Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Krojenie i hodowla serc wieprzowych w warunkach fizjologicznych

17.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60913

⸱

20 marca 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Molecular Cardiology, Department of Medicine, University of Louisville, 2Department of Bioengineering, University of Louisville, 3Diabetes and Obesity Center, Department of Medicine, University of Louisville, 4Department of Pharmacology and Toxicology, University of Louisville, 5Institute of Cardiovascular Sciences, University of Manchester, 6Faculty of Pharmacy, Zagazig University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje, jak kroić i hodować tkankę serca w warunkach fizjologicznych przez 6 dni. Ten system hodowli może być wykorzystany jako platforma do testowania skuteczności nowatorskich metod leczenia niewydolności serca, a także jako wiarygodne testowanie ostrej kardiotoksyczności w modelu 3D serca.

Streszczenie

Wiele nowych leków nie przechodzi badań klinicznych z powodu kardiotoksycznych skutków ubocznych, ponieważ obecnie dostępne testy in vitro i modele zwierzęce in vivo słabo przewidują obciążenie ludzkiego serca, stanowiąc wielomiliardowe obciążenie dla przemysłu farmaceutycznego. W związku z tym na całym świecie istnieje niezaspokojona potrzeba medyczna na lepsze podejścia do identyfikacji kardiotoksyczności leków przed podjęciem kosztownych i czasochłonnych badań klinicznych "po raz pierwszy na ludziach". Obecnie tylko niedojrzałe komórki serca (ludzkie indukowane pluripotencjalne kardiomiocyty pochodzące z pluripotencjalnych komórek macierzystych [hiPSC-CMs]) są używane do testowania skuteczności terapeutycznej i toksyczności leków, ponieważ są to jedyne ludzkie komórki serca, które mogą być hodowane przez dłuższy czas wymagany do zbadania skuteczności i toksyczności leku. Jednak pojedynczy typ komórki nie może replikować fenotypu złożonej tkanki serca 3D, która składa się z wielu typów komórek. Co ważne, działanie leków musi być testowane na dorosłych kardiomiocytach, które mają inną charakterystykę i reakcje toksyczne w porównaniu z niedojrzałymi hiPSC-CM. Hodowla wycinków ludzkiego serca jest obiecującym modelem nienaruszonego ludzkiego mięśnia sercowego. Technologia ta zapewnia dostęp do kompletnego systemu wielokomórkowego, który naśladuje tkankę ludzkiego serca i odzwierciedla fizjologiczne lub patologiczne warunki ludzkiego mięśnia sercowego. Niedawno, dzięki optymalizacji składników pożywki hodowlanej i warunków hodowli, w tym ciągłej stymulacji elektrycznej przy 1,2 Hz i przerywanym natlenianiu pożywki hodowlanej, opracowaliśmy nową konfigurację systemu hodowli, która zachowuje żywotność i funkcjonalność plastrów serca ludzkiego i świńskiego przez 6 dni w hodowli. W obecnym protokole szczegółowo opisujemy metodę krojenia i hodowli serca świni jako przykład. Ten sam protokół jest używany do hodowli plastrów z serc ludzi, psów, owiec lub kotów. Ten system hodowli ma potencjał, aby stać się potężnym predykcyjnym modelem in situ dla ludzi do badań ostrej kardiotoksyczności, który wypełnia lukę między wynikami badań przedklinicznych i klinicznych.

Wprowadzenie

Kardiotoksyczność wywołana lekami jest główną przyczyną wycofania się z rynku1. W ostatniej dekadzie XX wieku wycofano z rynku osiem leków niesercowo-naczyniowych, które powodowały nagłą śmierć z powodu komorowych zaburzeń rytmu serca2. Ponadto kilka terapii przeciwnowotworowych (choć w wielu przypadkach skutecznych) może prowadzić do wielu skutków kardiotoksycznych, w tym kardiomiopatii i arytmii. Na przykład zarówno tradycyjne (np. antracykliny i radioterapia), jak i celowane (np. trastuzumab) terapie raka piersi mogą powodować powikłania sercowo-naczyniowe w podgrupie pacjentów3. Ścisła współpraca między kardiologami i onkologami (za pośrednictwem rozwijającej się dziedziny "kardioonkologii") pomogła w opanowaniu tych powikłań, zapewniając skuteczne leczenie pacjentów2. Mniej jasne są skutki sercowo-naczyniowe nowszych leków, w tym inhibitorów Her2 i PI3K, zwłaszcza gdy terapie są stosowane w skojarzeniu. W związku z tym rośnie zapotrzebowanie na wiarygodne przedkliniczne strategie badań przesiewowych w kierunku toksyczności sercowo-naczyniowej związanej z pojawiającymi się terapiami przeciwnowotworowymi przed badaniami klinicznymi na ludziach. Brak dostępności systemów hodowli tkanki ludzkiego serca, która jest funkcjonalnie i strukturalnie zdolna do pracy przez ponad 24 godziny, jest czynnikiem ograniczającym wiarygodne badania kardiotoksyczności. W związku z tym istnieje pilna potrzeba opracowania niezawodnego systemu hodowli tkanki ludzkiego serca w warunkach fizjologicznych w celu badania toksyczności leków.

