Szczegółowo opisujemy prostą metodę tworzenia filmów poklatkowych o wysokiej rozdzielczości rojów Pseudomonas aeruginosa, które reagują na bakteriofagi (fagi) i stres antybiotykowy za pomocą płaskiego skanera dokumentów. Procedura ta jest szybką i prostą metodą monitorowania dynamiki roju i może być dostosowana do badania ruchliwości i wzrostu innych gatunków bakterii.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Obrazowanie poklatkowe rojów bakterii i zbiorowej reakcji na stres
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Rój to forma ruchliwości powierzchni obserwowana u wielu gatunków bakterii, w tym Pseudomonas aeruginosa i Escherichia coli. Tutaj gęste populacje bakterii przemieszczają się na duże odległości w charakterystycznych zbiorowiskach w kształcie wąsów w ciągu kilku godzin. Rój jest wrażliwy na kilka czynników, w tym średnią wilgotność, wilgotność i zawartość składników odżywczych. Ponadto zbiorowa reakcja na stres, którą obserwuje się u P. aeruginosa, które są stresowane antybiotykami lub bakteriofagami (fagami), odstrasza roje przed zbliżaniem się do obszaru, w którym występuje stres. Opisane tutaj metody dotyczą sposobu kontrolowania krytycznych czynników, które wpływają na rój. Przedstawiamy prostą metodę monitorowania dynamiki roju i zbiorowej reakcji na stres z wysoką rozdzielczością czasową za pomocą płaskiego skanera dokumentów oraz opisujemy, jak skompilować i przeprowadzić analizę ilościową rojów. Ta prosta i opłacalna metoda zapewnia precyzyjną i dobrze kontrolowaną ocenę ilościową roju i może być rozszerzona na inne rodzaje testów wzrostu na płytkach i gatunki bakterii.
Wprowadzenie
Rój to zbiorowa forma skoordynowanej ruchliwości bakterii, która zwiększa oporność na antybiotyki i produkcję czynników wirulencji u gospodarza1,2,3. To wielokomórkowe zachowanie zachodzi na półstałych powierzchniach, które przypominają warstwy śluzowe pokrywające błony nabłonkowe w płucach4,5. Biosurfaktanty są powszechnie wytwarzane przez populacje rojowe w celu pokonania napięcia powierzchniowego na powierzchniach, a ich produkcja jest regulowana przez złożone systemy sygnalizacji komórka-komórka, znane również jak....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie płytek agarowych roju do obrazowania poklatkowego roju P. aeruginosa
- Przygotuj 1 l 5 pożywek minimum M8 w szklanej butelce, dodając 64 g Na2HPO4•7H2O, 15 g KH2PO4 i 2,5 g NaCl w 500 ml podwójnie destylowanej wody (ddH2O). Dostosuj końcową objętość do 1 l za pomocą dodatkowego ddH2O. Autoklaw do sterylizacji i przechowywania płynnych mediów w temperaturze pokojowej.
- Przygotować 100 ml 1 MMgSO4 (siarczan magnezu) w szklanej butelce, dodając 24,6 g MgSO4•7H2O w 50 ml ddH2O. Dostosuj końcową objętość do 10....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Kroki prowadzące do hodowli P. aeruginosa, wywołania stresu komórkowego oraz obrazowania płytek agarowych do badania ruchu rojowego (swarming) przedstawiono na Ryc. 1. Pojedynczą kolonię szczepu dzikiego P. aeruginosa UCBPP-PA14 z płytki z agarem LB zaszczepiono w 2 mL bulionu LB i inkubowano przez noc w 37 °C, a następnie 5 µL zawiesiny naniesiono w centrum płytki agarowej do badania swarmingu. Obrazowanie poklatkowe tej płytki wykazuje początkowy wzrost w formie kolonii w centrum, a n.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Protokół ten koncentruje się na zminimalizowaniu zmienności w roju płytek agarowych oraz zapewnieniu prostej i taniej metody pozyskiwania poklatkowych obrazów P. aeruginosa rojącego się i reagującego na stres. Procedura ta może być rozszerzona o obrazowanie innych systemów bakteryjnych poprzez dostosowanie składu pożywki i warunków wzrostu. W przypadku P. aeruginosa, chociaż do wywołania rojumożna użyć minimalnej pożywki M9 lub FAB, przedstawion.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
