Method Article

Niestandardowa platforma mikroskopii wielofotonowej do obrazowania na żywo rogówki i spojówki myszy

DOI:

10.3791/60944

⸱

May 17th, 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, National Taiwan University, 2Institute of Pharmacology, College of Medicine, National Taiwan University, 3Molecular Imaging Center, National Taiwan University, 4Department of Dermatology, National Taiwan University Hospital, and College of Medicine, 5Research Center for Developmental Biology and Regenerative Medicine, National Taiwan University, 6Department of Ophthalmology, Chang Gung Memorial Hospital, 7College of Medicine, Chang Gung University

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentowana tutaj jest wielofotonowa mikroskopijna platforma do obrazowania powierzchni oka myszy na żywo. Fluorescencyjna mysz transgeniczna umożliwia wizualizację jąder komórkowych, błon komórkowych, włókien nerwowych i naczyń włosowatych na powierzchni oka. Nieliniowe sygnały generujące drugą harmoniczną pochodzące ze struktur kolagenowych zapewniają obrazowanie bez znaczników dla architektur zrębowych.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Konwencjonalne analizy histologiczne i systemy hodowli komórkowych są niewystarczające do pełnej symulacji fizjologicznej i patologicznej dynamiki in vivo. Mikroskopia wielofotonowa (MPM) stała się jedną z najpopularniejszych metod obrazowania w badaniach biomedycznych na poziomie komórkowym in vivo, a jej zalety obejmują wysoką rozdzielczość, głęboką penetrację tkanek i minimalną fototoksyczność. Zaprojektowaliśmy platformę obrazowania MPM z dostosowanym uchwytem na oko myszy i stolikiem stereotaktycznym do obrazowania powierzchni oka in vivo. Mysz reporterowa z podwójnym fluorescencyjnym białkiem umożliwia wizualizację jąder komórkowych, błon komórkowych, włókien nerwowych i naczyń włosowatych na powierzchni oka. Oprócz wielofotonowych sygnałów fluorescencyjnych, jednoczesne pozyskiwanie drugiej harmonicznej (SHG) pozwala na scharakteryzowanie architektury zrębu kolagenowego. Platforma ta może być wykorzystywana do obrazowania przyżyciowego z dokładnym pozycjonowaniem na całej powierzchni oka, w tym rogówki i spojówki.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Struktury powierzchni oka, w tym rogówka i spojówka, chronią inne głębsze tkanki oka przed zewnętrznymi zakłóceniami. Rogówka, przezroczysta przednia część oka, działa zarówno jako soczewka refrakcyjna do kierowania światła do oka, jak i jako bariera ochronna. Nabłonek rogówki jest najbardziej zewnętrzną warstwą rogówki i składa się z odrębnych warstw komórek powierzchownych, komórek skrzydeł i komórek podstawnych. Zrąb rogówki składa się z misternie upakowanych blaszek kolagenowych osadzonych w keratocytach. Śródbłonek rogówki, pojedyncza warstwa płaskich sześciokątnych komórek, odgrywa ważną rolę w utrzymaniu przezroczystości rogówki poprzez utrzymywanie zrębu rogówki w stanie stosunkowo odwodnionym dzięki swoim funkcjom pompowania1. Rąbek stanowi granicę między rogówką a spojówką i jest rezerwuarem komórek macierzystych nabłonka rogówki2. Silnie unaczyniona spojówka pomaga nawilżyć oczy poprzez produkcję śluzu i łez3.

Dynamika komórek struktur powierzchni rogówki jest tradycyjnie badana za pomocą analizy histologicznej lub hodowli komórkowej in vitro, co może nie symulować odpowiednio dynamiki komórek in vivo. Nieinwazyjne podejście do obrazowania na żywo może zatem wypełnić taką lukę. Ze względu na swoje zalety, do których należą wysoka rozdzielczość, minimalne fotouszkodzenia i głębsza głębia obrazowania, MPM stał się potężną modalnością w różnych obszarach badań biologicznych4,5,6,7,8. W przypadku obrazowania rogówki MPM dostarcza informacji komórkowych z wewnętrznej autofluorescencji pochodzącej z wewnątrzkomórkowego NAD (P) H. Sygnały generacji drugiej harmonicznej (SHG) pochodzące z niecentrosymetrycznych włókien kolagenowych typu I pod femtosekundowym skanowaniem laserowym zapewniają kolagenowe struktury zrębu bez dodatkowych procedur barwienia9. Wcześniej my i inne grupy wykorzystywaliśmy MPM do obrazowania rogówek zwierzęcych i ludzkich9,10,11,12,13,14,15.