Niedawny ruch w kierunku wykorzystania ludzkich pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych (hiPSC-CMs) w testach kardiotoksyczności dostarczył częściowego rozwiązania tego problemu; jednakże, niedojrzały charakter hiPSC-CM i utrata integralności tkankowej w porównaniu do wielokomórkowej natury tkanki serca są głównymi ograniczeniami tej technologii4. Niedawne badanie częściowo przezwyciężyło to ograniczenie poprzez wytwarzanie tkanek serca z hiPSC-CM na hydrożelach i poddawanie ich stopniowemu wzrostowi stymulacji elektrycznej w czasie5. Jednak ich właściwości elektromechaniczne nie osiągnęły dojrzałości obserwowanej u dorosłego mięśnia sercowego człowieka. Co więcej, tkanka serca jest strukturalnie bardziej skomplikowana, składa się z różnych typów komórek, w tym komórek śródbłonka, neuronów i różnych typów fibroblastów zrębu połączonych ze sobą bardzo specyficzną mieszaniną białek macierzy zewnątrzkomórkowej6. Ta niejednorodność populacji komórek niekardiomiocytów 7,8,9 w sercu dorosłego ssaka jest główną przeszkodą w modelowaniu tkanki serca przy użyciu poszczególnych typów komórek. Te główne ograniczenia podkreślają znaczenie opracowania metod umożliwiających hodowlę nienaruszonej tkanki serca w celu uzyskania optymalnych badań obejmujących fizjologiczne i patologiczne warunki serca5.

Hodowla plastrów ludzkiego serca jest obiecującym modelem nienaruszonego ludzkiego mięśnia sercowego. Technologia ta zapewnia dostęp do kompletnego wielokomórkowego systemu 3D, który jest podobny do tkanki ludzkiego serca, co może niezawodnie odzwierciedlać fizjologiczne lub patologiczne warunki ludzkiego mięśnia sercowego. Jednak jego zastosowanie zostało poważnie ograniczone przez krótki okres żywotności w kulturze, który nie wykracza poza 24 godziny przy użyciu najbardziej niezawodnych protokołów zgłoszonych do 2018 roku10,11,12. Ograniczenie to wynikało z wielu czynników, w tym zastosowania granicy faz powietrze-ciecz do hodowli plastrów oraz użycia prostej pożywki hodowlanej, która nie obsługuje wysokich wymagań energetycznych tkanki serca. Niedawno opracowaliśmy system hodowli zanurzonej, który jest w stanie zapewnić ciągłą stymulację elektryczną i zoptymalizowaliśmy składniki pożywek hodowlanych, aby utrzymać żywotność wycinków tkanki serca przez okres do 6 dni13. Ten system hodowli ma potencjał, aby stać się potężnym predykcyjnym modelem in situ dla ludzi do badań ostrej kardiotoksyczności, aby wypełnić lukę między wynikami badań przedklinicznych i klinicznych. W bieżącym artykule szczegółowo opisujemy protokół krojenia i hodowli plastrów serca na przykładzie serca świni. Ten sam proces stosuje się do serc ludzkich, psów, owiec lub kotów. Mamy nadzieję, że dzięki temu protokołowi uda nam się rozpowszechnić tę technologię w innych laboratoriach w społeczności naukowej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące zwierząt były zgodne z wytycznymi instytucjonalnymi Uniwersytetu w Louisville i zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt.

