Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Translacja oczyszczania powinowactwa rybosomów (TRAP) w celu zbadania rozwoju korzeni rzodkiewnika pospolitego (Arabidopsis thaliana) w skali specyficznej dla typu komórki

12K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60919

⸱

14 maja 2020

 ,  , 
1Department of Plant and Microbial Biology, University of Zurich, 2Biophore - UNIL, 3Laboratory of Cell and Molecular Biology, Institute of Biology, University of Neuchâtel

W tym artykule

Podsumowanie

Tłumaczenie oczyszczania powinowactwa rybosomów (TRAP) oferuje możliwość analizowania programów rozwojowych przy minimalnym przetwarzaniu narządów i tkanek. Protokół zapewnia wysokiej jakości RNA z komórek ukierunkowanych na podjednostkę rybosomalną znakowaną zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP). Narzędzia do dalszej analizy, takie jak qRT-PCR lub sekwencja RNA, ujawniają profile ekspresji specyficzne dla typu tkanki i komórki.

Streszczenie

W tym artykule udzielamy praktycznych instrukcji, jak uzyskać dane translatomowe z różnych typów komórek korzenia Arabidopsis thaliana za pomocą metody tłumaczenia oczyszczania powinowactwa rybosomów (TRAP) i konsekwentnego optymalizowania biblioteki o niskim nakładzie pracy.

Jako materiał wyjściowy wykorzystujemy linie roślinne, które wyrażają białko rybosomalne RPL18 oznaczone GFP w sposób specyficzny dla typu komórki, stosując odpowiednie promotory. Przed immunooczyszczaniem i ekstrakcją RNA tkanka jest zamrażana błyskawicznie, co pozwala zachować integralność tkanki i jednocześnie umożliwia wykonywanie badań szeregów czasowych z wysoką rozdzielczością czasową. Warto zauważyć, że struktury ściany komórkowej pozostają nienaruszone, co jest główną wadą alternatywnych procedur, takich jak metody sortowania komórek aktywowane fluorescencją, które opierają się na protoplastowaniu tkanek w celu wyizolowania odrębnych populacji komórek. Dodatkowo nie jest konieczne utrwalanie tkanek, jak w technikach opartych na mikrodysekcji laserowej, co pozwala na uzyskanie wysokiej jakości RNA.

Jednak pobieranie próbek z subpopulacji komórek i izolowanie tylko RNA związanego z polisomami poważnie ogranicza wydajność RNA. W związku z tym konieczne jest zastosowanie wystarczająco czułych metod przygotowania bibliotek w celu pomyślnego pozyskania danych za pomocą sekwencji RNA.

TRAP oferuje idealne narzędzie do badań nad roślinami, ponieważ wiele procesów rozwojowych obejmuje bariery komórkowe i mechaniczne szlaki sygnałowe. Zastosowanie promotorów do celowania w określone populacje komórek wypełnia lukę między poziomem narządu a pojedynczą komórką, które z kolei cierpią z powodu niskiej rozdzielczości lub bardzo wysokich kosztów. W tym przypadku stosujemy TRAP do badania komunikacji komórka-komórka w bocznym tworzeniu korzeni.

Wprowadzenie

Dzięki coraz szerszemu zastosowaniu technik sekwencjonowania nowej generacji można zwiększyć rozdzielczość przestrzenną w biologii rozwoju. Współczesne badania dążą do analizy tkanek z dokładnością do wyspecjalizowanych typów komórek, a nawet na poziomie pojedynczych komórek1,2,3,4. W tym celu w ciągu ostatnich pięćdziesięciu lat opracowano wiele różnych metod (patrz Rysunek 1A)5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15.

Wiele narzędzi stosowanych w naukach o roślinach stanowi adaptację technik opracowanych pierwotnie w badaniach nad zwierzętami. Nie dotyczy to jednak metody, którą szczegółowo przedstawiamy w niniejszym opracowaniu. W 2005 roku, opierając się na szerokiej wiedzy z zakresu translacji białek, zespół z laboratorium Bailey-Serres podjął próbę modyfikacji białek rybosomalnych w celu ich późniejszego oczyszczania powinowactwem16. Pozwoliło to uniknąć czasochłonnego i pracochłonnego profilowania polisomów, które opiera się na ultrodocentryfugacji w gradiencie sacharozy i jest stosowane do oceny rybosomów w procesie translacji od lat 60. XX wieku17,18. Metoda ta została odtąd nazwana oczyszczaniem rybosomów translacyjnych metodą powinowactwa (TRAP)16. Po pomyślnym przeprowadzeniu badań translatomu u roślin, Heiman i wsp. zaadaptowali metodę TRAP dla zwierząt19, a inni rozszerzyli jej zastosowanie na drożdże20, Drosophila21, Xenopus22 oraz zebrafish23,24.

Chociaż modyfikacja genetyczna systemu modelowego jest warunkiem wstępnym dla metody TRAP, co ogranicza jej zastosowanie do gatunków podatnych na transformację genetyczną, można wykorzystać to ograniczenie do celowania w podgrupy komórek o szczególnym znaczeniu, które w inny sposób byłyby niezwykle trudne do wyizolowania z nienaruszonej tkanki lub organu25 (np. silnie rozgałęzione komórki dendrytyczne w mózgu myszy lub strzępki grzybów w zainfekowanej tkance roślinnej). W roślinach wszystkie komórki są utrzymywane na miejscu przez ściany komórkowe, które stanowią podstawę szkieletu hydrostatycznego26. Aby uwolnić komórkę roślinną z tej macierzy, naukowcy stosują albo fizyczne wycięcie komórki z otaczającej ją tkanki za pomocą mikrosekcji laserowej (LCM)27, albo enzymatyczne trawienie ścian komórkowych28. W przypadku tych drugich, tzw. protoplastów, interesująca populacja jest znakowana fluorescencyjnie i może być oddzielana za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS)7. LCM zazwyczaj wymaga utrwalenia próbki i zatopienia jej w wosku, co w konsekwencji pogarsza jakość RNA29. Metody oparte na FACS pozwalają uzyskać wysokiej jakości RNA, jednak sam proces protoplastowania wprowadza zmiany w ekspresji genów30, a tkanki z modyfikowanymi i grubymi wtórnymi ścianami komórkowymi są znane z trudności w obróbce. Ponadto przyjmuje się, że wiele procesów rozwojowych u roślin opiera się na sygnałach przenoszonych mechanicznie, dlatego nienaruszalność ściany komórkowej ma kluczowe znaczenie31. Dwie metody, które stosują skrót pozwalający uniknąć izolacji całych komórek poprzez operowanie na poziomie jąder, to sortowanie jąder aktywowane fluorescencją (FANS) oraz izolacja jąder znakowanych w specyficznych typach komórek (INTACT). Podobnie jak w TRAP, wykorzystują one specyficzne dla typu komórek promotory do znakowania jąder, które następnie są wzbogacane odpowiednio poprzez sortowanie lub metodę pull-down8,15. Głównym wyzwaniem dla wszystkich tych podejść jest uzyskanie wystarczającej ilości materiału RNA z podgrup komórek w tkance. Ponieważ TRAP wychwytuje tylko część komórkowego RNA, gromadzenie próbek stanowi znaczne wąskie gardło. Dlatego potrzebne są szczególnie czułe protokoły przygotowania bibliotek, aby uzyskać wysokiej jakości dane z niskich ilości materiału wyjściowego.

