Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wielofotonowa obserwacja mikroskopowa naczyń w tkance wątroby myszy

3.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60932

⸱

17 maja 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biopharmaceutics, School of Laboratory Medicine and Biotechnology, Southern Medical University, 2Department of General Surgery, Nanfang Hospital, Southern Medical University, 3Department of Stomatology, Nanfang Hospital, Southern Medical University, 4College of Stomatology, Southern Medical University, 5School of Laboratory Medicine and Biotechnology, Southern Medical University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

W tym eksperymencie, myszowi wstrzykuje się do żyły ogonowej izotiocyjanian rodaminy B, który może zabarwiać naczynia krwionośne. Po odsłonięciu i utrwaleniu wątroby można wybrać określoną część wątroby do obserwacji głębokiej tkanki w żywym ciele za pomocą mikroskopii wielofotonowej.

Streszczenie

Obserwacja wewnątrznaczyniowej dynamiki tkanki wątroby myszy pozwala nam na prowadzenie dalszych dogłębnych obserwacji i badań nad chorobami tkankowymi wątroby myszy. Myszowi wstrzykuje się barwnik, który może zabarwić naczynia krwionośne. Aby obserwować wątrobę myszy in vivo, jest ona naświetlana i mocowana w ramce. Dwu- i trójwymiarowe obrazy naczyń krwionośnych w tkance wątroby uzyskuje się za pomocą mikroskopu wielofotonowego. Obrazy tkanek w wybranych miejscach są rejestrowane w sposób ciągły w celu obserwacji długotrwałych zmian; Obserwuje się również dynamiczne zmiany naczyń krwionośnych w tkankach wątroby. Mikroskopia wielofotonowa to metoda obserwacji funkcji komórek i komórek w głębokich skrawkach tkanek lub narządach. Mikroskopia wielofotonowa ma czułość na mikrostrukturę tkanek i umożliwia obrazowanie tkanek biologicznych w wysokiej rozdzielczości przestrzennej in vivo, zapewniając możliwość uchwycenia informacji biochemicznych organizacji. Mikroskopia wielofotonowa służy do obserwacji części wątroby, ale utrwalenie wątroby w celu ustabilizowania obrazu jest problematyczne. W tym eksperymencie specjalna przyssawka próżniowa służy do unieruchomienia wątroby i uzyskania bardziej stabilnego obrazu wątroby pod mikroskopem. Ponadto metoda ta może być stosowana do obserwacji dynamicznych zmian określonych substancji w wątrobie poprzez oznaczanie takich substancji barwnikami.

Wprowadzenie

Naczynia krwionośne mogą dostarczać składników odżywczych dla różnych tkanek narządowych ludzkiego ciała i wymieniać substancje. W tym samym czasie wiele cytokin, hormonów, leków i komórek działa również poprzez transport naczyniowy do określonych lokalizacji. Obserwacja zmian naczyniowych w tkance wątroby może pomóc w zrozumieniu rozkładu przepływu krwi w tkance wątroby i transportu substancji, a także pomóc w analizie niektórych chorób związanych z naczyniami krwionośnymi1,2.

Istnieje wiele sposobów na obserwację naczyń krwionośnych wątroby u myszy. Wśród nich mikroskopia optyczna ma wiele ograniczeń w obserwacji nieprzezroczystej tkanki naczyniowej3. Mikroskopia wielofotonowa może być używana do obrazowania naczyń krwionośnych żywych wątrob za pomocą nieinwazyjnej wysokiej rozdzielczości4. Nie tylko można uzyskać trójwymiarowe obrazy naczyń krwionośnych, ale technika ta może być również wykorzystana do pomocy w organizacji tkanki w celu obserwacji zachodzących w niej efektów biologicznych; Co więcej, można obrazować całą tkankę, a nie tylko mikronaczynia, jak w tomografii komputerowej i rezonansie magnetycznym5.

Mikroskopia wielofotonowa może być używana do skutecznego wykrywania rozproszonych sygnałów fluorescencyjnych w głęboko żyjących tkankach, przy mniejszej fototoksyczności6. Dzięki temu można zapewnić aktywność żywej tkanki i zmniejszyć ilość uszkodzeń. Mikroskopia wielofotonowa ma lepszą zdolność penetracji niż mikroskopia konfokalna, umożliwiając obserwację głębszych warstw7, zapewniając unikalne obrazowanie 3D. Mikroskopia wielofotonowa jest obecnie często stosowana w obrazowaniu nerwów czaszkowych8 i została rozszerzona o badanie dynamiki neuronów u żywych myszy9,10,11.

