Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Femtolitrowa matryca kropelkowa do masowo równoległej syntezy białek z pojedynczych cząsteczek DNA

10.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60945

⸱

20 czerwca 2020

 ,  ,  ,  , 
1SUGAR Program, X-star, Japan Agency for Marine-Earth Science and Technology (JAMSTEC), 2Center for Mathematical Science and Advanced Technology, Japan Agency for Marine-Earth Science and Technology (JAMSTEC), 3Deep-Sea Nanoscience Research Group, Japan Agency for Marine-Earth Science and Technology (JAMSTEC)

W tym artykule

Podsumowanie

Ogólnym celem protokołu jest przygotowanie ponad miliona uporządkowanych, jednolitych, stabilnych i biokompatybilnych kropel femtolitru na płaskim podłożu o powierzchni 1cm2, który może być użyty do syntezy białek bez komórek.

Streszczenie

Postępy w rozdzielczości przestrzennej i czułości wykrywania instrumentów naukowych umożliwiają zastosowanie małych reaktorów do badań biologicznych i chemicznych. Aby sprostać zapotrzebowaniu na wysokowydajne mikroreaktory, opracowaliśmy urządzenie do femtolitrowej matrycy kropelkowej (FemDA) i zademonstrowaliśmy jego zastosowanie w masowo równoległych reakcjach bezkomórkowej syntezy białek (CFPS). Ponad milion jednolitych kropel zostało łatwo wygenerowanych w obszarze wielkości palca przy użyciu dwuetapowego protokołu uszczelniania olejem. Każda kropla została zakotwiczona w mikrokomorze femtolitrowej składającej się z hydrofilowego dna i hydrofobowej ściany bocznej. Hybrydowa struktura hydrofilowo-hydrofobowa oraz dedykowane oleje uszczelniające i środki powierzchniowo czynne mają kluczowe znaczenie dla stabilnego zatrzymywania wodnego roztworu femtolitru w przestrzeni femtolitru bez strat związanych z parowaniem. Konfiguracja femtolitrowa i prosta konstrukcja urządzenia FemDA pozwoliły na minimalne zużycie odczynników. Jednolity wymiar reaktorów kropelkowych sprawił, że wielkoskalowe pomiary ilościowe i czasowe były przekonujące i wiarygodne. Technologia FemDA korelowała wydajność białka w reakcji CFPS z liczbą cząsteczek DNA w każdej kropli. Uprościliśmy procedury związane z mikrofabrykacją urządzenia, tworzeniem kropelek femtolitru oraz pozyskiwaniem i analizą mikroskopowych danych obrazowych. Szczegółowy protokół przy zoptymalizowanych niskich kosztach eksploatacji sprawia, że technologia FemDA jest dostępna dla każdego, kto ma standardowe pomieszczenia czyste i konwencjonalny mikroskop fluorescencyjny we własnym miejscu.

Wprowadzenie

Badacze używają reaktorów do przeprowadzania reakcji biochemicznych. Podjęto znaczne wysiłki w celu zmniejszenia rozmiarów reaktora i zwiększenia przepustowości eksperymentalnej w celu obniżenia zużycia odczynników przy jednoczesnej poprawie wydajności pracy. Oba aspekty mają na celu uwolnienie naukowców od dużego obciążenia pracą, obniżenie kosztów i przyspieszenie prac badawczo-rozwojowych. Mamy jasną historyczną mapę drogową dotyczącą rozwoju technologii reaktorów z punktu widzenia objętości reakcji i przepustowości: pojedyncze zlewki/kolby/probówki, probówki mililitrowe, probówki mikrolitrowe, mikrolitrowe 8-rurkowe paski, mikrolitrowe 96/384/1536-dołkowe płytki oraz mikroprzepływowe nanolitry/pikolitr/femtolitrowe reaktory1,2,3,4,5,6,7. Analogicznie do zmniejszania rozmiaru tranzystorów w układach scalonych w przemyśle półprzewodników w ostatnich dziesięcioleciach, mikroreaktory biochemiczne przechodzą proces redukcji objętości i integracji systemów. Takie narzędzia na małą skalę wywarły ogromny wpływ na biologię syntetyczną opartą na komórkach lub bezkomórkową, bioprodukcję oraz prototypowanie i badania przesiewowe o wysokiej przepustowości8,9,10,11,12. Ten artykuł opisuje nasze ostatnie wysiłki nad opracowaniem unikalnej technologii matryc kropelkowych i demonstruje jej zastosowanie w CFPS13, podstawowej technologii dla społeczności biologii syntetycznej i molekularnych badań przesiewowych14. W szczególności celowo zapewniamy zoptymalizowany i tani protokół, aby urządzenie FemDA było dostępne dla każdego. Tani i łatwy w obsłudze protokół dla zminiaturyzowanego urządzenia przyczyniłby się do realizacji celów edukacyjnych uniwersytetów i pomógłby w rozpowszechnianiu technologii.

FemDA przygotowuje kropelki femtolitrowe o bardzo wysokiej gęstości 106 na 1cm2 na płaskim podłożu szklanym. Pokryliśmy hydrofobowy polimer CYTOP15 na szklanym podłożu i selektywnie wytrawiliśmy (usunęliśmy) CYTOP w predefiniowanych pozycjach, aby wygenerować układ mikrokomór na podłożu. W ten sposób powstała mikrokomora składa się z hydrofobowej ściany bocznej (CYTOP) i hydrofilowego dna (szkła). Podczas sekwencyjnego przepływu wody i oleju po wzorzystej powierzchni, woda może zostać uwięziona i uszczelniona w mikrokomorach. Struktura hydrofilowa w hydrofobowości jest niezbędna do odpychania wody na zewnątrz mikrokomór, izolowania poszczególnych mikroreaktorów i zatrzymywania niewielkiego roztworu wodnego wewnątrz przestrzeni femtolitrowej. Ta unikalna właściwość została z powodzeniem zastosowana do przygotowania kropelek wody w oleju i dwuwarstwowych mikrokompartmentów lipidowych16,17. W porównaniu z prototypowym urządzeniem16, najpierw zoptymalizowaliśmy proces mikroprodukcji, aby zrealizować całkowite usunięcie polimeru CYTOP, a także pełne naświetlenie szklanego dna. CYTOP to specjalny fluoropolimer charakteryzujący się wyjątkowo niskim napięciem powierzchniowym (19 mN/m) niższym niż w przypadku konwencjonalnych materiałów mikroreaktorów, takich jak szkło, tworzywa sztuczne i silikon. Jego dobre parametry optyczne, elektryczne i chemiczne zostały już wykorzystane w obróbce powierzchni urządzeń mikroprzepływowych18,19,20,21,22,23,24. W systemie FemDA, aby osiągnąć dobre zwilżenie oleju na powierzchni CYTOP, napięcie powierzchniowe oleju musi być niższe niż napięcie powierzchni ciała stałego25. W przeciwnym razie ciekły olej w kontakcie z powierzchnią ciała stałego ma tendencję do stawania się kulistym, a nie rozprowadzania się po powierzchni. Poza tym odkryliśmy, że niektóre popularne oleje perfluorowęglowe (np. 3M FC-40)16 i oleje hydrofluoroeterowe (np. seria 3M Novec) mogą rozpuszczać CYTOP w wyniku amorficznej morfologii CYTOP, co jest śmiertelne dla pomiarów ilościowych i byłoby wątpliwe pod względem zanieczyszczenia krzyżowego między kropelkami. Na szczęście zidentyfikowaliśmy biokompatybilny i przyjazny dla środowiska olej wykazujący niższe (< 19 mN/m) napięcie powierzchniowe13. Znaleźliśmy również nowy środek powierzchniowo czynny, który może rozpuszczać się w wybranym oleju i funkcjonować w niskim stężeniu (0,1%, co najmniej 10-krotnie niższym niż wcześniej zgłaszane popularne stężenie26,27)13. Powstały w ten sposób interfejs woda/olej może być stabilizowany przez środek powierzchniowo czynny. Ze względu na wysoką szybkość parowania oleju, po przepłukaniu olejem, zastosowaliśmy inny biokompatybilny i przyjazny dla środowiska olej, który zastąpił pierwszy do uszczelniania mikrokomór. Pierwszy olej (ASAHIKLIN AE-3000 o zawartości 0,1% wag. SURFLON S-386) nazywamy odpowiednio "olejem do płukania", a drugi olej (Fomblin Y25) "olejem uszczelniającym".