1. Przygotowanie do krojenia (dzień przed krojeniem)

  1. Przygotowanie mikrotomu wibracyjnego
    1. Umieść ostrze ceramiczne w uchwycie, wykonując następujące czynności: po ostrożnym rozpakowaniu ostrza najpierw umieść ostrą krawędź w szczelinie narzędzia ostrza. Następnie włóż ostrze do uchwytu, poluzowując dwie na ramionach uchwytu i wsuń ostrze pod każdą podkładkę i mocno dociśnij je z powrotem do tylnych ograniczników. Dokręć, aby zamocować ostrze.
      nuta: nie należy dokręcać zbyt mocno.
    2. Skalibruj ostrze za pomocą protokołu kalibracji i narzędzi zgodnie z protokołem producenta.
      nuta: Krótko mówiąc, w celu ułatwienia wyrównania ostrza z osią jazdy i zminimalizowania ugięć osi Z, mikrotom wibracyjny wykorzystuje demontowalne urządzenie kalibracyjne. Gdy urządzenie kalibracyjne jest podłączone do przyrządu, jego obecność zostanie automatycznie wykryta, a wibrujący mikrotom przejmie kontrolę nad dostosowaniem ustawień amplitudy i częstotliwości ostrza do wielkości, która najlepiej pozwala na regulację błędu wyrównania ostrza.
      1. Naciśnij przycisk Slice, aby rozpocząć proces wyrównywania, który automatycznie przesunie ostrze tak, aby krawędź tnąca znalazła się w optymalnej pozycji w stosunku do urządzenia kalibracyjnego w celu najlepszej oceny wyrównania. Postępuj zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie, aby dokonać regulacji ostrza za pomocą dostarczonego śrubokręta, aby upewnić się, że wyrównanie Z mieści się w granicach 1 μm.
    3. Przeprowadź w autoklawie wannę wewnętrzną i wszystkie metalowe części wibrującego mikrotomu.
  2. Duże metalowe tace (do zbierania plastrów i nasączania pokryw płytek do stymulacji elektrycznej) należy sterylizować w autoklawie, wszelkie szklane pojemniki, ostrza w kształcie prostokąta, kleszcze, nożyczki, pasek rozrządu drukarki (pokrój je na kawałki o szerokości 6 mm), metalowe podkładki i 5 l podwójnie destylowanej wody (ddH2O).
  3. Wysterylizuj jeden słoik o pojemności 1 l, jeden słoik o pojemności 500 ml i jedną plastikową tackę do perfuzji serca in situ i in vitro roztworem kardioplegicznym.
  4. Przygotować 2 litry roztworu Tyrode'a do krojenia w zlewce o pojemności 2 l.
    1. Na 1 l roztworu Tyrode'a do krojenia zmieszać 3 g/l monoksymu 2,3-butanodionu (BDM), 140 mM NaCl (8,18 g), 6 mM KCl (0,447 g), 10 mM D-glukozy (1,86 g), 10 mM HEPES (2,38 g), 1 mM MgCl2 (1 ml 1 M roztworu), 1,8 mM CaCl2 (1,8 ml 1 M roztworu), do 1 L ddH2O. Doprowadzić pH do 7,40 za pomocą NaOH. Następnie przefiltrować roztwór za pomocą filtra próżniowego/systemu przechowywania o pojemności 1 000 ml i 0,22 μm i przechowywać go w temperaturze 4 °C przez noc.
  5. Przygotuj 4 l roztworu kardioplegicznego.
    1. Na 1 l roztworu kardioplegicznego zmieszać 110 mM NaCl (6,43 g), 1,2 mM CaCl2 (1,2 ml 1 M roztworu), 16 mM KCl (1,19 g), 16 mM MgCl2 (3,25 g), 10 mM NaHCO3 (0,84 g), 1 U/ml heparyny, do 1 l ddH2O. Doprowadzić pH do 7,40 za pomocą NaOH. Następnie przefiltrować roztwór za pomocą filtra próżniowego/systemu przechowywania o pojemności 1 000 ml, 0,22 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C przez noc.
      nuta: Dodać 1000 U/L heparyny w roztworze kardioplegii w dniu krojenia (patrz krok 2.1).
  6. Świeżo przygotuj 500 ml pożywki hodowlanej w oryginalnej butelce w komorze bezpieczeństwa biologicznego: wymieszaj pożywkę 199, 1x suplement insuliny-transferyny-selenu (ITS), 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 5 ng/ml czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF), 10 ng/ml FGF-basic i 2x antybiotyk-antybiotyk-przeciwgrzybiczy. Filtr sterylizować przez 0,22 μm, próżniowy filtr/system przechowywania i przechowywać w temperaturze 4 °C przez noc.
    nuta: Nie reguluj pH, dodaj VEGF i FGF świeżo przed użyciem.
  7. Przygotuj 4% płytki z żelu agarowego.
    1. Dodać 200 ml wysterylizowanego ddH2O do wysterylizowanej kolby o pojemności 500 ml. Odważyć 8 g agarozy i delikatnie wlać do kolby. Gotować przez 2 minuty w kuchence mikrofalowej, a następnie schłodzić przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    2. Wlej 25 ml do każdej 100 mm szalki Petriego w komorze bezpieczeństwa biologicznego (przygotuj 6 szalek) i odczekaj 1 godzinę do zestalenia. Następnie uszczelnić płytki folią parafinową, owinąć czystą folią i przechowywać w temperaturze 4 °C.
  8. Przygotować 4 litry 70% etanolu, rozcieńczając 200-procentowy absolutny etanol w autoklalawowanym ddH2O.
  9. Przygotuj 2x antybiotyk-antybiotyk w wysterylizowanym ddH2O: wymieszaj 980 ml wysterylizowanego ddH2O z 20 ml antybiotyku przeciwgrzybiczego pod szafką bezpieczeństwa biologicznego.