Od momentu swojego wprowadzenia metoda TRAP była stosowana albo w połączeniu z mikromacierzami DNA, albo – w obliczu znacznego spadku kosztów sekwencjonowania w ostatnich latach – z metodą RNA-seq10,32,33Wiele pytań badawczych zostało już wyjaśnionych, co zostało omówione w przeglądzie Sablok i wsp.34Jesteśmy przekonani, że w nadchodzących latach pojawi się więcej doniesień, ponieważ technika ta jest bardzo wszechstronna w kontekście łączenia różnych promotorów w celu celowania w konkretne typy komórek. W przyszłości będzie to możliwe do zrealizowania również w sposób indukowalny i może zostać połączone z badaniem reakcji rośliny na wiele biotycznych i abiotycznych czynników stresowych. Dodatkowo, w przypadkach, gdy nie dysponowano stabilnymi liniami transgenicznymi, systemy ekspresyjne w korzeniach włóknistych (hairy root) zostały pomyślnie wykorzystane do przeprowadzenia TRAP u pomidora oraz lucerny (medicago).35,36.

Schemat metod sekwencjonowania RNA; przedstawia przebieg analizy transkryptomu komórkowego, obejmujący izolację RNA, FACS oraz sekwencjonowanie TRAP wraz z wizualnymi fazami gromadzenia danych.
Rysunek 1: Oczyszczanie rybosomów za pomocą powinowactwa translacyjnego (TRAP) uzupełnia portfolio analiz „omicznych”. A. Zwiększona precyzja analityczna, aż do rozdzielczości pojedynczej komórki, a nawet podkomórkowej, może być osiągnięta za pomocą wielu metod lub ich kombinacji. Schemat przedstawia przegląd obecnie dostępnych narzędzi w dziedzinie roślin i zwierząt. Pobieranie tkanek z rozdzielczością komórkową można osiągnąć za pomocą protokołów takich jak LCM lub FACS, które następnie są łączone ze standardowym profilowaniem transkryptomu lub polisomów/analizą translatomu. TRAP i INTACT integrują zarówno wychwytywanie tkanek, jak i izolację RNA, ponieważ opierają się na znakowaniu epitopowym. Jednak INTACT pobiera próbki tylko z jąder komórkowych i stanowi zatem szczególny przypadek analizy transkryptomu. Mała ikona królika oznacza nowo opracowane metody w dziedzinie zwierząt: podczas gdy SLAM-ITseq i Flura-seq opierają się na metabolicznym celowaniu w nowo powstałe RNA za pomocą zmodyfikowanych zasad uracylu w komórkach ekspresujących odpowiedni enzym, Slide-seq wykorzystuje powlekane szkiełka szklane z kodami kreskowymi DNA, które dostarczają informacji pozycyjnych w zakresie komórkowym. W metodzie APEX-seq stosowane jest podejście oparte na znakowaniu bliskościowym w celu pobrania RNA ze specyficznych przedziałów podkomórkowych. Warto zauważyć, że zwiększona rozdzielczość często wymaga wytworzenia materiału transgenicznego (gwiazdki), dlatego metody te są przede wszystkim stosowane w przypadku gatunków modelowych. TRAP jest szczególnie odpowiedni do badań w naukach o roślinach obejmujących ścianę komórkową (CW) lub sygnały mechaniczne, a także w przypadku rodzajów komórek, które trudno jest uwolnić z macierzy CW. B. Szczegółowe kroki laboratoryjne procedury TRAP: siewki ekspresujące białko rybosomalne znakowane GFP w określonych typach komórek (np. endodermie korzenia) są hodowane na szalkach Petriego przez siedem dni, a materiał korzeniowy jest zbierany poprzez gwałtowne zamrażanie. Próbkę kontrolną całkowitego RNA pobiera się z homogenizowanego ekstraktu surowego przed odwirowaniem osadu za pomocą wirowania. Magnetyczne kuleczki anty-GFP są dodawane do oczyszczonego ekstraktu w celu przeprowadzenia immunoprecypitacji. Po inkubacji i trzech etapach płukania, RNA związane z polisomami (RNA TRAP/polisomalne) jest pozyskiwane bezpośrednio poprzez ekstrakcję fenolowo-chloroformową. LCM: laserowa mikrodysekcja, FACS/FANS: fluorescencyjnie aktywowane sortowanie komórek/jąder, APEX-seq: metoda oparta na zmodyfikowanej askorbinianowej peroksydazie, INTACT: izolacja jąder znakowanych w specyficznych typach komórek, SLAM-ITseq: alkilacja powiązana z tiolem (SH) dla metabolicznego sekwencjonowania RNA w tkance, Flura-seq: sekwencjonowanie RNA znakowanego fluorouracylem (Stworzono za pomocą Biorender.com) Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Celem niniejszego artykułu jest przedstawienie szczegółowego opisu metody TRAP, wyróżnienie krytycznych etapów oraz udzielenie wskazówek dotyczących możliwej metody przygotowania biblioteki.

Ogólny eksperyment TRAP składa się zasadniczo z następujących etapów (patrz również Rysunek 1B): (1) przygotowanie materiału roślinnego, w tym klonowanie konstruktu do znakowania rybosomów, wytworzenie i selekcja linii transgenicznych, uprawa i namnażanie nasion, sterylizacja i wysiew, aplikacja stresu/obróbka (opcjonalnie) oraz pobieranie tkanek; (2) immunopuryfikacja, obejmująca homogenizację tkanek i klarowanie ekstraktu surowego, przemywanie kulek i immunopuryfikację oraz etapy płukania; (3) ekstrakcja RNA i ocena jego jakości; oraz (4) przygotowanie biblioteki.

Korzeń Arabidopsis służy jako system modelowy do badania rozwoju roślin od czasu wprowadzenia tej rośliny jako modelu37,38. W niniejszej pracy zastosowanie metody TRAP zaprezentowano w kontekście rozwoju korzeni bocznych roślin. U roślin budowa całego systemu korzeniowego opiera się na realizacji tego programu i jest zatem niezwykle istotna dla przetrwania organizmu39. W przypadku Arabidopsis korzenie boczne wywodzą się z tkanki perycyklu, która znajduje się obok naczyń ksylemu i dlatego nazywana jest perycyklem bieguna ksylemowego (XPP; patrz Rysunek 2C)40. Niektóre komórki XPP, zlokalizowane głęboko wewnątrz korzenia, nabywają tożsamości komórek inicjujących i pod wpływem lokalnego impulsu hormonalnego zaczynają proliferować poprzez pęcznienie i podziały antyklinalne41. Jednak ze względu na obecność sztywnej macierzy ścian komórkowych proces ten wywiera naprężenia mechaniczne na sąsiednie tkanki. W szczególności dotyczy to nadkładającej się endodermy, gdyż znajduje się ona na drodze osi wzrostu korzenia bocznego42,43,44. W rzeczywistości nowo powstający prymordium musi wzrosnąć przez nadkładającą się komórkę endodermy (Rysunek 2C2), podczas gdy komórki kory i epidermy są jedynie odpychane na bok, aby prymordium mogło w końcu wyłonić się na zewnątrz45,46. Niedawne prace w naszym laboratorium wykazały, że endoderma aktywnie przyczynia się do umożliwienia proliferacji w perycyklu. Celowe zablokowanie endodermalnego sygnałowania hormonalnego jest wystarczające, aby zahamować nawet pierwszy podział w komórkach XPP47. Zatem komunikacja między perycyklem a endodermą stanowi bardzo wczesny punkt kontrolny rozwoju korzeni bocznych u Arabidopsis. Nie wiadomo jednak, w jaki sposób odbywa się ta interakcja. Aby rozwiązać tę zagadkę, wybraliśmy podejście TRAP-seq, aby celować w komórki XPP i endodermy. W celu wzbogacenia populacji komórek uczestniczących w programie tworzenia korzeni bocznych, zasymulowaliśmy impuls hormonalny poprzez egzogeniczną aplikację analogu auksyny (kwas 1-naftaloctowy, NAA)48, co jednocześnie pozwoliło na czasowe rozdzielenie początkowej fazy formowania się korzeni bocznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Klonowanie transgenu, produkcja i selekcja linii transgenicznych

