnione8,9. Aby upewnić się, że białka zostały zmodyfikowane w nienaruszonych komórkach, po zabiegu H2O2 i napromieniowaniu wykonano obrazy fluorescencyjne komórek traktowanych CellROX (Rysunek 6B) 8. Stabilność komórek w całym procesie znakowania dodatkowo potwierdza skuteczność IC-FPOP w badaniu białek w ich naturalnym środowisku komórkowym. Dzięki zastosowaniu tandemowej spektrometrii mas modyfikacje te mogą być zlokalizowane w określonych aminokwasach na białku. Rysunek 7 przedstawia modyfikację, która ma miejsce podczas IC-FPOP wraz z jego ekstrahowanym chromatogramem jonowym. Przesunięcie obserwowane w ekstrahowanym chromatogramie jonowym przekłada się na zmianę hydrofobowości spowodowaną utlenioną metioniną w zmodyfikowanym peptydzie.

Aby sprawdzić, czy modyfikacje FPOP badają dostępność rozpuszczalnika wewnątrz komórek, aktyna znakowana w komórce została porównana zarówno z badaniem in vitro, jak i różnymi strukturami krystalicznymi aktyny (Rysunek 8)8. Aktyna znakowana w komórce jest reprezentowana w Rysunek 8A pokazuje porównywalny zakres utleniania z badania in vitro przeprowadzonego przez Guan et al.10 (Rysunek 8B), wnioskując, że aktyna ma podobną dostępność rozpuszczalnika zarówno w badaniach wewnątrzkomórkowych, jak i in vitro. Aby dodatkowo potwierdzić, że IC-FPOP badał dostępność rozpuszczalnika aktyny, zakres modyfikacji FPOP porównano z dostępnością rozpuszczalnika znakowanych reszt obliczoną na podstawie dwóch struktur krystalicznych aktyny (Rysunek 8C). Ta korelacja pokazuje, że IC-FPOP dobrze bada dostępność rozpuszczalnika białka monomerycznego.

