Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Generacja ludzkiego chipa bariery krew-mózg opartego na iPSC

12.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60925

⸱

2 marca 2020

 ,  ,  ,  , 
1The Department of Physiology and Cell Biology, Faculty of Health Sciences, Ben-Gurion University of the Negev, 2The Regenerative Medicine and Stem Cell (RMSC) Research Center, Ben-Gurion University of the Negev, 3The Zlotowski Center for Neuroscience, Ben-Gurion University of the Negev, 4The Board of Governors Regenerative Medicine Institute, Cedars-Sinai Medical Center, 5Division of Micro and Nanosystems, KTH Royal Institute of Technology, 6AIMES, Department of Neuroscience, Karolinska Institutet

W tym artykule

Podsumowanie

Bariera krew-mózg (BBB) to wielokomórkowa jednostka nerwowo-naczyniowa ściśle regulująca homeostazę mózgu. Łącząc ludzkie iPSC i technologie narządów na chipie, stworzyliśmy spersonalizowany chip BBB, odpowiedni do modelowania chorób i przewidywania penetracji leków do OUN. Opisano szczegółowy protokół generowania i działania chipa BBB.

Streszczenie

Bariera krew-mózg (BBB) jest tworzona przez jednostki nerwowo-naczyniowe (NVU), które chronią ośrodkowy układ nerwowy (OUN) przed szeregiem czynników znajdujących się we krwi, które mogą zakłócać delikatne funkcjonowanie mózgu. W związku z tym bariera krew-mózg jest główną przeszkodą w dostarczaniu leków do OUN. Coraz więcej dowodów sugeruje, że bariera krew-mózg odgrywa kluczową rolę w powstawaniu i postępie chorób neurologicznych. W związku z tym istnieje ogromne zapotrzebowanie na model bariery krew-mózg, który może przewidzieć przenikanie leków ukierunkowanych na OUN, a także wyjaśnić rolę bariery krew-mózg w zdrowiu i chorobie.

Niedawno połączyliśmy technologie organ-on-chip i indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC), aby wygenerować chip BBB w pełni spersonalizowany dla ludzi. Ta nowatorska platforma wyświetla właściwości komórkowe, molekularne i fizjologiczne, które są odpowiednie do przewidywania transportu leków i cząsteczek przez ludzką barierę krew-mózg. Ponadto, korzystając z dostosowanych do potrzeb pacjenta chipów BBB, stworzyliśmy modele chorób neurologicznych i wykazaliśmy potencjał spersonalizowanych zastosowań medycyny predykcyjnej. Poniżej znajduje się szczegółowy protokół pokazujący, jak generować chipy BBB pochodzące z iPSC, zaczynając od różnicowania komórek śródbłonka mikronaczyniowego mózgu pochodzących z iPSC (iBMEC), a kończąc na mieszanych kulturach nerwowych zawierających progenitory nerwowe, zróżnicowane neurony i astrocyty. Opisano również procedurę wysiewu komórek do chipa narządu i hodowli chipów BBB pod kontrolowanym przepływem laminarnym. Na koniec przedstawiono szczegółowe opisy analiz chipów BBB, w tym testy przepuszczalności parakomórkowej do oceny przepuszczalności leków i cząsteczek, a także metody immunocytochemiczne do określania składu typów komórek w chipie.

Wprowadzenie

BBB to wysoce selektywna bariera, która oddziela OUN od krążącej krwi. Chroni krytyczne funkcje mózgu przed potencjalnie destrukcyjnymi substancjami, czynnikami i ksenobiotykami, jednocześnie umożliwiając napływ składników odżywczych i innych metabolitów niezbędnych do utrzymania homeostazy mózgu1. BBB to wielokomórkowy NVU, w którym perycyty, końcówki astrocytów i procesy neuronalne bezpośrednio stykają się z komórkami śródbłonka mikronaczyniowego mózgu (BMEC). Te interakcje pozwalają BMEC tworzyć wyspecjalizowane właściwości barierowe, które są wspierane przez ścisłe i przylegające połączenia2,3. Tworzenie tej bariery ogranicza parakomórkowe przechodzenie cząsteczek, ale zawiera ona spolaryzowane transportery do aktywnego transportu cząsteczek do OUN lub z powrotem do krwi1. Ze względu na te unikalne właściwości barierowe, bariera krew-mózg stanowi główną przeszkodę w dostarczaniu biofarmaceutyków do mózgu i szacuje się, że mniej niż 5% małych cząsteczek zatwierdzonych przez FDA może dotrzeć do klasy CNS4.

Modele zwierzęce są powszechnie używane do badania penetracji BBB i mechanizmów molekularnych związanych z rozwojem BBB5. Podczas gdy modele zwierzęce wiernie odwzorowują złożone wielokomórkowe środowisko in vivo, różnice w ekspresji i aktywności transporterów BBB, a także specyficzność substratów między gatunkami często uniemożliwiają dokładną ekstrapolację danych zwierzęcych na ludzi6. W związku z tym modele oparte na ludziach mają kluczowe znaczenie dla badania ludzkiej bariery krew-mózg i do wykorzystania w opracowywaniu leków przeznaczonych do celowania w OUN. Potrzeba ta staje się jeszcze bardziej widoczna wraz z rosnącą dominacją leków biologicznych, specyficznych dla człowieka w dziedzinie rozwoju farmaceutycznego. Coraz więcej dowodów sugeruje, że upośledzona bariera krew-mózg jest związana z wieloma poważnymi zaburzeniami OUN, w tym guzami mózgu i chorobami neurologicznymi7,8,9. Modele ludzkie wiernie odzwierciedlające te choroby mają potencjał, aby zarówno 1) zidentyfikować nowe szlaki, które mogą być celem rozwoju leków, jak i 2) przewidzieć penetrację OUN, skracając w ten sposób czas i zasoby w badaniach przedklinicznych i prawdopodobnie zmniejszając odsetek niepowodzeń w badaniach klinicznych.

Modele in vitro zostały szeroko wdrożone do badania interakcji między BMEC a innymi komórkami NVU i przeprowadzania badań przesiewowych pod kątem potencjalnych leków przepuszczalnych dla BBB10. Aby odtworzyć kluczowe aspekty ludzkiej bariery krew-mózg, modele in vitro muszą wykazywać fizjologicznie istotne właściwości (tj. niską przepuszczalność parakomórkową i fizjologicznie istotny transśródbłonkowy opór elektryczny [TEER] w poprzek monowarstwy śródbłonka). Ponadto profil molekularny systemu in vitro musi obejmować ekspresję reprezentatywnych funkcjonalnych systemów transportowych. Zazwyczaj modele in vitro składają się z komórek śródbłonka, które są hodowane na półprzepuszczalnej błonie z kombinacjami innych komórek NVU w celu poprawy właściwości BBB11. Takie podejście pozwala na prostą i stosunkowo szybką ocenę funkcjonalności bariery i przepuszczalności cząsteczek. Takie oparte na komórkach modele BBB można ustalić ze źródłami komórek zwierzęcych lub ludzkich, w tym komórek wyizolowanych z wycięć chirurgicznych lub unieśmiertelnionych linii BMEC.