  1. Sklonuj wybranego promotora w odpowiednim wektorze wejściowym. Zastosować metodę klonowania opartą na rekombinacji (tabela materiałów) i ponownie połączyć promotory w pDONRP4-P1r. Sklonuj RPL18 (ze znacznikiem powinowactwa lub wybranym białkiem fluorescencyjnym) za pomocą klonowania opartego na rekombinacji w pDONRP1-P249.
  2. Połącz wektor wejściowy zawierający RPL18 z wektorem wejściowym zawierającym promotor w reakcji rekombinacji dwóch fragmentów do odpowiedniego wektora docelowego z kasetą selekcyjną FAST-red50, aby ułatwić bezpośrednią selekcję nasion transgenicznych.
  3. Zweryfikuj zrekombinowany wektor poprzez sekwencjonowanie i przekształć go w odpowiednie, kompetentne agrobakterie. Zanurz rośliny Arabidopsis, a po 3-4 tygodniach zbierz i wybierz nasiona T151.
  4. Użyj mikroskopii, aby zidentyfikować dobrze wyrażające się linie i zweryfikować wzorce ekspresji zgodnie ze zgłoszoną aktywnością promotora w wielu niezależnych liniach. Wybierz linie pokazujące reprezentatywny wzorzec ekspresji z pojedynczą insercją T-DNA. Może to pomóc zminimalizować wyciszenie i będzie korzystne dla krzyżówek genetycznych.
  5. Wybierz potomstwo T3, które jest homozygotyczne pod względem genu markerowego.

2. Rozmnażanie i sterylizacja

  1. Specyficzny dla typu komórki TRAP izoluje RNA z ograniczonej liczby komórek docelowych na korzeń. Aby wygenerować potrzebny materiał wyjściowy, propaguj linie homozygotyczne. W tym celu należy stosować standardowe warunki wzrostu, ze szczególnym naciskiem na kontrolę wzrostu grzybów.
    UWAGA: Jeśli nie można uzyskać pojedynczych linii insercyjnych, należy hodować partie w dużych populacjach przez kilka pokoleń, aby uniknąć międzypokoleniowego wyciszania wywołanego przez T-DNA.
  2. Sterylizuj duże ilości nasion Arabidopsis za pomocą jednej rundy chloru gazowego i jednej rundy 70% EtOH.
    1. Rozłóż nasiona równomiernie na kwadratowych szalkach Petriego o wymiarach 12 cm x 12 cm (mniej niż 0,3 ml nasion na talerz) i ułóż je w eksykatorze lub innym odpowiednim pojemniku. Unikaj tworzenia się grudek lub hałd, ponieważ nasiona muszą być dostępne dla gazu. Przeprowadzić sterylizację gazową przez noc za pomocą wybielacza i objętości HCl, zgodnie z raportem52: 100 ml wybielacza (13%) z 6 ml stężonego HCl w eksykatorze o pojemności 60 l. Odżegnuj przez co najmniej 1 godzinę przed zebraniem nasion w sterylnym pojemniku.
      UWAGA: 37% HCl jest silnie i wymaga ostrożnego obchodzenia się. Chlor gazowy jest toksyczny, użyj okapu wyciągowego.
    2. Weź 0,1 ml suchych, sterylizowanych gazem nasion na talerz i wymieszaj je z roztworem sterylizacyjnym (70% EtOH, 0,01% Tween) w temperaturze pokojowej. Inkubować przez 20 minut, zdekantować EtOH i umyć nasiona 3-4 razy sterylnymH2O.
    3. Przenieś namoczone nasiona do probówek o pojemności 50 ml i rozcieńcz sterylnym 0,1% agarem, aby uzyskać 1 ml wchłoniętej gnojowicy nasiennej na płytkę (0,1 ml nasion/1 ml gnojowicy).
      UWAGA: Ze względu na zdarzenia integracji transgenów, linie roślinne mogą być podatne na różne techniki sterylizacji; szczególnie czas inkubacji EtOH okazał się krytyczny. W naszych rękach konieczne były podwójne etapy sterylizacji, aby uniknąć zanieczyszczenia grzybami podczas eksperymentów. Jest to szczególnie ważne podczas wykonywania szeregów czasowych, ponieważ zanieczyszczenie pojedynczego punktu czasowego utrudnia cały eksperyment. Może się zdarzyć, że podwójna sterylizacja nie zawsze jest potrzebna, w zależności od lokalnych warunków uprawy.

3. Poszycie

  1. Przygotuj te kroki z wyprzedzeniem. Zalać 1/2 MS płytek (pH 5,8) 1% agarem w ilościach potrzebnych do eksperymentu (20-30 na próbkę/punkt czasowy). Odetnij końcówki do pipet o pojemności 1 ml, aby powiększyć średnicę końcówki do ok. 3-4 mm za pomocą żyletki. Autoklaw końcówek. Utwórz uchwyt szablonu do posiewu trzech rzędów nasion na talerzu z kwadratowymi pokrywkami szalki Petriego. Przygotuj okap z przepływem laminarnym, aby zapewnić sterylne środowisko pracy i oznacz płytki do obróbki.
    UWAGA: Jeśli wiele płyt jest przetwarzanych w tym samym czasie, kolorowe etykiety mogą przyspieszyć etykietowanie.
  2. Umieść puste płytki agarowe w uchwycie szablonu i równomiernie rozprowadź 1 ml wchłoniętych nasion w trzech rzędach. Ułóż przetworzone płytki w stosach w przepływie laminarnym, aż nasiona wyschną (tj. przykleją się do powierzchni agaru). Nie zostawiaj talerzy dłużej, ponieważ agar również wyschnie.
  3. Gdy nasiona wystarczająco wyschną, zamknij pokrywki i uszczelnij każdą płytkę taśmą z mikroporami. Rozwarstwiać nasiona przez dwa dni w temperaturze 4 °C w ciemności, a następnie umieścić je w komorze wzrostowej.

4. Leczenie tkanek (opcjonalnie)

UWAGA: W tym protokole opisujemy egzogenne leczenie korzeni Arabidopsis syntetycznym wariantem auksyny NAA. W zależności od pytania eksperymentalnego, ta część musi zostać dostosowana lub może być całkowicie pominięta.

  1. Przygotuj paski bibuły o wysokości 1,5 - 2 cm i długości 10 cm. Wydłużony czas inkubacji wymaga, aby tkanka została poddana autoklawizowaniu przed użyciem.
  2. Usuń taśmę z mikroporami ze wszystkich płytek, które muszą zostać poddane leczeniu hormonalnemu. Rozcieńczyć 1 ml 10 mM NAA (rozpuszczonego w DMSO) w 1 l płynnego, autoklawowanego roztworu 1/2 MS (pH 5,8) i zanurzyć bibułkę w roztworze (10 μM NAA).
  3. Użyj pęsety, aby nałożyć pasek bibuły na każdy rząd korzeni. Delikatnie palcami usuń pęcherzyki powietrza. Opróżnij nadmiar płynu z talerza, zamknij pokrywkę i oznacz talerz czasem. Aby wydłużyć czas inkubacji, umieść płytki z powrotem w komorze wzrostowej.

5. Żniwa

  1. Pobrać płytki dla każdej kontrpróby biologicznej/punktu czasowego/zabiegu. Zebrać ciekły azot do czystego naczynia Dewara i oznaczyć probówki (15 lub 50 ml) dla różnych próbek tkanek. Przygotuj uchwyt na styropian.
    UWAGA: Zapoznaj się z procedurami obchodzenia się z ciekłym azotem (napowietrzanie, odmrożenia, potencjalnie eksplodujące rurki).
  2. Otwórz płytkę i usuń bibułę kleszkami, uważając, aby nie oderwać korzeni od powierzchni agaru. Za pomocą ostrza chirurgicznego przetnij raz na rząd wzdłuż połączenia pęd-korzeń w jednym, zdecydowanym pociągnięciu. Czyść ostrza między próbkami i często wymieniaj, aby zagwarantować ostrość.
  3. Za pomocą pęsety przesuń wzdłuż korzeni każdego rzędu, aby zebrać je w trzech pakietach. Chwyć korzenie i opróżnij je do probówki o pojemności 50 ml wypełnionej ciekłym azotem, aby zamrozić błyskawicznie.
    UWAGA: Nie próbuj składać korzeni w gęste struktury (takie jak kulki), ponieważ są one trudne do zmielenia w następnym kroku.
  4. Postępuj ze wszystkimi płytkami stanowiącymi jedną próbkę (w kolejności czasów inkubacji) i wylej nadmiar ciekłego azotu. Użyj pokrywki tuby, aby zapobiec rozlaniu się korzeni. Następnie zamknij pokrywę i zbierz wszystkie probówki z naczynia Dewara. Przechowywać tkankę korzeniową w temperaturze -80 °C.

