Artykuł metodologiczny

Wytwarzanie oligodendrocytów i pożywki kondycjonowanej oligodendrocytami do eksperymentów z kokulturą

DOI:

10.3791/60912

⸱

9 lutego 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1Sorbonne Université, Inserm, CNRS, UMR7225, Institut du Cerveau et de la Moelle épinière, ICM, 2Assistance Publique-Hôpitaux de Paris, GH Pitié Salpêtrière, 3Ecole Supérieure des Techniques de Biologie Appliquée

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy skuteczną metodę oczyszczania oligodendrocytów i produkcji pożywki kondycjonowanej przez oligodendrocyty, która może być wykorzystana do eksperymentów z kokulturą.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W ośrodkowym układzie nerwowym, oligodendrocyty są dobrze znane ze swojej roli w mielinizacji aksonów, która przyspiesza propagację potencjałów czynnościowych poprzez przewodnictwo solne. Co więcej, coraz więcej doniesień sugeruje, że oligodendrocyty oddziałują z neuronami poza mielinizacją, w szczególności poprzez wydzielanie rozpuszczalnych czynników. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół pozwalający na oczyszczanie komórek linii oligodendroglialnej z hodowli komórek glejowych zawierających również astrocyty i komórki mikrogleju. Metoda opiera się na wytrząsaniu przez noc w temperaturze 37 °C, co umożliwia selektywne oderwanie leżących nad nimi komórek oligodendroglialnych i komórek mikrogleju oraz eliminację mikrogleju poprzez adhezję różnicową. Następnie opisujemy hodowlę oligodendrocytów i produkcję pożywki kondycjonowanej oligodendrocytami (OCM). Zapewniamy również kinetykę leczenia OCM lub dodatek oligodendrocytów do oczyszczonych neuronów hipokampa w eksperymentach z udziałem współkultur, badając interakcje oligodendrocytów-neuronów.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oligodendrocyty (OL) to komórki glejowe ośrodkowego układu nerwowego (OUN), które wytwarzają mielinę owijającą się wokół aksonów. OL pochodzą z komórek prekursorowych oligodendrocytów (OPC), które namnażają się w strefach komorowych embrionalnego OUN, a następnie migrują i różnicują się w pełni dojrzałe OL (tj. komórki tworzące mielinę)1. OPC występują obficie we wczesnym okresie rozwoju, ale utrzymują się również w dorosłym mózgu, gdzie reprezentują główną populację komórek proliferacyjnych2. Pojedynczy OL otacza wiele aksonów w niepobudliwych sekcjach (tj. międzywęźlach), a krawędź każdej pętli mielinowej przyłącza się do aksonu, tworząc domenę przywęzłową, która ma kluczowe znaczenie dla właściwości izolacyjnych mieliny1,3. Pomiędzy parawęzłami znajdują się małe niezmielinizowane szczeliny zwane węzłami Ranviera. Węzły te są bogate w kanały sodowe bramkowane napięciem (Nav), co pozwala na regenerację i szybką propagację potencjałów czynnościowych poprzez przewodnictwo solne4. Ta ścisła interakcja umożliwia również wsparcie energii aksonalnej poprzez neuronalny wychwyt mleczanu z OLs5,6.

Dojrzewanie komórek linii oligodendroglialnej i proces mielinizacji są ściśle regulowane przez ich interakcje z neuronami7. Rzeczywiście, OL i OPC, zwane również komórkami NG2, wyrażają szereg receptorów dla neuroprzekaźników i mogą odbierać dane wejściowe z neuronów pobudzających i hamujących, umożliwiając im wyczuwanie aktywności neuronalnej, która może wywołać ich proliferację i / lub różnicowanie w komórki mielinizacyjne2. Z kolei OPC/OL wydzielają do przestrzeni zewnątrzkomórkowej mikropęcherzyki i białka, które samodzielnie lub synergistycznie pośredniczą w funkcjach neuromodulacyjnych i neuroprotekcyjnych8,9,10,11,12. Jednak mechanizmy molekularne kontrolujące wielorakie tryby interakcji między komórkami linii oligodendroglialnej a neuronami nie zostały jeszcze w pełni rozszyfrowane.