Dwuetapowa strategia uszczelniania olejem może doprowadzić do solidnego tworzenia matrycy kropel femtolitrowych w ciągu kilku minut i bez skomplikowanego oprzyrządowania. Ze względu na problem z parowaniem, uznano, że generowanie mikroreaktorów mniejszych niż objętości pikolitrów jest wyzwaniem28. Projekt FemDA rozwiązał ten problem poprzez systematyczną optymalizację materiałów i procesów stosowanych do przygotowania mikroreaktorów/kropel. Kilka godnych uwagi cech powstałych kropel to wysoka jednorodność (lub monodyspersyjność), stabilność i biokompatybilność w skali femtolitrowej. Współczynnik zmienności (CV) objętości kropli wynosi zaledwie 3% (bez korekcji winietowania dla obrazów mikroskopowych), co jest najmniejszym CV wśród platform kropel na świecie, co zapewnia wysoce równoległy i ilościowy pomiar. Kropla femtolitra jest stabilna przez co najmniej 24 godziny bez zanieczyszczenia krzyżowego między kropelkami w temperaturze pokojowej, co jest cenne dla wiarygodnego pomiaru przebiegu w czasie. Jeśli chodzi o biokompatybilność, udało nam się zsyntetyzować różne białka z pojedynczej kopii matrycy DNA w kropli femtolitru, co wcześniej uważano za trudne lub nieefektywne29,30. Warto byłoby wyjaśnić, dlaczego niektóre białka zdolne do syntezy w FemDA nie mogą być syntetyzowane w innych systemach kropelkowych. FemDA był nie tylko postępem technicznym, ale także umożliwił bezprecedensowy pomiar ilościowy, który może skorelować wydajność białka (odzwierciedloną przez intensywność fluorescencji kropli) z liczbą matrycowych cząsteczek DNA w każdej kropli. W rezultacie, histogram intensywności fluorescencji kropelek z CFPS opartego na FemDA wykazał dyskretny rozkład, który można ładnie dopasować za pomocą sumy rozkładów Gaussa o równych odstępach między pikami. Co więcej, prawdopodobieństwo wystąpienia kropelek zawierających różną liczbę cząsteczek DNA idealnie pasowało do rozkładu Poissona31. W ten sposób różna wydajność białka w każdej kropli może być znormalizowana w oparciu o dyskretny rozkład. Ta krytyczna cecha pozwala nam oddzielić informacje o aktywności enzymatycznej od pozornej intensywności, która nie była jeszcze dostępna w przypadku innych platform mikroreaktorów. Istniejące mikroprzepływowe systemy sortowania komórek/kropelek są wykwalifikowane w całkowicie automatycznym sortowaniu i dobrze radzą sobie z koncentracją próbek, ale czasami mogą uzyskać tylko stosunkowo szeroki lub długoogoniasty histogram w aspekcie analitycznym32,33. Nasz wysoce ilościowy i biokompatybilny system FemDA wyznacza nowy punkt odniesienia i wysoki standard analityczny w dziedzinie rozwoju mikroreaktorów.

Oleje i środki powierzchniowo czynne, które mogłyby być używane do przygotowania kropel, są nadal bardzo ograniczone34. Połączenie ASAHIKLIN AE-3000 i SURFLON S-386 zapoczątkowane w FemDA jest nowym członkiem rosnącego arsenału fizykochemicznego interfejsu między fazą wodną a fazą olejową13. Nowy interfejs w FemDA jest fizycznie stabilny, chemicznie obojętny i biologicznie kompatybilny ze złożonymi maszyneriami transkrypcji, translacji i modyfikacji potranslacyjnej dla wielu rodzajów białek13. Byłoby raczej atrakcyjne znalezienie białka, które nie może być syntetyzowane w ustawieniach kropelkowych. Poza tym oszczędność kosztów odczynników jest bardziej widoczna w systemie kropelkowym femtolitrowym niż w systemach reaktorów nanolitrowych i pikolitrowych35,36. W szczególności często występuje duża objętość martwa, która jest spowodowana głównie przez rurki lub zewnętrzne źródła zasilania, w systemach generowania kropel mikroprzepływowych, ale nie w naszym FemDA. Format tablicy jest również faworyzowany przez powtarzającą się i szczegółową charakterystykę mikroskopową (podobną do tak zwanej analizy o wysokiej zawartości) dla każdego pojedynczego reaktora37, a nie tylko pojedynczej migawki dla szybko poruszającego się obiektu. Skala femtolitrowa umożliwiła integrację ponad miliona reaktorów na powierzchni wielkości palca, podczas gdy taka sama liczba reaktorów nanolitrowych (jeśli taka istnieje) wymaga ponad metra kwadratowego powierzchni, co byłoby niewątpliwie niepraktyczne do wyprodukowania lub zastosowania takiego systemu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Mikrofabrykacja podłoża do mikrokomory femtolitrowej

UWAGA: Przeprowadź następujący eksperyment mikrofabrykacji w pomieszczeniu czystym. Przed wejściem do pomieszczenia czystego załóż rękawice i kombinezon do pomieszczeń czystych.