6. Oczyszczanie immunologiczne

UWAGA: Ten krok ma na celu uzyskanie wysokiej jakości TRAP/polisomowego RNA. Dlatego należy ściśle przestrzegać zaleceń dotyczących dobrych praktyk w zakresie obchodzenia się z RNA. Wykonaj wszystkie czynności opisane w tej sekcji w sterylnym stole i wyczyść cały sprzęt i sprzęt laboratoryjny roztworem do usuwania RNaz (tabela materiałów). Załóż rękawice i zmień je natychmiast po zanieczyszczeniu próbką, lodem lub innymi źródłami, które nie zostały oczyszczone. Ponieważ jest to bardzo ważny aspekt, zawarto sekcję dotyczącą ponownego wykorzystania sprzętu wraz z poradami dotyczącymi utylizacji odpadów.

  1. Przygotowanie buforu
    1. Przygotować roztwory podstawowe zgodnie z tabelą 1 i sterylizować w autoklawie (A) lub filtrze (₳). O ile nie określono inaczej, rozpuszczalnikiem jest woda wolna od RNaz.
    2. Rozpuścić i podsycić ditionotreitol (DTT), fluorek fenylometylosulfonylu (PMSF), cykloheksymid (CHX) i chloramfenikol (CAM) w odpowiednich rozpuszczalnikach, jak wskazano w tabeli 1, i przechowywać w temperaturze -20 °C. Wszystkie inne zapasy mogą pozostać w temperaturze pokojowej.
    3. Wstępnie wymieszaj bulony - ze składnikami 1-4 dla buforu do płukania (WB) i 1-6 dla buforu do ekstrakcji polisomów (PEB) - aby uniknąć czasochłonnego mieszania buforu przed każdą ekstrakcją. Dlatego wodę i zamrożone składniki (7-10) należy dodawać dopiero w dniu ekstrakcji. Przechowywać wstępnie wymieszane wywary i wodę wolną od RNaz w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Stężenie NTC wynosi 1/5 stężenia zgłoszonego przez Zanetti et al. 2005, ponieważ interakcja nanolitości z GFP jest wrażliwa na wysokie stężenia DTT.
powiedział: powiedział: cyfrowa
składnikiKoncentracja zapasówDodać objętość w ml na 50 ml WB*Dodaj objętość w ml na 50 ml PEB*
1Tris, pH 9ZA2 mln55
cyfra arabskaKclZA2 mln55
3EGTA (EGTA)ZA0,5 mlnRozdział 2.5Rozdział 2.5
4MgCl2ZA1 mlnPytanie 1,75Pytanie 1,75
5PteZA20% (v/v)0Rozdział 2.5
6Mieszanka detergentówZA0Rozdział 2.5
Animacja 2020% (v/v)
Tryton-X 10020% (v/v)
Brij-3520% (w/v)
Igepal20% (v/v)
7Naziemna telewizja₳0,5 mln0,10,1
8PMSF (Kanał PMSF)₳0,1 M (izopropanol)0,50,5
9Cykloheksymid₳25 mg/ml (EtOH)0,10,1
10chloramfenikol₳50 mg/ml (EtOH)0,050,05

Tabela 1: Porady dotyczące składu bufora i mieszania. Składniki o podanych stężeniach zapasowych zmieszane w podanych ilościach dają 50 ml WB lub PEB. Tris: tris-(hydroksymetylo)-aminometan, EGTA: glikol etylenowy-bis(β-aminoetylowy eter)-N,N,N',N'-tetraoctowy, PTE: eter polioksyetyleno-(10)-tridecylowy, A: autoklaw, ₳: filtr-sterylizacja; *napełnij do 50 ml wodą wolną od RNaz.