Ponadto, w wielu stanach patologicznych OUN, OL są przede wszystkim dotknięte, co zakłóca ich interakcję z neuronami. Na przykład w stwardnieniu rozsianym (SM) dysfunkcja neurologiczna jest spowodowana ogniskową demielinizacją w OUN, wtórną do utraty OL, która może prowadzić do uszkodzenia aksonów i związanej z tym akumulacji niepełnosprawności. Remielinizacja może mieć miejsce, choć w większości przypadków niewystarczająco13. Postęp poczyniony w ciągu ostatniej dekady, spowodowany rozwojem immunoterapii, zmniejszył odsetek nawrotów, ale promowanie remielinizacji pozostaje do tej pory niezaspokojoną potrzebą. W związku z tym lepsze zrozumienie roli, funkcji i wpływu OL ma szczególne znaczenie dla opracowania nowych terapii dla szerokiego spektrum schorzeń OUN.

Tutaj opisujemy metody oczyszczania i hodowli OLs. Umożliwia to precyzyjne zbadanie wewnętrznych mechanizmów regulujących ich rozwój i biologię. Ponadto takie wysoce wzbogacone kultury OL umożliwiają produkcję pożywki kondycjonowanej oligodendrocytami (OCM), którą można dodać do oczyszczonych kultur neuronów w celu uzyskania wglądu w wpływ czynników wydzielanych przez OL na fizjologię i łączność neuronalną. Ponadto opisujemy, jak wdrożyć system kohodowli in vitro, w którym oczyszczone oligodendrocyty i neurony są ze sobą łączone, co pozwala zająć się mechanizmami regulującymi (re)mielinizację.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opieka i wykorzystanie szczurów w tym eksperymencie jest zgodne z polityką i wytycznymi instytucji (UPMC, INSERM i Dyrektywa Rady Wspólnoty Europejskiej 86/609/EWG). Poniższy protokół ustala się dla standardowego miotu liczącego 12 szczeniąt.

1. Przygotowanie kolb (~5 min)

UWAGA: Wykonaj następujące kroki dzień przed sekcją w okapie z przepływem laminarnym w sterylnych warunkach.

  1. Kolby o długości 150 cm2 (T150) pokryć nasadką filtrującą (1 kolba na 2 młode) przy użyciu 5 ml polietyleneniminy (PEI, 100 mg/l, patrz protokół w pliku uzupełniającym 1).
  2. Przechowywać kolby w temperaturze 4 °C przez noc.
  3. W dniu rozbioru przepłukać pokryte kolby 3 razy sterylną wodą destylowaną.

2. Przygotowanie podłoża (~10 min)

UWAGA: Wykonaj te czynności w okapie z przepływem laminarnym w sterylnych warunkach.

  1. Przygotować 500 ml pożywki hodowlanej, składającej się ze zmodyfikowanej pożywki Eagle (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionej 10% płodowej surowicy cielęcej (FCS) i penicyliny-streptomycyny (100 j.m./ml).
  2. Przygotować 20,6 ml pożywki do trawienia enzymatycznego w probówce o pojemności 50 ml, składającej się z 20 ml DMEM, 200 μl DNazy (50 μg/ml), 200 μl papainy (30 U/ml) i 200 μl L-cysteiny (0,24 mg/ml).
  3. Filtruj i sterylizuj media za pomocą filtra 0,22 μm.
  4. Utrzymuj media w okapie z przepływem laminarnym w temperaturze pokojowej (RT) do czasu rozwarstwienia.

3. Przygotowanie do sekcji (~10 min)

UWAGA: Wykonaj te czynności w okapie z przepływem laminarnym w sterylnych warunkach.

  1. Przygotować 100 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami bez wapnia i magnezu (PBS; 1x). Sterylizuj filtrem za pomocą filtra 0,22 μm.
  2. Przygotuj 50 ml lodowatego roztworu 1x PBS uzupełnionego 750 μl 45% glukozy. Sterylizuj filtrem za pomocą filtra 0,22 μm.
  3. Napełnij szalkę Petriego o średnicy 100 mm 1x PBS do czyszczenia narzędzi i trzema szalkami Petriego o średnicy 60 mm lodowatą PBS-glukozą do pobierania tkanek. Połóż szalki Petriego na lodzie do momentu rozbioru.