  1. Czyszczenie szklanego podłoża nakrywkowego
    1. Ustaw szkło nakrywkowe na stojaku do witrażowania szkła nakrywkowego. Sonikować szkło nakrywkowe w 8 M wodorotlenku sodu (NaOH) przez 15 minut w temperaturze pokojowej (RT).
      UWAGA: NaOH w wysokich stężeniach jest bardzo niebezpieczny dla skóry i oczu. Delikatnie obchodź się z nim bez rozprysków.
    2. Wyjmij ruszt z roztworu NaOH i opłucz szklankę nakrywkową wodą dziesięć razy. Trzymaj szkło nakrywkowe w czystej wodzie.
      UWAGA: Wyrzuć odpady alkaliczne do wyznaczonego zbiornika. Roztwór NaOH można poddać recyklingowi do oryginalnej butelki i używać do pięciu razy.
    3. Osusz każdy kawałek szkła nakrywkowego za pomocą pistoletu do przedmuchiwania powietrzem.
    4. Piecz wysuszoną szklankę nakrywkową na płycie grzejnej w temperaturze 200 °C przez 5 minut. Podczas kolejnych procesów obsługi należy zachować stałą orientację górnej strony szklanego podłoża.
  2. Silanizacja powierzchni szkła
    1. Zresetuj oczyszczoną szklankę nakrywkową na suchym stojaku do barwienia.
    2. Dodaj 150 ml etanolu do zlewki z PTFE. Za pomocą igły (22 G x 70 mm) wyposażonej w strzykawkę o pojemności 1 ml pobrać 0,075 ml (3-aminopropylo)trietoksysilanu i natychmiast wstrzyknąć go do etanolu (tj. 0,05 % obj.). Pociągnąć i popchnąć strzykawkę kilka razy, aby przepłukać wnętrze strzykawki. Wymieszaj roztwór z igłą, aby był jednorodny.
      UWAGA: (3-aminopropylo)trietoksysilan może być przechowywany w temperaturze pokojowej i ciśnieniu 1 atm przez dwa lata ze szczelnym zamknięciem. Etanol absolutny powinien być szczelnie zamknięty po użyciu. Nie zalecamy używania przeterminowanych odczynników.
    3. Inkubować szkło nakrywkowe w 0,05% obj. roztworze aminozylanu przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    4. Opłucz szklankę nakrywkową czystą wodą pięć razy. Trzymaj szkło nakrywkowe w czystej wodzie.
      UWAGA: Wyrzuć odpady do wyznaczonego zbiornika.
    5. Osusz każdy kawałek szkła nakrywkowego za pomocą pistoletu do przedmuchiwania.
    6. Umieść całe wysuszone szkło nakrywkowe na folii aluminiowej. Piecz szklankę nakrywkową na płycie grzejnej w temperaturze 80 °C przez 5 minut.
  3. Powlekanie spinowe perfluoropolimeru CYTOP
    1. Umieść szkło nakrywkowe na niestandardowym uchwycie próżniowym powlekarki wirowej (Rysunek 1A). Włącz przełącznik podciśnienia, aby zamocować szklane podłoże.
      UWAGA: Konstrukcja uchwytu próżniowego ma kluczowe znaczenie dla równomiernego pokrycia lepkiego polimeru na prostokątnym (24 mm × 32 mm) i cienkim (0,13-0,17 mm) podłożu (Rysunek 1A). Odkryliśmy, że prostokątny stolik na próbkę z wieloma otworami (48 otworów, każdy o średnicy 1 mm) łączący się z kanałem próżniowym działał lepiej niż okrągły stolik z pojedynczym otworem centralnym.
    2. Upuść 70-90 μl polimeru CYTOP typu A na środek szklanego podłoża. Natychmiast powlekaj polimer (Rysunek 1B).
      UWAGA: Stan powlekania wirowego (3 400 obr./min, 30 s) zapewnia grubość 3 μm. Użyj mikropipety przeznaczonej do lepkiej cieczy. Trzymaj mikropipetę pionowo, aby polimer opadł na podłoże niemal idealnie po okręgu. Wewnątrz końcówki pipety często tworzy się pęcherzyk powietrza, gdy tłok przesuwa się w dół. Nie upuszczaj ostatniej kropli CYTOP z bańką.
    3. Podnieś powlekane szkło palcami trzymając rogi szklanego podłoża i umieść je na folii aluminiowej.
    4. Powtórzyć kroki 1.3.1-1.3.3, aby obtoczyć wszystkie pozostałe kawałki szkła nakrywkowego.
    5. Piec szkło powlekane w temperaturze 80 °C przez 30 minut, a następnie w temperaturze 200 °C przez 1 h.
      UWAGA: Ta obróbka w pełni utwardza CYTOP i kowalencyjnie wiąże CYTOP z powierzchnią szkła. Przykryj obszar pieczenia pokrywką wykonaną z folii aluminiowej, aby w razie potrzeby uniknąć potencjalnego kurzu podczas długotrwałego procesu pieczenia.
    6. Wyjmij szkło nakrywkowe pokryte CYTOP z płyty grzejnej i ostudź do temperatury RT. Ostrożnie podnieś każdy kawałek powlekanego szkła i sprawdź go, aby zobaczyć, czy jest prawidłowo pokryty. Wyrzucić podłoże z niejednorodną powłoką.
      UWAGA: Powierzchnia ładnie pokrytego CYTOPU powinna wyglądać na płaską bez nieregularnych tęczowych wzorów (Rysunek 1C). Oględziny pod odpowiednim kątem mogą szybko ocenić płaskość, a także jakość powłoki. W tym miejscu protokół można wstrzymać.
  4. Fotorezystor z powłoką wirową
    1. Umieść szkło nakrywkowe pokryte CYTOP na uchwycie próżniowym (patrz krok 1.3.1) powlekarki wirowej. Włącz przełącznik podciśnienia, aby zamocować szklaną pokrywę.
    2. Upuść 0,2-0,3 ml fotorezystu na środek podłoża. Natychmiast obrócić fotorezystor z prędkością 6 000 obr./min przez 60 s.
      UWAGA: Nie upuszczaj ostatniej kropli fotorezystu z bąbelkami. Jeśli powlekarka wirowa obsługuje wyższą prędkość wirowania, prędkość wirowania może wynosić do 7,500 obr./min, aby uzyskać cieńszą powłokę. Niska energia powierzchniowa CYTOP zapobiega przywieraniu większości fotorezystorów do jego powierzchni. Jeśli fotorezystor AZ P4903 nie jest dostępny, dobrą alternatywą jest fotorezystor AZ P4620.
    3. Podnieś powlekane podłoże dwoma palcami trzymając rogi podłoża. Zetrzyj nadmiar fotorezystu w pobliżu krawędzi podłoża (często nazywanego usuwaniem ściegu krawędziowego lub EBR) za pomocą czystej wycieraczki nasączonej etanolem (Rysunek 1D). Podłoże ułożyć na folii aluminiowej.
      UWAGA: Aceton NIE jest zalecany do EBR.
    4. Powtórz kroki 1.4.1-1.4.3, aby pokryć fotorezystem pozostałe kawałki szkła nakrywkowego pokrytego CYTOP. Podnieś każdy kawałek powlekanego szkła i sprawdź go, aby zobaczyć, czy jest prawidłowo pokryty.
      UWAGA: Powierzchnia ładnie pokrytego fotorezystu powinna wyglądać na płaską bez nieregularnych wzorów (Rysunek 1D). Oględziny pod odpowiednim kątem mogą szybko ocenić płaskość, a także jakość powłoki. Podłoże wykazujące niejednorodną powłokę można poddać recyklingowi poprzez przemywanie kolejno acetonem, 2-propanolem iH2Oi ponownie wykorzystać.
    5. Piecz pokryte podłoże w temperaturze 110 °C przez 5 minut na płycie grzejnej.
    6. Usuń powlekane podłoże z płyty grzejnej i ostudź do temperatury pokojowej. Odstawić na 30 minut przy wilgotności względnej 40%-60% w celu ponownego nawodnienia fotorezystu.
      UWAGA:H2Ojest niezbędne do następującej reakcji fotochemicznej. Wypalony fotorezystor stracił zawartośćH2Owewnątrz fotorezystu. Proces rehydratacji pozwala na wchłonięcieH2Oz powietrza. Wilgotność względna niższa niż 20% lub wyższa niż 80% nie jest odpowiednia dla procesu ponownego nawodnienia.
  5. Fotolitografia
    1. W czasie oczekiwania na ponowne nawodnienie (patrz krok 1.4.6) uruchom nakładkę maski. Rozgrzej źródło światła. Załaduj chromowaną fotomaskę.
      UWAGA: Postępuj zgodnie z instrukcją obsługi, aby obsługiwać nakładkę maski. Fotomaska może być wytwarzana za pomocą litografii wiązką elektronów (EB), jeśli urządzenie EB jest dostępne. Alternatywnie fotomaskę można zlecić lokalnej firmie.
    2. Załaduj ponownie uwodniony substrat (po zakończeniu kroku 1.4.6) na uchwyt (Rysunek 1E).
    3. Ustaw parametry ekspozycji. Naświetlić podłoże przez 25 s przy natężeniu promieniowania UV 13 mW/cm2 (linia h) w trybie kontaktu próżniowego. Następnie rozładuj podłoże i umieść je na stojaku do barwienia szkła nakrywkowego (tym samym, który został użyty w kroku 1.1.1).
    4. Powtórzyć kroki 1.5.2-1.5.3, aby odsłonić pozostałe kawałki ponownie uwodnionego substratu.
  6. rozwój
    1. Rozwijaj podłoże przez 5 minut, aby rozpuścić naświetlony fotorezystor (Rysunek 1F). Podczas tego czasu delikatnie potrząśnij stojakiem w wywoływaczu raz w czasie 4 minut.
      UWAGA: Deweloperem był AZ 300 MIF. Alternatywne wywoływacze alkaliczne (np. AZ 400 K) są ogólnie stosowane do rozwoju, ale powinny wymagać optymalizacji warunków rozwoju (np. czasu, temperatury, mieszania). NIE używaj szklanych zlewek jako pojemnika wywoływacza.
    2. Spłucz podłoże czystą wodą dziesięć razy. Trzymaj szkło nakrywkowe w czystej wodzie.
      UWAGA: Wyrzuć wywoływacza do wyznaczonego zbiornika.
    3. Dokładnie wysusz każdy kawałek podłoża za pomocą pistoletu do przedmuchiwania.
  7. Reaktywne trawienie jonowe
    1. Umieścić wysuszony substrat (z kroku 1.6.3) w komorze reakcyjnej maszyny do trawienia jonami reaktywnymi (RIE).
      UWAGA: Zgodnie z zasadą konserwacji obiektu, maszyna RIE może być zawsze włączona lub wyłączona za każdym razem. Jeśli przełącznik był wyłączony, włącz go zgodnie z instrukcją.
    2. Wytrawić odsłonięty fotorezystor CYTOP plazmą O2 (Rysunek 1G).
      UWAGA: Warunek RIE był następujący. Ø2 natężenie przepływu gazu: 50 sccm; ciśnienie w komorze: 10,0 Pa; Moc RF: 50 W; czas trawienia: 27 min. Czas trawienia został zoptymalizowany pod kątem całkowitego wytrawiania CYTOP o grubości 3 μm.
    3. Za pomocą pęsety należy pobrać każdy kawałek podłoża z komory reakcyjnej i umieścić go na stojaku do barwienia szkła nakrywkowego.
      UWAGA: Zgodnie z zasadami konserwacji obiektu, komora reakcyjna może wymagać krótkiego procesu czyszczenia plazmąO2 (np. czas trawienia: 5 min), aby utrzymać komorę reakcyjną w czystości po każdym uruchomieniu.
  8. Usuwanie fotorezystu i czyszczenie
    1. Sonikować podłoże w acetonie przez 5 minut w temperaturze pokojowej, aby rozpuścić pozostały fotorezyst.
    2. Sonikować substrat w 2-propanolu przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    3. Opłucz podłoże czystą wodą pięć razy. Sonikować substrat przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Przepłukać próbkę czystą wodą przez kolejne pięć razy. Utrzymuj podłoże w czystej wodzie.
    4. Wysusz każdy kawałek podłoża za pomocą pistoletu do przedmuchiwania (Rysunek 1H).
      UWAGA: Podłoże można przechowywać na plastikowej szalce Petriego. Wytworzone podłoże jest stabilne strukturalnie w RT przez co najmniej rok. W tym miejscu protokół można wstrzymać.
    5. Scharakteryzuj profil powierzchni przygotowanego podłoża za pomocą trójwymiarowej (3D) skaningowej mikroskopii konfokalnej, interferometrii światła białego (lub interferometrii skaningowej koherentnej) lub skaningowej mikroskopii elektronowej. Użyj odpowiedniego oprogramowania, aby zmierzyć średnicę i głębokość powstałych mikrokomór.
      UWAGA: Próbka może być ponownie wykorzystana do innych eksperymentów po charakterystyce za pomocą bezkontaktowego i nieniszczącego laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego 3D lub interferometru światła białego. W tym miejscu protokół można wstrzymać.