2. Perfuzja serca świni

  1. Dodać 1 ml heparyny o stężeniu 1 000 j./ml do każdego 1 litra roztworu kardioplegicznego. Roztwór należy przechowywać na lodzie.
    nuta: Co najmniej 3 litry są potrzebne do perfuzji i konserwacji serca podczas transferu do pomieszczenia do hodowli tkankowej.
  2. Zabierz następujące przedmioty do sali chirurgicznej świń: jedno duże wiadro z lodem pełne lodu, jedną wysterylizowaną metalową tacę (trzymaj na wiadrze z lodem do perfuzji serca), jeden wysterylizowany słoik o pojemności 500 ml, jeden słoik o pojemności 1 litra (do przeniesienia serca w roztworze kardioplegii z powrotem do pomieszczenia do hodowli tkankowej, na lodzie) i jedną wysterylizowaną plastikową tacę pełną lodu (aby utrzymać roztwór kardioplegiczny na lodzie).
  3. Przygotuj system perfuzji serca in situ zawierający 3-kierunkowy kran odcinający, strzykawkę o pojemności 60 ml, cewnik igłowy motylkowy 18 G i rurkę przedłużającą do zbiornika roztworu kardioplegicznego.
  4. Znieczulenie samca świni Yorkshire (2-3 miesiące, 20-25 kg) należy najpierw wstrzyknąć domięśniowo koktajl ketaminy (20 mg/kg)/ksylazyny (2 mg/kg). Potwierdź prawidłowe znieczulenie poprzez utratę napięcia szczęki. Następnie przenieś świnię na salę operacyjną, zaintubuj i mechanicznie przewietrz płuca zgodnie z wcześniejszym opisem14.
  5. Utrzymuj znieczulenie za pomocą (1,5−2%) izofluranu.
  6. Umieść zwierzę w odpowiedniej pozycji bocznej i ogol sierść z okolicy klatki piersiowej. Oczyść skórę peelingiem alkoholowym, a następnie wysterylizuj miejsce operowane 10% (w/v) roztworem jodu powidonu.
  7. Otwórz klatkę piersiową przez lewe nacięcie torakotomii za pomocą skalpela w 4. przestrzeni międzyżebrowej i użyj retraktora klatki piersiowej między żebrami, aby utrzymać klatkę piersiową otwartą i odsłonić serce.
    nuta: Do tej procedury użyj wszystkich wysterylizowanych narzędzi.
  8. Włóż cewnik z igłą motylkową do lewego przedsionka i przymocuj igłę zamknięciem ze sznurka w torebce. Po dożylnym wstrzyknięciu dożylnej dawki heparyny w bolusie (100 j./kg) należy rozpocząć perfuzję serca in situ za pomocą 500 ml lodowatego roztworu kardioplegicznego (w celu spowolnienia częstości akcji serca) przez cewnik lewego przedsionka.
  9. Głęboko znieczulij świnię 5% izofluranem. Szybko wyciąć serce z klatki piersiowej za pomocą nożyczek chirurgicznych. Kankaniulować aortę za pomocą kaniuli aortalnej i perfuzjować serce in vitro kolejnym 1 litrem lodowatego roztworu kardioplegicznego (100 ml / min) w celu wypłukania krwi naczyniowej.
  10. Po perfuzji serca należy przechowywać serce w 1-litrowym słoiku wypełnionym lodowatym roztworem kardioplegii i przechowywać na lodzie podczas transferu do pomieszczenia do hodowli tkankowych.