Niedawno, protokoły różnicowania ludzkich komórek pluripotencjalnych w BMEC zostały wprowadzone jako atrakcyjne źródło dla ludzkich modeli BBB in vitro12,13. BMEC pochodzące z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) są wysoce skalowalne, wykazują kluczowe cechy morfologiczne i funkcjonalne ludzkiego krew-mózg oraz przenoszą genetykę pacjenta. W hodowli iBMEC tworzą monowarstwę, która wyraża markery połączeń ścisłych i wyświetla in vivo podobne do kompleksów połączeń ścisłych. Komórki te wyrażają również markery BBB, w tym transporter glukozy BBB, transporter glukozy 1 (GLUT1). Co ważne, w przeciwieństwie do innych alternatywnych źródeł komórkowych dla ludzkich BMEC, iBMEC uzyskują właściwości barierowe o wartościach tak wysokich, jak te zmierzone in vivo14, polaryzują wzdłuż osi podstawno-bocznej i wyrażają funkcjonalne pompy wypływu. Co więcej, wykorzystanie iPSC z różnych podmiotów zarówno 1) z zadowoleniem przyjmuje możliwość przetestowania aspektów bariery krew-mózg w sposób medycyny spersonalizowanej, jak i 2) zapewnia elastyczne źródło generowania dodatkowych typów komórek NVU. Generowanie tych komórek z izogenicznego źródła komórkowego w celu stworzenia spersonalizowanych chipów BBB pomogłoby również w zrozumieniu różnic międzyosobniczych w odpowiedziach na leki, co jest główną przyczyną oporności lub upośledzonej odpowiedzi na leczenie obserwowanej w badaniach klinicznych.

Użycie iBMEC jako monowarstw w naczyniu lub na półprzepuszczalnej wkładzie transwell stanowi potężne podejście do modelowania BBB. Systemy te są zwykle solidne, powtarzalne i opłacalne. Ponadto analizy funkcjonalne, takie jak TEER i przepuszczalność, są stosunkowo proste do przeprowadzenia. Jednak systemy dwuwymiarowe (2D) nie są w stanie oddać trójwymiarowej natury tkanek in vivo i brakuje im fizjologicznych sił naprężeń ścinających dostarczanych przez krążącą krew i komórki krwi. Ogranicza to zdolność śródbłonka naczyniowego w tych modelach do rozwijania i utrzymywania wewnętrznych właściwości i funkcji BBB.

Mikroinżynieryjne systemy zbudowane z żywych komórek zostały zaimplementowane do modelowania różnych funkcji narządów w koncepcji zwanej organ-on-chips. Odtwarzając podobną do vivo architekturę wielokomórkową, interfejsy tkanka-tkanka, mikrośrodowiska fizykochemiczne i perfuzję naczyniową, te mikroinżynieryjne platformy generują poziomy funkcjonalności tkanek i narządów, które nie są możliwe w konwencjonalnych systemach hodowli 2D. Umożliwiają również obrazowanie w czasie rzeczywistym w wysokiej rozdzielczości i analizę profili biochemicznych, genetycznych i metabolicznych podobnych do żywych komórek w kontekście tkanek i narządów in vivo. Jednak szczególnym wyzwaniem związanym z układem typu organ-on-chip jest to, że projektowanie, wytwarzanie i stosowanie tych mikroinżynieryjnych chipów wymaga specjalistycznej wiedzy inżynierskiej, której zwykle brakuje w biologicznie zorientowanych laboratoriach akademickich.

Niedawno połączyliśmy technologie iPSC i organ-on-chip, aby wygenerować spersonalizowany model chipa BBB15,16. W celu sprostania opisanym wyzwaniom technologicznym zastosowano dostępny na rynku Chip-S1 wraz z modułem hodowli, instrumentem zaprojektowanym do automatyzacji konserwacji chipów w prosty i solidny sposób (Emulate Inc.). Chip BBB odtwarza interakcje między komórkami nerwowymi i śródbłonkowymi i osiąga fizjologicznie istotne wartości TEER, które są mierzone za pomocą specjalnie wykonanych chipów narządowych ze zintegrowanymi złotymi elektrodami17. Ponadto chip BBB wykazuje niską przepuszczalność parakomórkową, reaguje na sygnały zapalne na poziomie narządu, wyraża aktywne pompy wypływowe i wykazuje predykcyjny transport rozpuszczalnych biomarkerów i biofarmaceutyków. Warto zauważyć, że chipy BBB wygenerowane od kilku osób oddają oczekiwane różnice funkcjonalne między zdrowymi osobami a pacjentami z chorobami neurologicznymi15.

Protokół opisany poniżej opisuje niezawodną, wydajną i powtarzalną metodę generowania ludzkich chipów BBB opartych na iPSC w warunkach dynamicznego przepływu. Podano wytyczne dotyczące rodzaju testów i analiz punktów końcowych, które można przeprowadzić bezpośrednio w chipie BBB lub z próbek ścieków. W ten sposób protokół demonstruje spektrum technik, które można zastosować do oceny właściwości biologicznych i funkcjonalnych oraz odpowiedzi w modelu istotnym dla człowieka.

Krótki opis chipa BBB opartego na iPSC znajduje się tutaj. Ludzkie iPSC są początkowo różnicowane i rozmnażane w kolbach do hodowli tkankowych jako swobodnie unoszące się agregaty neuronalnych komórek progenitorowych, zwane sferami EZ. Górny kanał klasy Chip-S116,18,19 jest wypełniony zdysocjowanymi sferami EZ, które tworzą "stronę mózgu" chipa, gdy komórki różnicują się w ciągu 7 dni w mieszaną kulturę neuronalnych komórek progenitorowych (iNPC), iAstrocytów i iNeuronów. Ludzkie iPSC są również zróżnicowane na płytkach do hodowli tkankowych w iBMEC. Dolny kanał chipa jest wysiedlany iBMEC, aby utworzyć "stronę krwi", gdy rozwijają się, tworząc rurkę śródbłonka (Rysunek 1). Porowata membrana pokryta macierzą zewnątrzkomórkową (ECM), która oddziela górny i dolny kanał: 1) umożliwia tworzenie interakcji międzykomórkowych między kanałami oraz 2) umożliwia użytkownikowi przeprowadzanie testów przepuszczalności i obrazowanie komórek w dowolnym kanale za pomocą konwencjonalnego mikroskopu świetlnego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Generowanie komórek progenitorowych neuronów pochodzących z iPSC (iNPCs)