Transgeniczne linie myszy wykazujące białka fluorescencyjne w określonych populacjach komórek były szeroko wykorzystywane do różnych badań w dziedzinie biologii komórki, w tym rozwoju, homeostazy tkanek, regeneracji tkanek i kancerogenezy. Użyliśmy transgenicznych szczepów myszy znakowanych białkami fluorescencyjnymi do obrazowania in vivo rogówek9,10, mieszków włosowych10 i epidermis10 przez MPM. Dwufluorescencyjny szczep myszy z błoną komórkową znakowaną tdTomato i jądrem komórkowym oznaczonym EGFP jest wyhodowany z dwóch szczepów myszy: R26R-GR (B6; 129-Gt (ROSA)26Sortm1Ytchn/J, #021847)16 i mT-mG (Gt(ROSA26)ACTB-tdTomato-EGFP, #007676)17. Transgeniczna linia myszy R26R-GR zawiera podwójne fluorescencyjne konstrukty reporterowe białka, w tym gen fuzyjny H2B-EGFP i gen fuzji sygnału kotwicznego mCherry-GPI, wprowadzone do locus Gt (ROSA)26Sor. Transgeniczny szczep mT-mG to ukierunkowane na błonę komórkową myszy fluorescencyjne Cre-reporter tdTomato i EGFP. Przed rekombinacją Cre białko błony komórkowej z ekspresją fluorescencji tdPomidor jest szeroko obecne w różnych komórkach. Ten transgeniczny szczep myszy umożliwia nam wizualizację jąder-EGFP i błony za pomocą tdTomato bez wzbudzenia Cre. Dwie samice (R26R-GR+/+) i jeden samiec (mT-mG+/+) transgeniczna mysz zostały wyhodowane razem, aby wyprodukować wystarczającą ilość myszy do eksperymentów. Ich potomstwo z R26R-GR+/-; W tym badaniu wykorzystano genotyp mT-mG+/-, dwufluorescencyjny szczep myszy. W porównaniu z jedną fluorescencyjną linią myszy reporterowej, jak opisano wcześniej9,10, ten dwufluorescencyjny szczep myszy reporterowej zapewnia nam o 50% krótszy czas obrazowania.

W tej pracy opisujemy szczegółowy protokół techniczny do obrazowania in vivo powierzchni oka krok po kroku, korzystając z naszej platformy obrazowania i transgenicznych myszy z podwójnym fluorescencyjnym światłem.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z procedurami zatwierdzonymi przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Narodowego Uniwersytetu Tajwańskiego i Szpitala Chang Gung Memorial.

1. Konfiguracja mikroskopii wielofotonowej

  1. Zbuduj system oparty na mikroskopie pionowym z obiektywem zanurzonym w wodzie 20x 1,00 NA (Rysunek 1A).
  2. Użyj lasera Ti: Sapphire (o regulowanej długości fali) jako źródła wzbudzenia. Ustaw długość fali wyjściowej lasera na 880 nm dla EGFP i 940 nm dla tdTomato (Rysunek 1A).
  3. Dołącz dwa zwierciadła dichroiczne (495 nm i 580 nm) do separacji SHG/EGFP i EGFP/tdTomato (Rysunek 1A). Sygnały SHG, EGFP i tdTomato należy oddzielić spektralnie za pomocą filtrów pasmowoprzepustowych 434/17nm, 510/84nm i 585/40nm (Rysunek 1A).
  4. Aby zoptymalizować jakość obrazu i uniknąć fotowybielania i uszkodzenia tkanek, ustaw moc lasera na około 35 mW dla obrazowania rogówki i 50 mW dla rąbka. Zmierz moc lasera, zanim laser przejdzie przez układ optyczny. Dokładna moc lasera na próbkach wynosi około 8-9 mW. Kompletny mikroskopijny projekt jest pokazany w Rysunek 1A.
    UWAGA: Górny limit mocy lasera jest ustawiony na 70 mW, aby uniknąć fotowybielania i uszkodzenia tkanek.