  1. Homogenizacja/mielenie tkanek
    1. Ostudzić wirówkę i umieścić homogenizatory i probówki wirówkowe na lodzie. Rozmrozić podwielokrotności DTT, PMSF, CHX i CAM. Wymieszać PEB i WB z roztworów podstawowych w probówkach o pojemności 50 ml zgodnie z wymaganiami dnia (# próbek) i schłodzić na lodzie.
      UWAGA: PMSF należy dodać tylko na krótko przed użyciem, ponieważ okres półtrwania PMSF w wodzie wynosi tylko 30 minut.
    2. Przygotować dużą ilość ciekłego azotu w naczyniu Dewara i pobrać próbki tkanek z magazynu w temperaturze -80 °C. Noś bawełniane rękawice pod standardowymi rękawicami laboratoryjnymi, aby zapobiec poparzeniom zimnymi zaprawami. Wlej ciekły azot do moździerzy i tłuczków, aż będą wystarczająco zimne, aby umożliwić mielenie. Zaleca się opracowanie systemu rozróżniania zapraw (etykietowanie lub utrzymywanie w określonej kolejności).
    3. Opróżnij próbkę tkanki do moździerza i ostrożnie zmielić, aż cały materiał stanie się białym proszkiem. W razie potrzeby dodaj ciekły azot, aby utrzymać tkankę zamrożoną lub ułatwić lepsze mielenie.
    4. Dodać 5 ml PEB do próbki i szybko wymieszać z proszkiem, zanim bufor zamarznie. Podczas gdy ta próbka rozmraża się (mieszaj od czasu do czasu), przetwarzaj inną próbkę.
    5. Jak tylko mieszanina będzie mogła zostać przeniesiona, opróżnij gnojowicę do szklanego homogenizatora i trzymaj na lodzie. Za pomocą dodatkowych 2 ml PEB opłucz moździerz i tłuczek i dodaj je do próbki w homogenizatorze.
      UWAGA: Unikaj całkowicie płynnej próbki, ponieważ umożliwia to degradację RNA.
    6. Zmiel zawiesinę ręcznie, aż ekstrakt będzie jednorodny. Zalecamy co najmniej 4 do 5 zanurzeń.
      UWAGA: Może to wymagać dodatkowego czasu oczekiwania, aby gnojowica mogła się dalej rozmrozić. Obchodzenie się z homogenizatorami wymaga pewnej staranności. Nie stosuj brutalnej siły i uważaj na siły ssania. Jeśli nie zostanie to uwzględnione, doprowadzi to do rozlania, zanieczyszczenia lub zniszczenia homogenizatora.
    7. Wlej surowy ekstrakt z korzenia do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml (trzymaj na lodzie).
      UWAGA: Zazwyczaj przed przeniesieniem można zmielić kilka próbek. Wymagana jest równoległa obsługa mielenia, przenoszenia i homogenizacji. Staraj się pracować szybko, ale nie spiesz się; Zachowaj spokój. Zhomogenizowane próbki należy zawsze przechowywać na lodzie.
  2. Całkowite pobranie próbki RNA
    1. Przenieść 200 μl podwielokrotności każdej próbki surowej do czystej probówki wirówkowej (oznaczonej i uprzednio schłodzonej na lodzie).
    2. Kontynuować ekstrakcję RNA zgodnie z opisem dla próbek TRAP w pkt 7.1 i 7.2. Wykonaj te czynności, gdy próbki są oczyszczane w wirówce.
    3. Wykonaj zabieg DNazy z ponownie zawieszonym całkowitym RNA w celu wyeliminowania zanieczyszczenia DNA i oczyszczenia reakcji za pomocą komercyjnego zestawu (tabela materiałów).
      UWAGA: Ekstrakcje całkowitego RNA zwykle dają wysokie stężenia, a próbki muszą być znacznie rozcieńczone. Zalecamy pomiar stężenia po rozcieńczeniu za pomocą czułego protokołu Qubit.
  3. Oczyszczanie surowego ekstraktu
    1. Pobrać wiadro z lodem z próbkami z ppkt 6.2.7 i odwirować je przez 15 minut w temperaturze 16 000 x g i temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Aby zrównoważyć wirówkę, odpowiednio sparuj próbki. W przypadku, gdy nie jest to do końca możliwe, dostosuj jedną próbkę, dodając PEB.
    2. Wlać supernatant do świeżej probówki wirówkowej (uprzednio schłodzonej na lodzie) i powtórzyć wirowanie (15 minut przy 16 000 x g i 4 °C). Ten transfer można szybko wykonać obok wirówki.
    3. Podczas oczyszczania surowego ekstraktu rozpocząć mycie kulek GFP zgodnie z krokiem 6.6.
      UWAGA: Zachowaj to wiaderko na lód do kołysania na shakerze, ale nie umieszczaj go z powrotem na sterylnej ławce, ponieważ może być zanieczyszczone.
  4. Pranie koralików
    1. Porcję kulek magnetycznych GFP (#samples x 60 μl, tabela materiałów) do probówki o pojemności 1,5 ml. Umieść na stojaku magnetycznym. Po zebraniu kulek usuń supernatant.
    2. Dodaj 1 ml zimnego WB, ponownie zawieś kulki i ponownie je zbierz. Wyrzuć bufor do przemywania i powtórz jeszcze raz z 1 ml WB.
    3. Na koniec ponownie zawiesij koraliki w WB do początkowej objętości użytej w kroku 6.5.1.
  5. Oczyszczanie immunologiczne (IP)
    1. Natychmiast po odwirowaniu wlać oczyszczony supernatant do znakowanych probówek o pojemności 15 ml i dodać 60 μl przemytych kulek na próbkę.
    2. Umieść wszystkie próbki poziomo w pojemniku na lód i umieść je na shakerze. Pozostawić mieszaninę do inkubacji przez 2 godziny w celu związania polisomów znakowanych GFP z kulkami.
    3. Zbierz kulki na stojaku magnetycznym na probówki 15 ml (na lodzie) i dodaj PMSF do pozostałego PEB. Odrzucić supernatant. Wlej około 5 ml PEB do kulek i ponownie je zawieś, przechylając. Potrząsać próbkami przez 15 minut w tym samym ustawieniu, co w sekcji 6.6.2.
    4. Powtórz prania z WB do łącznej liczby 3 prań (1 x PEB, 2 x WB). Przed każdą wymianą bufora dodaj PMSF.
    5. Zbierz kulki w 1 ml WB i przenieś je do probówki o pojemności 1,5 ml. Na koniec zbierz koraliki jeszcze raz na stojaku magnetycznym i usuń cały płyn. Zamknąć probówkę i trzymać na lodzie, aż wszystkie próbki zostaną przetworzone.
    6. Próbki należy przetransportować do dygestorium w celu ekstrakcji RNA.
  6. Utylizacja odpadów i regeneracja materiałów laboratoryjnych.
    1. Jeżeli procedura sterylizacji zostanie przeprowadzona zgodnie z dobrą praktyką laboratoryjną (patrz sekcja 2.2.1), w wyniku której otrzyma się wodny roztwór NaCl. Pozostaw chlor gazowy, a także resztki HCl i wybielacz do opróżnienia w dygestoriach.
    2. Utylizacja PEB i WB: Ponieważ CHX rozkłada się przy wysokim pH, zbierz wszystkie płyny i doprowadź do pH>9. Odpady płynne należy utylizować w halogenowych odpadach chemicznych. Wszystkie ciała stałe (tkanki, pipety serologiczne, rękawiczki itp.) należy usunąć jako odpady chemiczne.
    3. Płyny zawierające fenol należy zbierać oddzielnie, a także materiał zanieczyszczony fenolem (końcówki, probówki i rękawice).
    4. Moździerze, tłuczki i homogenizatory (gąbki i szczotkę) umyć ręcznie mydłem i dokładnie spłukać. Następnie wypiekać materiał w temperaturze >220 °C przez noc. Przed zabiegiem zawinąć w folię aluminiową lub umieścić w żaroodpornym, przykrytym pojemniku.
    5. Wyszczotkuj czyste probówki wirówkowe detergentem, a następnie roztworem dietylopirowęglanowym (DEPC) w dygestorium. W tym celu dodać płynny DEPC do wody dejonizowanej (1 ml DEPC na 1 l H2O) i wymieszać przez wytrząsanie. Umieść probówki wirówkowe na tacy, którą można sterylizować w autoklawie, która wyłapuje rozlaną wodę DEPC. Wlej zawiesinę do tubek i pozostaw na 3 godziny lub na noc. DEPC rozkłada się w kolejnym procesie autoklawowania.
      UWAGA: DEPC jest wysoce toksyczny.

7. Ekstrakcja RNA i kontrola jakości

  1. Ekstrakcja RNA
    1. Schłodzić wirówkę stołową do temperatury 4 °C.
    2. Dodać 1 ml odczynnika na bazie kwasu-guanidyny-fenolu (tabela materiałów) do każdej próbki, odwrócić w celu ponownego zawieszenia kulek lub całkowitej zawiesiny RNA i inkubować przez 5 minut na lodzie. Nie wirować!
    3. Dodać 200 μl chloroformu i inkubować przez 3 minuty na lodzie. Następnie dokładnie zwirować próbki.
    4. Aby ułatwić separację faz, wirować z maksymalną prędkością przez 10-15 minut, 4 °C.
    5. Oznaczyć 1,5 ml probówek o niskiej retencji (tabela materiałów) i podać w każdej z nich podwielokrotność 650 μl izopropanolu.
    6. Ostrożnie pobrać górną fazę wodną (ok. 650 μl) i przenieść do przygotowanych probówek z izopropanolem. Unikaj dotykania różowej fazy organicznej.
    7. Wytrącić RNA przez noc w temperaturze -20 °C.
      UWAGA: Zaleca się przechowywanie próbek w izopropanolu w temperaturze -20 °C lub -80 °C i rozpuszczanie w wodzie tylko wtedy, gdy jest to konieczne. Wodny roztwór RNA ulega degradacji nawet w temperaturze -80 °C, gdy jest przechowywany przez tygodnie/miesiące.
  2. Wytrącanie RNA
    1. Schłodzić wirówkę stołową do temperatury 4 °C.
    2. Przygotuj świeży 80% EtOH z wodą wolną od RNaz i schłodzić w temperaturze -20 °C (5 minut w temperaturze -80 °C pomaga przyspieszyć proces).
    3. Odwirować próbki z maksymalną prędkością (ok. 13 000 x g) przez 30 minut i odrzucić supernatant. Osad nie będzie widoczny, więc ostrożnie pipetuj tak, jakby tam był. Dodaj 1 ml zimnego 80% EtOH i odwróć probówkę jeden lub dwa razy.
    4. Odwirować ponownie przez 30 minut z maksymalną prędkością i powtórzyć mycie, w sumie dwa mycia.
    5. Wiruj przez 2 minuty i usuń wszystkie resztki EtOH za pomocą końcówki o pojemności 10 μl. Pozostaw granulkę do wyschnięcia na 3-5 minut (nie więcej) w temperaturze pokojowej i ponownie zawieś w 20 μl wody wolnej od RNaz.
    6. Próbki należy przechowywać na lodzie i jak najszybciej przeprowadzić kontrolę jakości. Kontynuować przechowywanie próbek w temperaturze -80 °C. Unikać cykli zamrażania i rozmrażania.
  3. Kontrola jakości za pomocą dedykowanego sprzętu (Tabela Materiałów) zgodnie z zaleceniami producenta.

