Artykuł metodologiczny

Metoda przesiewowa do identyfikacji leków promujących heterochromatynę przy użyciu Drosophila

5.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60917

⸱

12 marca 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, University of California San Diego

W tym artykule

Podsumowanie

Drosophila to szeroko stosowany model eksperymentalny, odpowiedni do badania przesiewowego leków o potencjalnym zastosowaniu w terapii raka. W tym miejscu opisujemy zastosowanie barwnych fenotypów oczu Drosophila jako metody badań przesiewowych związków małocząsteczkowych, które sprzyjają tworzeniu heterochromatyny.

Streszczenie

Drosophila to doskonały organizm modelowy, który może być używany do badania związków przydatnych w terapii raka. Opisana tutaj metoda jest opłacalną metodą in vivo do identyfikacji związków promujących heterochromatynę przy użyciu Drosophila. Szczep DX1 firmy Drosophila, o różnorodnym fenotypie koloru oczu, który odzwierciedla zakres tworzenia heterochromatyny, zapewniając w ten sposób narzędzie do badania przesiewowego leków promujących heterochromatynę. W tej metodzie przesiewowej zmienność oka jest określana ilościowo na podstawie powierzchni czerwonej pigmentacji zajmującej części oka i jest oceniana w skali od 1 do 5. Metoda przesiewowa jest prosta i czuła oraz pozwala na badanie związków in vivo. Badania przesiewowe leków przy użyciu tej metody zapewniają szybki i niedrogi sposób identyfikacji leków promujących heterochromatynę, które mogą mieć korzystny wpływ na terapię przeciwnowotworową. Identyfikacja związków, które sprzyjają powstawaniu heterochromatyny, może również doprowadzić do odkrycia epigenetycznych mechanizmów rozwoju nowotworów.

Wprowadzenie

Heterochromatyna to skondensowana forma DNA, która odgrywa kluczową rolę w ekspresji genów, w regulacji segregacji chromosomów podczas podziału komórki oraz w ochronie przed niestabilnością genomu1. Heterochromatyna została uznana za regulator represji genów i ochronę integralności chromosomów podczas mitozy komórki2,3. Jest to związane z di- i trimetylacją histonu H3 lizyny 9 (H3K9me) podczas zobowiązania linii4,5. Co więcej, rekrutacja białek chromodomeny białka heterochromatyny 1 (HP1) jest również uważana za związaną z heterochromatyną i epigenetyczną represją ekspresji genów6. Białka te są niezbędnymi składnikami i markerami tworzenia heterochromatyny.

Ponieważ niestabilność genomu umożliwia komórkom nabywanie zmian genetycznych, które sprzyjają kancerogenezie, heterochromatyna staje się coraz bardziej rozpoznawalna w rozwoju raka i może być celem leczenia raka7,8. Obecnie nie ma leków, które mają ugruntowaną pozycję we wspomaganiu tworzenia heterochromatyny. W tym miejscu przedstawiamy prostą i szybką, ale skuteczną metodę badań przesiewowych związków małocząsteczkowych, które sprzyjają tworzeniu heterochromatyny. Badania przesiewowe przeprowadza się poprzez leczenie Drosophila za pomocą biblioteki leków małocząsteczkowych. Metoda ta wykorzystuje różnorodny fenotyp koloru oczu w szczepie DX1Drosophila, na który wpływa poziom heterochromatyny. Muchy DX1 zawierają tandemowy układ siedmiu transgenów P[lac-w], które mają różnorodną ekspresję / depresję w zależności od heterochromatynizacji, dlatego zakres różnorodności koloru oczu odzwierciedla poziom heterochromatyny. W szczególności wzrost heterochromatyny można wykryć na podstawie rosnącego odsetka barwnego koloru oczu (białe oko). Wręcz przeciwnie, zmniejszająca się heterochromatyna byłaby wykrywana przez rosnący odsetek ekspresji transgenu P[lac-w] (czerwone oko)9,10,11,12.

Dlatego korzystamy z tego systemu transgenów Drosophila, który wytwarza różnorodny fenotyp koloru oczu, ponieważ jego ekspresja jest bezpośrednio skorelowana z ilością obecnej heterochromatyny. Po odkryciu związków, co do których podejrzewa się, że sprzyjają tworzeniu się heterochromatyny, możemy potwierdzić to podejrzenie za pomocą innych metod, takich jak western blot. Te substancje promujące heterochromatynę mogą być w przyszłości rozwijane do badań klinicznych z udziałem pacjentów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie biblioteki leków

  1. Zidentyfikuj i przygotuj bibliotekę leków do badań przesiewowych przy użyciu odpowiedniego rozpuszczalnika o pożądanym stężeniu (np. 10 mM w DMSO).
    UWAGA: Konkretnym przykładem biblioteki leków jest Oncology Set III z National Cancer Institute (NCI) Developmental Therapeutics Program (DTP). Związki w tym zestawie są dostarczane w postaci 20 μl przy 10 mM w 100% DMSO w dwóch 96-dołkowych płytkach PP z dnem i przechowywane w temperaturze -20 °C. Mapy NCI Plate oraz podstawowe dane chemiczne każdego leku można znaleźć na następujących stronach internetowych:
    numer tablicy NCI 4740
    numer tablicy NCI 4741