2. Przygotowanie zwierząt do obrazowania na żywo

  1. Do eksperymentu użyj 8-12-tygodniowych myszy. Wstrzyknąć domięśniowo 50-80 mg/kg chlorowodorku tiletaminy i chlorowodorku zolazepamu do znieczulenia ogólnego. Sprawdź, czy nie ma reakcji na odruch wycofania, szczypiąc palec u nogi. Odpowiednie znieczulenie jest ważne, aby umożliwić stabilne monitorowanie częstości oddechów.
    UWAGA: Myszy w wieku 8 tygodni lub starsze są zalecane, ponieważ ich gałki oczne są dojrzałe.
  2. Umieść mysz w znieczuleniu na podgrzewanym stoliku i włóż sondę monitorującą temperaturę do odbytu.
    UWAGA: Sonda musi być całkowicie włożona do jamy odbytu bez wystawienia na działanie powietrza, aby uniknąć przegrzania grzałki i wywołania udaru cieplnego.

3. Trzymanie oczu do obrazowania powierzchni oka na żywo

  1. Do obrazowania powierzchni oka na żywo użyj specjalnie zaprojektowanego stereotaktycznego uchwytu myszy składającego się z dwóch części: uchwytu na głowę do stabilizacji głowy i uchwytu na oko do cofnięcia powiek i odsłonięcia całej powierzchni oka (Rysunek 1B-D).
  2. Włóż pręty uszne do zewnętrznego przewodu słuchowego i utrzymuj trzypunktowe mocowanie uchwytu głowy (Rysunek 1B, D).
  3. Miejscowo nanieść roztwór 0,4% chlorowodorku oksybuprokainy w soli fizjologicznej i pozostawić na 3 minuty w celu znieczulenia powierzchni oka.
  4. Upewnij się, że gałka oczna jest wysunięta przez prawidłowe ręczne chowanie powieki. W przeciwnym razie może dojść do niedokrwienia i krwawienia z gałki ocznej.
  5. Ostrożnie umieść pętlę rurki polietylenowej lub uchwytu na oczy wzdłuż brzegu powieki, aby odsłonić powierzchnię oka. Ustabilizuj gałkę oczną za pomocą uchwytu na oko składającego się ze kleszczyków Dumonta nr 5 z końcówkami pokrytymi pętlą z rurki polietylenowej (Rysunek 1C,D).
  6. Przykręć kleszcze za pomocą pokrętła w dystalnych kleszczach uchwytu na oko, aby utrzymać stabilną gałkę oczną (Rysunek 1D).
  7. Nakładaj żel pod oczy o współczynniku załamania światła 1,338 na powierzchnię rogówki jako medium zanurzeniowe, aby utrzymać wilgotność powierzchni oka co godzinę. Ponadto regularne stosowanie żelu pod oczy co godzinę pozwala uniknąć zmętnienia rogówki podczas obrazowania.
  8. Obróć gałkę oczną za pomocą uchwytu, który zablokował się na stoliku z silnikiem krokowym, aby obrazować na całej powierzchni rogówki od środkowej rogówki do obszaru peryferyjnego (Rysunek 1C,D).
    UWAGA: Zarówno nadmiar, jak i niewystarczająca ilość żelu pod oczy może mieć wpływ na jakość obrazów podczas obrazowania. Dlatego suplementowanie żelu pod oczy co godzinę, aby regularnie utrzymywać wilgotność powierzchni, jest ważne dla obrazowania.

4. Akwizycja obrazu Z-serial

UWAGA: Ustaw pierwszy i ostatni slajd w każdym stosie, aby zredukować artefakty ruchu upuszczania.

  1. Przed wykonaniem zdjęć należy zobrazować pole celownicze za pomocą rtęciowego źródła światła.
  2. Kliknij symbol oprogramowania mikroskopu, aby włączyć oprogramowanie.
  3. Wybierz odpowiednie wzmocnienie PMT i wzmocnienie cyfrowe, aby uwidocznić strukturę komórkową na powierzchni oka.
  4. Ustaw pierwszy slajd i ostatni slajd, aby uzyskać stos.
  5. Wprowadź wartości liczbowe rozdzielczości obrazu i kroku z, np. 512 x 512 i 1 μm jako krok z.
  6. Kliknij przycisk Start, aby zebrać obrazy z-szeregowe.
  7. Rejestruj obrazy na żywo dwukrotnie w tym samym obszarze, po raz pierwszy przy wzbudzeniu 880 nm dla zbierania sygnałów SHG/EGFP, a drugi przy wzbudzeniu 940 nm dla zbierania sygnałów EGFP/tdTomato.
    UWAGA: Połączenie dwóch stosów zapewnia obrazy z 3 kanałami. Rozdzielczość obrazu i rozmiar formatu skanowania wynosiły odpowiednio 512 x 512 pikseli i 157 μm x 157 μm.