8. Przygotowanie biblioteki

  1. Synteza i amplifikacja cDNA za pomocą zestawu SMARTer v4 Ultra Low Input RNA Kit
    1. Obliczyć rozcieńczenie każdej próbki tak, aby zawierało 1,5 ng TRAP-RNA lub całkowitego RNA w objętości 4,75 μl. Przeprowadzić wszystkie reakcje w probówkach PCR i rozcieńczyć próbki świeżymi podwielokrotnościami wody wolnej od RNaz.
    2. Wszystkie kroki należy wykonać zgodnie z zaleceniami producenta przy 1/2 objętości reakcji. Amplifikuj cDNA za pomocą 12-13 cykli PCR.
    3. Oczyść PCR, dodając 0,5 μl 10x buforu do lizy i 25 μl kulek SPRI (tabela materiałów). Jeśli przetwarzanych jest wiele próbek, bufor do lizy i kulki można wstępnie wymieszać. Upewnij się, że kulki są równomiernie rozproszone przed pipetowaniem.
    4. Postępować zgodnie z protokołem w pełnych objętościach reakcji (17 μl buforu elucyjnego). Nie pozwól, aby koraliki wyschły dłużej niż 3 minuty. Przesuszone próbki można potencjalnie uratować dzięki wydłużonemu czasowi inkubacji.
    5. Zmierz stężenie próbki za pomocą zestawu Qubit HS DNA.
      UWAGA: Zestaw SMARTer v4 może tolerować wejście do 200 pg. Uzyskaliśmy biblioteki w przypadkach, w których nie można było określić wartości kubitów (poniżej 250 pg, granica wykrywalności) za pomocą 16-cyklowego PCR. Jednak ograniczony materiał wejściowy może również dawać mniej złożone biblioteki.
  2. Fragmentacja i ligacja adapterowa PCR za pomocą zestawu do przygotowania biblioteki DNA Nextera XT
    1. Rozcieńczyć cDNA wodą wolną od RNaz, aby uzyskać stężenie 200 pg/μl i odpipetować 1,25 μl w probówce PCR.
    2. Wykonaj wszystkie kroki zgodnie z producentem z 1/4 objętości reakcji. Amplifikuj cDNA za pomocą 12 cykli PCR i kompatybilnych adapterów dla próbek należących do jednej puli sekwencjonowania. Dzięki zestawom indeksowym A i D firmy Illumina można multipleksować do 384 próbek.
    3. Do oczyszczania PCR dodać 12,5 μl buforu do reprodukcji i 22,5 μl kulek SPRI (stosunek 0,9x). Eluować próbkę za pomocą 22 μl buforu elucyjnego.
      UWAGA: Kontrola jakości i łączenie zostały przeprowadzone przez firmę zajmującą się sekwencjonowaniem (Tabela materiałów), a zatem normalizacja oparta na koralikach nie była potrzebna. Reakcja fragmentacji enzymatycznej (znakowania) jest bardzo wrażliwa na wprowadzany materiał, ponieważ każdy enzym tnie tylko raz. W związku z tym nie należy przekraczać zalecanego stężenia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W celu oceny jakości powyższa procedura powinna zostać zweryfikowana na kilku etapach pośrednich: walidacji wzorca ekspresji in planta, kontroli jakości wyizolowanego RNA polisomalnego, a także końcowych bibliotek. Dodatkowo można przeprowadzić analizę qRT-PCR z użyciem znanych genów markerowych, aby potwierdzić odpowiedź na warunki traktowania lub doprecyzować warunki eksperymentalne.

Analiza konfokalna rozkładu sygnału...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Weryfikacja wzorca lokalizacji RPL18
Kluczowe znaczenie dla uniknięcia błędnej interpretacji danych z jakiegokolwiek eksperymentu TRAP ma właściwy wzorzec ekspresji znakowanej podjednostki rybosomalnej. W związku z tym, włączenie GFP jako znacznika epitopu do RPL18 bardzo elegancko pozwala na weryfikację pożądanego wzorca ekspresji, a co za tym idzie, na usunięcie frakcji polisomowej z tej samej tkanki. Bardziej inwazyjne podejścia w celu zapewnienia prawidłowych wzorców promotorów są stosowane prze...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować Jean-Claude'owi Walserowi z Centrum Różnorodności Genetycznej w Zurychu za kluczowe porady ekspertów we wczesnej fazie tego projektu. Prace w laboratorium Vermeera były wspierane przez grant profesury SNF (PP00P3_157524) oraz grant na sprzęt R'EQUIP (316030_164086) ze Szwajcarskiej Narodowej Fundacji Nauki (SNSF) przyznany JEMV.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Sterylizacja
bleach, 13%Sigma71696
zlewkaVWR214-1172/74/75
eksykator z płytką porcelanową (DURAN)Sigma/MerckZ317454-1EA/Z317594-1EA
EtOH, p.a.Honeywell02860-1L
HCl, 37%Roth4625.1
Tween 20SigmaP9416
Plate growth + harvesting
MS sole, mieszanka soli podstawowych, w tym bufor MES Instalacja agarowaDuchefaM0254
do hodowli komórkowychApplichem/PanreacA2111.1000
DMSOSigmaD4540
forceptsRubis Szwajcaria5-SA model
KOHFluka60370
taśma mikroporowa/chirurgiczna3M1530-0
NAADuchefaN0903
szalki Petriego 120x120 mmSkalpel
Chusteczki VWR/Swann-Morton233-5454
, neutralne, dwuwarstwowedowolnie wybrane przez użytkownika
Immunoprecypitacja
GFP-kulki: gtma-100 GFP-Trap_MAChromoteknp. gtma-100
Brij-35SigmaP1254-500G
probówki wirówkowe (zgodnie z wirówka)Beckman Coulter357001
ChloramfenikolApplichemC0378-25G
rękawice bawełnianeVWR113-7355
Cykloheksymid, klasa HPLCSigma01810-1G
DEPCVWRE174może mieć długie terminy dostaw
DTTFluka43815
EGTAHomogenizatory Sigma3054.3
DUALL 23KONTES GLASS CO (przez VWR)SCERSP885450-0023 (zestaw)SCERSP885451-0023 tylko tłuczek - tylko cylinder SCERSP885452-0023; długie terminy dostaw
Igepal CA-360SigmaI3021-100ml
KClSigma60130
MgCl2 heksahydratRoth2189.2
moździerz i tłuczekVWR470148-960 & 470019-978
PMSFRoche10 837 091 001
Polioksyetyleno-(10)-tridecyleter/PTESigmaP2393-500G
Woda wolna od RNazRothT143.3
RNAZapThermo FisherAM9780/AM9782do czyszczenia powierzchni
Tris, >99,3% RothAE15.3
Triton X-100FlukaT8787-250ml
Tween 20SigmaP9416-100ml
ekstrakcja RNA
2-propanol, p.a.Sigma33539-1L-GL-R
Chloroform, klasa HPLCScharlauCL02181000
EtOH, p.a.Probówki02860-1L
o niskiej retencji, 1,5 mlEppendorf/SigmaZ666548-250EAZestaw
DNaz bez RNazLoBind Qiagen79254
Zestaw do czyszczenia RNeasy MiniElute Qiagen74204
Odczynnik TRIzolThermoFisher/Ambion15596018
Przygotowanie biblioteki
15/50 mL Rurkowy separator magnetycznyAbraxisPN 472250
Koraliki AMPureBeckman CoulterA63881
Zestaw indeksów AIlluminaFC-131-2001
Zestaw indeksów DMagnesy neodymowe IlluminaFC-131-2004
Amazon/inne6 x 1,5 mm zakres: N42 (NdFeB)
Zestaw Nextera XTIlluminaFC-131-1024/1096https://emea.support.illumina.com/
Paski PCRZestaw ThermoScientificAB-0266
SMARTer v4Takara Bioscience634892https://www.takarabio.com/
BioanalyzerAgilent2100 BioanalyzerInstrument specjalistyczny sprzęt do kontroli jakości RNA/DNA
TapestationAgilent4200 Tapestation Instrumentspecjalistyczny sprzęt do kontroli jakości RNA/DNA
Analizator fragmentówAgilent5400 Analizator fragmentów Systemspecjalistyczny sprzęt do kontroli jakości RNA/DNA (wysoka przepustowość)
LabChipPerkinElmerLabChip GX Touch Analizator kwasów nukleinowychspecjalistyczny sprzęt do kontroli jakości RNA/DNA (wysoka przepustowość)
Fluorometr Qubit 4ThermoFisherQ33239specjalistyczny sprzęt do oznaczania stężenia RNA/
DNAqRT-PCR
GATA23Microsynthfwd: AGTGAGAATGAA
AGAAGAGAAGGG;
rev: GTGGCTGCGAAT
AATATGAATACC
GH3.3Microsynthfwd: CAAACCAATCCT
CCAAATGAC;
rev: ACTTATCCGCAA
CCCGACT
LBD29Microsynthfwd: TCTCCAACAACA
GGTTGTGAAT;
rev: AAGGAGCCTTAG
TAGTGTCTCCA
UBC21Mikrosyntezatorfwd: TGCGACTCAGGG
AATCTTCT;
rev: TCATCCTTTCTT
AGGCATAGCG
SsoAdvanced Uniwersalny SYBR GreenBio-Rad#172-5270
iScript Adv cDNA KitBio-Rad#172-5038
miscellaneous
Falcon probówki 15 ml, CellstarGreiner bio-one188261
Falcon probówki 50 ml, CellstarGreiner Końcówki filtrujące bio-one210261
1 mlAxygenTF-1000-R-S Końcówki
filtrujące 10 i mikro; lKońcówki filtrów AxygenTF-10-R-S
100 i mikro; lKońcówki filtrujące AxygenTF-100-R-S
20 i mikro; lKońcówki filtrów AxygenTF-20-R-S
200 i mikro; lAxygenTF-200-R-S
1,5 mlSARSTEDT72.690.001
Jodek propidynySigmaP4170-100MG
firma sekwencjonującaNovogeneen.novogene.com
do 688102 Greiner bio-one, wirówkowe Honeywell Probówki do mikrowirówek