4. Sekcja

UWAGA: Sekcja jest przeprowadzana od samców i samic szczurów rasy Wistar w dniu po urodzeniu (P) 2.

  1. Aby zapewnić sterylne środowisko, upewnij się, że ławka jest czyszczona 100% etanolem. Wysterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne 100% etanolem.
  2. Delikatnie spryskaj szyję szczeniaka 70% etanolem.
  3. Użyj dużych nożyczek chirurgicznych, aby odciąć głowę zwierzęciu i umieść głowę na 100-milimetrowej szalce Petriego zawierającej lodowatą glukozę PBS.
  4. Użyj zakrzywionych kleszczy, aby utrzymać głowę zwierzęcia na wysokości oczu. Użyj małych nożyczek chirurgicznych, aby wykonać małe nacięcie u podstawy czaszki i przeciąć czaszkę wzdłuż linii środkowej mózgu.
  5. Użyj kleszczy, aby delikatnie oderwać dwie części czaszki od linii środkowej.
  6. Użyj małej łyżki chirurgicznej, aby usunąć mózg z jamy głowy. Umieść mózg na 60-milimetrowej szalce Petriego zawierającej lodowaty PBS-glukozę na lodzie.
  7. Oglądając pod steromikroskopem, użyj cienkich kleszczy, aby usunąć móżdżek, pień mózgu i opuszki węchowe z półkul mózgowych.
  8. Użyj cienkich kleszczy, aby oddzielić dwie półkule mózgowe. Użyj cienkich kleszczy, aby odkleić opony mózgowe. Umieść korę mózgową na szalce Petriego o średnicy 60 mm na lodzie.
    UWAGA: Lodowaty PBS ma kluczowe znaczenie dla prawidłowego usuwania opon mózgowych.

5. Dysocjacja tkanek

UWAGA: Wykonaj te czynności w okapie z przepływem laminarnym w sterylnych warunkach.

  1. Użyj ostrego skalpela, aby drobno posiekać korę mózgową. Przenieść zmieloną tkankę do probówki o pojemności 50 ml zawierającej pożywkę do trawienia enzymatycznego.
  2. Inkubować przez 30 minut w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  3. Użyj mikropipety p1000, aby delikatnie usunąć pożywkę do trawienia enzymatycznego, upewniając się, że tkanka korowa pozostaje na dnie probówki o pojemności 50 ml.
  4. Użyj mikropipety p1000, aby dodać 1 ml DMEM-10% FCS i delikatnie rozcierać tkankę.
  5. Użyj filtra 70 μm i tłoka strzykawki o pojemności 1 ml, aby przefiltrować tkankę korową do probówki o pojemności 50 ml.
    UWAGA: Resztki tkanki na ściance rurki wewnętrznej można kilkakrotnie przepłukać za pomocą DMEM-10% FCS.
  6. Napełnij probówkę o pojemności 50 ml DMEM-10%FCS. Wirować przy 423 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Ostrożnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy za pomocą 2 ml DMEM-10%FCS.
  7. Delikatnie rozcierać osad komórkowy za pomocą mikropipety p1000, a następnie mikropipety p200. Rozcieńczyć zawiesinę komórek odpowiednią objętością DMEM-10%FCS.
    UWAGA: Dwa mózgi = jeden T150 = 5 ml DMEM-10% FCS.
  8. Płytka 5 ml zawiesiny komórek na T150 o gęstości 1 x 105 komórek/cm2. Dodaj 20 ml ciepłego DMEM-10%FCS do każdego T150. Inkubować w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  9. Odnowić połowę pożywki hodowlanej po 6 dniach in vitro (DIV) ciepłym DMEM-10%FCS.

6. Przygotowanie do potrząsania

  1. Preparat do wytrząsania należy wykonać w dniu poprzedzającym wstrząsanie w okapie z przepływem laminarnym w sterylnych warunkach.
  2. Odnowić połowę pożywki, dodając świeżą, ciepłą pożywkę do kolby i inkubować w temperaturze 37 °C w temperaturze 5% CO2 .