  1. Wytworzyć EZ-spheres z kolonii iPSC zgodnie z opisem poniżej oraz zgodnie z wcześniejszymi publikacjami20,21,22.
    1. Hodować kolonie iPSC do osiągnięcia pełnej konfluencji na 6-dołkowych płytkach pokrytych matrycą błony podstawnej (0,5 mg/płytkę) w pożywce mTESR1 lub innej komercyjnej pożywce (patrz Tabela materiałów).
    2. Usunąć pożywkę dla iPSC i zastąpić ją 2 mL pożywki dla EZ-spheres [ESM; DMEM:F12 7:3 uzupełnione o 100 ng/mL podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF), 100 ng/mL czynnik wzrostu naskórka, 5 µg/mL heparyny oraz 2% suplementu B27].
    3. Zeskrobać dno każdego konfluentnego dołka za pomocą grzbietu sterylnego końcówki pipety 1000 µL lub skrobaka do komórek.
    4. Zebrać wszystkie komórki i przenieść do kolby T25 o ultra-niskim przywieraniu, aby umożliwić spontaniczne formowanie się wolno pływających sfer. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
    5. Dokarmiać sfery co 2–3 dni, gdy pożywka zmieni kolor na żółty, zastępując połowę pożywki świeżym ESM. Pozwala to sferom pozostać w pożywce kondycjonowanej, co jest bardzo ważne dla ich wzrostu i utrzymania.
      1. Oprzeć kolbę na statywie do probówek i pozwolić sferom osiąść pod wpływem grawitacji przez 1–2 min w narożniku kolby.
      2. Po osiadaniu odessać połowę naddatku za pomocą pipety serologicznej 5 mL lub 10 mL i zastąpić ją świeżym, uprzednio ogrzanym ESM.
    6. Pasażować EZ-spheres co tydzień poprzez rozdrabnianie sfer do średnic 200 μm, jak opisano wcześniej23,20,21. EZ-spheres można utrzymywać do 25 pasaży; są one idealne do użytku między 8. a 25. pasażem.
  2. Przygotować zawiesinę pojedynczych komórek iNPC:
    1. W celu indukcji różnicowania neuronalnego dysocjować EZ-sphere do pojedynczych komórek.
    2. Zebrać sfery 3–4 dni po rozdrabnianiu z kolby T75 i przenieść do stożkowej probówki 15 mL, a następnie pozostawić na 2 min lub do momentu, aż wszystkie sfery osiądą na dnie.
    3. Powoli usunąć ESM za pomocą pipety 5 mL, nie naruszając osiadłych sfer. Dodać 1 mL roztworu do dysocjacji (patrz Tabela materiałów) i inkubować przez 10 min w temperaturze 37 °C.
    4. Zamieszać roztwór do dysocjacji i sfery po 5 min inkubacji, aby upewnić się, że wszystkie osiadłe sfery zostały poddane działaniu odczynnika.
    5. Powoli usunąć roztwór do dysocjacji. Dodać 1 mL pożywki do różnicowania neuronalnego [NDM; DMEM: F12 z 2% B27 bez witaminy A, 1% suplementu N2 oraz ludzkim neurotroficznym czynnikiem pochodzącym z mózgu (hBDNF, 20 ng/mL)].
    6. Tryturować sfery do pojedynczych komórek poprzez pipetowanie za pomocą pipety 1 mL, a następnie pipety 200 µL, aż wszystkie sfery ulegną dysocjacji. Unikać tworzenia pęcherzyków powietrza podczas procedury ryturacji.
    7. Policzyć zdysocjowane komórki za pomocą hemocytometru i rozcieńczyć komórki do końcowej gęstości 1 x 106 komórek/mL. Można zmienić gęstość w zależności od zastosowania.
      UWAGA: Wyższe gęstości (do 6 x 106 komórek/mL) są zalecane dla krótkoterminowych kultur do 3 dni, a niższe gęstości dla długoterminowych zastosowań do 3 tygodni.
      UWAGA: Komórki są teraz gotowe do wysiania do górnego kanału chipa w celu utworzenia „strony mózgu”.

2. Różnicowanie iPSC w iBMEC

  1. Przesiać iPSC z jednej w pełni zrosłej studni płytki 6-dołkowej w stosunku 1:6 do płytki 6-dołkowej powleczonej matrycą błony podstawnej. Pozostawić komórki do adhezji na 24 h. Codziennie wymieniać pożywkę iPSC.
  2. Codziennie zliczać komórki przy użyciu hemocytometru.
  3. Gdy komórki osiągną gęstość 1,5–3,0 x 105 komórek/studnię, zastąpić pożywkę iPSC 3 mL niekondycjonowanej pożywki bez bFGF [DMEM:F12 1:1, z 10% zamiennika surowicy knockout (KOSR), 1% nieessentialnych aminokwasów (NEAA), 0,5% suplementu glutaminy (Tabela materiałów) oraz 100 µM β-merkaptoetanolu]. Wymieniać pożywkę codziennie przez 6 dni24.
  4. W 6. dniu zastąpić pożywkę pożywką dla komórek śródbłonka (EC) [bezzsurowicza pożywka dla ludzkich komórek śródbłonka (hESFM) uzupełniona o 1% bydlęcej surowicy pochodzącej z osocza ubogopłytkowego, 20 ng/mL bFGF oraz 10 µM kwasu retinowego (RA) w formie all-trans]. Pozostawić pożywkę na 2 dni.
  5. Usunąć pożywkę EC i dodać 1 mL roztworu dysocjującego na studnię. Inkubować w 37 °C przez 35 min.
    UWAGA: Choć w przypadku zastosowanego tutaj roztworu dysocjującego jest to uważane za długi czas inkubacji, iBMEC są w stanie znieść taką procedurę przy zachowaniu żywotności komórek powyżej 90%.
  6. Oddzielić komórki od studni poprzez delikatne pipetowanie zawiesiny komórkowej i zebrać wszystkie komórki do stożkowej probówki 15 mL.
    UWAGA: Unikać gwałtownego pipetowania. Jeśli komórki nie oddzielają się łatwo, inkubować przez dodatkowe 5 min.
  7. Dodać jedną objętość pożywki EC do probówki stożkowej 15 mL w celu inaktywacji Accutase, wirować przy 200 x g przez 5 min, usunąć pożywkę i zastąpić ją 1 mL pożywki EC (bez bFGF i RA).
  8. Zliczyć komórki za pomocą hemocytometru i dostosować gęstość komórek do 14–20 x 106 komórek/mL.
    UWAGA: Komórki są teraz gotowe do wysiania do dolnego kanału chipa w celu utworzenia „strony krwi”.