2. Badanie przesiewowe pod kątem leków promujących heterochromatynę przy użyciu Drosophila

  1. Strategia hodowlana Drosophila (Rysunek 1A)
    1. Dzień 1: Krzyż trzeci w1118/Y; Samce much DX1/CyO i trzy lub więcej dziewiczych w 1118 samicach much w fiolce z pokarmem o wymiarach 25 mm x 95 mm z 9 ml standardowej pożywki Drosophila (przepis Bloomington). Skonfigurować trzy fiolki replikujące dla każdego leku i jedną kontrolną dla ekranu.
      UWAGA: Muchy DX1 zostały dzięki uprzejmości Jamesa Birchlera (University of Missouri)9,13.
    2. Dzień 2 i Dzień 3: Pozwól muszkom złożyć jaja przez 2 dni w temperaturze pokojowej (22 °C).
    3. Dzień 4: Użyj krótkiego impulsu gazu CO2 do znieczulenia much rodzicielskich i wyrzuć muchy rodzicielskie do "kostnicy much" (butelka zawierająca 70% alkoholu).
  2. Podawaj leki Drosophila do badań przesiewowych.
    1. Rozcieńczyć każdy związek leczniczy z oryginalnego materiału wyjściowego (20 μL przy 10 mM w 100% DMSO w 96-dołkowych płytkach PP U-bottom) do końcowego stężenia 10 μM z 33% DMSO w wodzie. Użyj 33% DMSO w wodzie bez żadnego leku jako kontrola.
      UWAGA: Niektóre leki są słabo rozpuszczalne w wodzie i zostały rozpuszczone w DMSO. 100% DMSO jest toksyczne dla much. 33% jest tolerowane.
    2. Dzień 4: Odpipetować 60 μl 10 μM roztworu leku lub grupy kontrolnej na wierzch pokarmu dla much. W tym momencie upewnij się, że muchy rodzicielskie zostały usunięte, a na pokarmie znajdują się jaja much i pełzające larwy w pierwszym stadium
      3. rozwojowym.
    3. Dzień 6: Powtórzyć pipetowanie 60 μl tego samego 10 μM roztworu leku do fiolki z żywnością.
      UWAGA: Ponieważ do pokarmu dla much dodano narkotyki, pokarm na górnej powierzchni zawiera stężenie prawie 10 μM, a pokarm na dole może nie być w pełni penetrowany. Wszystkie muchy składają jaja na wierzchu pokarmu i zjadają pokarm na górnej powierzchni.
  3. Obserwuj i oceniaj zmiany koloru oczu.
    1. Dwa dni po pojawieniu się much F1 (około 14 dnia) zbadaj muchy. Użyj krótkiej serii CO2 do znieczulenia much F1 i usuń muchy z ich fiolki na porowatą podkładkę preparacyjną z CO2 sączącym się spod bibuły filtracyjnej.
    2. Sprawdź muchy na tej podkładce pod mikroskopem preparacyjnym. Zbadaj całą muchę i zidentyfikuj wszystkie w1118/Y; Heterozygotyczne samce DX1/+ ze względu na brak fenotypu kręconych skrzydeł z dominacją CyO.
    3. Oceń kolor oczu każdego z w1118/Y; Heterozygotyczny samiec DX1/+ leci w skali od 1 do 5 (Ryc. 1B). Procentowy udział białego koloru oczu oceniono w następujący sposób:
      1. <5% całkowitej powierzchni oczu rozproszonych
      2. 6% - 25% czerwonych plam całkowita powierzchnia oczu
      3. 26% - 50% czerwonych plam całkowita powierzchnia oczu
      4. 51% - 75% czerwonych plam całkowita powierzchnia oczu < BR / > 5. >75% czerwonych plam całkowita powierzchnia oczu
      UWAGA: Alternatywnie, homogenizuj głowy muchy w 100% metanolu i użyj spektrometru do pomiaru pigmentacji oczu przy OD 450 nm. Wybierz tylko samce, ponieważ PEV jest bardziej wymawiany u samców DX1. Zdobądź więcej niż 10 samców w każdej fiolce.
    4. Obliczyć średni indeks barwy wszystkich samców z każdej naciętej fiolki. Wykonaj trzy próby dla każdego związku (Rysunek 1C).
      UWAGA: Ponieważ kolor oczu zmienia się wraz z wiekiem, jest to krok, w którym zależy od czasu. Kolor oczu należy obliczyć w tym samym wieku – 2 dni. Zwykle w każdej fiolce należy naciąć >10 much.
    5. Aby potwierdzić, że związki rzeczywiście sprzyjają tworzeniu heterochromatyny, użyj innej techniki, takiej jak western blotting, aby zweryfikować (Rysunek 1G).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Protokół ten został z powodzeniem zastosowany do przesiewania związków promujących tworzenie się heterochromatyny w Muszka owocówka, który stanowi wydajny i niskokosztowy system in vivo do opracowywania leków (Rysunek 1). Przeskanowaliśmy bibliotekę leków małocząsteczkowych Oncology Set III, składającą się z 97 zatwierdzonych przez FDA leków onkologicznych, wykorzystując DX1 szczep Drosophila melanogaster (Rycina 1B). ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Heterochromatyna to skondensowana forma DNA, która odgrywa kluczową rolę w regulacji ekspresji genów. Staje się coraz bardziej rozpoznawalny w leczeniu nowotworów i może służyć jako potencjalny cel terapii przeciwnowotworowej 15,16,17,18. Związki małocząsteczkowe są powszechnie stosowane w opracowywaniu leków ze względu na zalety w produkcji, konserwacji i metabolizmie w organizmach ludzkich. A...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Dziękujemy J. Birchlerowi, E. Bachowi i Bloomington Drosophila Stock Center za różne szczepy Drosophila; National Cancer Institute (NCI) Developmental Therapeutics Program dla biblioteki leków małocząsteczkowych Oncology Set; Studenci studiów licencjackich UCSD, w tym Amy Chang, Taesik You, Jessica Singh-Banga, Rachel Meza i Alex Chavez. Badania opisane w tej publikacji były wspierane przez grant badawczy American Thoracic Society dla J.L. oraz finansowanie z NIH: R01GM131044 dla W.X.L.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Muchy Drosophila DX1 szczepDX1 zostały uprzejmie dostarczone przez Jamesa Birchlera (University of Missouri)
Drosophila media spożywczeUCSD kuchnia muchowa
MetotreksatNCI biblioteka
Dimetylosulfotlenek (DMSO)SigmaD2650
Etylowy alkoholSigmaE7023-500ML
leków