Bibliografia

  1. Van Verk, M. C., Hickman, R., Corné, M. J., Pieterse, M., Van Wees, S. C. RNA-Seq: Revelation Of The Messengers. Trends In Plant Science. 18 (4), 175-179 (2013).
  2. Libault, M., Pingault, L., Zogli, P., Schiefelbein, J. Plant Systems Biology At The Single-Cell Level. Trends In Plant Science. 22 (11), 949-960 (2017).
  3. Mustroph, A., et al. Profiling Translatomes Of Discrete Cell Populations Resolves Altered Cellular Priorities During Hypoxia In Arabidopsis. Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. 106 (44), 18843-18848 (2009).
  4. Karve, R., Iyer-Pascuzzi, A. S. Digging Deeper: High-Resolution Genome-Scale Data Yields New Insights Into Root Biology. Current Opinion In Plant Biology. 24, 24-30 (2015).
  5. Warner, J. R., Knopf, P. M., Rich, A. A Multiple Ribosomal Structure In Protein Synthesis. Proceedings of The National Academy of Sciences of The United States of America. 49 (1), 122-129 (1963).
  6. Gautam, V., Sarkar, A. K. Laser Assisted Microdissection, An Efficient Technique To Understand Tissue Specific Gene Expression Patterns And Functional Genomics In Plants. Molecular Biotechnology. 57 (4), 299-308 (2015).
  7. Bargmann, B. O. R., Birnbaum, K. D. Fluorescence Activated Cell Sorting Of Plant Protoplasts. Journal of Visualized Experiments. (36), e1673(2010).
  8. Deal, R. B., Henikoff, S. The Intact Method For Cell Type-Specific Gene Expression And Chromatin Profiling In Arabidopsis Thaliana. Nature Protocols. 6 (1), 56-68 (2011).
  9. Dougherty, J. D. The Expanding Toolkit Of Translating Ribosome Affinity Purification. The Journal of Neuroscience: The Official Journal Of The Society For Neuroscience. 37 (50), 12079-12087 (2017).
  10. Mustroph, A., Juntawong, P., Bailey-Serres, J. Isolation Of Plant Polysomal mRNA By Differential Centrifugation And Ribosome Immunopurification Methods. Methods in Molecular Biology. 553, 109-126 (2009).
  11. Matsushima, W., et al. SLAM-ITseq: Sequencing Cell Type-Specific Transcriptomes Without Cell Sorting. Development. 145 (13), (2018).
  12. Basnet, H., et al. Flura-Seq Identifies Organ-Specific Metabolic Adaptations During Early Metastatic Colonization. Elife. 8, (2019).
  13. Rodriques, S. G., et al. Slide-Seq: A Scalable Technology For Measuring Genome-Wide Expression At High Spatial Resolution. Science. 363 (6434), 1463-1467 (2019).
  14. Fazal, F. M., et al. Atlas Of Subcellular RNA Localization Revealed By Apex-Seq. Cell. 178 (2), 473-490 (2019).
  15. Slane, D., Bayer, M. Cell Type-Specific Gene Expression Profiling Using Fluorescence-Activated Nuclear Sorting. Plant Gene Regulatory Networks: Methods And Protocols. Kaufmann, K., Mueller-Roeber, B. , Springer. New York, NY. 27-35 (2017).
  16. Zanetti, M. E., Chang, I. F., Gong, F., Galbraith, D. W., Bailey-Serres, J. Immunopurification Of Polyribosomal Complexes Of Arabidopsis For Global Analysis Of Gene Expression. Plant Physiology. 138 (2), 624-635 (2005).
  17. King, H. A., Gerber, A. P. Translatome Profiling: Methods For Genome-Scale Analysis Of mRNA Translation. Briefings In Functional Genomics. 15 (1), 22-31 (2016).
  18. Mašek, T., Valášek, L., Pospíšek, M. Polysome Analysis And RNA Purification From Sucrose Gradients. RNA: Methods And Protocols. Nielsen, H. , Humana Press. Totowa, NJ. 293-309 (2011).
  19. Heiman, M., et al. A Translational Profiling Approach For The Molecular Characterization Of Cns Cell Types. Cell. 135 (4), 738-748 (2008).
  20. Halbeisen, R. E., Scherrer, T., Gerber, A. P. Affinity Purification Of Ribosomes To Access The Translatome. Methods. 48 (3), 306-310 (2009).
  21. Thomas, A., et al. A Versatile Method For Cell-Specific Profiling Of Translated mRNAs In Drosophila. Plos One. 7 (7), e40276(2012).
  22. Watson, F. L., et al. Cell Type-Specific Translational Profiling In The Xenopus Laevis Retina. Developmental Dynamics. 241 (12), 1960-1972 (2012).
  23. Lam, P. Y., Harvie, E. A., Huttenlocher, A. Heat Shock Modulates Neutrophil Motility In Zebrafish. Plos One. 8 (12), e84436(2013).
  24. Fang, Y., et al. Translational Profiling Of Cardiomyocytes Identifies An Early Jak1/Stat3 Injury Response Required For Zebrafish Heart Regeneration. Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. 110 (33), 13416-13421 (2013).
  25. Mustroph, A., Zanetti, M. E., Girke, T., Bailey-Serres, J. Isolation And Analysis Of mRNAs From Specific Cell Types Of Plants By Ribosome Immunopurification. Methods In Molecular Biology. 959, 277-302 (2013).
  26. Monshausen, G. B., Gilroy, S. Feeling Green: Mechanosensing In Plants. Trends In Cell Biology. 19 (5), 228-235 (2009).
  27. Day, R. C., Grossniklaus, U., Macknight, R. C. Be More Specific! Laser-Assisted Microdissection Of Plant Cells. Trends In Plant Science. 10 (8), 397-406 (2005).
  28. Sheen, J. Signal Transduction In Maize And Arabidopsis Mesophyll Protoplasts. Plant Physiology. 127 (4), 1466-1475 (2001).
  29. Datta, S., et al. Laser Capture Microdissection: Big Data From Small Samples. Histology And Histopathology. 30 (11), 1255-1269 (2015).
  30. Birnbaum, K., et al. A Gene Expression Map Of The Arabidopsis Root. Science. 302 (5652), 1956(2003).
  31. Hamant, O., Haswell, E. S. Life Behind The Wall: Sensing Mechanical Cues In Plants. BMC Biology. 15 (1), 1354(2017).
  32. Vragović, K., et al. Translatome Analyses Capture Of Opposing Tissue-Specific Brassinosteroid Signals Orchestrating Root Meristem Differentiation. Proceedings of The National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), 923-928 (2015).
  33. Wang, Y., Jiao, Y. Translating Ribosome Affinity Purification (Trap) For Cell-Specific Translation Profiling In Developing Flowers. Methods In Molecular Biology. 1110, 323-328 (2014).