3. Mikrofabrykacja chipa organowego

  1. Do modelu chipa BBB i jego produkcji należy wykorzystać chip organowy zgodnie z wcześniej opisaną procedurą16,18,19. Chip organowy z wysokim kanałem (patrz Tabela materiałów) jest wykonany z wysoce elastycznego elastomeru polidimetylosiloksanu (PDMS) i zawiera dwa nałożone na siebie równoległe kanały w skali mikro, oddzielone elastyczną membraną porowatą. Rozmiary górnego i dolnego mikrokanału wynoszą odpowiednio 1 mm x 1 mm oraz 1,0 mm x 0,2 mm. Oba kanały są oddzielone elastyczną membraną porowatą wykonaną z PDMS o grubości 50 μm, zawierającą pory o średnicy 7 μm w odstępach 40 μm. Powierzchnia membrany porowatej oddzielającej kanały wynosi 0,171 cm2.

4. Przygotowanie chipa

  1. Chipowy model organu jest dostarczany w opakowaniu wraz z uchwytem, co eliminuje konieczność przesuwania lub zniekształcania ustawienia chipa podczas manipulacji. Dodatkowo uchwyt chipa łączy się bezpiecznie z przenośnym modułem („Pod”), który pełni funkcję interfejsu między modułem hodowlanym a chipem.
    1. Spryskać opakowanie chipów 70% etanolem i przenieść do komory z laminarnym przepływem powietrza (BSC).
    2. Otworzyć opakowanie i umieścić chipowy model organu w sterylnej szalce Petriego. Uchwyt chipa należy trzymać wyłącznie za boki, aby uniknąć bezpośredniego kontaktu z chipem.
    3. Upewnić się, że zakładka uchwytu jest skierowana w prawą stronę (Rysunek 2), a w przypadku użycia wielu chipów, ustawić je wszystkie w tej samej orientacji.
    4. Oznaczyć każdy chip na zakładce uchwytu (pełne przygotowanie chipa i przebieg pracy przedstawiono na Rysunku 3).

5. Aktywacja powierzchni i powlekanie ECM

  1. Przygotowanie roztworu do aktywacji powierzchni
    1. Odczynnik Emulate reagent 1 (ER-1), dostarczany w fiolce zawierającej 5 mg, jest światłoczuły. Świeży roztwór ER-1 należy przygotować bezpośrednio przed użyciem. Integralność ER-1 jest kluczowa dla prawidłowego przygotowania chipów.
    2. Podczas pracy z ER-1 należy wyłączyć światło w BSC.
      UWAGA: ER-1 działa drażniąco na oczy i musi być obsługiwany w BSC przy użyciu odpowiednich rękawiczek i ochrony oczu.
    3. Przed użyciem należy pozwolić odczynnikom ER-1 i ER-2 wyrównać temperaturę do temperatury pokojowej (RT).
    4. Należy chronić roztwór przed światłem, owijając pustą sterylną probówkę stożkową 15 mL folią.
    5. W BSC należy krótko ostukać fiolkę z ER-1, aby proszek osiadł na dnie.
    6. Do fiolki należy dodać 1 mL buforu ER-2, a następnie niezwłocznie przenieść jej zawartość na dno owiniętej probówki stożkowej 15 mL. Nie mieszać za pomocą pipety. Przeniesiony do probówki stożkowej roztwór będzie miał kolor czerwony.
    7. Powtórzyć krok 5.1.6 trzykrotnie. W ostatniej serii należy zakręcić fiolkę ER-1 i odwrócić ją, aby zebrać pozostały na nakrętce proszek, a następnie przenieść roztwór do probówki stożkowej; w ten sposób uzyskana zostanie objętość 4 mL roztworu ER-1.
    8. Do 4 mL roztworu ER-1 w probówce stożkowej 15 mL należy dodać 6 mL roztworu ER-2, aby uzyskać stężenie końcowe 0,5 mg/mL. ER-1 powinien być całkowicie rozpuszczony w roztworze ER-2.
  2. Aktywacja powierzchni
    1. Używając pipety P200 i sterylnej filtrowanej końcówki 200 μL, należy pobrać 200 μL mieszaniny ER-1.
    2. Pipetę należy umieścić w dolnym wlocie i wprowadzić 20 μL mieszaniny ER-1 przez dolny kanał, aż mieszanina zacznie wypływać z wylotu dolnego kanału.
    3. Należy dodać około 50 μL mieszaniny ER-1 i wprowadzić ją do wlotu górnego kanału. Mieszaninę należy przepchnąć przez górny kanał, aż zacznie wypływać z wylotu górnego kanału.
    4. Cały nadmiar mieszaniny ER-1 z powierzchni chipa należy usunąć poprzez delikatne aspirację. Należy upewnić się, że mieszanina ER-1 jest usuwana tylko z powierzchni chipa, a nie z kanałów.
    5. Przed aktywacją ultrafioletową (UV) należy sprawdzić, czy w kanałach nie ma pęcherzyków powietrza. W przypadku wykrycia pęcherzyków powietrza należy je usunąć, przepłukując kanał mieszaniną ER-1.
    6. Otwartą szalkę zawierającą chipy należy umieścić w komorze z lampą UV (dostarczonej przez Emulate Inc.).
    7. Przełącznik z tyłu komory UV należy ustawić w pozycji „Consistent”. Należy włączyć zasilanie i rozpocząć aktywację UV. Chipy należy pozostawić pod światłem UV na 20 min.
      UWAGA: Należy unikać narażania personelu na działanie światła UV.
    8. Należy usunąć mieszaninę ER-1 z obu kanałów.
    9. Każdy kanał należy przepłukać 200 μL roztworu ER-2.
    10. Należy usunąć ER-2 z obu kanałów.
    11. Każdy kanał należy przepłukać 200 μL sterylnego zimnego soli fizjologicznej Dulbecco (DPBS).
    12. Zimny DPBS należy pozostawić w kanałach do momentu przejścia do następnego kroku.
  3. Przygotowanie i nanoszenie macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM)
    1. Roztwór ECM należy przygotować, łącząc poszczególne komponenty ECM z zimnym DPBS, wodą lub innym rozpuszczalnikiem do końcowych stężeń roboczych. Roztwór ECM powinien być przygotowywany na świeżo przed każdym użyciem.
    2. Zarówno górny, jak i dolny kanał chipa należy pokryć ECM o składzie dobranym do rodzaju wysiewanych komórek. Mieszaninę ECM należy przechowywać w lodzie do momentu użycia.
    3. Do pokrycia „strony mózgu” należy użyć lamininy (50 µg/mL), a do pokrycia „strony krwi” kolagenu IV i fibronektyny zmieszanych w stosunku 4:1 (320:80 µg/mL), zgodnie z opisem w sekcji 5.6.
  4. Przygotowanie alikwotów ECM
    1. Lamininę o stężeniu 1 mg/mL należy rozcieńczyć w zimnym DPBS do stężenia końcowego 50 µg/mL. Należy przygotować alikwoty i przechowywać je w temperaturze -20 °C do momentu użycia.
    2. Kolagen IV należy rozpuścić w 0,1% kwasie octowym do stężenia 1 mg/mL. Roztwór należy inkubować w temperaturze 2–8 °C przez noc lub w RT przez 1-3 h, aż do całkowitego rozpuszczenia.
    3. Należy przygotować 1 mL mieszaniny kolagenu IV:fibronektyny (320 µL kolagenu IV, 80 µL fibronektyny, 600 µL sterylnej wody dwukrotnie destylowanej H2O). Mieszaninę można przechowywać w temperaturze -20 °C.
  5. Pokrywanie chipów ECM
    1. Należy całkowicie aspirować zimny DPBS z obu kanałów. Pipetę P200 należy ustawić na pobranie 100 μL roztworu kolagenu IV:fibronektyny.
    2. Roztwór należy wprowadzić przez wlot dolnego kanału, aż na wylocie uformuje się mała kropla. Po usunięciu końcówki pipety na wlocie powinna pozostać mała kropla.
    3. Roztwór lamininy należy wprowadzić przez wlot górnego kanału, aż na wylocie uformuje się mała kropla. Po usunięciu końcówki pipety na wlocie powinna pozostać mała kropla.
    4. Należy dokładnie obejrzeć kanały, aby upewnić się, że nie ma w nich pęcherzyków powietrza. Jeśli pęcherzyki są obecne, należy przepłukać kanał odpowiednim roztworem ECM, aż zostaną całkowicie usunięte.
    5. Kroki 5.5.1–5.5.4 należy powtórzyć dla każdego chipa.
    6. Do nakrętki probówki stożkowej 15 mL należy dodać 1,5 mL DPBS. Nakrętkę z DPBS należy umieścić w szalce hodowlanej 150 mm z chipami, aby zapewnić dodatkową wilgotność, a następnie uszczelnić szalkę parafilmem. Dla uzyskania najlepszych wyników chipy należy inkubować w temperaturze 4 °C przez noc.
      UWAGA: Jeśli jest to pożądane, komórki można wysiać w tym samym dniu, w którym przeprowadzono aktywację chipa i nanoszenie ECM, choć zalecana jest inkubacja nocna. Chipy mogą być gotowe do wysiewu 4 h po dodaniu ECM i inkubowaniu w temperaturze 37 °C.