2. Przygotowanie mikrokanalików polidimetylosiloksanu (PDMS)

UWAGA: NIE noś rękawiczek lateksowych do obsługi PDMS. Zamiast tego załóż rękawice z polietylenu (PE).

  1. Wprowadzanie mikrokanału do wzorca
    1. Wytnij podwójnie powlekaną samoprzylepną taśmę z folii kaptonowej na określony kształt (3 mm x 19 mm) mikrokanalików za pomocą noża stołowego.
      UWAGA: Taśma kaptonowa miała numer 7602 #25 (Teraoka Seisakusho), co dawało wysokość kanału 135 μm. Obcinarka biurkowa STIKA wykorzystuje wtyczkę (dostępną na stronie Roland: https://www.rolanddga.com) programu Adobe Illustrator do uruchomienia cięcia zgodnie z rysunkiem w pliku Adobe Illustrator. W tym miejscu protokół można wstrzymać.
    2. Przyklej każdą przeciętą taśmę kaptonową na płaskim dnie szalki Petriego. Standardowa szalka Petriego o średnicy 90 mm może pomieścić 12 sztuk taśmy.
      UWAGA: Struktura reliefowa służy jako wzorzec do formowania replik PDMS. Delikatnie dociśnij powierzchnię taśmy pęsetą, jeśli między taśmą a podłożem szalki Petriego znajdują się pęcherzyki powietrza. Alternatywnie, klasyczna miękka litografia może być zastosowana do przygotowania wzorca na waflu krzemowym38. W tym miejscu protokół można wstrzymać.
  2. Utwardzanie żywicy PDMS na szalce Petriego z wzorem taśmy
    1. Założyć nowe rękawice PE i przenieść 2,5 g utwardzacza z elastomeru silikonowego SYLGARD 184 za pomocą jednorazowej plastikowej pipety do określonej plastikowej zlewki (Rysunek 2A).
    2. Zmienić rękawice na nowe i przenieść 25 g bazy prepolimerowej elastomeru silikonowego SYLGARD 184 za pomocą jednorazowej strzykawki o pojemności 50 ml do powyższej plastikowej zlewki.
      UWAGA: Zmień rękawice, aby zapobiec potencjalnemu zanieczyszczeniu krzyżowemu utwardzacza do podstawy.
    3. Użyj mieszalnika odgazowującego, aby wymieszać i odgazować mieszaninę (program: 3 minuty mieszania, a następnie 2 minuty odpowietrzania).
      UWAGA: Jeśli mieszalnik odgazowujący nie jest dostępny, mieszaninę mieszaną ręcznie (przez około 15 minut) można odgazować w komorze próżniowej.
    4. Wlej mieszaninę PDMS na szalkę Petriego z wzorem taśmy (Rysunek 2B). Umieść szalkę Petriego w mini komorze próżniowej i odpowietrzaj mieszaninę PDMS przez 1-3 godziny (Rysunek 2C).
      UWAGA: Jeśli po 1 godzinie w mieszaninie PDMS pozostanie jakiekolwiek powietrze, wyjmij szalkę Petriego z komory próżniowej, rozbij pęcherzyk powietrza za pomocą dmuchawy powietrza, a następnie włóż szalkę Petriego z powrotem do komory próżniowej i kontynuuj proces odpowietrzania.
    5. Umieść szalkę Petriego w piekarniku w temperaturze 60 °C na noc, aby utwardzić PDMS (Rysunek 2D).
      UWAGA: Chociaż zwiększenie temperatury może skrócić czas utwardzania, maksymalna temperatura, jaką może tolerować polistyrenowa szalka Petriego bez odkształcenia fizycznego, wynosi około 60 °C.
  3. Formowanie repliki kanału PDMS
    1. Oderwij utwardzony elastomer PDMS od szalki Petriego (Rysunek 2E).
    2. Odetnij każdy kawałek bloków kanałów PDMS za pomocą płaskiego obcinaka do (Rysunek 2F).
    3. Umieść elastomer PDMS na macie do cięcia kanałem skierowanym do góry. Przebij otwór na każdym końcu kanału za pomocą stempla do biopsji (Ryc. 2G).
    4. Oczyść powierzchnię kanału PDMS taśmą klejącą. Następnie owiń żywicę PDMS w inny kawałek taśmy klejącej, aby utrzymać ją w czystości przed użyciem. Przygotowany kanał PDMS należy przechowywać na czystej szalce Petriego.
      UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać.

3. Montaż urządzenia do mikrokomór femtolitrowych

  1. Umieść kilka kawałków nasączonych wodą czystych wycieraczek wzdłuż wewnętrznej ścianki szalki Petriego, aby uzyskać uproszczoną komorę nawilżania. Żywicę PDMS pokrytą taśmą klejącą umieścić w komorze nawilżania i uszczelnić komorę folią parafinową. Inkubować przez co najmniej 3 godziny, ale nie dłużej niż jeden dzień.
    UWAGA: PDMS jest porowatym materiałem, który umożliwia przepływ gazu przez żywicę39. Porowata struktura PDMS prowadzi do absorpcji cząsteczek wody z otoczenia aż do osiągnięcia równowagi. Ta obróbka wstępna wypełnia pory PDMS parą wodną i może znacznie spowolnić parowanie kropelek wody przylegających do krawędzi kanału PDMS.
  2. Zdejmij taśmę klejącą z żywicy PDMS. Umieść kanał PDMS w obszarze matrycy mikrokomór podłoża (Rysunek 2H).
    UWAGA: Żywica PDMS odwracalnie przylega do powierzchni CYTOP. Delikatnie dociśnij blok PDMS pęsetą, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza między żywicą PDMS a podłożem, jeśli występują.
  3. Włóż niefiltrowaną końcówkę pipety o pojemności 200 μl do jednego (jako wylotu) z otworów kanału PDMS.
    UWAGA: Siła przyczepności między PDMS a CYTOP jest ograniczona. Aby uniknąć fizycznego odkształcenia żywicy PDMS, a także oderwania kanału PDMS od powierzchni, nie należy wkładać końcówki pipety zbyt głęboko.