W tym eksperymencie, po fluorescencyjnym oznakowaniu naczyń krwionośnych myszy, wątroba jest unieruchomiona w ramce, a dynamikę naczyń krwionośnych w żywej tkance wątroby można zobaczyć za pomocą mikroskopii wielofotonowej. Ten eksperyment pokazuje, jak oznaczać określone substancje, używać mikroskopii wielofotonowej do obserwacji lokalizacji w tkance, obserwować zdarzenia komórkowe w tkance międzykomórkowej, dokonywać pomiarów fotochemicznych12,13,14 i obserwować dynamikę materiału wewnątrz żywej tkanki15. Na przykład marker śródbłonka nowotworu 1 (TEM1) został zidentyfikowany jako nowy marker powierzchniowy regulowany w górę na naczyniach krwionośnych i zrębie w wielu guzach litych, oznaczający jednołańcuchowy zmienny fragment (scFv) 78 przeciwko TEM1, a następnie mikroskopia wielofotonowa może być wykorzystana do lokalizacji naczyniaka krwionośnego myszy i oceny guzów16.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące opieki nad zwierzętami były zgodne z polityką chińskiego szpitala Nanfang dotyczącą zdrowia i dobrego samopoczucia (nr wniosku: NFYY-2019-73).

1. Przygotowanie myszy

  1. Znieczulij mysz.
    1. Przygotować pentobarbital sodu (50 mg/kg) w strzykawce.
    2. Chwyć mysz (8-tygodniowego samca C57BL/6) lewą ręką tak, aby jej brzuch był skierowany do góry, a głowa niżej niż ogon. Zdezynfekuj skórę brzucha 75% alkoholem.
    3. Trzymając strzykawkę w prawej ręce, przekłuć igłą białą linię brzucha lekko w prawą stronę skóry na 3-5 mm. Upewnij się, że igła strzykawki i skóra są ustawione pod kątem 45°, powoli wstrzyknij pentobarbital do jamy brzusznej. Po goleniu dezynfekuje okolice miejsca nacięcia myszy 3 razy na przemian 75% roztworem alkoholu i chlorheksydyny.
    4. Sprawdź, czy znieczulenie powiodło się przez brak odruchu prostującego.
  2. Wstrzyknąć izotiocyjanian rodaminy B-dekstran do żyły ogonowej.
    1. Przygotować 100 μl 10 mg/ml izotiocyjanianu rodaminy B i dekstranu w strzykawce.
    2. Przetrzyj ogon myszy 75% alkoholem.
    3. Przytrzymaj ogon lewą ręką, trzymaj strzykawkę w prawej ręce z igłą równolegle do żyły i wstrzyknij 100 μl barwnika.
    4. Po wstrzyknięciu należy zatamować krwawienie bawełnianym wacikiem.
  3. Namocz sierść na brzuchu myszy gazą zwilżoną sterylną wodą i ogol brzuch myszy za pomocą brzytwy, wykonując ruchy w kierunku futra. Po goleniu dezynfekuje okolice miejsca nacięcia myszy 3 razy na przemian 75% roztworem alkoholu i chlorheksydyny.
  4. Po przetarciu poduszki grzewczej 75% alkoholem otwórz poduszkę grzewczą i umieść mysz na plecach w poduszce grzewczej, aby utrzymać temperaturę ciała na poziomie 37 °C.

2. Mocowanie wątroby myszy za pomocą ramki do obrazowania narządów ciała

UWAGA: Ramka do obrazowania narządów komercyjnych nie została jeszcze wydana.

  1. Umieść czystą przyssawkę w ustalonej pozycji.
  2. Zainstaluj urządzenie do obrazowania narządów (rysunek uzupełniający 1) i przetrzyj poduszkę grzewczą i przyssawkę 75% alkoholem.
  3. Podłącz przyssawkę (o średnicy 5 mm) do węża pompy próżniowej i włącz pompę próżniową.
  4. Na sterylnym stole wysterylizowanym 75% alkoholem dezynfekuje okolice miejsca nacięcia myszy 3 razy na przemian 75% roztworem alkoholu i chlorheksydyny, następnie dezynfekuje okolice miejsca nacięcia myszy 3 razy na przemian 75% roztworem alkoholu i chlorheksydyny, a następnie nożyczkami chirurgicznymi odcina 2 cm skóry od dolnej granicy mostka myszy i odsłania wątrobę.
  5. Umieść mysz razem z poduszką grzewczą na podstawie uchwytu.
  6. Wyreguluj uchwyt do obrazowania narządów tak, aby przyssawka przytrzymywała wątrobę. Następnie użyj podciśnienia 30-35 kPa do ssania, tak aby wątroba przyczepiła się do przyssawki (rysunek uzupełniający 2).