6. Zasiewanie kanału „strony mózgu” i różnicowanie sfer EZ w mieszane kultury neuronalne

  1. Przenieś naczynie zawierające przygotowane chipy do BSC. Delikatnie przemyj oba kanały 200 µL NDM.
  2. Unikając kontaktu z portami, ostrożnie odessij nadmiar kropel medium z powierzchni chipa. Przed zasianiem każdego chipa delikatnie wymieszaj zawiesinę komórkową, aby zapewnić jej homogeniczność.
  3. Sianie iNPC do górnego kanału w celu utworzenia „strony mózgowej”
    1. Zasiej komórki (1 x 106 komórek/mL) do górnego kanału chipa. Wprowadź końcówkę P200 zawierającą 30–100 μL zawiesiny komórek do wlotu górnego kanału i delikatnie odłącz końcówkę od pipety. Używając pustej pipety P200, naciśnij tłok, włóż końcówkę do wylotu górnego kanału i ostrożnie przeciągnij zawiesinę pojedynczych komórek przez chip.
    2. Przykryj naczynie i przenieś je pod mikroskop, aby sprawdzić gęstość zasiania oraz homogeniczność rozkładu komórek w górnym kanale. Delikatnie usuń końcówki pipety z portów wlotowego i wylotowego chipa.
    3. Gęstość zasiania powinna odpowiadać pokryciu powierzchni na poziomie 20%. Jeśli gęstość zasiania jest wyższa lub niższa od oczekiwanej bądź nierównomierna, przenieś chipy z powrotem do BSC, przemyj kanał 2x 200 μL świeżego medium i powtórz krok 6.3.1.
    4. Po potwierdzeniu prawidłowej gęstości komórek, niezwłocznie umieść chipy w inkubatorze na 2 h w temperaturze 37 °C po zasianiu każdej partii chipów. Wypłucz nieprzytwierdzone komórki świeżym NDM.
    5. Utrzymuj komórki w warunkach statycznych w temperaturze 37 °C z codzienną wymianą NDM przez co najmniej 48 h przed uruchomieniem przepływu. iBMECs można siać po przytwierdzeniu iNPC lub w kolejnym dniu po zasianiu iNPC.

7. Wysiewanie iBMECs do dolnego kanału w celu utworzenia „strony naczyniowej”

  1. Przenieść płytkę z przygotowanymi chipami do BSC. Delikatnie przepłucz dolny kanał 200 µL pożywki EC.
  2. Unikając kontaktu z portami, ostrożnie odessaj krople nadmiaru pożywki EC z powierzchni chipa, upewniając się, że w obu kanałach pozostała pożywka. Delikatnie wymieszaj zawiesinę komórek przed zasianiem każdego chipa, aby zapewnić jednorodność zawiesiny.
  3. Za pomocą pipety P200 pobierz 30–100 µL zawiesiny komórek iBMEC (14–20 x 106 komórek/mL) i umieść końcówkę w wlocie dolnego kanału. Delikatnie odłącz końcówkę od pipety, pozostawiając końcówkę z zawiesiną komórek w porcie wlotowym.
  4. Wciśnij tłok pipety P200 z pustą końcówką, włóż ją do wylotu dolnego kanału i ostrożnie przeciągnij pojedynczą zawiesinę komórek przez dolny kanał, powoli zwalniając tłok pipety.
  5. Odessaj nadmiar zawiesiny komórek z powierzchni chipa. Unikaj bezpośredniego kontaktu z portami wlotowym i wylotowym, aby upewnić się, że zawiesina komórek nie zostanie odessana z kanałów.
  6. Przykryj chip i przenieś go pod mikroskop w celu obserwacji gęstości zasiewu. Dolny kanał powinien być wypełniony bez widocznych przerw między komórkami przy powiększeniu 4x lub 10x (Rysunek 4).
  7. Jeśli gęstość zasiewu jest mniejsza niż 90% pokrycia lub jest nierównomiernie rozłożona, odpowiednio dostosuj gęstość komórek i powtórz kroki 7.2–7.6, aż w kanale zostanie osiągnięta prawidłowa gęstość. Po potwierdzeniu prawidłowej gęstości komórek (Rysunek 4), zasiej komórki w pozostałych chipach. Aby komórki przytwierdziły się do porowatej membrany znajdującej się na górze dolnego kanału, odwróć każdy chip do góry dnem i umieść go w uchwycie do chipów.
  8. Umieść mały zbiornik (nakrętka od probówki stożkowej 15 mL zawierająca sterylny DPBS) wewnątrz płytki 150 mm, aby zapewnić wilgotność dla komórek. Inkubuj chipy w temperaturze 37 °C przez około 3 h lub do momentu, aż komórki w dolnym kanale przytwierdzą się do powierzchni. Gdy iBMEC przytwierdzą się do membrany (~3 h po zasianiu), odwróć chipy z powrotem do pozycji pionowej, aby umożliwić przytwierdzenie komórek do dolnej części dolnego kanału.

