Method Article

Niestandardowa platforma mikroskopii wielofotonowej do obrazowania na żywo rogówki i spojówki myszy

DOI:

10.3791/60944

⸱

May 17th, 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, National Taiwan University, 2Institute of Pharmacology, College of Medicine, National Taiwan University, 3Molecular Imaging Center, National Taiwan University, 4Department of Dermatology, National Taiwan University Hospital, and College of Medicine, 5Research Center for Developmental Biology and Regenerative Medicine, National Taiwan University, 6Department of Ophthalmology, Chang Gung Memorial Hospital, 7College of Medicine, Chang Gung University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentowana tutaj jest wielofotonowa mikroskopijna platforma do obrazowania powierzchni oka myszy na żywo. Fluorescencyjna mysz transgeniczna umożliwia wizualizację jąder komórkowych, błon komórkowych, włókien nerwowych i naczyń włosowatych na powierzchni oka. Nieliniowe sygnały generujące drugą harmoniczną pochodzące ze struktur kolagenowych zapewniają obrazowanie bez znaczników dla architektur zrębowych.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Konwencjonalne analizy histologiczne i systemy hodowli komórkowych są niewystarczające do pełnej symulacji fizjologicznej i patologicznej dynamiki in vivo. Mikroskopia wielofotonowa (MPM) stała się jedną z najpopularniejszych metod obrazowania w badaniach biomedycznych na poziomie komórkowym in vivo, a jej zalety obejmują wysoką rozdzielczość, głęboką penetrację tkanek i minimalną fototoksyczność. Zaprojektowaliśmy platformę obrazowania MPM z dostosowanym uchwytem na oko myszy i stolikiem stereotaktycznym do obrazowania powierzchni oka in vivo. Mysz reporterowa z podwójnym fluorescencyjnym białkiem umożliwia wizualizację jąder komórkowych, błon komórkowych, włókien nerwowych i naczyń włosowatych na powierzchni oka. Oprócz wielofotonowych sygnałów fluorescencyjnych, jednoczesne pozyskiwanie drugiej harmonicznej (SHG) pozwala na scharakteryzowanie architektury zrębu kolagenowego. Platforma ta może być wykorzystywana do obrazowania przyżyciowego z dokładnym pozycjonowaniem na całej powierzchni oka, w tym rogówki i spojówki.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Struktury powierzchni oka, w tym rogówka i spojówka, chronią inne głębsze tkanki oka przed zewnętrznymi zakłóceniami. Rogówka, przezroczysta przednia część oka, działa zarówno jako soczewka refrakcyjna do kierowania światła do oka, jak i jako bariera ochronna. Nabłonek rogówki jest najbardziej zewnętrzną warstwą rogówki i składa się z odrębnych warstw komórek powierzchownych, komórek skrzydeł i komórek podstawnych. Zrąb rogówki składa się z misternie upakowanych blaszek kolagenowych osadzonych w keratocytach. Śródbłonek rogówki, pojedyncza warstwa płaskich sześciokątnych komórek, odgrywa ważną rolę w utrzymaniu przezroczystości rogówki poprzez utrzymywanie zrębu rogów....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z procedurami zatwierdzonymi przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Narodowego Uniwersytetu Tajwańskiego i Szpitala Chang Gung Memorial.

1. Konfiguracja mikroskopii wielofotonowej

  1. Zbuduj system oparty na mikroskopie pionowym z obiektywem zanurzonym w wodzie 20x 1,00 NA (Rysunek 1A).
  2. Użyj lasera Ti: Sapphire (o regulowanej długości fali) jako źródła wzbudzenia. Ustaw długość fali wyjściowej lasera na 880 nm dla EGFP i 940 nm dla tdTomato (Rysunek 1A).
  3. D....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Korzystając z tej platformy obrazowania na żywo, powierzchnia oka myszy może być wizualizowana na poziomie komórkowym. Aby uwidocznić pojedyncze komórki na powierzchni oka, wykorzystaliśmy podwójnie fluorescencyjne myszy transgeniczne z EGFP wyrażonym w jądrze i tdTomato wyrażonym w błonie komórkowej. Bogaty w kolagen zrąb rogówki został uwydatniony przez sygnały SHG.

W nabłonku rogówki zwizualizowano komórki powierzchowne, komórki skrzydeł i komórki podstawne (Rysunek 2). .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta niestandardowa platforma obrazowania MPM z oprogramowaniem kontrolnym została wykorzystana do obrazowania przyżyciowego narządów nabłonkowych myszy, w tym skóry10, mieszka włosowego10 i powierzchni oka 9,10 (ryc. 1A). Zbudowany na zamówienie system był używany ze względu na jego elastyczność w wymianie komponentów optycznych do różnych eksperymentów, od początku naszego projektu. Ta .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy za wsparcie grantowe od Ministerstwa Nauki i Technologii Tajwanu (106-2627-M-002-034, 107-2314-B-182A-089, 108-2628-B-002-023, 108-2628-B-002-023), Narodowego Tajwańskiego Szpitala Uniwersyteckiego (NTUH108-T17) oraz Szpitala Chang Gung Memorial na Tajwanie (CMRPG3G1621, CMRPG3G1622, CMRPG3G1623).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Oprogramowanie AVIZO LiteThermo Fisher ScientificWersja: 2019.3.0
Filtry pasmowo-przepustoweSemrockFF01-434/17
FF01-500/24
FF01-585/40
Lustra dichroiczneSemrockFF495-Di01-25x36
FF580-Di01-25x36
Oprogramowanie sterujące GalvanoThorlabsGVS002
Jade BIOSouthPort CorporationJade BIO
Chlorowodorek oksybuprokainySigmaO0270000
PMTHamamatsuH7422A-40
Rurka polietylenowaBECTON DICKINSON427401
Stereotaktyczny uchwyt na myszStep Technology Co., Ltd000111
Ti: Laser szafirowyWidma-FizykaMai-Tai DeepSee
Mikroskopia pionowaOlympusBX51WI
Vidisic GelDr. Gerhard Mann Chem-pharm. Fabrik GmbHD13581
ZoletilVirbacVR-2831

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. DelMonte, D. W., Kim, T. Anatomy and physiology of the cornea. Journal of Cataract & Refractive Surgery. 37 (3), 588-598 (2011).
  2. Van Buskirk, E. M. The anatomy of the limbus. Eye (London). 3, Pt 2 101-108 (1989).
  3. Hodges, R. R., Dartt, D. A.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Multiphoton MicroscopyOcular Surface ImagingMouse Cornea ImagingSecond Harmonic GenerationDual Fluorescent ReporterCustom Eye HolderStereotaxic StageZ Serial ImagingFluorescent Protein VisualizationCorneal Stroma Analysis

Related Articles