Artykuł metodologiczny

Obrazowanie żywych komórek cytoszkieletu mikrotubul i manipulacja mikromechaniczna merystemu wierzchołkowego rzodkiewnika

4.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60936

⸱

23 maja 2020

 , 
1Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy protokół obrazowania żywych komórek cytoszkieletu mikrotubul korowych na merystemie wierzchołkowym pędu i monitorowania jego reakcji na zmiany sił fizycznych.

Streszczenie

Zrozumienie regulacji wzrostu i morfogenezy na poziomie komórek i tkanek było głównym tematem badań biologicznych przez wiele dziesięcioleci. Postępy w technologiach molekularnych i obrazowania pozwoliły nam uzyskać wgląd w to, w jaki sposób sygnały biochemiczne wpływają na zdarzenia morfogenetyczne. Jednak coraz bardziej oczywiste jest, że oprócz sygnałów biochemicznych, sygnały mechaniczne wpływają również na kilka aspektów wzrostu komórek i tkanek. Merystem wierzchołkowy rzodkiewnika (SAM) to struktura w kształcie kopuły odpowiedzialna za wytwarzanie wszystkich narządów nadziemnych. Organizacja cytoszkieletu mikrotubul korowych, który pośredniczy w odkładaniu się celulozy apoplastycznej w komórkach roślinnych, jest przestrzennie odrębna. Wizualizacja i ilościowa ocena wzorców mikrotubul korowych są niezbędne do zrozumienia biofizycznej natury komórek w SAM, ponieważ celuloza jest najsztywniejszym elementem ściany komórkowej rośliny. Stereotypowa forma organizacji mikrotubul korowych jest również konsekwencją sił fizycznych obejmujących całą tkankę występujących w SAM. Perturbacja tych sił fizycznych i późniejsze monitorowanie organizacji mikrotubul korowych pozwala na identyfikację białek kandydujących zaangażowanych w pośredniczenie w mechanopercepcji i transdukcji. W tym miejscu opisujemy protokół, który pomaga badać takie procesy.

Wprowadzenie

Komórki roślinne są otoczone zewnątrzkomórkową matrycą polisacharydów i glikoprotein, która mechanicznie przypomina materiał kompozytowy wzmocniony włóknami, zdolny do dynamicznej zmiany swoich właściwości mechanicznych1. Wzrost w komórkach roślinnych jest napędzany przez pobieranie wody do komórki, co powoduje jednoczesne narastanie sił rozciągających na ścianę komórkową. W odpowiedzi na takie siły modyfikacje stanu fizycznego ściany komórkowej pozwalają na ekspansję komórki. Komórki ze ścianami pierwotnymi są zdolne do szybkiego wzrostu w porównaniu z wtórną ścianą komórkową zawierającą komórki, głównie ze względu na różnice w składzie chemicznym zawartych w nich polisacharydów. Pierwotne komórki ściany składają się z celulozy, hemicelulozy i pektyny oprócz glikoprotein i nie mają ligniny, składnika obecnego w wtórnej ścianie komórkowej2. Celuloza, polimer glukozy połączony wiązaniami β-1,4, jest głównym składnikiem ścian komórkowych. Jest zorganizowany w struktury fibrylarne, które są w stanie wytrzymać duże siły rozciągające występujące podczas wzrostu komórek3. Oprócz wytrzymywania sił rozciągających, zbrojenie mechaniczne w kierunku preferencyjnym powoduje rozszerzanie się turgoru wzdłuż osi prostopadłej do orientacji netto mikrofibryla celulozowego. Na organizację mikrowłókien celulozy ma wpływ cytoszkielet mikrotubul korowych, ponieważ kierują one ruchem kierunkowym kompleksów syntetyzujących celulozę znajdujących się na błonie komórkowej4. Dlatego monitorowanie organizacji mikrotubul korowych za pomocą białka związanego z mikrotubulami lub tubuliny połączonej z cząsteczką fluorescencyjną służy jako wskaźnik zastępczy do obserwacji nakładających się wzorów celulozy w komórkach roślinnych.