7. Potrząsanie

  1. Pokryj trzy 100-milimetrowe szalki Petriego PEI. Przechowywać je przez noc w temperaturze 4 °C.
  2. Przykryj nakrętkę kolby folią parafinową i włóż kolby do plastikowej torby. Kolby zawierające komórki glejowe wstrząsać przez noc z prędkością 250 obr./min w temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Pierwsze wstrząsy wykonywane są przy 8 DIV i można wykonać do trzech różnych wstrząsów (zobacz Rysunek 1 dla pomiaru czasu).

8. Pobieranie i hodowla komórek linii OL

UWAGA: Te kroki powinny być wykonywane w okapie z przepływem laminarnym w sterylnych warunkach.

  1. Następnego dnia po wstrząśnięciu przygotować pożywkę Bottensteina-Sato (BS) zgodnie z tabelą 1.
  2. Opłucz pokryte szalki Petriego 3 razy sterylną wodą destylowaną.
  3. Zebrać supernatant kolb zawierający głównie komórki linii OL, ale także niektóre komórki mikrogleju i umieścić go na niepowlekanych 100-milimetrowych szalkach Petriego.
    UWAGA: Ten krok umożliwia usunięcie komórek mikrogleju poprzez szybkie przyleganie różnicowe do powierzchni naczynia.
  4. Inkubować szalki Petriego przez 15 minut w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  5. Napełnić każdą kolbę T150 25 ml ciepłej, świeżo przygotowanej pożywki hodowlanej i inkubować w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C poniżej 5% CO2 do drugiego wstrząsu.
  6. Przenieść supernatant z płytek Petriego do nowych, niepowlekanych płytek Petriego o średnicy 100 mm, aby umożliwić przyleganie pozostałych komórek mikrogleju.
  7. Inkubować szalki Petriego przez 15 minut w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  8. Usunąć supernatant, który zawiera nieprzylegające komórki linii OL i przenieść go do probówek o pojemności 50 ml (supernatant z 2 szalek Petriego na probówkę o pojemności 50 ml). Wyrzuć szalki Petriego pokryte mikroglejem.
  9. Odwirowywać supernatant przez 5 minut przy 423 x g. Ostrożnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy z 1 ml pożywki BS. Zbierz wszystkie granulki we wspólnej probówce o pojemności 50 ml i dostosuj objętość do 10 ml za pomocą pożywki BS.
  10. Określ gęstość komórek, zliczając komórki pod mikroskopem.
    UWAGA: Należy uzyskać gęstość komórek między 3 x 105/ml a 5 x 105/ml.
  11. Dodać 20 ml BS, jeśli gęstość komórek jest większa lub równa 4 x 105/ml, aby uzyskać końcową objętość 30 ml, lub dodać tylko 10 ml BS, jeśli gęstość komórek jest mniejsza niż 4 x 105/ml, aby uzyskać końcową objętość 20 ml.
  12. Dwie lub trzy wstępnie pokryte 100 mm szalki Petriego należy umieścić na płytce 10 ml zawiesiny komórek. Inkubować w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  13. Usuń zanieczyszczenia z szalek Petriego, odświeżając całe podłoże BS 2 godziny później.
    UWAGA: Zbadaj kulturę pod mikroskopem przed i po oczyszczeniu, aby zweryfikować gęstość komórek i skuteczność usuwania zanieczyszczeń.
  14. Inkubować przez 2 dni w podłożu BS w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37 °C poniżej 5% CO2,
    UWAGA: Zbadaj kulturę pod mikroskopem. Zbieg powinien wynosić od 70% do 80%.

9. Produkcja OCM

UWAGA: Wykonaj te kroki w okapie z przepływem laminarnym w sterylnych warunkach.

  1. Przygotować NB-B27low medium zgodnie z tabelą 2.
  2. Odnowić pożywkę hodowlaną za pomocą 10 ml ciepłej pożywki NB-B27low . Inkubować przez 2 dni w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C poniżej 5% CO2 .
  3. Zebrać OCM, tj. supernatant zawierający czynniki wydzielane przez OL. Sterylizuj OCM za pomocą filtra 0,22 μm.
    UWAGA: Przechowywać OCM w temperaturze 4 °C maksymalnie 2 miesiące.