J.-L.B., A.S. i N.M.H-K. napisali i poprawili rękopis. Wszyscy autorzy zaprojektowali eksperymenty. J.-L.B. przeprowadził eksperymenty i analizy. Praca ta była wspierana przez NIH award K22AI112816 i grant R21AI139968 dla AS oraz przez Uniwersytet Kalifornijski. N.M.H-K. był wspierany przez stypendia Lundbeck R220-2016-860 i R251-2017-1070. Fundatorzy nie odegrali żadnej roli w podjęciu decyzji o zgłoszeniu pracy do publikacji. Nie mamy żadnych sprzecznych interesów, które moglibyśmy zadeklarować.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Reodczynniki | |||
| Bacto agar, odwodniony | BD Difco | 214010 | Do płytki agarowej LB i płytki agarowej do roju |
| Casaminokwasy | BD Difco | 223050 | Do podłoża rojowego |
| D-Glucose | Fisher Chemical | D16500 | Dekstroza. Do podłoża rojowego |
| Fosfomycyna sól disodowa | Tokyo Chemical Industry | F0889 | Stężenie zapasów: 200 mg / mL. Rozpuszczony w ddH2O |
| Siarczan gentamycyny | Sigma-Aldrich | G1914 | Stężenie podstawowe: 3 mg/ml. Rozpuszczony w ddH2O |
| Siarczan kanamycyny | Sigma-Aldrich | 60615 | Stężenie podstawowe: 100 mg/mL. Rozpuszczony w ddH2O |
| LB-Miller | BD Difco | 244620 | Do bulionu LB i płytek agarowych LB |
| Siarczan magnezu siedmiowodny | Sigma-Aldrich | 230391 | Do podłoża rojowego |
| Fosforan potasu jednozasadowy | Sigma-Aldrich | P0662 | Do 5x pożywki M8 |
| Chlorek sodu | Sigma-Aldrich | S9888 | Do 5x M8 |
| Fosforan sodu dwuzasadowy siedmiowodny | Fisher Chemical | S373 | Do 5x M8 pożywki |
| szczepy | |||
| Pseudomonas aeruginosa | Siryaporn lab | AFS27E.118 | PA14 szczep |
| DMS3vir | O'Toole lab | DMS3vir20 | Bacteriophage |
| < strong>Kieszonkowe materiały | |||
| Papier ścierny z tlenku glinu | 3M | 150 Fine | Do czarnych pokrywek |
| tkanina | Joann | PRD7089 | tkanina |
| farba w sprayu | Krylon | 5592 Matowa czerń | Do czarnych pokrywek |
| Kolba Erlenmeyera | Kimax | 26500 | 250 ml |
| Szklane butelki do przechowywania | Pyrex | 13951L | 250 mL, 500 mL, 1,000 mL |
| 8-calowe opaski zaciskowe | Gardner Bender | E173770 | Do mocowania czarnej matowej tkaniny |
| Szalki Petriego (100 mm x 15 mm) | Fisher | FB0875712 | 100 mm x 15 mm płyty styropianowe |
| Drewniane patyczki | Fisher | 23-400-102 | Do smug i zaszczepiania bakterii |
| Sprzęt | |||
| Rynek autoklawów | Kuźnia Industries | STM-E Do | sterylizacji odczynników |
| Pipeta 25 ml | USA Scientific, Inc. | 1072-5410 | Do pipetowania 20 ml do rojowych płytek agarowych |
| Osuszacz | Frigidaire | FAD704DWD 70-litrowy | Do utrzymywania wilgotności względnej w pomieszczeniu na poziomie około 45% |
| ImageJ | NIH | v1.52a | Oprogramowanie do analizy obrazu |
| Inkubator | VWR | 89032-092 | Do wzrostu bakterii w temperaturze 37 &; C |
| Kąpiel wodna Isotemp | Fisher | 15-462-21Q | Do mediów chłodzących do 55 & deg; C |
| Okap z przepływem laminarnym | The Baker Company | SG603A | Do suszenia płyt |
| Pibuła P-20 | Gilson | F123601 | Plamienie na rojowych płytkach agarowych |
| Kontroler pipet | BrandTech | accu-jet | Do pipetowania 20 ml do rojowych płytek agarowych |
| Bęben rolkowy | Nowy Brunszwik | TC-7 | Do rozwoju bakterii przy 100 obr./min |
| Skaner | Epson | Skaner fotograficzny Epson Perfection V370 | do płyt obrazowych |
| Oprogramowanie do automatyzacji skanera | RoboTask Lite | v7.0.1.932 | Do 30-minutowego obrazowania wewnętrznego |
| Oprogramowanie do akwizycji obrazu skanera | Epson | v9.9.2.5US | Oprogramowanie do płyt obrazowych |
Bibliografia
- Butler, M. T., Wang, Q., Harshey, R. M. Cell density and mobility protect swarming bacteria against antibiotics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3776-3781 (2010).
- Lai, S., Tremblay, J., Déziel, E.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