figure-results-1
Rysunek 1: Jak prawidłowo skonstruować ferule. (A) Umieść razem tulejki, rurki krzemionkowe i tuleję przed dokręceniem. (B) Dokręć wszystkie elementy razem. (C) Produktem końcowym będzie worek, który został zaciśnięty na tulei. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Konfiguracja systemu przepływu IC-FPOP. (A) Obraz w pełni zmontowanego systemu przepływu IC-FPOP umieszczonego obok lasera. (B) Przykład elementu dystansowego potrzebnego do zwiększenia średnicy zewnętrznej strzykawek o pojemności 500 μl w celu skutecznego dokręcenia wszystkich strzykawek razem. (C) Reprezentatywne zdjęcia przedstawiające przestrzeń wymaganą dla mieszadeł magnetycznych. (D) Korki są niezbędne do zatrzymania pompy strzykawkowej bez rozbijania strzykawek. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Schemat systemu przepływu opracowanego dla IC-FPOP. Niebieskie linie reprezentują rurki krzemionkowe o średnicy wewnętrznej 450 μm i średnicy zewnętrznej 670 μm, linie czerwone mają średnicę wewnętrzną 150 μm i średnicę zewnętrzną 360 μm, a linie pomarańczowe mają średnicę wewnętrzną 75 μm i średnicę zewnętrzną 360 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Oprogramowanie do analizy białek używane do wykrywania modyfikacji FPOP. Typowy przepływ pracy z odpowiednimi modyfikacjami wyszukiwanymi w każdym węźle. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Ilustracja 5: system przepływu pojedynczych komórek hydrodynamicznie skupia komórki w jednym strumieniu. (A) Ortogonalny stos YZ ilustrujący ogniskowanie 3D analitu komórkowego (czerwony, fluorofor TMRM) otoczony buforem osłonki (zielony, fluorofor FITC). Trójwymiarowa mapa cieplna średniej intensywności bufora osłonowego (B) i analitu komórkowego (C). Niższe intensywności są niebieskie, a najwyższe czerwone (B-C). Ten rysunek został zmodyfikowany z Rinas et al.9 Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Ryc. 6: Wykorzystanie systemu przepływu IC-FPOP drastycznie zwiększa ilość białek zmodyfikowanych przez FPOP w komórkach pobierających. (A) Porównanie utlenionych białek zidentyfikowanych z systemem przepływu i bez niego. System przepływu zidentyfikował 1391 białek zmodyfikowanych FPOP, podczas gdy tylko 105 białek zidentyfikowano bez systemu przepływu z nakładaniem się 58 zmodyfikowanych białek. Ten rysunek został zmodyfikowany na podstawie Rinas et al.9 (B) Obrazowanie fluorescencyjne komórek traktowanych CellROX po IC-FPOP pokazuje, że komórki są nadal nienaruszone po znakowaniu oksydacyjnym. Komórki zobrazowano za pomocą wielofotonowego mikroskopu Olympus Fluoview FV1000 MPE o długości fali 665 nm. Pokazany obraz to pojedynczy wycinek. Ten rysunek został zmodyfikowany z Espino et al.8 Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-7
Rysunek 7: Przykłady tandemowych widm MS/MS, które mają miejsce podczas IC-FPOP. Widma jonów produktowych (MS/MS) niezmodyfikowanego peptydu (A) i utlenienie (B) wykryte na reszcie M8 znajdującej się na tym peptydzie. Reprezentatywny EIC peptydu niezmodyfikowanego (C) i peptydu zmodyfikowanego (D). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-8
Rysunek 8: IC-FPOP jest skuteczny w badaniu dostępności rozpuszczalników dla białek. (A) Zakres modyfikacji 9 oksydacyjnie modyfikowanych peptydów z aktyny. Wartości są przedstawiane jako średnie plus i minus odchylenie standardowe (n = 3). (B) Modyfikacja peptydów aktynowych utlenionych in vitro przez radiolizę synchrotronową z Guan et al.10 (C) Korelacja modyfikacji reszty FPOP z SASA w stanie ciasnym (trójkąty, przerywana linia trendu) i otwartym (okręgi, ciągła linia trendu) aktyny. Ten rysunek został zmodyfikowany z Espino et al.8 Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opracowano kilka technik opartych na spektrometrii mas w celu badania struktury białek i kompleksów białko-ligand w sposób obejmujący cały proteom w całych komórkach lub lizatach komórkowych. Techniki te obejmują między innymi stabilność białek na podstawie szybkości utleniania (SPROX), termiczne profilowanie proteomu (TPP), sieciowanie chemiczne (XL-MS) i ślad białka rodnika hydroksylowego (HRPF). Każda technika ma unikalne ograniczenia i zalety w porównaniu ze sobą, które zostały szeroko przeanalizowane12. Każda z tych metod została wykorzystana w biologii strukturalnej całego proteomu w celu wyjaśnienia struktury białek i ostatecznie ich funkcjonowania w złożonym środowisku komórkowym. IC-FPOP to technika HRPF, która wykorzystuje rodniki hydroksylowe do oksydacyjnej modyfikacji łańcuchów bocznych aminokwasów odsłoniętych na rozpuszczalnik, badając strukturę białka i interakcje białko-ligand w żywotnych komórkach13. IC-FPOP jest ulepszeniem początkowego HRPF w żywych komórkach, które wykorzystywały chemię Fentona do generowania rodników w skali minutowej14. W tym badaniu zmiany strukturalne w integralnym białku błonowym w odpowiedzi na obniżenie pH lub siły jonowej buforu udało się scharakteryzować z dobrym pokryciem oksydacyjnym białka. W porównaniu z chemią Fentona, IC-FPOP jest znacznie szybszy, modyfikując białka w skali mikrosekundowej, umożliwiając w ten sposób badanie natywnej konformacji białek.

Kluczowym testem dla IC-FPOP jest potwierdzenie żywotności komórek po ekspozycji naH2O2. Używając 40 cm linii mieszającej, komórki inkubuje się wH2O2przez około 3 s przed napromienianiem. Czas ten można regulować, zmieniając długość tej rurki krzemionkowej. Warto zauważyć, że chociaż zastosowanie błękitu trypanowego do badania żywotności komórek pokazuje, że integralność komórek jest utrzymywana po inkubacjiH2O2, komórki mogą potencjalnie być pod wpływem stresu wpływającego na szlaki sygnałowe, które oddziałują zH2O2. Na szczęście krótki czas inkubacji jest szybszy niż synteza białek, co daje pewność, że obecne białka nie są indukowane przezH2O2.