10. Dodawanie OCM

UWAGA: Czynności powinny być wykonywane w okapie z przepływem laminarnym w sterylnych warunkach. OCM można dodać do oczyszczonych kultur neuronów hipokampa przygotowanych zgodnie z następującym protokołem14 i otrzymać przez dodanie, 24 godziny po izolacji, środków antymitotycznych urydyny i 5-fluorodeoksyurydyny (5 μM) przez 36 godzin.

  1. W 3 DIV usunąć całą pożywkę do hodowli neuronów zawierającą środki antymitotyczne i dodać 500 μl świeżego, ciepłego OCM.
  2. Odnawiaj połowę podłoża co 3 dni świeżo przygotowanym ciepłym NB-B27.
    UWAGA: Takie kultury mogą być utrzymywane do 21 DIV.

11. Dodanie OL do oczyszczonej hodowli neuronów hipokampa

UWAGA: Wykonaj następujące kroki w okapie z przepływem laminarnym w sterylnych warunkach. OL można dodawać do oczyszczonych kultur hipokampa otrzymanych w taki sam sposób, jak opisano powyżej.

  1. Przygotować pożywkę do współhodowli zgodnie z tabelą 3.
  2. Pobierz kulturę OL przy zbieganiu od 70% do 80%. Spłucz 2 ml ciepłego 1x PBS.
  3. Aby odłączyć komórki, dodaj 2 ml 0,25% trypsyny do szalki Petriego o średnicy 100 mm.
  4. Inkubować przez 5 minut w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37 °C poniżej 5% CO2 .
  5. Dodaj 2 ml DMEM-10% FCS, aby zablokować reakcję enzymatyczną. Zebrać supernatant zawierający komórki linii OL.
  6. Wirować przy 423 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Ostrożnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w ciepłym pożywce do kohodowli, aby uzyskać stężenie 1,25 x 105 komórek/ml.
  7. Dodaj OL do oczyszczonej hodowli neuronów hipokampa, usuwając 200 μl pożywki do hodowli neuronów i dodając 200 μl zawiesiny komórkowej na dołek (2,5 x 104 komórki / dołek) 24-dołkowej płytki.
  8. Odświeżaj połowę pożywki kokulturowej co 2-3 dni.
    UWAGA: Kokultury mogą być utrzymywane do 24 DIV.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym protokole, komórki linii OL są oczyszczane z kultur glejowych poprzez strząsanie astrocytów i mikrogleju. Czystość i badanie fenotypowe kultur OL można ocenić za pomocą barwienia immunologicznego za pomocą markerów glejowych15. Analiza ekspresji różnych markerów wykazała, że hodowle OL były w większości pre-OL z 90% ± 4% komórek O4+, 85% ± 7% komórek NG2+ i 4,7% ± 2,1% komórek PLP+, podczas gdy 7,2% ± 2,5% komórek stanowiły as...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół uzyskiwania wysoce wzbogaconych kultur komórek linii oligodendroglialnej z mieszanych kultur glejowych, zaadaptowanych z wcześniej opublikowanej metody16, a następnie produkcji pożywki kondycjonowanej OL. Ta technika wytrząsania nie jest kosztowna, można ją powtórzyć trzykrotnie i jest optymalna do uzyskania dużej ilości oczyszczonych OL, ponieważ komórki hodowane w pożywce