5. Przetwarzanie obrazów i rekonstrukcja 3D

  1. Załaduj obrazy z-serial do Fiji software18.
  2. Wybierz wtyczkę Filtr Median 3D na Fidżi, aby zredukować szumy tła.
  3. Wybierz filtr Pakuj maskę wyostrzającą na Fidżi, aby wyostrzyć obrazy.
  4. Kliknij "Auto" w jasności/kontraście, aby automatycznie zoptymalizować jakość obrazów.
  5. Zapisz obrazy jako sekwencje obrazów, aby móc eksportować obrazy szeregowe Z.
  6. Załaduj obrazy z-serial do komercyjnego oprogramowania (np. Avizo lite) w celu rekonstrukcji 3D za pomocą renderowania objętościowego.
  7. Na wszystkich obrazach MPM sygnały EGFP, tdTomato i SHG są wyświetlane odpowiednio w kolorze pseudozielonym, czerwonym i cyjanowym.
  8. Przechwytuj obrazy struktury 3D za pomocą migawki.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Korzystając z tej platformy obrazowania na żywo, powierzchnia oka myszy może być wizualizowana na poziomie komórkowym. Aby uwidocznić pojedyncze komórki na powierzchni oka, wykorzystaliśmy podwójnie fluorescencyjne myszy transgeniczne z EGFP wyrażonym w jądrze i tdTomato wyrażonym w błonie komórkowej. Bogaty w kolagen zrąb rogówki został uwydatniony przez sygnały SHG.

W nabłonku rogówki zwizualizowano komórki powierzchowne, komórki skrzydeł i komórki podstawne (Rysunek 2). ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta niestandardowa platforma obrazowania MPM z oprogramowaniem kontrolnym została wykorzystana do obrazowania przyżyciowego narządów nabłonkowych myszy, w tym skóry10, mieszka włosowego10 i powierzchni oka 9,10 (ryc. 1A). Zbudowany na zamówienie system był używany ze względu na jego elastyczność w wymianie komponentów optycznych do różnych eksperymentów, od początku naszego projektu. Ta ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy za wsparcie grantowe od Ministerstwa Nauki i Technologii Tajwanu (106-2627-M-002-034, 107-2314-B-182A-089, 108-2628-B-002-023, 108-2628-B-002-023), Narodowego Tajwańskiego Szpitala Uniwersyteckiego (NTUH108-T17) oraz Szpitala Chang Gung Memorial na Tajwanie (CMRPG3G1621, CMRPG3G1622, CMRPG3G1623).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Oprogramowanie AVIZO LiteThermo Fisher ScientificWersja: 2019.3.0
Filtry pasmowo-przepustoweSemrockFF01-434/17
FF01-500/24
FF01-585/40
Lustra dichroiczneSemrockFF495-Di01-25x36
FF580-Di01-25x36
Oprogramowanie sterujące GalvanoThorlabsGVS002
Jade BIOSouthPort CorporationJade BIO
Chlorowodorek oksybuprokainySigmaO0270000
PMTHamamatsuH7422A-40
Rurka polietylenowaBECTON DICKINSON427401
Stereotaktyczny uchwyt na myszStep Technology Co., Ltd000111
Ti: Laser szafirowyWidma-FizykaMai-Tai DeepSee
Mikroskopia pionowaOlympusBX51WI
Vidisic GelDr. Gerhard Mann Chem-pharm. Fabrik GmbHD13581
ZoletilVirbacVR-2831