3. Regulacja wielofotonowego laserowego mikroskopu skaningowego

  1. Włącz mikroskop wielofotonowy i wybierz obiektyw 60x/1,00 W.
  2. Zamocuj ramkę i mysz pod soczewką obiektywu.
  3. Dodaj kroplę zwykłej soli fizjologicznej, która może pokryć całą soczewkę, która jest środkiem przyssawki, i wyreguluj soczewkę obiektywu tak, aby dotykała tylko normalnej soli fizjologicznej.
  4. Kliknij dwukrotnie ikonę komputera, aby włączyć oprogramowanie lasera i włączyć przełącznik. Następnie naciśnij i przytrzymaj przycisk zasilania i migawkę przez 3 sekundy.
  5. Ustaw długość fali na 800 nm.
  6. Uruchom oprogramowanie operacyjne mikroskopu za pomocą komputera.
  7. W polu Acquisition Setting (Ustawienie akwizycji) ustaw Laser 800 (Laser 800).

4. Obserwacja za pomocą wielofotonowego laserowego mikroskopu skaningowego

  1. W obszarze Image Acquisition Control (Kontrola pozyskiwania obrazów) kliknij przełącznik Fluorescent (Fluorescencyjny).
  2. Upewnij się, że oświetlenie w pomieszczeniu i sprzęcie jest wyłączone. Aby zmniejszyć poziom hałasu, używaj mikroskopu w zaciemnionym otoczeniu.
  3. Otwórz przesłonę ścieżki światła w mikroskopie.
  4. Obróć filtr fluorescencyjny na czwarty bieg i pociągnij dwie dźwignie przełącznika optycznego.
  5. Patrząc przez okular, użyj quasispirali zgrubnej i precyzyjnej ostrości, aby wyregulować ogniskową, a osi X/Y użyj opcji Dostosuj pole widzenia, aby znaleźć obszar docelowy.

5. Wielofotonowa mikrografia skaningowa laserowa

  1. Wyłącz przełącznik fluorescencyjny w oprogramowaniu, przełącz filtr fluorescencyjny na drugi bieg (drugi bieg to RXD1) i naciśnij dwie dźwignie przełącznika optycznego.
  2. Kliknij Focus ×2, aby wyświetlić podgląd obszaru docelowego i dostosować ustawienia akwizycji oraz parametry kontroli akwizycji obrazu (rozdzielczość obrazu: 1024).
  3. Naciśnij Control + C i dostosuj wysokie napięcie, wzmocnienie i przesunięcie (aby zmniejszyć poziom szumów).
  4. Kliknij Zatrzymaj, aby zatrzymać podgląd, kliknij przycisk XY, aby zeskanować w dwóch wymiarach, i zapisz po zakończeniu (Rysunek 1).
  5. Wybierz region, kliknij Głębokość, a następnie Podgląd, aby wybrać zestaw końcowy i zestaw początkowy (patrz pełna wymagana część naczynia krwionośnego) w ustawieniach Mikroskop. Skanuj obrazy 3D i zapisz je po zakończeniu (Rysunek 2).
  6. Wybierz region, kliknij Czas i dostosuj inne ustawienia akwizycji oraz parametry kontroli akwizycji obrazu (Rozmiar kroku: 1 μm; Plastry: 10; Numer skanowania czasowego: 40). Skanuj różne plasterki i zapisz je po zakończeniu, aby uzyskać ruchome obrazy (Wideo 1).
    UWAGA: Poproś kogoś, aby zaopiekował się myszami podczas skanowania i odpowiednio dodał znieczulenie.
  7. Poświęć mysz przez sekcję szyi.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rozkład naczyń krwionośnych w wątrobie można zobaczyć na Rysunku 1, obrazowanym za pomocą mikroskopii wielofotonowej. Naczynie krwionośne dzieli się na szereg odgałęzień wychodzących z pnia i rozprzestrzeniających się w otaczającej przestrzeni. Zewnętrzny obrys naczynia krwionośnego jest czerwony, wewnętrzna jama ciemna, a w jej wnętrzu znajduje się wiele elementów. Im wyraźniejszy jest obraz, tym bliżej płaszczyzny obserwacji on się znajduje. Wokół widoczne są również czerwone plamki, co pr...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Obserwacja określonej żywej tkanki jest skutecznym sposobem zrozumienia zmian, lokalizacji i skutków biologicznych materiału wewnątrz tkanki17. W tym eksperymencie ważnymi krokami są naprawienie wątroby za pomocą urządzenia do obrazowania narządów, które może rozwiązać problem artefaktów ruchowych spowodowanych oddychaniem i biciem serca, oraz użycie mikroskopu wielofotonowego do obserwacji. Za pomocą tej metody wewnętrzne tkanki wątroby in vivo są obserwowane za pomocą mikroskopu wielofotonowego,...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (81772133, 81902444), Fundusz Nauk Przyrodniczych Guangdong (2020A1515010269, 2020A1515011367), Projekt Badawczy Nauki i Technologii Zdrowia Obywatelskiego w Kantonie (201803010034, 201903010072) oraz Projekt Wojskowych Innowacji Medycznych (17CXZ008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Strzykawka 1 ml x 2Hunan Pinan Technologia urządzeń medycznychYA0551
Poduszka grzewcza 5 WBiolinkOptics TechnologyBL336
75% absolutny etanolGuangdong Guanghua Sci-Tech1.17113.023
Chłonny wacikZdrowe warunki sanitarne Królestwo
Instrument chirurgiczny myszyRWD NaukiprzyrodniczeSP0001-GW tym nożyczki i pęseta Mikroskopia
wielofotonowaOlympusFV1200MPE
Oprawa do obrazowania narządówTechnologia BiolinkOpticsBL336W zestawie przyssawka, wąż, pompa podciśnieniowa i wspornik
Izotiocyjanian rodaminy B– Maszynka do golenia DextranSigmaR9379
Lei WaRE-3201
Pentobarbital soduSigmaP3761-25G