4. Roztwór reakcji ładowania do zmontowanego urządzenia

  1. Postaw aluminiowy stojak na mikrorurki na lodzie. Wstępnie schłodzić olej do spłukiwania (olej ASAHIKLIN AE-3000 zmieszany z 0,1% wag. środkiem powierzchniowo czynnym SURFLON S-386) w mikroprobówce o pojemności 1,5 ml na aluminiowym stojaku.
  2. Połóż kolejny aluminiowy blok na lodzie.
  3. Przygotowanie roztworu reakcyjnego CFPS
    1. Przygotować roztwór reakcyjny CFPS w probówce do PCR. Wymieszaj każdy podwielokrotny składnik zestawu CFPS, rozcieńczony matrycowy DNA (jak pokazano w niniejszym dokumencie za pomocą białka fluorescencyjnego mNeonGreen40 i roztworu fosfatazy alkalicznej Escherichia coli41) oraz innych niezbędnych składników zgodnie ze specyficznymi potrzebami (np. inhibitor RNazy, substrat fluorogenny, chaperon).
      UWAGA: Matryca DNA stosowana do CFPS musi być przygotowana zgodnie z instrukcją zawartą w odpowiednim zestawie CFPS. W tej demonstracji zastosowano system wyrażeń oparty na T742. Ponieważ zużycie odczynnika w urządzeniu FemDA jest dość małe, 10 μl jest wystarczająco duże, aby wypełnić cały kanał PDMS.
    2. W przypadku syntezy białek fluorescencyjnych mNeonGreen należy wymieszać składniki w następującej kolejności: dodać 2,7 μl H2O bez nukleaz do 6 μl podwielokrotności roztworu A (z zestawu CFPS); dodać 0,3 μl inhibitora RNazy; dodać 1,5 μl rozcieńczonego roztworu matrycowego DNA; krótko wymieszać i przenieść mieszaninę do 4,5 μl podwielokrotności roztworu B (z zestawu CFPS).
      UWAGA: Całkowita objętość wynosi 15 μL. Ponieważ ilość każdej podwielokrotności jest proporcjonalna do całkowitej objętości końcowej mieszaniny, całkowita objętość mniejsza niż 10 μl może skutkować zdecydowanie zbyt małą objętością (< 0,2 μl) podwielokrotności niektórych składników.
    3. W przypadku syntezy fosfatazy alkalicznej należy wymieszać składniki w następującej kolejności: dodać 1,2 μlH2Odo 6 μL roztworu A; dodać 0,3 μl inhibitora RNazy; dodać 0,6 μl wzmacniacza wiązań dwusiarczkowych 1 i 2 (z zestawu); dodać 0,3 μL 5 mM fosforanu 6,8-difluoro-4-metylobelokliferylu (DiFMUP); dodać 1,5 μl roztworu DNA; krótko wymieszać i przenieść mieszaninę do 4,5 μl roztworu B.
      UWAGA: W teście fosfatazy alkalicznej substrat fluorogenny DiFMUP może wytwarzać wysoce fluorescencyjną 6,8-difluoro-7-hydroksy-4-metylokoumarynę (DiFMU) po enzymatycznym rozszczepieniu końcowej grupy fosforanowej.
  4. Pobrać 10 μl mieszaniny za pomocą niefiltrowanej końcówki pipety o pojemności 200 μl. Włóż końcówkę pipety do otworu wlotowego (patrz krok 3.3) kanału PDMS. Nacisnąć tłok, aby wstrzyknąć roztwór do kanału, aż wyleje się z wylotu (w miejscu, w którym w kroku 3.3 została już włożona inna końcówka pipety).
  5. Oddziel pipetę od końcówki pipety i trzymaj te dwie końcówki pipet nadal włożone do wlotu i wylotu.
    UWAGA: Podczas pipetowania należy unikać powstawania pęcherzyków powietrza. Nie należy pozostawiać kciuka z tłoka do czasu oddzielenia pipety od końcówki pipety, aby zapobiec cofaniu się roztworu do kanału PDMS.

5. Generowanie tablicy kropel femtolitrowych (FemDA) dla CFPS

  1. Przenieś cały zestaw zmontowanego urządzenia do wstępnie schłodzonego bloku aluminiowego (patrz krok 4.2). Dokładnie upewnij się, że obszar matrycy mikrokomory szybko zmienia się z półprzezroczystego (Rysunek 2I) do przezroczystego (Rysunek 2J).
    UWAGA: Roztwór reakcyjny CFPS nie może dostać się bezpośrednio do mikrokomór. Rozpuszczalność powietrza w wodzie jest odwrotnie proporcjonalna do temperatury. Uwięzione powietrze rozpuści się w roztworze po przeniesieniu urządzenia z RT do niskiej temperatury. Zmiana przezroczystości jest wygodnym wizualnym wskaźnikiem do oceny, czy roztwór dostanie się do mikrokomór.
  2. Pobierz 30 μl wstępnie schłodzonego oleju do płukania (patrz krok 4.1) i natychmiast przenieś olej do końcówki pipety włożonej do wlotu przez jej górny otwór. Olej płuczący przemieszcza się do kanału i wytłacza nadmiar roztworu reakcyjnego znajdującego się na zewnątrz mikrokomór. Każda mikrokomora jest izolowana przez olej do spłukiwania.
    UWAGA: Ruchomy interfejs między roztworem reakcyjnym a olejem do spłukiwania jest widoczny, co pomaga ludziom obserwować ruch płynu wewnątrz kanału. Wytłaczany roztwór można zebrać do poprzedniej probówki, przechowywać w temperaturze 4 °C i ponownie wykorzystać do innego urządzenia FemDA lub równoległej reakcji masowej (w mikroprobówce lub płytce do mikromiareczkowania).
  3. Pobrać 30 μl oleju uszczelniającego (Fomblin Y25) do 200 μl przefiltrowanej końcówki pipety. Zawieś pipetę w pozycji pionowej.
  4. Jednocześnie wyjmij dwie włożone końcówki pipet (patrz kroki 3.3 i 4.4) z urządzenia. Natychmiast przenieś urządzenie z bloku aluminiowego na parafilm.
    UWAGA: Użyj pęsety, aby przymocować (ale trzymaj z dala od obszaru kanału) urządzenie na aluminiowym bloku na czas wyjmowania końcówek pipet.
  5. Natychmiast włożyć gotową końcówkę pipety zawierającą olej uszczelniający (patrz krok 5.3) do wlotu kanału PDMS i wstrzyknąć olej do kanału, aż wyleje się z wylotu.
    UWAGA: Wykonaj ten krok zaraz po przeniesieniu urządzenia do RT. Aby zapobiec cofaniu się do kanału, nie należy pozostawiać kciuka z tłoka, dopóki olej uszczelniający nie wyleje się z wylotu. Olej płuczący odparowuje natychmiast po wyjściu z kanału, podczas gdy następujący po nim olej uszczelniający gromadzi się na wylocie ze względu na wyjątkowo niskie straty podczas parowania.
  6. Odłącz pipetę od końcówki pipety, a następnie wyjmij końcówkę pipety z urządzenia. Oczyść powierzchnię PDMS za pomocą kawałka czystej wycieraczki, a następnie nałóż nową kroplę oleju uszczelniającego odpowiednio na wlot i wylot. Kropelki femtolitru są zamykane w indywidualnych mikrokomorach przez olej.
    UWAGA: Użyj pęsety, aby przymocować (ale trzymaj z dala od obszaru kanału) kanał PDMS na podłożu podczas wyjmowania końcówki mikropipety.
  7. Wytrzyj wilgoć nagromadzoną na dolnej powierzchni szkła nakrywkowego. Przygotowane urządzenie FemDA jest teraz gotowe do inkubacji i obrazowania mikroskopowego.