3. Krojenie tkanek serca świni

  1. Ustaw kąpiel tkankową na wibratomie, dodaj lód do płaszcza chłodzącego do kąpieli tkankowej, a następnie dodaj roztwór Tyrode'a do kąpieli tkankowej. Ustaw plastikowy słoik o pojemności 1 l, aby zebrać odpady stopionego lodu z płaszcza chłodzącego do kąpieli tkankowej.
  2. Pod komorą bezpieczeństwa biologicznego przenieś serce świni na tacę zawierającą 1 l świeżego zimnego roztworu kardioplegicznego.
  3. Wypreparuj serce, aby wyizolować lewą komorę za pomocą wysuwanych sterylnych skalpeli. Następnie pokrój lewą komorę na bloki po 1−2 cm3 każdy za pomocą prostokątnych ostrzy brzytwy. Użyj jednego kawałka do krojenia, a pozostałe kawałki trzymaj w probówce o pojemności 50 ml w zimnym roztworze Tyrode'a na lodzie do późniejszego krojenia, jeśli zajdzie taka potrzeba.
    nuta: Masuj tkankę przed krojeniem rękami, zwłaszcza jeśli jest to drugi blok. Masowanie pomaga przywrócić prawidłową konfigurację włókien mięśniowych i zapobiega sztywności w obrębie bloku serca.
  4. Dodaj 1−2 krople kleju tkankowego (tabela materiałów) do metalowego uchwytu na próbkę i przyklej kawałek 4% bloku agaru o powierzchni około 1cm2.
  5. Dodaj 1-2 krople kleju tkankowego na agar.
  6. Przyklej blok serca do agaru stroną z nasierdziem serca skierowaną w dół na kleju tkankowym i upewnij się, że jest tak płaski, jak to możliwe. Następnie przenieś uchwyt na tkankę z blokiem serca do jego pozycji w kąpieli krojącej wibratomu.
  7. Podłącz rurkę tlenową do kąpieli do krojenia i metalową tacę wypełnioną roztworem Tyrode'a do zbierania plastrów (natleniona kąpiel Tyrode'a). Następnie dodaj sitka o średnicy 40 μm do metalowej tacy, aby zebrać plastry po pokrojeniu.
  8. Regulacja pozycji krojenia
    1. Korzystając z oprogramowania do obsługi wibratomu i deski rozdzielczej, wyreguluj wysokość ostrza/próbki. Wybierz przycisk wysokości i postępuj zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie, aby dostosować wysokość. Idealnie, aby ostrze znajdowało się blisko górnej części tkanki, ale poniżej mięśni brodawkowatych i upewnij się, że płyn pokrywa tkankę i ostrze przed krojeniem.
    2. Dostosuj miejsce, w którym chcesz rozpocząć krojenie tkanki, wybierając przycisk postępu. Naciśnij przycisk krojenia i zwiększ prędkość za pomocą pokrętła, aby przesunąć ostrze w kierunku krawędzi chusteczki. Następnie ponownie naciśnij plasterek, aby zatrzymać, i naciśnij przycisk postępu, aby dezaktywować proces.
    3. Dostosuj parametry cięcia: prędkość posuwu = 0,03 mm/s, częstotliwość drgań = 80 Hz i amplituda drgań poziomych = 2 mm. Następnie rozpocznij krojenie, wybierając przycisk plasterka.
    4. Pozwól wibratomowi kroić, aż dotrze do końca tkanki, ale zanim uderzy w tylny koniec uchwytu próbki. W tym momencie ponownie naciśnij plasterek, aby zatrzymać. Naciśnij przycisk Return, aby wrócić do pozycji początkowej.
    5. Wybierz automatyczne powtarzanie (klikając go dwukrotnie), co pozwoli wibrującemu mikrotomowi automatycznie powtórzyć proces krojenia do 99 razy.
  9. Zbieranie plasterków
    1. Poczekaj, aż plastry będą na całej długości i będą dobrze wyglądać (po przejściu przez warstwy mięśni brodawkowatych), a następnie zacznij zbierać plasterki.
    2. Zbierz plastry za pomocą plastikowej pipety Pasteura wypełnionej zimnym roztworem Tyrode, aby delikatnie pobrać chusteczkę z kąpieli. W razie potrzeby użyj kleszczy i nożyczek sprężynowych, aby oddzielić plasterek od bloku serca, jeśli tkanka jest nadal przyczepiona.
    3. Przenieś plasterek do sitka do jednej komórki w natlenionej kąpieli Tyrode'a (patrz krok 3.7) i użyj płynu w plastikowej pipecie Pasteura, aby tkanka leżała płasko na jednym z sitek do komórek, a następnie dodaj metalową podkładkę na górze, aby przytrzymać tkankę w dół.
      nuta: Plastry muszą być inkubowane przez co najmniej 1 godzinę w roztworze Tyrode'a przed przetworzeniem (ma to na celu rozluźnienie tkanki przez BDM).