8. Inicjacja przepływu

  1. Przepływ jest zazwyczaj uruchamiany 48 h po wysianiu iBMECs. Czas ten jest niezbędny, aby iBMECs trwale przytwierdziły się do chipa.
  2. Aby utrzymać przepływ laminarny przez chip, ważne jest odgazowanie i wyrównanie temperatury pożywki. Pożywkę należy wstępnie ogrzać w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C przez 1 h.
  3. Do 50 mL ogrzanej pożywki można odgazować poprzez inkubację w systemie filtracji próżniowej przez 15 min.
  4. Przygotowanie (priming) modułów przenośnych
    1. Zdezynfekować zewnętrzną stronę opakowania i tacek modułu przenośnego 70% etanolem, wytrzeć i przenieść do BSC. Otworzyć opakowanie i umieścić moduły w tacce. Ustawić je tak, aby zbiorniki znajdowały się z tyłu tacy.
    2. Pipetować 3 mL wstępnie wyrównanej, ciepłej pożywki do każdego zbiornika wlotowego. Dodać pożywkę do hodowli EC do zbiornika wlotowego dolnego kanału oraz NDM do zbiornika wlotowego górnego kanału (Rycina 5).
    3. Pipetować 300 μL wstępnie wyrównanej, ciepłej pożywki do każdego zbiornika wylotowego, bezpośrednio nad każdym portem wylotowym (Rycina 5).
    4. Umieścić do sześciu modułów przenośnych na każdej tacce. Przenieść tacki do inkubatora i wsunąć całkowicie do modułu hodowlanego, uchwytem tacy skierowanym na zewnątrz.
    5. Wybrać i uruchomić cykl „Prime” w module hodowlanym. Zamknąć drzwi inkubatora i pozwolić modułowi hodowlanemu na przygotowanie (priming) modułów przenośnych (trwa to ok. 1 min). Cykl przygotowania kończy się, gdy pasek stanu wyświetla napis „Ready”. Wyjąć tackę z modułu hodowlanego i przenieść ją do BSC.
    6. Zweryfikować, czy moduły przenośne zostały pomyślnie przygotowane, sprawdzając spód każdego modułu przenośnego w BSC. Poszukać obecności małych kropli przy wszystkich czterech portach.
      1. Jeśli któryś z modułów przenośnych nie wykazuje obecności kropli, ponownie uruchomić cykl prime dla tych modułów. Jeśli pożywka ściekła na tackę (może to zdarzyć się częściej przy portach wylotowych), oczyścić tackę 70% etanolem.
  5. Podłączenie chipów do modułów przenośnych, regulacja i uruchomienie przepływu
    1. Delikatnie przemyć oba kanały każdego chipa ciepłą, wyrównaną, specyficzną dla danej komórki pożywką hodowlaną, aby usunąć ewentualne pęcherzyki powietrza w kanale, a następnie nanieść małe krople pożywki (zgodnie z rodzajem pożywki w kanale) na górę każdego portu wlotowego i wylotowego.
    2. Wsunąć chipy wraz z nośnikami do modułów przenośnych i umieścić do sześciu sztuk na każdej tacce. Wsunąć tacki do modułu hodowlanego. Zaprogramować odpowiednie warunki hodowli na chipie organowym (szybkość przepływu i rozciąganie) w module hodowlanym.
    3. Zaprogramowane warunki zostaną uruchomione natychmiast po zakończeniu cyklu „Regulate”.
      UWAGA: Szybkość przepływu dla każdego kanału może być kontrolowana niezależnie i może być ustawiona w zakresie od 0–1 000 µL/h. Chip BBB jest zazwyczaj hodowany przy 30 µL/h. Przy przepływie pożywek takich jak pożywka EC lub ESM z prędkością 30 µL/h i 1000 µL/h, siły ścinania wynoszą odpowiednio 0,01 dyn/cm2 i 0,33 dyn/cm2.
    4. Uruchomić cykl „Regulate”, który trwa około 2 h, po czym moduł hodowlany rozpocznie przepływ zgodnie z zaprogramowanymi warunkami hodowli na chipie organowym.

9. Ocena przepuszczalności parakomórkowej bariery krew-mózg

  1. Przygotować NDM uzupełniony o 10 µg/mL dekstranu-FITC (4 kDa). Roztwór ten zostanie użyty jako wkład do kanału „strony krwi”.
  2. Wypełnić dolne zbiorniki kanałów modułów przenośnych NDM uzupełnionym o dekstran-FITC. Górne zbiorniki kanałów wypełnić NDM bez znacznika.
  3. Perfundować oba kanały, górny i dolny, z prędkością przepływu 30 µL/h przez co najmniej 4 h, aż do momentu nagromadzenia wystarczającej ilości medium do pobrania w celu oceny fluorescencji w czytniku płytek (zazwyczaj 100 µL).
  4. Pobrać próbki medium ze zbiorników wlotowych i wylotowych kanałów górnego i dolnego. Próbki chronić przed światłem.
  5. Przygotować szereg rozcieńczeń NDM uzupełnionego o 10 µg/mL dekstranu-FITC w stosunku 1:1 przy użyciu NDM bez znacznika, aby stworzyć 10–12 punktową krzywą kalibracyjną.
  6. Przenieść po 100 µL każdej próbki, w tym próbki z krzywej kalibracyjnej, do czarnej płytki 96-dołkowej i zmierzyć fluorescencję za pomocą czytnika płytek (wzbudzenie 485 nm, emisja 530 nm).
  7. Wykorzystać zmierzone wartości do obliczenia wartości Papp w następujący sposób:

Schemat równania przepuszczalności, obliczanie Papp dla analizy transportu przez błonę z wykorzystaniem danych wejściowych dotyczących stężenia.