Wzór cytoszkieletu mikrotubul korowych jest pod kontrolą sił mechanicznych pochodzących z morfologii komórek i tkanek. Organizacja mikrotubul korowych nie ma żadnej preferencyjnej organizacji w czasie w komórkach znajdujących się na wierzchołku SAM, podczas gdy komórki na obrzeżach i granicy między SAM a wyłaniającym się narządem mają stabilny, wysoce zorganizowany nadkomórkowy układ mikrotubul korowych5. Opracowano kilka podejść mających na celu fizyczne zakłócenie stanu mechanicznego komórek. Zmiany stanu osmotycznego, a także leczenie związkami farmakologicznymi i enzymatycznymi, które wpływają na sztywność ściany komórkowej, mogą powodować późniejsze zmiany sił rozciągających doświadczanych przez komórkę6,7. Inną alternatywą jest zastosowanie urządzeń, które pozwalają na stopniowy wzrost sił ściskających odczuwanych przez tkanki8. Wykazano również, że zastosowanie sił odśrodkowych wpływa na siły mechaniczne bez fizycznego kontaktu z komórkami9. Jednak najpowszechniej stosowany sposób zmiany sił kierunkowych w grupie komórek wykorzystuje fakt, że wszystkie komórki naskórka są pod napięciem, a fizyczna ablacja komórek wyeliminuje lokalnie ciśnienie turgoru, a także zakłóci adhezję między komórkami, modyfikując w ten sposób siły rozciągające doświadczane przez sąsiednie komórki. Odbywa się to albo poprzez celowanie w impulsowy laser ultrafioletowy o dużej mocy, albo za pomocą cienkiej igły.

Tutaj omawiamy proces obrazowania i oceny zachowania mikrotubul korowych pod kątem zakłóceń mechanicznych w SAM.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Wzrost roślin

  1. Nasiona rzodkiewnika siej eksprymujące domenę wiążącą mikrotubule połączone z białkiem zielonej fluorescencji (MBD-GFP)10 na glebie i trzymaj w długim dniu (16 godzin dziennie / 8 godzin w nocy), w temperaturze 20 °C/6 °C przez 1 tydzień do kiełkowania.
  2. Po wykiełkowaniu przenieś sadzonki do nowych doniczek z wystarczającą przestrzenią do wzrostu, aby umożliwić silny wzrost wegetatywny. Rośliny należy przechowywać w krótkich warunkach dziennych (8 godzin w dzień / 16 godzin w nocy), w temperaturze 20 °C/16 °C przez 3-5 tygodni.
  3. Przenieś rośliny do długiego dnia (16 godzin w dzień / 8 godzin w nocy), w temperaturze 20 °C/16 °C i trzymaj, aż rośliny się wykiełkują (2-3 tygodnie). Pozwól kwiatostanowi urosnąć do 2-5 cm długości.

2. Przygotowanie podłoża

  1. Przygotuj naczynia do preparacji, wypełniając małe szalki Petriego (około 5,5 cm szerokości, 1,5 cm głębokości) do około połowy ich głębokości 2% agarozy. Naczynia preparacyjne mogą być również używane do obrazowania pojedynczych punktów czasowych.
  2. Przygotuj pożywkę wzrostową.
    1. Przygotuj 50 ml 1000-krotnego roztworu podstawowego witaminy z 5 g mio-inozytolu, 0,05 g kwasu nikotynowego, 0,05 g chlorowodorku pirydoksyny, 0,5 g chlorowodorku tiaminy i 0,1 g glicyny.
    2. Przygotuj pożywkę wzrostową, składającą się z 1/2 pożywki Murashige i Skoog, 1% sacharozy, 1,6% agaru, 1x witaminy, pH = 5,8. Autoklaw i pozwól mu ostygnąć.
    3. Na sterylnej, czystej ławce wysterylizuj plastikowe pudełka na zawiasach (około 5,2 cm x 5,2 cm x 3 cm), zanurzając je w 70% etanolu na 15 minut.
    4. Na sterylnej, czystej ławce, gdy podłoże osiągnie znośne ciepło, dodaj N6-benzyladeninę do końcowego stężenia 200 nM i 1/1000 PPM (mieszanina roślinnych środków konserwujących) i dobrze wymieszaj. Napełnij sterylne pudełka pożywką do około połowy ich głębokości.