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. DelMonte, D. W., Kim, T. Anatomy and physiology of the cornea. Journal of Cataract & Refractive Surgery. 37 (3), 588-598 (2011).
  2. Van Buskirk, E. M. The anatomy of the limbus. Eye (London). 3, Pt 2 101-108 (1989).
  3. Hodges, R. R., Dartt, D. A. Tear film mucins: front line defenders of the ocular surface; comparison with airway and gastrointestinal tract mucins. Experimental Eye Research. 117, 62-78 (2013).
  4. Tan, H. Y., et al. Multiphoton fluorescence and second harmonic generation imaging of the structural alterations in keratoconus ex vivo. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (12), 5251-5259 (2006).
  5. Konig, K. Multiphoton microscopy in life sciences. Journal of Microscopy. 200, Pt 2 83-104 (2000).
  6. Rompolas, P., et al. Spatiotemporal coordination of stem cell commitment during epidermal homeostasis. Science. 352 (6292), 1471-1474 (2016).
  7. Park, S., et al. Tissue-scale coordination of cellular behaviour promotes epidermal wound repair in live mice. Nature Cell Biology. 19 (2), 155-163 (2017).
  8. Xin, T., Gonzalez, D., Rompolas, P., Greco, V. Flexible fate determination ensures robust differentiation in the hair follicle. Nature Cell Biology. 20 (12), 1361-1369 (2018).
  9. Wu, Y. F., et al. Intravital multiphoton microscopic imaging platform for ocular surface imaging. Experimental Eye Research. 182, 194-201 (2019).
  10. Wu, Y. F., Tan, H. Y., Lin, S. J. Long-Term Intravital Imaging of the Cornea, Skin, and Hair Follicle by Multiphoton Microscope. Methods in Molecular Biology. , (2019).
  11. Lo, W., et al. Fast Fourier transform-based analysis of second-harmonic generation image in keratoconic cornea. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (7), 3501-3507 (2012).
  12. Tan, H. Y., et al. Multiphoton fluorescence and second harmonic generation microscopy for imaging infectious keratitis. Journal of Biomedical Optics. 12 (2), 024013(2007).
  13. Jester, J. V., et al. Four-dimensional multiphoton confocal microscopy: the new frontier in cellular imaging. Oculur Surface. 2 (1), 10-20 (2004).
  14. Morishige, N., et al. Second-harmonic imaging microscopy of normal human and keratoconus cornea. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 48 (3), 1087-1094 (2007).
  15. Hao, M., et al. In vivo non-linear optical (NLO) imaging in live rabbit eyes using the Heidelberg Two-Photon Laser Ophthalmoscope. Experimental Eye Research. 91 (2), 308-314 (2010).
  16. Chen, Y. T., et al. R26R-GR: a Cre-activable dual fluorescent protein reporter mouse. PLoS One. 7 (9), 46171(2012).
  17. Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
  18. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  19. Masihzadeh, O., Lei, T. C., Ammar, D. A., Kahook, M. Y., Gibson, E. A. A multiphoton microscope platform for imaging the mouse eye. Molecular Vision. 18, 1840-1848 (2012).
  20. Zhang, H., et al. Two-photon imaging of the cornea visualized in the living mouse using vital dyes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (10), 6526-6536 (2013).
  21. Lee, J. H., et al. Comparison of confocal microscopy and two-photon microscopy in mouse cornea in vivo. Experimental Eye Research. 132, 101-108 (2015).
  22. Ehmke, T., et al. In vivo nonlinear imaging of corneal structures with special focus on BALB/c and streptozotocin-diabetic Thy1-YFP mice. Experimental Eye Research. 146, 137-144 (2016).
  23. Webster, M. T., Manor, U., Lippincott-Schwartz, J., Fan, C. M. Intravital Imaging Reveals Ghost Fibers as Architectural Units Guiding Myogenic Progenitors during Regeneration. Cell Stem Cell. 18 (2), 243-252 (2016).
  24. Mesa, K. R., et al. Homeostatic Epidermal Stem Cell Self-Renewal Is Driven by Local Differentiation. Cell Stem Cell. 23 (5), 677-686 (2018).
  25. Goh, C. C., et al. Real-time imaging of dendritic cell responses to sterile tissue injury. Journal of Investigative Dermatology. 135 (4), 1181-1184 (2015).
  26. Kissenpfennig, A., et al. Dynamics and function of Langerhans cells in vivo: dermal dendritic cells colonize lymph node areas distinct from slower migrating Langerhans cells. Immunity. 22 (5), 643-654 (2005).
  27. Chow, Z., Mueller, S. N., Deane, J. A., Hickey, M. J. Dermal regulatory T cells display distinct migratory behavior that is modulated during adaptive and innate inflammation. Journal of Immunology. 191 (6), 3049-3056 (2013).
  28. Dudeck, A., et al. Mast cells are key promoters of contact allergy that mediate the adjuvant effects of haptens. Immunity. 34 (6), 973-984 (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Multiphoton MicroscopyOcular Surface ImagingMouse Cornea ImagingSecond Harmonic GenerationDual Fluorescent ReporterCustom Eye HolderStereotaxic StageZ Serial ImagingFluorescent Protein VisualizationCorneal Stroma Analysis

Related Articles