6. Obrazowanie mikroskopowe

  1. Uruchom odwrócony mikroskop fluorescencyjny. Poczekaj na stabilizację (chłodzenie) aparatu. Użyj soczewki obiektywowej z olejkiem 60x lub 100x. Ustaw urządzenie FemDA na zmotoryzowanym stoliku. Ustaw parametry obrazowania.
    UWAGA: Parametry obrazowania obejmują ścieżkę pliku, kanały obrazowania, filtry, czasy naświetlania (generalnie wystarczy 100 ms; możliwy jest również krótszy lub dłuższy czas w zależności od specyfikacji aparatu) oraz natężenie światła.
  2. Znajdź płaszczyznę ogniskowej. Dostosuj położenie osi z soczewki obiektywu i ustal płaszczyznę ogniskowej za pomocą wewnętrznego systemu autofokusa. Ustaw obszar zainteresowania (ROI; tj. oś x, oś y), który ma zostać zobrazowany.
    UWAGA: Główni producenci mikroskopów (Nikon, Olympus, Zeiss, Leica) oferują opcję integracji systemu autofokusa z mikroskopem. Ten system autofokusa jest niezbędny do utrzymania stałej płaszczyzny ogniskowej podczas automatycznego obrazowania wieloobszarowego. Zwroty z inwestycji obejmują obszar FemDA w kanale PDMS.
  3. Uchwyć obrazy fluorescencyjne. Uchwyć pojedynczą klatkę obrazu w rozmytym jasnym polu (BF) dla każdego zwrotu z inwestycji. NIE zmieniaj kolejności i współrzędnych ROI podczas obrazowania różnych kanałów.

7. Analiza danych obrazu

UWAGA: Analizuj dane obrazu za pomocą domowej roboty wtyczki (o nazwie "FemDA") opartej na Fidżi (http://fiji.sc), aby wyodrębnić intensywność fluorescencji każdej kropli43. Zainstaluj poprawną wersję Fiji zgodnie z systemem operacyjnym. Fidżi obsługuje większość formatów plików graficznych (np. plik nd2 z mikroskopu Nikon, plik czi z mikroskopu Zeiss) za pomocą wbudowanej wtyczki "Bio-Formats".

  1. Instalacja wtyczki
    1. Skopiuj i wklej plik wtyczki (który jest dostępny po zapytaniu u autora korespondencyjnego lub za pośrednictwem następującego linku instytucjonalnego: https://fbox.jamstec.go.jp/public/FcsQwAsMKIqA9j0B2MJwLUMeHGsxp09hAkAFdVhQIDkZ) do folderu "wtyczki" Fidżi.
    2. Uruchom oprogramowanie Fidżi; wtyczka "FemDA" znajduje się w menu rozwijanym "Wtyczki" Fidżi.
  2. Wstępne przetwarzanie danych obrazu
    1. Otwórz rozmyty obraz BF (patrz krok 6.3). Kliknij opcję Process (Proces) | Odejmij tło..., aby usunąć gładkie, ciągłe tła z każdej klatki danych obrazu (Rysunek 4B). Kliknij opcję Process (Proces) | Filtry | Mediana w celu zmniejszenia szumu w każdej klatce danych obrazu ( Rysunek 4C).
    2. Kliknij Obraz | Dostosuj | Próg do sprawdzenia i oddzielenia pierwszego planu (wskazującego mikrokomory) od tła (wskazującego obszar poza mikrokomorami) każdej klatki danych obrazu (powiększone wstawki w Rysunek 4A-C).
      UWAGA: Wybierz odpowiedni algorytm z listy rozwijanej w oknie Próg, tak aby tylko obszary mikrokomory, a także krawędzie każdej mikrokomory, mogły być zidentyfikowane i podświetlone jako pierwszy plan. W szczególności większość podświetlonych krawędzi musi być ciągła bez przerw.
  3. Wyznaczanie współrzędnych kropli
    1. Kliknij Wtyczki | FemDA | Analiza FemDA, aby otworzyć graficzny interfejs użytkownika (GUI) dostosowanej wtyczki (górna połowa Rysunek 4D).
    2. Wprowadź przybliżoną minimalną i maksymalną liczbę pikseli w pojedynczej mikrokomorze. Wprowadź oczekiwaną minimalną i maksymalną okrągłość (0: dowolny kształt; 1: idealne koło) mikrokomór. Wprowadź numer klatki początkowej i końcowej.
    3. Kliknij Generuj ROI w graficznym interfejsie użytkownika, aby wykryć każdą mikrokomorę, a pomyślnie wykryte ROI zostaną wyświetlone w wyskakującym okienku ROITable.
    4. Wróć do okna Analiza FemDA i kliknij przycisk Zastosuj maskę ROI, aby sprawdzić, czy mikrokomory nad ramkami zostały prawidłowo wykryte (w lewym dolnym rogu Rysunek 4D). Jeśli nie, zmodyfikuj niektóre z nich i powtórz kliknięcie Generuj ROI i Zastosuj maskę ROI. Jeśli tak, przejdź do następnego kroku.
      UWAGA: Może istnieć bardzo niewiele mikrokomór, których nie można dobrze zidentyfikować jako ROI (patrz dolna połowa Rysunek 4D) przez dowolny algorytm progu z powodu niewystarczającego kontrastu między pierwszym planem a tłem. Nie jest to problematyczne z punktu widzenia statystyki.
  4. Ekstrakcja intensywności fluorescencji
    1. Otwórz obraz fluorescencji i przesuń go na wierzch. Kliknij ponownie przycisk Zastosuj maskę ROI, aby zastosować określone ROI do obrazu fluorescencyjnego (w prawym dolnym rogu Rysunek 4D).
    2. Wybierz opcję One-Shot do analizy obrazu punktu końcowego (jak na przykładzie danych mNeonGreen) lub Time-Lapse do analizy danych przebiegu w czasie (jak na przykładzie danych fosfatazy alkalicznej).
    3. Wprowadź 100 w polu Liczba górnych pikseli oznacza, że tylko 100 górnych pikseli każdego ROI zostanie użytych do obliczenia średniej intensywności odpowiedniej kropli. Jeśli wprowadź 0 w liczbie górnych pikseli, wszystkie piksele każdego ROI zostaną użyte do obliczenia średniej intensywności odpowiedniej kropli.
      UWAGA: Może wystąpić przesunięcie o kilka pikseli między obrazami BF a obrazami fluorescencyjnymi, co oznacza, że niektóre piksele w obrębie ROI mogą należeć do tła obrazu fluorescencyjnego. W związku z tym wtyczka zapewnia opcję określenia liczby pikseli o najwyższej intensywności w celu obliczenia średniej intensywności każdej kropli.
    4. W celu analizy obrazu punktu końcowego (tj. wybierz opcję One-Shot w kroku 7.4.2), kliknij przycisk Zmierz intensywność, aby obliczyć średnią intensywność wszystkich wykrytych kropel. ROITable jest aktualizowany o nowe dane z obrazu fluorescencyjnego. W międzyczasie histogram jest wyświetlany w nowym wyskakującym oknie Histogram (Rysunek 4E).
      UWAGA: Zmiana rozmiaru pojemnika w polu Numer pojemnika może zoptymalizować wyświetlanie histogramu. Dopasowanie do sumy rozkładów Gaussa można osiągnąć w opracowanym graficznym interfejsie użytkownika. W wyskakującym oknie dziennika Fidżi wyświetlane są wyniki dopasowania. Alternatywnie, wyeksportuj dane, klikając przycisk Zapisz jako tekst i przeprowadź różne analizy statystyczne za pomocą innego oprogramowania (Rysunek 4F, G).
    5. W celu analizy obrazu przebiegu czasu (tj. wybierz opcję Time-Lapse w kroku 7.4.2), wyskakującym okienkiem jest Intensywność Przebieg czasu zamiast Histogramu, który zawiera histogram odpowiadający określonemu punktowi czasowemu i wykres intensywności czasu (Rysunek 5). Dane tekstowe można również wyeksportować za pomocą menu Plik w oknie kontekstowym.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Proces mikrofabrykacji składa się z czyszczenia podłoża, funkcjonalizacji powierzchni, nanoszenia powłoki CYTOP, fotolitografii, trawienia suchego, usuwania fotorezystu oraz końcowego czyszczenia. Co istotne, przedstawiony protokół pozwolił na całkowite usunięcie hydrofobowego polimeru CYTOP z wnętrza mikrokomerek (Ryc. 3A), co doprowadziło do powstania wysoce równoległej struktury hydrofilowej wewnątrz hydrofobowej na standardowym podłożu ze szkiełka podstawowego. Dzięki zastosowaniu protok...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Wysoce ilościowy pomiar oparty na wysoce jednorodnych, stabilnych i biokompatybilnych kropelkach w FemDA umożliwił dyskretny rozkład, co jest unikalną cechą naszego badania różniącą się od innych. W tym artykule systematycznie optymalizowaliśmy i szczegółowo opisywaliśmy procesy mikrowytwarzania i tworzenia kropel. W ustalonym protokole znajduje się kilka krytycznych kroków.