Bibliografia

  1. Morgan, M. A., Shilatifard, A. Chromatin signatures of cancer. Genes Development. 29 (3), 238-249 (2015).
  2. Saksouk, N., Simboeck, E., Dejardin, J. Constitutive heterochromatin formation and transcription in mammals. Epigenetics Chromatin. 8, 3(2015).
  3. Allshire, R. C., Madhani, H. D. Ten principles of heterochromatin formation and function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (4), 229-244 (2018).
  4. Jenuwein, T., Allis, C. D. Translating the histone code. Science. 293 (5532), 1074-1080 (2001).
  5. Grewal, S. I., Moazed, D. Heterochromatin and epigenetic control of gene expression. Science. 301 (5634), 798-802 (2003).
  6. Heard, E. Delving into the diversity of facultative heterochromatin: the epigenetics of the inactive X chromosome. Current Opinion in Genetics & Development. 15 (5), 482-489 (2005).
  7. Ci, X., et al. Heterochromatin Protein 1alpha Mediates Development and Aggressiveness of Neuroendocrine Prostate Cancer. Cancer Research. 78 (10), 2691-2704 (2018).
  8. Zhu, Q., et al. Heterochromatin-Encoded Satellite RNAs Induce Breast Cancer. Molecular Cell. 70 (5), 842-853 (2018).
  9. Dorer, D. R., Henikoff, S. Expansions of transgene repeats cause heterochromatin formation and gene silencing in Drosophila. Cell. 77 (7), 993-1002 (1994).
  10. Fanti, L., Dorer, D. R., Berloco, M., Henikoff, S., Pimpinelli, S. Heterochromatin protein 1 binds transgene arrays. Chromosoma. 107 (5), 286-292 (1998).
  11. Shi, S., et al. JAK signaling globally counteracts heterochromatic gene silencing. Nature Genetics. 38 (9), 1071-1076 (2006).
  12. Shi, S., et al. Drosophila STAT is required for directly maintaining HP1 localization and heterochromatin stability. Nature Cell Biology. 10 (4), 489-496 (2008).
  13. Ronsseray, S., Boivin, A., Anxolabehere, D. P-Element repression in Drosophila melanogaster by variegating clusters of P-lacZ-white transgenes. Genetics. 159 (4), 1631-1642 (2001).
  14. Loyola, A. C., et al. Identification of methotrexate as a heterochromatin-promoting drug. Scientific Reports. 9 (1), 11673(2019).
  15. Dialynas, G. K., Vitalini, M. W., Wallrath, L. L. Linking Heterochromatin Protein 1 (HP1) to cancer progression. Mutation Research. 647 (1-2), 13-20 (2008).
  16. Janssen, A., Colmenares, S. U., Karpen, G. H. Heterochromatin: Guardian of the Genome. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 34, 265-288 (2018).
  17. Zhu, Q., et al. BRCA1 tumour suppression occurs via heterochromatin-mediated silencing. Nature. 477 (7363), 179-184 (2011).
  18. Hu, X., et al. Unphosphorylated STAT5A stabilizes heterochromatin and suppresses tumor growth. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (25), 10213-10218 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Przesiewy Drosophilaocena mozaikowo ci oczuszczep DX1identyfikacja metotreksatuwalidacja metod Western blotformowanie heterochromatynyterapeutyki przeciwnowotworoweprzesiewy in vivotestowanie bibliotek lek w

Powiązane artykuły