4. Hodowla plastrów serca

  1. Przygotowanie plastrów do uprawy
    1. Przytnij plasterek od krawędzi, aby uniknąć nierównych krawędzi. Następnie przyklej go z obu końców do wysterylizowanego poliuretanowego paska rozrządu drukarki o szerokości 6 mm z metalowymi drutami osadzonymi za pomocą kleju tkankowego.
    2. Przenieś podparte plasterki serca na 6 dołków, które zawierają 6 ml pożywki hodowlanej w każdym dołku.
    3. Umieść pokrywę płytki stymulacyjnej (Tabela materiałów) na górze płytki 6-dołkowej i podłącz pokrywę do stymulatora elektrycznego hodowli komórkowej (Tabela materiałów). Dostosuj stymulator tak, aby stymulował elektrycznie plastry serca przy napięciu 10 V, 1.2 Hz w sposób ciągły przez cały czas.
      UWAGA: Po podłączeniu stymulacji plastry serca zaczną bić, a ruch ten będzie wizualnie widoczny.
    4. Przenieść płytki do inkubatora i utrzymywać w temperaturze 37 °C przy nawilżonym powietrzu i 5% CO2 .
  2. Zmieniaj pożywkę 3 razy dziennie i dodawaj 6 ml pożywki do dołka podczas każdej zmiany pożywki.
    nuta: Pożywka hodowlana jest natleniana przez 5 minut przed każdą zmianą pożywki. Pożywkę należy wymieniać co najmniej 1 raz dziennie; W razie potrzeby jest to w porządku w weekendy. Dwa dni z tylko 1 wymianą nośnika dziennie to maksimum, które jest testowane.
  3. Codziennie zmieniaj pokrywę płytki stymulacyjnej, aby zapobiec uwalnianiu się toksycznych cząstek grafitu do pożywki hodowlanej (zwykle podczas wymiany pożywki w ciągu dnia).
    1. Zdejmij pokrywę płytki stymulacyjnej z naczynia hodowlanego i włóż białą piankową zatyczkę w miejscu, w którym osłona łączy się z stymulatora elektrycznego hodowli komórkowej, aby zapobiec uszkodzeniu obwodu elektrycznego przez wodę.
    2. Umieść pokrywę płytki w kąpieli z autoklawowaną wodą z 2x antybiotykiem-antybiotykiem. Trzymaj go w tej kąpieli (tj. kąpieli płuczącej) przez noc.
    3. Następnego dnia przenieś pokrywę płyty do kąpieli 70% etanolowej na 5-15 minut w celu odkażenia. Strząśnij jak najwięcej płynu z urządzenia przed zmianą kąpieli.
    4. Następnie przenieś pokrywę płytki do trzeciej i ostatniej kąpieli (tj. czystej kąpieli), która składa się z autoklawowanej wody i 2x antybakteryjno-przeciwgrzybiczego, aby wypłukać wszelkie pozostałe ślady etanolu.
    5. Po wypłukaniu pokrywy płytki w czystej kąpieli użyj czystej, niestrzępiącej się chusteczki (spryskanej etanolem), aby wysuszyć resztki wody z plastikowych części, a następnie usuń biały kawałek pianki i ostrożnie umieść pokrywę płytki z powrotem na płytce hodowlanej.
      nuta: Nie dotykaj czarnych elektrod grafitowych, które wchodzą do studni, ponieważ urządzenie nie będzie już sterylne.
    6. Używając sterylnych kleszczy, upewnij się, że tkanka znajduje się na środku dołka, tak aby pokrywa płytki nie dotykała tkanki. Upewnij się, że zakrzywiona strona pokrywy płyty pokrywa się z kątową stroną płyty i że kwadratowe rogi są wyrównane.
      UWAGA: Aby zminimalizować zanieczyszczenie pokryw płytek stymulacyjnych, po zakończeniu eksperymentu należy je przechowywać w czystych i pustych płytkach 6-dołkowych.
  4. Wykonaj test MTT, pomiary wapnia i ocenę funkcji skurczu na świeżych plastrach serca świni (dzień 0), a po 6 dniach w hodowli zgodnie z Ou et al.13.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wykorzystując dostępny komercyjnie stymulator elektryczny do hodowli komórkowych, który pozwala na jednoczesne umieszczenie ośmiu płytek 6-dołkowych, odwzorowaliśmy środowisko dorosłego serca poprzez indukcję stymulacji elektrycznej z częstotliwością fizjologiczną (1,2 Hz) i przesiewowo dobraliśmy podstawowe składniki pożywki w celu wydłużenia czasu trwania funkcjonalności hodowli plastrów serca świni13. Ponieważ serca świni i człowieka są podobne pod względem wiel...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Poniżej opisujemy szczegółowy protokół wideo dla naszej niedawno opublikowanej metody uproszczonej przepustowości pożywki (procesy do 48 warstw/urządzenie), która umożliwia hodowlę plastrów serca świni przez okres wystarczająco długi, aby przetestować ostrą kardiotoksyczność13. Proponowane warunki naśladują środowisko serca, w tym częstotliwość stymulacji elektrycznej, dostępność składników odżywczych i przerywane natlenienie. Przedłużoną żywotność plastrów serca w naszej kulturze stymulowanej bio...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