  34. Sablok, G., Powell, J. J., Kazan, K. Emerging Roles And Landscape Of Translating mRNAs In Plants. Frontiers in Plant Science. 8, 1443(2017).
  35. Ron, M., et al. Hairy Root Transformation Using Agrobacterium Rhizogenes As A Tool For Exploring Cell Type-Specific Gene Expression And Function Using Tomato As A Model. Plant Physiology. 166 (2), 455-469 (2014).
  36. Reynoso, M. A., et al. Evolutionary Flexibility In Flooding Response Circuitry In Angiosperms. Science. 365 (6459), 1291-1295 (2019).
  37. Dolan, L., et al. Cellular Organisation Of The Arabidopsis Thaliana Root. Development. 119 (1), 71(1993).
  38. Ristova, D., Barbez, E. Root Development. , Springer. New York, NY. (2018).
  39. Shekhar, V., Stӧckle, D., Thellmann, M., Vermeer, J. E. M. The Role Of Plant Root Systems In Evolutionary Adaptation. Current Topics in Developmental Biology. 131, 55-80 (2019).
  40. Malamy, J. E., Benfey, P. N. Down And Out In Arabidopsis: The Formation Of Lateral Roots. Trends in Plant Science. 2 (10), 390-396 (1997).
  41. de Smet, I., et al. Bimodular Auxin Response Controls Organogenesis In Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences of The United States of America. 107 (6), 2705-2710 (2010).
  42. Péret, B., et al. Arabidopsis Lateral Root Development: An Emerging Story. Trends In Plant Science. 14 (7), 399-408 (2009).
  43. Vilches-Barro, A., Maizel, A. Talking Through Walls: Mechanisms Of Lateral Root Emergence In Arabidopsis Thaliana. Current Opinion in Plant Biology. 23, 31-38 (2015).
  44. Porco, S., et al. Lateral Root Emergence In Arabidopsis Is Dependent On Transcription Factor Lbd29 Regulation Of Auxin Influx Carrier Lax3. Development. 143 (18), 3340-3349 (2016).
  45. Stoeckle, D., Thellmann, M., Vermeer, J. E. Breakout-Lateral Root Emergence In Arabidopsis Thaliana. Current Opinion in Plant Biology. 41, 67-72 (2018).
  46. Banda, J., et al. Lateral Root Formation In Arabidopsis: A Well-Ordered Lrexit. Trends in Plant Science. 24 (9), 826-839 (2019).
  47. Vermeer, J. E. M., et al. A Spatial Accommodation By Neighboring Cells Is Required For Organ Initiation In Arabidopsis. Science. 343 (6167), 178-183 (2014).
  48. Vanneste, S., et al. Cell Cycle Progression In The Pericycle Is Not Sufficient For Solitary Root/Iaa14-Mediated Lateral Root Initiation In Arabidopsis Thaliana. The Plant Cell. 17 (11), 3035-3050 (2005).
  49. Marques-Bueno, M. M., et al. A Versatile Multisite Gateway-Compatible Promoter And Transgenic Line Collection For Cell Type-Specific Functional Genomics In Arabidopsis. The Plant Journal : For Cell and Molecular Biology. 85 (2), 320-333 (2016).
  50. Shimada, T. L., Shimada, T., Hara-Nishimura, I. A Rapid And Non-Destructive Screenable Marker, Fast, For Identifying Transformed Seeds Of Arabidopsis Thaliana. The Plant Journal : For Cell and Molecular Biology. 61 (3), 519-528 (2010).
  51. Clough, S. J., Bent, A. F. Floral Dip: A Simplified Method For Agrobacterium Mediated Transformation Of Arabidopsis Thaliana. The Plant Journal. 16 (6), 735-743 (1998).
  52. Lindsey, B. E., Rivero, L., Calhoun, C. S., Grotewold, E., Brkljacic, J. Standardized Method For High-Throughput Sterilization Of Arabidopsis Seeds. Journal Of Visualized Experiments. (128), e56587(2017).
  53. Andersen, T. G., et al. Diffusible Repression Of Cytokinin Signalling Produces Endodermal Symmetry And Passage Cells. Nature. 555, 529-533 (2018).
  54. Schroeder, A., et al. The Rin: An Rna Integrity Number For Assigning Integrity Values To Rna Measurements. BMC Molecular Biology. 7, 3(2006).
  55. Vragović, K., Bartom, E., Savaldi-Goldstein, S. Quantitation Of Cell Type-Specific Responses To Brassinosteroid By Deep Sequencing Of Polysome-Associated Polyadenylated RNA. Methods in Molecular Biology. 1564, 81-102 (2017).
  56. Bertin, B., Renaud, Y., Aradhya, R., Jagla, K., Junion, G. Trap-Rc, Translating Ribosome Affinity Purification From Rare Cell Populations Of Drosophila Embryos. Journal Of Visualized Experiments. (103), e52985(2015).
  57. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis Of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR And The 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  58. Jiao, Y., Meyerowitz, E. M. Cell-Type Specific Analysis Of Translating Rnas In Developing Flowers Reveals New Levels Of Control. Molecular Systems Biology. 6, 419(2010).
  59. Tian, C., et al. A Gene Expression Map Of Shoot Domains Reveals Regulatory Mechanisms. Nature Communications. 10 (1), 141(2019).
  60. Townsley, B. T., Covington, M. F., Ichihashi, Y., Zumstein, K., Sinha, N. R. Brad-Seq: Breath Adapter Directional Sequencing: A Streamlined, Ultra-Simple And Fast Library Preparation Protocol For Strand Specific mRNA Library Construction. Frontiers in Plant Science. 6, 366(2015).
  61. Song, Y., et al. A Comparative Analysis Of Library Prep Approaches For Sequencing Low Input Translatome Samples. BMC Genomics. 19 (1), 696(2018).
  62. Basu, D., Haswell, E. S. Plant Mechanosensitive Ion Channels: An Ocean Of Possibilities. Current Opinion in Plant Biology. 40, 43-48 (2017).
  63. Brady, S. M., et al. A High-Resolution Root Spatiotemporal Map Reveals Dominant Expression Patterns. Science. 318 (5851), 801(2007).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Metoda TRAPbia ko rybosomalne RPL18izolacja RNA polisom wprzygotowanie biblioteki przy niskim wk adzie materia uintegralno ciany kom rkowejformowanie korzeni bocznychmagnetyczne kuleczki GFP
Translacja oczyszczania powinowactwa rybosomów (TRAP) w celu zbadania rozwoju korzeni rzodkiewnika pospolitego (Arabidopsis thaliana) w skali specyficznej dla typu komórki
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.