Po pierwsze, jednolita powłoka polimeru CYTOP o wysokiej lepkości na prostokątnym cienkim podłożu szklanym w dużej mierz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez grant JSPS KAKENHI numer JP18K14260 oraz budżet Japońskiej Agencji ds. Nauki i Technologii Morskiej i Ziemi. Dziękujemy Shigeru Deguchi (JAMSTEC) i Tetsuro Ikuta (JAMSTEC) za udostępnienie urządzeń do charakteryzacji. Dziękujemy Kenowi Takai (JAMSTEC) za wsparcie w zakresie oprogramowania komercyjnego. Mikrofabrykacja została przeprowadzona w Takeda Sentanchi Supercleanroom na Uniwersytecie Tokijskim, przy wsparciu "Nanotechnology Platform Program" Ministerstwa Edukacji, Kultury, Sportu, Nauki i Technologii (MEXT), Japonia, grant numer JPMXP09F19UT0087.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
(3-aminopropylo)trietoksysilanSigma-Aldrich440140
1 ml strzykawkaTerumoSS-01T
2-propanolKanto ChemicalEL gradeEL: do użytku elektronicznego.
Laserowy skaningowy mikroskop konfokalny 3DLasertecOPTELICS HYBRIDZastosowanie mają również inne podobne mikroskopy (np. Keyence VK-X1000, Olympus LEXT OLS5000).
Strzykawka 50 mlTerumoSS-50LZ
Fosforan 6,8-difluoro-4-metylobelokliferyluThermo Fisher ScientificD6567Przygotować 5 mM roztwór podstawowy w dimetylosulfotlenku
AcetonieKanto ChemicalEL gradeEL: do użytku elektronicznego.
Czystość 99,8%.
Dmuchawa powietrzaHozanZ-263
Blok aluminiowyBIO-BIKAB-24M-02
Aluminiowy stojak na mikroprobówkiBIO-BIKAB-136C
ASAHIKLIN AE-3000AGC(próbka testowa)Bezpłatna próbka testowa może być dostępna na zapytanie do AGC.
Wycieraczka BEMCOT PS-2Ozu028208
Dziurkacz do biopsji z tłokiemKaiBPP-10F
Szkło osłonoweSzkło Matsunami nr1 (24 mm i razy 32 mm, grubość 0,13 ~ 0,17 mm)Dostosowane do rozmiaru.
Stojak na witraże do szkła nakrowegoNakayama803-131-11
CRECIA TechnoWipe czysta wycieraczkaNippon Paper CreciaC100-M
Mata do cięciaGE HealthcareWB100020
CYTOPAGCCTL-816AP
Mieszalnik odgazowującyThinkyAR-100
Nóż biurkowyRolandSTIKA SV-8
DeweloperAZ Electronic MaterialsAZ 300 MIFFirma AZ Electronic Materials została przejęta przez Merck.
Inne wywoływacze alkaliczne mogą być również odpowiednie, ale powinny wymagać optymalizacji warunków rozwoju (czas, temperatura itp.)
Podwójnie powlekana samoprzylepna taśma foliowa KaptonTeraoka Seisakusho7602 #25
EtanolKanto ChemicalEL klasaEL: do użytku elektronicznego.
Czystość 99,5%.
Fidżi: ImageJ 1.51n
Płaski nóż doTokyo-IDEALMT-0100
Olej FomblinSolvayY25 lub Y25/6Bezpłatna próbka testowa może być dostępna na zapytanie do Solvay. Fomblin Y25/6 jest alternatywą, jeśli Y25 nie jest łatwo dostępny.
Płyta grzejnaAS ONETH-900
Igła iniekcyjnaTerumoNN-2270C22G i razy 70 mm
Wymagany jest odwrócony mikroskop fluorescencyjnyNikonEclipse Ti-ESpecyfikacja epifluorescencji, kamera CCD lub sCMOS, zmotoryzowany stolik, system autofokusa i obiektyw o wysokiej NA.
KaleidaGraphSynergyWersja: 4.5
Nakładka do maskiSUSSMA-6Inne nakładki na maski są również stosowane, o ile dostępny jest tryb kontaktu próżniowego.
Pipeta MICROMANGILSONE M250EKońcówka tłoka kapilarnego: CP250
Microsoft ExcelMicrosoft: 16.16.15
Mini komora próżniowaJAKO JEDNAMVP-100MV
Woda wolna od nukleazNIPPON GENE316-90101
Probówka do PCR ParafilmAmcorPM-996
NIPPON GeneticsFG-021D/SP
Szalka PetriegoAS ONEGD90-15Średnica 90 mm, wysokość 15 mm.
Firma PhotoresistAZ Electronic MaterialsAZ P4903Firma AZ Electronic Materials została przejęta przez firmę Merck. Alternatywą jest AZ P4620.
Czytnik płytekBioTekPOWERSCAN HT
Rękawice polietylenoweAS ONE6-896-02Nazwa handlowa: Saniment.
Zestaw do syntezy białek in vitro PURExpressNew England BiolabsE6800S lub E6800LDo bezkomórkowej reakcji syntezy białek.
System trawienia jonami reaktywnymiSamcoRIE-10NRInne systemy RIE również mają zastosowanie, ale powinny wymagać optymalizacji warunków RIE (natężenie przepływu gazu, ciśnienie w komorze, moc RF, czas trawienia itp.)
Inhibitor RNazyNew England BiolabsM0314S Taśma
klejąca3M810-1-18D
Roztwór wodorotlenku soduFUJIFILM Wako Pure Chemical194-09575Stężenie 8 M; niebezpieczeństwo.
Powlekarka wirowaOshiganeSC-308
SURFLON S-386 środek powierzchniowo czynnyAGC(próbka testowa)Bezpłatna próbka testowa może być dostępna na zapytanie do AGC.
SYLGARD 184 elastomer silikonowyDowSylgard184Skład chemiczny: polidimetylosiloksan. Domyślny stosunek mieszania to podstawa : utwardzacz = 10 : 1 (m / m).
PęsetaIdeal-tek2WF. SA.1
2A
AS ONEASU-2M
Uchwyt próżniowyOshigane(dostosowany)Materiał: delrin; prostokątny stolik na próbkę z wieloma otworami (48 otworów, każdy o średnicy 1 mm); rozmiar jest dostosowany do rozmiaru szkła nakrywkowego (24 mm i razy 32 mm).
Wersja Wersja Myjka ultradźwiękowa