TMAM posiada udziały w Tenaya Therapeutics. Pozostali autorzy nie zgłaszają żadnych konfliktów.

Podziękowania

TMAM jest wspierany przez P30GM127607 grantowe NIH i grant American Heart Association 16SDG29950012. RB jest obsługiwany przez P01HL78825 i UM1HL113530.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1,000 ml, 0,22 &mikro; m, Filtr próżniowy/systemy przechowywaniaVWR28199-812
2,3-butanodion monoksymowy (BDM)FisherAC150375000
500 mL, 0,22 &mikro; m, Filtr próżniowy/systemy przechowywania VWR28199-788
6-dołkowa pokrywa czaszy C (pokrywa płytki stymulacji elektrycznej)Ion OptixCLD6WFC
6-dołkowe płytkiFisher08-772-1B
AgaroseBioline USABIO-41025
Antybiotykowo-przeciwgrzybiczeThermo15-240-062
C-Pace EM ( stymulator elektryczny hodowli komórkowych)Ion OptixCEP100
Chlorek wapnia (CaCl2)FisherC79-500
Ceramiczne ostrza do wibracyjnego mikrotomuCampden Instruments7550-1-C
Retraktor klatki piersiowej CooleyMillennium Surgical63-G5623
D-GlucoseFisherD16-1
Jednorazowy skalpel #20Biologyproducts.com DS20X
Sitka do komórek Falcon, sterylne, CorningVWR21008-952
Surowica bydlęcapłodu ThermoA3160502
Kleszcze GraefeFisherNC9475675
Heparyna sól sodowaSigma-AldrichH3149-50KU
HEPESFisherBP310-1
Histoacryl BLUE Klej do tkanekAmazonhttps://www.amazon.com/HISTOACRYL-FLEXIBLE-1051260P-Aesculap-Adhesive/dp/B074WB5185/
Iris Nożyczki sprężynowe
IrisFisher731210
Isoflurane, USPPiramalNDC 66794-017-25
ITS Płynny suplement podłożaSigma-AldrichI3146-5ML
Ketamina HCl (500 mg / 10 mL)West-WardNDC 0143-9508
Chlorek magnezu (MgCl2)Nożyczki
Mayo SuperCutAROSurgical Instruments CorporationAROSuperCut™ 07.164.17
Medium 199, Earle's SaltsThermo11-150-059
Reduktor tlenuPraxair
Zbiorniki tlenu -Praxair
Plastikowe pipety PasteuraFisher13-711-48
Chlorek potasu (KCl)Fisher
AC193780010 Pasek rozrządudrukarki Amazonhttps://www.amazon.com/Uxcell-a14081200ux0042-PRINTER-Precision-Timing/dp/B00R1J3KDC/
Ostrza prostokątne brzytwyFisher12-640
Rekombinowany ludzki FGF podstawowyR& D Systems233-FB-025/CF
Rekombinowany ludzki VEGFR& D Systems293-VE-010/CF
Chowane skalpeleFisher22-079-716
Wodorowęglan sodu (NaHCO3)FisherAC217125000
Wibracyjny mikrotomCampden Instruments7000 SMZ-2
Ksylazyna HCl (100 mg/mL)Zaopatrzenie weterynaryjne HeartlandNADA 139-236
Fisher NC9019530 chirurgiczne Fisher M33-500 Chlorek sodu (NaCl)Fisher AC327300010