  1. Wykonuj codzienne pomiary w celu oceny właściwości barierowych i potwierdzenia, że chip BBB nadal funkcjonuje prawidłowo.

10. Immunocytochemia

  1. Przenieść chipy do dygestorium chemicznego. Za pomocą pipety P200 utrwalić komórki, perfundując oba kanały 200 µL 4% paraformaldehydu (PFA) w DPBS, a następnie inkubować przez 10 min w RT.
  2. Po utrwalaniu perfundować każdy kanał 200 μL DPBS i inkubować przez 5 min. Powtórzyć przemywanie DPBS 2x.
  3. Zablokować i permeabilizować komórki na chipie poprzez perfuzję podstawowego roztworu blokującego (PBS uzupełniony o 5% normalnego surowicy osła i 0,1% Triton X-100). Inkubować w RT przez 1 h.
  4. Rozcieńczyć przeciwciała pierwszorzędowe w podstawowym roztworze blokującym i inkubować przez noc w 4 °C. Markerami BMECs są GLUT-1 (rozcieńczenie 1:100), ZO-1 (1:300), PECAM-1 (1:250; CD31) oraz VE-cadherin (1:200). Markerami neuronalnymi są βIII-tubulin (1:1000; Tuj1α), S100β (1:500), nestin (1:1000) i GFAP (1:1000).
  5. Przemyć chipy 3x zimnym DPBS.
  6. Rozcieńczyć przeciwciała drugorzędowe w wtórnym roztworze blokującym (DPBS z 5% normalnej surowicy osła bez Triton-X).
  7. Perfundować oba kanały roztworem przeciwciał drugorzędowych. Zazwyczaj fluorescencyjne przeciwciała drugorzędowe są rozcieńczane 1:1000. Inkubować przez 1 h w RT, chroniąc przed światłem.
  8. Przemyć chipy 3x DPBS.
  9. Zbarwić jądra komórkowe, perfundując chip 100 μL roztworu DAPI. Inkubować w RT przez 5 min.
  10. Przemyć chipy 3x DPBS.
  11. Chip jest gotowy do obrazowania przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego prostego lub odwróconego. Przezroczystość PDMS umożliwia obrazowanie w nienaruszonym chipie organoidowym. Powiększenia powyżej 10x mogą wymagać obiektywów o długiej odległości roboczej ze względu na grubość chipa organoidowego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rysunek 6A,B,C przedstawia chip BBB z wysianymi sferami EZ w górnym kanale po „stronie mózgu” oraz iBMECs w dolnym kanale po „stronie krwi”. Najpierw wysiano iBMECs i pozostawiono je do przyczepienia na noc, po czym wysiano sfery EZ. Następnie chipy hodowano w warunkach statycznych z codzienną wymianą pożywki przez siedem dni. Chip BBB utrwalono za pomocą 4% PFA w RT przez 10 min i przemyto 3x DPBS. Immunocytochemię na chipie BBB przeprowadzono z użyciem: 1) nestyny jako mar...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Połączenie technologii organ-on-chip i komórek pochodzących z iPSC w NVU daje nadzieję na dokładne modelowanie ludzkiego BBB. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół prostego i niezawodnego zastosowania niedawno opublikowanego chipa BBB16 opartego na iPSC. Przegląd i czas paradygmatu wysiewu przedstawiono na rysunku 3. Aby uzyskać i utrzymać funkcje barierowe, które są odpowiednie do modelowania BBB, kluczowe znaczenie ma wygenerowanie jednorodnej monowarstwy...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Cedars-Sinai posiada mniejszościowy pakiet udziałów w Emulate, firmie produkującej mikroprzepływowe chipy narządowe do badania. Członek zarządu Cedars-Sinai zasiada również w zarządzie Emulate. Firma Emulate nie udzieliła żadnego wsparcia finansowego na te badania. Cedars-Sinai i Emulate mają złożone patenty związane z tą pracą.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować dr Soshanie Svendsen za krytyczną edycję. Praca ta była wspierana przez grant Izraelskiej Fundacji Naukowej 1621/18, Ministerstwo Nauki i Technologii (MOST), Izrael 3-15647, grant Kalifornijskiego Instytutu Medycyny Regeneracyjnej ID DISC1-08800, Sherman Family Foundation, grant NIH-NINDS 1UG3NS105703 oraz grant The ALS Association 18-SI-389. AH został sfinansowany przez Fundację Wallenberga (numer grantu 2015.0178).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AccutaseEMD MilliporeSCR005Roztwór dysocjacyjny
B27Gibco12587010
BfgfPeprotech100-18B
Chip-S1Emulate IncChip-S1Organ-Chip
Collagen IVSigmaC5533
DAPIInvitrogenD3571
Dextran-FITCSigma46944
DMEM: F12Thermo Fisher Scientific31330038
Surowica osłaSigmaD9663
Emuluj odczynnik 1 (ER-1)Emuluj IncER-1
Emuluj odczynnik 2 (ER-2)Emuluj IncER-2
FibronektynaSigmaF1141
Glej Fibrylarne Białko Kwasowe (GFAP)DakoZ0334
GLUT-1InvitrogenMA5-11315
GlutamaxLife Technologies35050038Suplement glutaminy
hBDNFPeprotech450-02
KOSRThermo Fisher Scientific10828028
LamininSigmaL2020
MatrigelCorning354234Macierz błony podstawnej
mTeSR1StemCell Technologies, Inc.85851
NEAAPrzemysł biologiczny01-340-1B
NestinMilliporeMAB353
NutriStemPrzemysł biologiczny05-100-1AAlternatywne podłoża
PECAM-1Thermo Fisher Scientific10333
Surowica bydlęca uboga w płytki krwi (PPP)Technologie biomedyczneJ64483AB
Kwas retinowy (RA)SigmaR2625
S100βAbcamab6602
Steriflip-GP Sterylna probówka wirówkowa Górny filtrMilliporeSCGP00525
Triton X-100SigmaX100
ZO-1 Przeciwciało monoklonalneInvitrogen33-9100
β III-tubulina (Tuj1α)SigmaT8660
β-merkaptoetanolLife Technologies31350010