3. Sekcja SAM

  1. Odetnij kwiatostan i usuń starsze pąki kwiatowe ostrymi kleszczami, obierając kwiaty u podstawy szypułek, aż trudno będzie je zobaczyć gołym okiem.
  2. Za pomocą kleszczy wykonaj szczelinę w agarozie w naczyniu preparacyjnym i posadź podstawę kwiatostanu w grubym agarze. Daje to dobre, solidne wsparcie dla dalszego drobnego rozbioru młodszych kwiatów w celu odsłonięcia SAM.
  3. Usuń pozostałe pąki kwiatowe, dociskając je kleszczami, zaczynając od najstarszych i kolejno przechodząc do młodszych etapów pod mikroskopem preparacyjnym, aż SAM będzie widoczny. SAM jest zwykle odsłaniany, gdy usuwane są starsze kwiaty do stadium 6 do 7. Po odsłonięciu SAM należy uniknąć odwodnienia próbki, szybko przechodząc do następnego kroku.

4. Transfer i wzrost hodowlanych SAM

  1. Umieść świeżo wypreparowaną próbkę, jak opisano w sekcji 1, w pożywce wzrostowej w prostokątnym plastikowym pudełku hodowlanym na zawiasach, z SAM odsłoniętym nad powierzchnią pożywki. Dodaj kilka kropli sterylnej wody dejonizowanej do krawędzi pudełek hodowlanych i zamknij pokrywę, aby utrzymać wilgotność wewnątrz pudełka. Upewnij się, że dodana woda nie zakrywa SAM.
  2. Zamknij pokrywę i owiń pudełko taśmą z mikroporami. Umieścić pojemnik wzrostowy w warunkach długiego dnia lub ciągłego dnia w temperaturze 22 °C i rosnąć przez 12–24 godziny, aby umożliwić SAM regenerację po procedurze preparacji i dostosowanie się do warunków hodowli.

5. Obrazowanie SAM

  1. Napełnij pudełko hodowlane zawierające SAM sterylną wodą dejonizowaną, aby przykryć próbkę. Sprawdź pod mikroskopem preparacyjnym i usuń wszelkie pęcherzyki powietrza, mocno rozpylając wodę skierowaną na próbkę za pomocą pipety o pojemności 1 ml.
  2. Umieść pudełko hodowlane na pionowym stoliku mikroskopu konfokalnego. Uważaj, aby pudełko hodowlane nie stykało się z obiektywami mikroskopu. Użyj długodystansowej soczewki do zanurzania w wodzie 40x lub 60x o aperturze numerycznej 0,8-1, która jest optymalna do obrazowania bez szkła nakrkowego.
  3. Opuść obiektyw do wody i sprawdź, czy na przedniej soczewce obiektywu nie utworzyły się pęcherzyki powietrza. Usuń wszelkie pęcherzyki, obniżając stolik i delikatnie przecierając soczewkę chusteczką optyczną i dodając niewielką ilość wody do przedniej soczewki obiektywu za pomocą pipety Pasteura przed ponownym zanurzeniem w wodzie.
  4. Korzystając z filtra GFP i modułu epi-illumination mikroskopu konfokalnego, wyreguluj kontroler XY, aby zlokalizować próbkę. Regulując położenie okularów, umieść SAM bezpośrednio pod źródłem światła i ustaw ostrość wzdłuż osi Z, aż wierzchołek znajdzie się w miejscu.
    UWAGA: Nie patrz bezpośrednio na światło ultrafioletowe.
  5. Po znalezieniu próbki należy ją oświetlić za pomocą lasera zdolnego do wzbudzania GFP (tj. źródła laserowego o długości fali 488 nm lub 496 nm). Dostosuj zoom optyczny mikroskopu tak, aby cały SAM i zawiązki kwiatowe etapu 1 znajdowały się w polu view. Dalej dostosuj moc wyjścia lasera i ustawienia wzmocnienia, aby zapewnić optymalny stosunek sygnału do szumu.
    UWAGA: Wysoka intensywność lasera spowoduje fotowybielanie próbki. Paleta niedoświetlenia i prześwietlenia pomaga zapewnić lepszą regulację tych ustawień.
  6. Pozwól próbce osiąść na 2-5 minut. Uzyskaj konfokalne stosy Z próbki w odstępach 0,25 μm-0,5 μm Z w rozdzielczości około 0,3 μm o rozmiarze piksela. Upewnij się, że całkowity czas obrazowania wymagany do pobrania stosów Z dla jednej próbki nie przekracza 10 minut od momentu zanurzenia próbki w wodzie do zakończenia akwizycji.
  7. Natychmiast usuń wodę i przenieś pudełko hodowlane z powrotem do komory wzrostowej. Trzymanie próbek przez długi czas pod wodą wpłynie na stan osmotyczny komórek.