Bibliografia

  1. Onakpoya, I. J., Heneghan, C. J., Aronson, J. K. Post-marketing withdrawal of 462 medicinal products because of adverse drug reactions: a systematic review of the world literature. BMC Medicine. 14, 10(2016).
  2. Fermini, B., Fossa, A. A. The impact of drug-induced QT interval prolongation on drug discovery and development. Nature Reviews Drug Discovery. 2 (6), 439-447 (2003).
  3. Moslehi, J. J. Cardiovascular Toxic Effects of Targeted Cancer Therapies. The New England Journal of Medicine. 375 (15), 1457-1467 (2016).
  4. Robertson, C., Tran, D. D., George, S. C. Concise review: maturation phases of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cells. 31 (5), 829-837 (2013).
  5. Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).
  6. Pinto, A. R., et al. Revisiting Cardiac Cellular Composition. Circulation Research. 118 (3), 400-409 (2016).
  7. Kanisicak, O., et al. Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart. Nature Communications. 7, 12260(2016).
  8. Fu, X., et al. Specialized fibroblast differentiated states underlie scar formation in the infarcted mouse heart. Journal of Clinical Investigations. 128 (5), 2127-2143 (2018).
  9. Kretzschmar, K., et al. Profiling proliferative cells and their progeny in damaged murine hearts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (52), E12245-E12254 (2018).
  10. Perbellini, F., et al. Investigation of cardiac fibroblasts using myocardial slices. Cardiovascular Research. 114 (1), 77-89 (2018).
  11. Watson, S. A., et al. Preparation of viable adult ventricular myocardial slices from large and small mammals. Nature Protocols. 12 (12), 2623-2639 (2017).
  12. Kang, C., et al. Human Organotypic Cultured Cardiac Slices: New Platform For High Throughput Preclinical Human Trials. Scientific Reports. 6, 28798(2016).
  13. Ou, Q., et al. Physiological Biomimetic Culture System for Pig and Human Heart Slices. Circulation Research. 125 (6), 628-642 (2019).
  14. Jones, S. P., et al. The NHLBI-sponsored Consortium for preclinicAl assESsment of cARdioprotective therapies (CAESAR): a new paradigm for rigorous, accurate, and reproducible evaluation of putative infarct-sparing interventions in mice, rabbits, and pigs. Circulation Research. 116 (4), 572-586 (2015).
  15. Crick, S. J., Sheppard, M. N., Ho, S. Y., Gebstein, L., Anderson, R. H. Anatomy of the pig heart: comparisons with normal human cardiac structure. Journal of Anatomy. 193 (Pt 1), 105-119 (1998).
  16. Fischer, C., et al. Long-term functional and structural preservation of precision-cut human myocardium under continuous electromechanical stimulation in vitro. Nature Communications. 10 (1), 117(2019).
  17. Franke, J., Abs, V., Zizzadoro, C., Abraham, G. Comparative study of the effects of fetal bovine serum versus horse serum on growth and differentiation of primary equine bronchial fibroblasts. BMC Veterinary Research. 10, 119(2014).
  18. Vuorenpaa, H., et al. Novel in vitro cardiovascular constructs composed of vascular-like networks and cardiomyocytes. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 50 (4), 275-286 (2014).
  19. Qiao, Y., et al. Multiparametric slice culture platform for the investigation of human cardiac tissue physiology. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 144, 139-150 (2018).
  20. Watson, S. A., et al. Biomimetic electromechanical stimulation to maintain adult myocardial slices in vitro. Nature Communications. 10 (1), 2168(2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Krojenie tkanki sercahodowla serca winici cie wibratomemstymulacja elektrycznao tlenione pod o eostra kardiotoksycznotest ywotno ci MTTocena funkcji skurczowejpomiar transient w wapniowych
Krojenie i hodowla serc wieprzowych w warunkach fizjologicznych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.