Bibliografia

  1. Pardridge, W. M. Blood-brain barrier endogenous transporters as therapeutic targets: a new model for small molecule CNS drug discovery. Expert Opinion on Therapeutic Targets. 19 (8), 1059-1072 (2015).
  2. Gastfriend, B. D., Palecek, S. P., Shusta, E. V. Modeling the blood-brain barrier: beyond the endothelial cells. Current Opinion in Biomedical Engineering. 5, 6-12 (2018).
  3. Jamieson, J. J., Linville, R. M., Ding, Y. Y., Gerecht, S., Searson, P. C. Role of iPSC-derived pericytes on barrier function of iPSC-derived brain microvascular endothelial cells in 2D and 3D. Fluids and Barriers of the CNS. 16 (1), 15(2019).
  4. El-Habashy, S. E., et al. Novel treatment strategies for brain tumors and metastases. Pharmaceutical Patent Analyst. 3 (3), 279-296 (2014).
  5. Lim, R. G., et al. Huntington's disease iPSC-derived brain microvascular endothelial cells reveal WNT-mediated angiogenic and blood-brain barrier deficits. Cell Reports. 19 (7), 1365-1377 (2017).
  6. Dumitrescu, A. M., Liao, X. H., Weiss, R. E., Millen, K., Refetoff, S. Tissue-specific thyroid hormone deprivation and excess in monocarboxylate transporter (mct) 8-deficient mice. Endocrinology. 147 (9), 4036-4043 (2006).
  7. Spencer, J. I., Bell, J. S., DeLuca, G. C. Vascular pathology in multiple sclerosis: reframing pathogenesis around the blood-brain barrier. Journal of Neurology and Neurosurgical Psychiatry. 89 (1), 42-52 (2018).
  8. Yamazaki, Y., Kanekiyo, T. Blood-brain barrier dysfunction and the pathogenesis of Alzheimer's disease. International Journal of Molecular Sciences. 18 (9), 1965(2017).
  9. Ben-Zvi, A., et al. Mfsd2a is critical for the formation and function of the blood-brain barrier. Nature. 509 (7501), 507(2014).
  10. Heng, M. Y., Detloff, P. J., Albin, R. L. Rodent genetic models of Huntington disease. Neurobiology of Disease. 32 (1), 1-9 (2008).
  11. Ho, R., et al. ALS disrupts spinal motor neuron maturation and aging pathways within gene co-expression networks. Nature Neuroscience. 19 (9), 1256(2016).
  12. Griep, L. M., et al. BBB on chip: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function. Biomedical Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).
  13. Prabhakarpandian, B., et al. Synthetic tumor networks for screening drug delivery systems. Journal of controlled release. 201, 49-55 (2015).
  14. Delsing, L., et al. Barrier properties and transcriptome expression in human iPSC-derived models of the blood-brain barrier. Stem Cells. 36 (12), 1816-1827 (2018).
  15. Park, T. E., et al. Hypoxia-enhanced Blood-Brain Barrier Chip recapitulates human barrier function and shuttling of drugs and antibodies. Nature Communications. 10 (1), 2621(2019).
  16. Vatine, G. D., et al. Human iPSC-Derived Blood-Brain Barrier Chips Enable Disease Modeling and Personalized Medicine Applications. Cell Stem Cell. 24 (6), 995-1005 (2019).
  17. Henry, O. Y. F., Villenave, R., Cronce, M. J., Leineweber, W. D., Benz, M. A., Ingber, D. E. Organs-on-chips with integrated electrodes for trans-epithelial electrical resistance (TEER) measurements of human epithelial barrier function. Lab on a Chip. 17 (13), 2264-2271 (2017).
  18. Sances, S., et al. Human iPSC-derived endothelial cells and microengineered organ chip enhance neuronal development. Stem Cell Reports. 10 (4), 1222-1236 (2018).
  19. Workman, M. J., et al. Enhanced utilization of induced pluripotent stem cell–derived human intestinal organoids using microengineered chips. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 669-677 (2018).
  20. Ebert, A. D., et al. EZ spheres: a stable and expandable culture system for the generation of pre-rosette multipotent stem cells from human ESCs and iPSCs. Stem Cell Research. 10 (3), 417-427 (2013).
  21. Shelley, B. C., Gowing, G., Svendsen, C. N. A cGMP-applicable expansion method for aggregates of human neural stem and progenitor cells derived from pluripotent stem cells or fetal brain tissue. Journal of Visualized Experiments. (88), e51219(2014).
  22. Vatine, G. D., et al. Modeling psychomotor retardation using iPSCs from MCT8-deficient patients indicates a prominent role for the blood-brain barrier. Cell Stem Cell. 20 (6), 831-843 (2017).
  23. Svendsen, C. N., et al. A new method for the rapid and long term growth of human neural precursor cells. Journal of Neuroscience Methods. 85 (2), 141-152 (1998).
  24. Lippmann, E. S., Al-Ahmad, A., Azarin, S. M., Palecek, S. P., Shusta, E. V. A retinoic acid-enhanced, multicellular human blood-brain barrier model derived from stem cell sources. Scientific Reports. 4, 4160(2014).
  25. Canfield, S. G., et al. An isogenic blood-brain barrier model comprising brain endothelial cells, astrocytes, and neurons derived from human induced pluripotent stem cells. Journal of Neurochemistry. 140 (6), 874-888 (2017).
  26. Jamieson, J. J., Gerecht, S. Chipping Away at Blood-Brain-Barrier Modeling. Cell stem cell. 24 (6), 831-832 (2019).
  27. Faal, T., et al. Induction of Mesoderm and Neural Crest-Derived Pericytes from Human Pluripotent Stem Cells to Study Blood-Brain Barrier Interactions. Stem Cell Reports. 12 (3), 451-460 (2019).
  28. Lippmann, E. S., et al. Derivation of blood-brain barrier endothelial cells from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 30 (8), 783(2012).
  29. Qian, T., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells. Science Advances. 3 (11), 1701679(2017).
  30. Neal, E. H., et al. A Simplified, Fully Defined Differentiation Scheme for Producing Blood-Brain Barrier Endothelial Cells from Human iPSCs. Stem Cell Reports. 12 (6), 1380-1388 (2019).
  31. Wevers, N. R., et al. A perfused human blood-brain barrier on-a-chip for high-throughput assessment of barrier function and antibody transport. Fluids and Barriers of the CNS. 15 (1), 23(2018).
  32. Huh, D., et al. Microfabrication of human organs-on-chips. Nature Protocols. 8 (11), 2135(2013).
  33. Huh, D., Matthews, B. D., Mammoto, A., Montoya-Zavala, M., Hsin, H. Y., Ingber, D. E. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

komórki śródbłonka pochodzące z iPSCtechnologia organ-on-chipkomórki progenitorowe neuronówtest przepuszczalności parakomórkowejanaliza immunocytochemicznaróżnicowanie ludzkich iPSCmikrofluidyczna hodowla komórekbadanie przepuszczalności lekówmodele chorób neurologicznych
Generacja ludzkiego chipa bariery krew-mózg opartego na iPSC
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.