Bibliografia

  1. Chiu, D. T., Lorenz, R. M., Jeffries, G. D. M. Droplets for ultrasmall-volume analysis. Analytical Chemistry. 81 (13), 5111-5118 (2009).
  2. Squires, T. M., Quake, S. R. Microfluidics: fluid physics at the nanoliter scale. Reviews of Modern Physics. 77 (3), 977-1026 (2005).
  3. Guo, M. T., Rotem, A., Heyman, J. A., Weitz, D. A. Droplet microfluidics for high-throughput biological assays. Lab on a Chip. 12 (12), 2146-2155 (2012).
  4. Zhu, P. A., Wang, L. Q. Passive and active droplet generation with microfluidics: a review. Lab on a Chip. 17 (1), 34-75 (2017).
  5. Griffiths, A. D., Tawfik, D. S. Miniaturising the laboratory in emulsion droplets. Trends in Biotechnology. 24 (9), 395-402 (2006).
  6. Tran, T. M., Lan, F., Thompson, C. S., Abate, A. R. From tubes to drops: droplet-based microfluidics for ultrahigh-throughput biology. Journal of Physics D: Applied Physics. 46 (11), 114004(2013).
  7. Zhang, Y., Jiang, X. Microfluidic tools for DNA analysis. DNA Nanotechnology. Fan, C. , Springer. Heidelberg. 113-153 (2013).
  8. Dubuc, E., et al. Cell-free microcompartmentalised transcription-translation for the prototyping of synthetic communication networks. Current Opinion in Biotechnology. 58, 72-80 (2019).
  9. Damiati, S., Mhanna, R., Kodzius, R., Ehmoser, E. K. Cell-free approaches in synthetic biology utilizing microfluidics. Genes. 9 (3), (2018).
  10. Lee, K. H., Kim, D. M. Applications of cell-free protein synthesis in synthetic biology: Interfacing bio-machinery with synthetic environments. Biotechnology Journal. 8 (11), 1292-1300 (2013).
  11. Supramaniam, P., Ces, O., Salehi-Reyhani, A. Microfluidics for artificial life: techniques for bottom-up synthetic biology. Micromachines. 10 (5), (2019).
  12. Bowman, E. K., Alper, H. S. Microdroplet-assisted screening of biomolecule production for metabolic engineering applications. Trends in Biotechnology. , (2019).
  13. Zhang, Y., et al. Accurate high-throughput screening based on digital protein synthesis in a massively parallel femtoliter droplet array. Science Advances. 5 (8), 8185(2019).
  14. Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications. Nature Reviews Genetics. , (2019).
  15. Sakane, Y., Suzuki, Y., Kasagi, N. The development of a high-performance perfluorinated polymer electret and its application to micro power generation. Journal of Micromechanics and Microengineering. 18 (10), 104011(2008).
  16. Sakakihara, S., Araki, S., Iino, R., Noji, H. A single-molecule enzymatic assay in a directly accessible femtoliter droplet array. Lab on a Chip. 10 (24), 3355-3362 (2010).
  17. Watanabe, R., et al. Arrayed lipid bilayer chambers allow single-molecule analysis of membrane transporter activity. Nature Communications. 5, 4519(2014).
  18. Chiu, C., Lisicka-Skrzek, E., Tait, R. N., Berini, P. Fabrication of surface plasmon waveguides and devices in Cytop with integrated microfluidic channels. Journal of Vacuum Science & Technology B. 28 (4), 729-735 (2010).
  19. Krupin, O., Asiri, H., Wang, C., Tait, R. N., Berini, P. Biosensing using straight long-range surface plasmon waveguides. Optics Express. 21 (1), 698-709 (2013).
  20. Hanada, Y., Ogawa, T., Koike, K., Sugioka, K. Making the invisible visible: a microfluidic chip using a low refractive index polymer. Lab on a Chip. 16 (13), 2481-2486 (2016).
  21. Berry, S., Kedzierski, J., Abedian, B. Low voltage electrowetting using thin fluoroploymer films. Journal of Colloid and Interface Science. 303 (2), 517-524 (2006).
  22. Lin, Y. Y., et al. Low voltage electrowetting-on-dielectric platform using multi-layer insulators. Sensors and Actuators B-Chemical. 150 (1), 465-470 (2010).
  23. Kimura, H., Yamamoto, T., Sakai, H., Sakai, Y., Fujii, T. An integrated microfluidic system for long-term perfusion culture and on-line monitoring of intestinal tissue models. Lab on a Chip. 8 (5), 741-746 (2008).
  24. Yang, T. J., Choo, J., Stavrakis, S., de Mello, A. Fluoropolymer-coated PDMS microfluidic devices for application in organic synthesis. Chemistry-a European Journal. 24 (46), 12078-12083 (2018).
  25. de Gennes, P. G. Wetting: statics and dynamics. Reviews of Modern Physics. 57 (3), 827-863 (1985).
  26. Holtze, C., et al. Biocompatible surfactants for water-in-fluorocarbon emulsions. Lab on a Chip. 8 (10), 1632-1639 (2008).
  27. Wagner, O., et al. Biocompatible fluorinated polyglycerols for droplet microfluidics as an alternative to PEG-based copolymer surfactants. Lab on a Chip. 16 (1), 65-69 (2016).
  28. Mashaghi, S., Abbaspourrad, A., Weitz, D. A., van Oijen, A. M. Droplet microfluidics: a tool for biology, chemistry and nanotechnology. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 82, 118-125 (2016).
  29. Mazutis, L., et al. Droplet-based microfluidic systems for high-throughput single DNA molecule isothermal amplification and analysis. Analytical Chemistry. 81 (12), 4813-4821 (2009).
  30. Galinis, R., et al. DNA nanoparticles for improved protein synthesis in vitro. Angewandte Chemie-International Edition. 55 (9), 3120-3123 (2016).
  31. Zhang, Y., Noji, H. Digital bioassays: theory, applications, and perspectives. Analytical Chemistry. 89 (1), 92-101 (2017).
  32. Mazutis, L., et al. Single-cell analysis and sorting using droplet-based microfluidics. Nature Protocols. 8 (5), 870-891 (2013).
  33. Courtois, F., et al. An integrated device for monitoring time-dependent in vitro expression from single genes in picolitre droplets. ChemBioChem. 9 (3), 439-446 (2008).
  34. Baret, J. C. Surfactants in droplet-based microfluidics. Lab on a Chip. 12 (3), 422-433 (2012).
  35. Agresti, J. J., et al. Ultrahigh-throughput screening in drop-based microfluidics for directed evolution. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (9), 4004-4009 (2010).
  36. Fallah-Araghi, A., Baret, J. C., Ryckelynck, M., Griffiths, A. D. A completely in vitro ultrahigh-throughput droplet-based microfluidic screening system for protein engineering and directed evolution. Lab on a Chip. 12 (5), 882-891 (2012).
  37. Duncombe, T. A., Dittrich, P. S. Droplet barcoding: tracking mobile micro-reactors for high-throughput biology. Current Opinion in Biotechnology. 60, 205-212 (2019).
  38. Qin, D., Xia, Y. N., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro- and nanoscale patterning. Nature Protocols. 5 (3), 491-502 (2010).
  39. Mukhopadhyay, R. When PDMS isn't the best. Analytical Chemistry. 79 (9), 3248-3253 (2007).
  40. Shaner, N. C., et al. A bright monomeric green fluorescent protein derived from Branchiostoma lanceolatum. Nature Methods. 10 (5), 407-409 (2013).
  41. Bradshaw, R. A., et al. Amino acid sequence of Escherichia coli alkaline phosphatase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 78 (6), 3473-3477 (1981).
  42. Shimizu, Y., et al. Cell-free translation reconstituted with purified components. Nature Biotechnology. 19 (8), 751-755 (2001).
  43. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  44. Mantilla, C. B., Prakash, Y. S., Sieck, G. C. Volume measurements in confocal microscopy. Techniques in Confocal Microscopy. Conn, P. M. , Academic Press. Oxford, UK. 143-162 (2010).
  45. Noji, H. Single-molecule counting of biomolecules with femtoliter dropret chamber array. The 17th International Conference on Solid-State Sensors, Actuators and Microsystems (TRANSDUCERS & EUROSENSORS XXVII. , 630-632 (2013).
  46. Zhang, Y., et al. Matrix-localization for fast analysis of arrayed microfluidic immunoassays. Analytical Methods. 4 (10), 3466-3470 (2012).
  47. Zhang, Y., et al. Two dimensional barcode-inspired automatic analysis for arrayed microfluidic immunoassays. Biomicrofluidics. 7 (3), 034110(2013).
  48. Gonzalez, R. C., Woods, R. E. Digital image processing. , Pearson. New York, NY. (2018).
  49. Cohen, L., Walt, D. R. Single-molecule arrays for protein and nucleic acid analysis. Annual Review of Analytical Chemistry. 10 (1), 345-363 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Bezkom rkowa synteza bia ekmacierz mikrokomerekprotok uszczelniania olejemmikroskopia fluorescencyjnamikroskopia konfokalnaanaliza obrazuwydajno bia kaaktywno enzymatyczna
Femtolitrowa matryca kropelkowa do masowo równoległej syntezy białek z pojedynczych cząsteczek DNA
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.