Bottensteina-Sato (BS) zawierają PDGFα namnażają się. Komórki glejowe są prz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Żaden z autorów nie ma sprzecznych interesów ani sprzecznych interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować Rémi Ronzano za jego mądre rady w redagowaniu manuskryptów. Praca ta została sfinansowana przez ICM, INSERM, grant fundacji ARSEP dla NSF oraz Bouvet-Labruyère Price.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
5-fluorodeoksyurydynaSigmaF0503
B27 suplementThermoFisher17504044
roztwór D-(+)-glukozySigmaG8769
DNaza (dezoksyrybonukleaza I)WorthingtonLS002139
Dulbecco's Modified Eagle MediumThermoFisher31966021
Etanol 100% Sigma32221-M
Etanol 70%VWR Chemicals83801.360
Surowica cielęca płoduThermoFisher10082147
L-cysteinaSigmaC7352
NeurobasalThermoFisher21103049
PapainaWorthingtonLS003126
Penicylina-StreptomycynaThermoFisher15140122
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami bez wapnia i magnezuThermoFisherA1285601
Polietyleninin(PEI)SigmaP3143
Tetraboran dekahydratSigmaB9876
TrypsynaSigma Sigma
UrydynaSigmaU3750
Bottenstein-Sato (BS) media
apo-Transferyna ludzkaSigmaT1147
BSA (albumina surowicy bydlęcej)SigmaA4161
Dulbecco's Modified Eagle MediumThermoFisher31966021
InsulinaSigmaI5500
PDGFPeprotechAF-100-13A
Penicylina-StreptomycynaThermoFisher15140122
ProgesteronSigmaP8783
Dichlorowodorek putrescynySigmaP5780
Selenin soduSigmaS5261
T3 (sól sodowa 3,3',5-trijodo-L-tyroniny)SigmaT6397
T4 ( L-tyroksyna)SigmaT1775
Pożywka do wspólnej hodowli
apo-Transferyna ludzkaSigmaT1147
B27 suplementThermoFisher17504044
BiotynaSigmaB4639
BSA (albumina surowicy bydlęcej)SigmaA4161
CeruloplasminSigma239799
Dulbecco's Modified Eagle MediumThermoFisher31966021
HydrokortyzonSigmaH4001
InsulinaSigmaI5500
N-acetylo-L-cysteinaSigmaA8199
NeurobasalThermoFisher21103049
Penicylina-StreptomycynaThermoFisher15140122
ProgesteronSigmaP8783
PutrescinSigmaP5780
Rekombinowany ludzki CNTFSigma450-13
Selenin soduSigmaS5261
T3 (sól sodowa 3,3',5-trijodo-L-tyroniny)SigmaT6397
Witamina B12SigmaV6629
Tools
0,22 &mikro; m filtrSartorius514-7010
Strzykawka 1 mlTerumo1611127
100 mm szalka PetriegoDutscher193100
Probówka 15 mlCorning Life Science734-1867
Tubka 50 mlCorning Life Science734-1869
60 mm szalka PetriegoDutscher067003
70 & Mikro; Filtr mMiltenyi Biotec130-095-823
Mikroskop lornetkowyOlympusSZX7
Kleszcze zakrzywioneFine Science Tools11152-10
Kleszcze do drobnychFine Science Tools91150-20
Duże nożyczki chirurgiczneFine Science Tools14008-14
SkalpelSwann-morton233-5528
ShakerInfors HT
Małe nożyczki chirurgiczneFine Science Tools91460-11
Mała łyżka chirurgicznaBar Naor LtdBN2706
T150 cm2 kolba z nasadką filtrującąDutscher190151
Animal
P2 Wistar szczurJanvierRjHAn:WI
przedmiotów