6. Mikromechaniczne zakłócenia SAM

  1. Skonfiguruj warunki obrazowania zgodnie z opisem w punkcie 5 i uzyskaj stosy obrazów preablacji organizacji mikrotubul korowych.
  2. Zdekantować wodę w naczyniu do hodowli. Wykonać ablację za pomocą czystej igły strzykawkowej (0,4 mm x 20 mm).
    1. Używając mikroskopu preparacyjnego, ostrożnie przytrzymaj igłę i powoli zbliż się do SAM.
      UWAGA: Wstrzymywanie oddechu i posługiwanie się igłą z luźnym uchwytem pomaga uniknąć potrząsania.
    2. Krótko zetknij się z kopułą SAM z końcówką igły, aby potwierdzić, że ablacja została wykonana. Najlepiej wykonać ablację na obrzeżach SAM, co pozwala na wizualizację zachowania i przejścia niezorganizowanych mikrotubul korowych w centralnej części kopuły.
  3. Napełnij naczynie hodowlane sterylną wodą dejonizowaną i dodaj idodek propidyny (10 μg/ml). Oprócz monitorowania sygnału mikrotubul korowych GFP, wizualizacja jodku propidyny za pomocą oddzielnego kanału może wyraźnie oznaczyć obszary komórek poddanych ablacji. Jodek propidyny jest oświetlany za pomocą lasera o długości fali 561 nm lub innego odpowiedniego lasera o emisji rejestrowanej w zakresie 600-650 nm.
  4. Natychmiast po ablacji należy pobrać stosy obrazów (patrz punkt 6) i powtarzać proces akwizycji co 2 godziny przez okres 6 godzin. Po każdym punkcie czasowym należy zwrócić szalkę hodowlaną wraz z próbką do komory inkubacyjnej. Upewnij się, że na pożywce hodowlanej pozostało trochę wody i owiń naczynie hodowlane taśmą z mikroporami, aby zapobiec wysuszeniu.

7. Wizualizacja danych i kwantyfikacja

  1. Generuj rzuty powierzchni za pomocą ogólnodostępnego oprogramowania, takiego jak MORPHOGRAPHX11, FIJI12 lub makro SurfCut13.
  2. Wykonaj ekstrakcję anizotropii mikrotubul korowych za pomocą makro FibrilTool14 w FIJI.
    UWAGA: Szczegółowe protokoły korzystania z oprogramowania można uzyskać z odpowiednich cytatów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rysunek 1 przedstawia typowe obrazy projekcyjne uzyskane z linii MBD-GFP, w których komórki w centrum kopułki wykazują zdezorganizowane mikrotubule korowe, a komórki na obrzeżach wykazują rozkład obwodowy (Rysunek 1A,B), podczas gdy komórki domeny granicznej zawierają mikrotubule korowe ułożone równolegle do długiej osi komórki. Obserwacje te wykazują różnice w przestrzennym rozkładzie mikrotubul korowych w różny...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Ocena zdarzeń mechanicznej transdukcji sygnału ma kluczowe znaczenie dla identyfikacji regulatorów molekularnych zaangażowanych w szlaki mechano-percepcji i transdukcji. Opisany tutaj protokół zapewnia ilościowy wgląd w takie zdarzenia poprzez wykorzystanie odpowiedzi mikrotubul korowych jako odczytu dla takiego procesu w SAM Arabidopsis. Opisana tutaj procedura jest rutynowo stosowana w kilku badaniach na różnych typach tkanek 16,17,18,19.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
FibrilToolBoudaoud, A. et al., Nat Protoc. 2014
FIJISchindelin, J. et al., Nat Methods. 2012
glicynaMerck1.04201.1000
Leica SP8 mikroskop konfokalnyLeicaDM6000 CS
MAP4-GFPMarc, J. et al., Plant Cell 1998
taśma mikroporowaLeukopor02482-00
MorphographXStrauss, S. et al., Metody Mol Biol. 2019
mio-inozytolSigmaI5125
N6-benzyladeninaSigmaB3408
kwas nikotynowySigmaN4126
plastikowe pudełko na zawiasachNauki o mikroskopii elektronowej64312
PPM (Roślinna mieszanina konserwująca)Technologia komórek roślinnychPPM
Jodek propidynySigmaP4864
chlorowodorek pirydoksynySigmaP9755
SURFCUTErguvan, O. et al., BMC Biol. 2019
chlorowodorek tiaminySigmaT4625