Kolejnym ważnym krokiem jest potwierdzenie prawidłowego montażu układu przepływowego. Po zmontowaniu upewnij się, że nie ma wycieków po przepłukaniu systemu żądanym buforem. Jeśli występują nieszczelności, upewnij się, że rurka krzemionkowa została prawidłowo przycięta i przylega do tulejki, aby zapewnić prawidłowe uszczelnienie po dokręceniu. Wszystkie części są dokręcane ręcznie, więc nie są potrzebne żadne narzędzia. Podczas każdego eksperymentu IC-FPOP upewnij się, że mieszadła magnetyczne w strzykawce komórkowej pozostają w ruchu. To małe poruszenie ogranicza liczbę komórek, które osiadają na dnie strzykawki, ale nie jest wystarczająco ostre, aby ścinać komórki. Po jednym uruchomieniu w strzykawce pozostaje około 50 μl komórek. Zawsze upewnij się, że rozcieńczyłeś to na etapie płukania, aby ograniczyć liczbę komórek, które przenoszą się do następnego eksperymentu. Zaleca się użycie strzykawki ze świeżymi komórkami, jeśli porównuje się leczenie wieloma komórkami. Istotne jest również dobranie odpowiedniego buforu dla badanych komórek. Niektóre wygaszają rodnik hydroksylowy, co prowadzi do mniejszej liczby modyfikacji białek. Xu i wsp. wykazali, że niektóre powszechnie stosowane skracają czas życia rodnika hydroksylowego11. DPBS i HBSS są powszechnymi używanymi w eksperymentach IC-FPOP.

Po IC-FPOP zoptymalizuj protokół trawienia w oparciu o potrzebne parametry. Ponieważ FPOP wytwarza nieodwracalne modyfikacje kowalencyjne, jest wystarczająco dużo czasu na dokładne trawienie i oczyszczanie bez utraty pokrycia etykietą. Zawsze testuj i normalizuj stężenie białka, aby równomierne stężenia peptydów były ładowane do tandemowej spektrometrii mas. Na koniec należy pamiętać, że immunoprecypitacji nie można wykonać w połączeniu z IC-FPOP. Jeśli modyfikacja FPOP jest ukierunkowana na region interakcji, powinowactwo przeciwciała zostanie obniżone. Aby pomóc w identyfikacji modyfikacji FPOP, etapy separacji metodą chromatografii 2D wykazały ponad trzykrotnie większą liczbę wykrytych utlenionych peptydów15.

Wyzwaniem każdego eksperymentu FPOP jest skomplikowany poziom analizy danych ze względu na możliwe produkty utleniania, które mogą powstać. Dotyczy to zarówno badań wewnątrzkomórkowych, jak i in vitro, ale drastycznie wzrasta wraz z dodatkową złożonością analizy lizatów komórkowych. Wraz z dalszą optymalizacją IC-FPOP powstaje więcej białek o wyższym pokryciu modyfikacji, co sprawia, że analiza staje się bardziej uciążliwa. Ścinająca ilość danych generowanych z pojedynczego eksperymentu IC-FPOP ogranicza użycie ręcznej walidacji, co powoduje, że badacze w większym stopniu polegają na oprogramowaniu. Z tego powodu Rinas i wsp. opracowali strategię oceny ilościowej HRPF przy użyciu Proteome Discoverer (PD)16. Ta metoda wykorzystuje przepływ pracy z wieloma węzłami wyszukiwania na PD w połączeniu z platformą ilościową w arkuszu kalkulacyjnym. Trwają prace nad dalszymi ulepszeniami platformy IC-FPOP w celu zwiększenia liczby zidentyfikowanych peptydów z modyfikacjami FPOP, a także zwiększenia odtwarzalności i dokładności oznaczania ilościowego.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lisa Jones jest wynalazcą patentu na zespół przepływowy do ogniw (numer publikacji: 20180079998).