Bibliografia

  1. Wu, Z., et al. Multi-photon microscopy in cardiovascular research. Methods. 130, 79-89 (2017).
  2. Zhou, M., Ling, W., Luo, Y. Intrahepatic mass-forming cholangiocarcinoma growing in a giant hepatic hemangioma: A case report. Medicine (Baltimore). 98 (27), 16410(2019).
  3. Werkmeister, E., et al. Multiphoton microscopy for blood vessel imaging: new non-invasive tools (Spectral SHG, FLIM). Clinical Hemorheology and Microcirculation. 37 (1-2), 77(2007).
  4. Wang, H., et al. Does optical microangiography provide accurate imaging of capillary vessels?: validation using multiphoton microscopy. Journal of Biomedical Optics. 19 (10), 1-5 (2014).
  5. Upputuri, P. K., Sivasubramanian, K., Mark, C. S., Pramanik, M. Recent developments in vascular imaging techniques in tissue engineering and regenerative medicine. Biomed Research International. 2015, 783983(2015).
  6. Ustione, A., Piston, D. W. A simple introduction to multiphoton microscopy. Journal of Microscopy. 243 (3), 221-226 (2011).
  7. Centonze, V. E., White, J. G. Multiphoton excitation provides optical sections from deeper within scattering specimens than confocal imaging. Biophys Journal. 75 (4), 2015-2024 (1998).
  8. Vogt, N. Chromatic multiphoton imaging of the whole brain. Nature Methods. 16 (6), 459(2019).
  9. Bacskai, B. J., et al. Imaging of amyloid-β deposits in brains of living mice permits direct observation of clearance of plaques with immunotherapy. Nature Medicine. 7 (3), 369-372 (2001).
  10. Lendvai, B., Stern, E. A., Chen, B., Svoboda, K. Experience-dependent plasticity of dendritic spines in the developing rat barrel cortex in vivo. Nature. 404 (6780), 876-881 (2000).
  11. Svoboda, K., Denk, W., Kleinfeld, D., Tank, D. W. In vivo dendritic calcium dynamics in neocortical pyramidal neurons. Nature. 385 (6612), 161-165 (1997).
  12. Liu, H., et al. In vivo Deep-Brain Structural and Hemodynamic Multiphoton Microscopy Enabled by Quantum Dots. Nano Letters. , (2019).
  13. Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. Intravital multiphoton microscopy as a tool for studying renal physiology and pathophysiology. Methods. 128, 20-32 (2017).
  14. Shear, J. B. Peer Reviewed: Multiphoton-Excited Fluorescence in Bioanalytical Chemistry. Analytical Chemistry. 71 (17), 598-605 (1999).
  15. Heymann, F., et al. Long term intravital multiphoton microscopy imaging of immune cells in healthy and diseased liver using CXCR6.Gfp reporter mice. Journal of Visualized Experiments. (97), (2015).
  16. Yuan, X., et al. Characterization of the first fully human anti-TEM1 scFv in models of solid tumor imaging and immunotoxin-based therapy. Cancer Immunology & Immunotherapy. 66 (3), 367-378 (2017).
  17. Williams, R. M., Zipfel, W. R., Webb, W. W. Multiphoton microscopy in biological research. Current Opinion in Chemical Biology. 5 (5), 603-608 (2001).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Mikroskopia wielofotonowaobrazowanie naczyń krwionośnychwstrzykiwanie barwnika naczyniowegounieruchomienie za pomocą ssania próżniowegoobrazowanie trójwymiaroweskaningowy mikroskop laserowyizotiocyjanian rodaminy Bramka do obrazowania organówdynamiczna obserwacja naczyń
Wielofotonowa obserwacja mikroskopowa naczyń w tkance wątroby myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.