Bibliografia

  1. Cosgrove, D. J. Re-constructing our models of cellulose and primary cell wall assembly. Current Opinion in Plant Biology. 22, 122-131 (2014).
  2. McFarlane, H. E., Doring, A., Persson, S. The cell biology of cellulose synthesis. Annual Reviews in Plant Biology. 65, 69-94 (2014).
  3. Burgert, I. Exploring the micromechanical design of plant cell walls. American Journal of Botany. 93 (10), 1391-1401 (2006).
  4. Paredez, A. R., Somerville, C. R., Ehrhardt, D. W. Visualization of cellulose synthase demonstrates functional association with microtubules. Science. 312 (5779), 1491-1495 (2006).
  5. Barbier de Reuille, P., et al. MorphoGraphX: A platform for quantifying morphogenesis in 4D. Elife. 4, 05864(2015).
  6. Kierzkowski, D., et al. Elastic domains regulate growth and organogenesis in the plant shoot apical meristem. Science. 335 (6072), 1096-1099 (2012).
  7. Heisler, M. G., et al. Alignment between PIN1 polarity and microtubule orientation in the shoot apical meristem reveals a tight coupling between morphogenesis and auxin transport. PLoS Biology. 8 (10), e1000516(2010).
  8. Louveaux, M., Rochette, S., Beauzamy, L., Boudaoud, A., Hamant, O. The impact of mechanical compression on cortical microtubules in Arabidopsis: a quantitative pipeline. Plant Journal. 88 (2), 328-342 (2016).
  9. Nakayama, N., et al. Mechanical regulation of auxin-mediated growth. Current Biology. 22 (16), 1468-1476 (2012).
  10. Marc, J., et al. A GFP-MAP4 reporter gene for visualizing cortical microtubule rearrangements in living epidermal cells. Plant Cell. 10 (11), 1927-1940 (1998).
  11. Strauss, S., Sapala, A., Kierzkowski, D., Smith, R. S. Quantifying Plant Growth and Cell Proliferation with MorphoGraphX. Methods in Molecular Biology. 1992, 269-290 (2019).
  12. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  13. Erguvan, O., Louveaux, M., Hamant, O., Verger, S. ImageJ SurfCut: a user-friendly pipeline for high-throughput extraction of cell contours from 3D image stacks. BMC Biology. 17 (1), 38(2019).
  14. Boudaoud, A., et al. FibrilTool, an ImageJ plug-in to quantify fibrillar structures in raw microscopy images. Nature Protocols. 9 (2), 457-463 (2014).
  15. Sampathkumar, A., et al. Primary wall cellulose synthase regulates shoot apical meristem mechanics and growth. Development. 146 (10), (2019).
  16. Hervieux, N., et al. A Mechanical Feedback Restricts Sepal Growth and Shape in Arabidopsis. Current Biology. 6 (8), P1019-P1028 (2016).
  17. Sampathkumar, A., et al. Subcellular and supracellular mechanical stress prescribes cytoskeleton behavior in Arabidopsis cotyledon pavement cells. Elife. 3, e01967(2014).
  18. Sampathkumar, A., et al. Primary wall cellulose synthase regulates shoot apical meristem mechanics and growth. Development. 146 (10), dev179036(2019).
  19. Uyttewaal, M., et al. Mechanical stress acts via katanin to amplify differences in growth rate between adjacent cells in Arabidopsis. Cell. 149 (2), 439-451 (2012).
  20. Hamant, O., et al. Developmental patterning by mechanical signals in Arabidopsis. Science. 322 (5908), 1650-1655 (2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Mikroskopia konfokalnaorganizacja mikrotubul korowychfiltr GFPmikroskopia si atomowychmakro narz dzie do w kienbarwienie jodkiem propidyny

Powiązane artykuły