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została wsparta przez nagrodę NSF CAREER Award (MCB1701692) dla LMJ.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Stożkowe probówki wirówkowe 15 mlFisher Scientific14-959-53Awystarczy dowolna marka
ml gazoszczelna strzykawka, wyjmowana blokada Luer LockSGE Analytical Science008760
50 ml stożkowe probówki wirówkoweFisher Scientific14-432-22wystarczy dowolna marka
500 µ Strzykawki gazoszczelne L SGE: Naprawiono modele Luer-LokFisher ScientificSG-00723
Aceton, klasa HPLCFisher ScientificA929-4Ilość 4 L nie jest konieczna
Acetonitryl z 0,1% kwasem mrówkowym (v / v), klasa LC / MSFisher ScientificLS120-500
ACQUITY UPLC M-Class Symetria C18 Kolumna pułapki, 100 Å, 5 µ m, 180 i mikro; m x 20 mm, 2G, V/M, 1/opkWody186007496
ACQUITY UPLC M-Class SystemWodyACQUITY UPLC M-Class System
Folia aluminiowaFisher Scientific01-213-100wystarczy dowolna marka
Aqua 5 µ m C18 125 i Aring; materiał opakowaniowyPhenomenex04A-4299
WirówkaEppendorf022625501
Delikatne wycieraczkido zadań Fisher Scientific06-666A
Dithiothreiotol (DTT)AmericanBioAB00490-00005
DMSO, BezwodnyInvitrogenD12345
EX350 Laser excimerowyGAM LaserEX350 Laser
FEP Rurki 1/16 "OD x 0,020" IDIDEX Zdrowie i Science1548L
Kwas mrówkowy, klasa LC / MSZAWÓR Fisher ScientificA117-50
HV3-2Hamilton86728
Nadtlenek wodoruFisher ScientificH325-100wystarczy dowolny 30% nadtlenek wodoru
Jodoacetamid (IAA)ACROS Organics122270050
Legato 210 pompa strzykawkowaKD Scientific788212Każda pompa strzykawkowa, która może pomieścić 4, 5 ml strzykawek, pobierać i wydalać płyn oraz mieć sposób na zwietrzałe silnik, powinna działać
Luer Adapter żeński Luer na 1/4-28 męski polipropylenIDEX Zdrowie i ilość ScienceP-618L
Metanol, LC/MS GradeFisher ScientificA454SK-44 L 4 L nie jest konieczna
MikrowirówkaThermo Scientific75002436
N,N'-dimetylotiomocznik (DMTU)ACROS Organics116891000
NanoTight Sleeve Zielony 1/16" ID x .0155" ID x 1,6"IDEX Zdrowie & ScienceF-242X
NanoTight Rękaw Żółty 1/16" OD x 0,027" ID x 1,6"IDEX Zdrowie & ScienceF-246
N-tert-butylo-&alfa;-fenylonitron (PBN)ACROS Organics177350250
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass SpectrometerThermo ScientificOrbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometerinstrumenty o wysokiej rozdzielczości (np. Q exactive Orbitrap lub Orbitrap Fusion) mogą być używane
PE50-C miernik energii piroelektrycznejOphir Optronics7Z02936
Ilościowy kolorymetryczny test peptydowy PierceThermo Scientific23275
Zestaw do oznaczania białek BCA Pierce Rapid GoldThermo ScientificA53225
Proteaza trypsyny Pierce, klasa MSThermo Scientific90058
Uniwersalna nukleaza Pierce do lizy komórekFisher Scientific88702
Kamień do rozłupywania Polymicro, 1 "x 1" x 1/32 "Molex1068680064wystarczy dowolny obcinak do rurek kapilarnych
Elastyczne rurki kapilarne z topionej krzemionki Polymicro, średnica wewnętrzna 150 i mikro; m, Średnica zewnętrzna 360 µ m, TSP150350Polymicro Technologies1068150024
Elastyczne rurki kapilarne z topionej krzemionki Polymicro, średnica wewnętrzna 450 i mikro; m, Średnica zewnętrzna 670 µ m, TSP450670Polymicro Technologies1068150025
Elastyczne rurki kapilarne z topionej krzemionki Polymicro, średnica wewnętrzna 75 i mikro; m, Średnica zewnętrzna 360 µ m, TSP075375Polymicro Technologies1068150019
Monobasic Fosforan potasuFisher ScientificP382-500
Proteom Discover 2.2 (oprogramowanie proteomiczne od dołu do góry)Thermo ScientificOPTON-30799
Obrotowe magnetyczne mieszadło bębnoweV& P Naukowy, Inc.VP 710D3
Obrotowe magnetyczne mieszadło bębnowe, zestaw akcesoriów do użytku z pompami strzykawkowymiV& P Naukowy, Inc.VP 710D3-4
Super Tuleja bezkołnierzowa z pierścieniem SST, Tefzel™ (ETFE), 1/4-28 z płaskim dnem, do 1/16" średnicy zewnętrznejIDEX Health & ScienceP-259X
Super Nakrętka bezkołnierzowa PEEK 1/4-28 z płaskim dnem, do 1/16" i 1/32" ODIDEX Health & Mieszadła ScienceP-255X
Super Tumble, średnica 3,35 mm, grubość 0,61 mmV& P Naukowy, Inc.VP 722F
Thermo Scientific Pierce RIPA BufferFisher ScientificPI89900
Tris BaseFisher ScientificBP152-500
Upchurch Scientific Krzyże niskociśnieniowe: PEEKFisher Scientific05-700-182
Koszulki niskociśnieniowe Upchurch Scientific: PEEKFisher Scientific05-700-178
Soczewki sferyczne z krzemionki stopionej UV PLANO-WYPUKŁETHORLABSLA4052
V& P Scientific IncSupplier Diversity Partner TUMBL STIR DISC PARYLENE 1000V& P Naukowy, Inc.VP724F
VHP MicroTight Union do 360 i mikro; m ODIDEX Zdrowie & ScienceUH-436
Woda z 0,1% kwasem mrówkowym (v/v), LC/MS GradeFisher ScientificLS118-500
Woda, LC/MSGrade Fisher ScientificW6-4
5 excimerowy inne