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zalc, B. The acquisition of myelin: a success story. Novartis Foundation Symposium. 276, 15-21 (2006).
  2. Habermacher, C., Angulo, M. C., Benamer, N. Glutamate versus GABA in neuron-oligodendroglia communication. Glia. 67 (11), 2092-2106 (2019).
  3. Sherman, D. L., Brophy, P. J. Mechanisms of axon ensheathment and myelin growth. Nature Reviews. Neuroscience. 6 (9), 683-690 (2005).
  4. Freeman, S. A., Desmazières, A., Fricker, D., Lubetzki, C., Sol-Foulon, N. Mechanisms of sodium channel clustering and its influence on axonal impulse conduction. Cellular and molecular life sciences: CMLS. 73 (4), 723-735 (2016).
  5. Lee, Y., et al. Oligodendroglia metabolically support axons and contribute to neurodegeneration. Nature. 487 (7408), 443-448 (2012).
  6. Nave, K. A. Myelination and the trophic support of long axons. Nature Reviews. Neuroscience. 11 (4), 275-283 (2010).
  7. Monje, M. Myelin Plasticity and Nervous System Function. Annual Review of Neuroscience. 41, 61-76 (2018).
  8. Birey, F., et al. Genetic and Stress-Induced Loss of NG2 Glia Triggers Emergence of Depressive-like Behaviors through Reduced Secretion of FGF2. Neuron. 88 (5), 941-956 (2015).
  9. Frühbeis, C., et al. Neurotransmitter-triggered transfer of exosomes mediates oligodendrocyte-neuron communication. PLoS Biology. 11 (7), e1001604(2013).
  10. Jang, M., Gould, E., Xu, J., Kim, E. J., Kim, J. H. Oligodendrocytes regulate presynaptic properties and neurotransmission through BDNF signaling in the mouse brainstem. eLife. 8, (2019).
  11. Sakry, D., et al. Oligodendrocyte precursor cells modulate the neuronal network by activity-dependent ectodomain cleavage of glial NG2. PLoS Biology. 12 (11), e1001993(2014).
  12. Sakry, D., Yigit, H., Dimou, L., Trotter, J. Oligodendrocyte precursor cells synthesize neuromodulatory factors. PloS One. 10 (5), e0127222(2015).
  13. Stadelmann, C., Timmler, S., Barrantes-Freer, A., Simons, M. Myelin in the Central Nervous System: Structure, Function, and Pathology. Physiological Reviews. 99 (3), 1381-1431 (2019).
  14. Freeman, S. A., et al. Acceleration of conduction velocity linked to clustering of nodal components precedes myelination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), E321-E328 (2015).
  15. Baumann, N., Pham-Dinh, D. Biology of oligodendrocyte and myelin in the mammalian central nervous system. Physiological Reviews. 81 (2), 871-927 (2001).
  16. McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. The Journal of Cell Biology. 85 (3), 890-902 (1980).
  17. Dean, J. M., et al. Strain-specific differences in perinatal rodent oligodendrocyte lineage progression and its correlation with human. Developmental Neuroscience. 33 (3-4), 251-260 (2011).
  18. Domingues, H. S., Portugal, C. C., Socodato, R., Relvas, J. B., Astrocyte, Oligodendrocyte, Astrocyte, and Microglia Crosstalk in Myelin Development, Damage, and Repair. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 71(2016).
  19. Klinghoffer, R. A., Hamilton, T. G., Hoch, R., Soriano, P. An allelic series at the PDGFalphaR locus indicates unequal contributions of distinct signaling pathways during development. Developmental Cell. 2 (1), 103-113 (2002).
  20. Spassky, N., et al. The early steps of oligodendrogenesis: insights from the study of the plp lineage in the brain of chicks and rodents. Developmental Neuroscience. 23 (4-5), 318-326 (2001).
  21. Moyon, S., et al. Demyelination Causes Adult CNS Progenitors to Revert to an Immature State and Express Immune Cues That Support Their Migration. Journal of Neuroscience. 35 (1), 4-20 (2015).
  22. Gardner, A., Jukkola, P., Gu, C. Myelination of rodent hippocampal neurons in culture. Nature Protocols. 7 (10), 1774-1782 (2012).
  23. Thetiot, M., et al. An alternative mechanism of early nodal clustering and myelination onset in GABAergic neurons of the central nervous system. bioRxiv. , 763573(2019).
  24. Dubessy, A. L., et al. Role of a Contactin multi-molecular complex secreted by oligodendrocytes in nodal protein clustering in the CNS. Glia. 67 (12), 2248-2263 (2019).
  25. Barateiro, A., Fernandes, A. Temporal oligodendrocyte lineage progression: in vitro models of proliferation, differentiation and myelination. Biochimica Et Biophysica Acta. 1843 (9), 1917-1929 (2014).
  26. Thetiot, M., Ronzano, R., Aigrot, M. S., Lubetzki, C., Desmazières, A. Preparation and Immunostaining of Myelinating Organotypic Cerebellar Slice Cultures. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (145), (2019).
  27. Mannioui, A., Zalc, B. Conditional Demyelination and Remyelination in a Transgenic Xenopus laevis. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1936, 239-248 (2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

oczyszczanie oligodendrocyt wr nicowanie oligodendrocyt whodowla neuron w hipokampaadhezja r nicowawstrz sanie przez nocpod o e Bottenstein Satokom rki O4 dodatniekom rki NG2 dodatnie

Powiązane artykuły