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gau, B., Garai, K., Frieden, C., Gross, M. L. Mass spectrometry-based protein footprinting characterizes the structures of oligomeric apolipoprotein E2, E3, and E4. Biochemistry. 50 (38), 8117-8126 (2011).
  2. Li, Z., et al. High structural resolution hydroxyl radical protein footprinting reveals an extended Robo1-heparin binding interface. Journal of Biological Chemistry. 290 (17), 10729-10740 (2015).
  3. Zhang, H., Gau, B. C., Jones, L. M., Vidavsky, I., Gross, M. L. Fast photochemical oxidation of proteins for comparing structures of protein− ligand complexes: the calmodulin− peptide model system. Analytical Chemistry. 83 (1), 311-318 (2010).
  4. Jones, L. M., et al. Complementary MS methods assist conformational characterization of antibodies with altered S-S bonding networks. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 24 (6), 835-845 (2013).
  5. Kiselar, J. G., Janmey, P. A., Almo, S. C., Chance, M. R. Structural analysis of gelsolin using synchrotron protein footprinting. Molecular & Cellular Proteomic. 2 (10), 1120-1132 (2003).
  6. Vahidi, S., Stocks, B. B., Liaghati-Mobarhan, Y., Konermann, L. Mapping pH-induced protein structural changes under equilibrium conditions by pulsed oxidative labeling and mass spectrometry. Analytical Chemistry. 84 (21), 9124-9130 (2012).
  7. Hambly, D. M., Gross, M. L. Laser flash photolysis of hydrogen peroxide to oxidize protein solvent-accessible residues on the microsecond timescale. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 16 (12), 2057-2063 (2005).
  8. Espino, J. A., Mali, V. S., Jones, L. M. In cell footprinting coupled with mass spectrometry for the structural analysis of proteins in live cells. Analytical Chemistry. 87 (15), 7971-7978 (2015).
  9. Rinas, A., Mali, V. S., Espino, J. A., Jones, L. M. Development of a Microflow System for In-Cell Footprinting Coupled with Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 88 (20), 10052-10058 (2016).
  10. Guan, J. Q., Almo, S. C., Reisler, E., Chance, M. R. Structural Reorganization of Proteins Revealed by Radiolysis and Mass Spectrometry: G-Actin Solution Structure Is Divalent Cation Dependent. Biochemistry. 42 (41), 11992-12000 (2003).
  11. Xu, G., Chance, M. R. Hydroxyl radical-mediated modification of proteins as probes for structural proteomics. Chemical Reviews. 107 (8), 3514-3543 (2007).
  12. Kaur, U., et al. Proteome-Wide Structural Biology: An Emerging Field for the Structural Analysis of Proteins on the Proteomic Scale. Journal of Proteome Research. 17 (11), 3614-3627 (2018).
  13. Chea, E. E., Jones, L. M. Analyzing the structure of macromolecules in their native cellular environment using hydroxyl radical footprinting. Analyst. 143 (4), 798-807 (2018).
  14. Zhu, Y., et al. Elucidating in vivo structural dynamics in integral membrane protein by hydroxyl radical footprinting. Molecular & Cellular Proteomic. 8 (8), 1999-2010 (1999).
  15. Rinas, A., Jones, L. M. Fast photochemical oxidation of proteins coupled to multidimensional protein identification technology (MudPIT): expanding footprinting strategies to complex systems. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (4), 540-546 (2015).
  16. Rinas, A., Espino, J. A., Jones, L. M. An efficient quantitation strategy for hydroxyl radical-mediated protein footprinting using Proteome Discoverer. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 408 (11), 3021-3031 (2016).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

FPOP wewn trzkom rkoweanaliza struktury bia ekmapowanie lad w rodnik w hydroksylowychprzep ywowy system jednokom rkowyna wietlanie laserem ekscymerowymtandemowa analiza LCMSoddzia ywania bia ko bia kopomiar dost pno ci rozpuszczalnikaproteomika kom rkowa

Powiązane artykuły