Mikroskopia sił trakcyjnych do badania aktywacji limfocytów B

Summary

Tutaj prezentujemy protokół używany do przeprowadzania eksperymentów z mikroskopią siły trakcyjnej na komórkach B. Opisujemy przygotowanie miękkich żeli poliakrylamidowych i ich funkcjonalizację, a także pozyskiwanie danych pod mikroskopem i podsumowanie analizy danych.

Abstract

Mikroskopia siły trakcyjnej (TFM) umożliwia pomiar sił wytwarzanych przez komórkę na podłożu. Technika ta wyprowadza pomiary siły pociągowej na podstawie eksperymentalnie zaobserwowanego pola przemieszczenia wytwarzanego przez komórkę ciągnącą na elastycznym podłożu. Tutaj dostosowaliśmy TFM do zbadania przestrzennej i czasowej struktury pola siłowego wywieranego przez komórki B, gdy jest aktywowane przez zaangażowanie antygenu w receptor komórek B. Sztywność żelu, gęstość kulek i funkcjonalizacja białek muszą być zoptymalizowane pod kątem badania stosunkowo małych komórek (~ 6 μm), które oddziałują z ligandami receptorów na powierzchni komórki i reagują na nie specyficznie.

Introduction

B Limfocyty są komórkami układu odpornościowego wytwarzającymi przeciwciała. Aby aktywować adaptacyjną odpowiedź immunologiczną, najpierw pozyskują antygen w formie natywnej (tj. nieprzetworzonej) przez specyficzny receptor zwany receptorem komórek B (BCR)¹. Proces ten zachodzi w strefie komórek węzła chłonnego B. Nawet jeśli niektóre antygeny mogą dotrzeć do komórki B przez płyny limfatyczne, większość antygenów, zwłaszcza o dużej masie cząsteczkowej (>70 kDa, co jest rozmiarem granicznym dla przewodów limfatycznych) jest rzeczywiście prezentowana w swojej natywnej postaci na powierzchni komórki prezentującej antygen (APC), zwykle makrofaga zatokowego podtorebkowego lub pęcherzykowej komórki dendrytycznej, poprzez lektynę lub receptory Fc (niespecyficzne). Kontakt z tą komórką prowadzi do powstania synapsy immunologicznej, w której BCR wywiera siłę na antygeny związane z APC. Wiązanie antygenu z BCR inicjuje sygnalizację BCR, która może aktywować mechanizmy generujące siłę. Siły te mogą być ważne dla wzmocnienia sygnalizacji BCR, ale są również niezbędne dla komórek B do ekstrakcji, a następnie internalizacji antygenu.

Ostatnie badania wykazały, że BCR jest rzeczywiście mechanowrażliwy². Na przykład sztywniejsze podłoża wywołują wzmocnioną sygnalizację BCR³. Co więcej, siła generowana w synapsie immunologicznej przyciąga pojedyncze BCR, aby zbadać jej powinowactwo do antygenu, a tym samym zapewnić dyskryminację powinowactwa⁴. W związku z tym interesujące jest zbadanie mechanicznej odpowiedzi limfocytów B na prezentację antygenu i przeanalizowanie tej odpowiedzi pod kątem typu zaangażowanych receptorów (IgG/IgM)⁵, cząsteczek adhezyjnych (ligandy integrynowe) lub w komórkach modyfikowanych farmakologicznie i genetycznie (tj. wyciszenie białka poniżej sygnalizacji BCR lub dynamiki cytoszkieletu)⁶.

Prostą metodą obserwacji reakcji komórki na substrat o sztywności fizjologicznej i jednocześnie badania sił wywieranych na podłoże jest Mikroskopia Sił Trakcyjnych (TFM). TFM polega na obserwacji pola przemieszczenia wytwarzanego przez komórkę ciągnącą po elastycznym podłożu. Pierwotnie deformacja żelu była obserwowana poprzez zmarszczki samego elastomeru za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym⁷, ale wprowadzenie mikrokulek fluorescencyjnych jako markerów odniesienia pozwoliło na lepszą rozdzielczość i od tego czasu stało się standardem⁸. Metoda ta została wykorzystana do zbadania siły trakcyjnej wywieranej przez przylegające komórki, tkanki, a nawet organoidy osadzone w żelach. Opracowano kilka wariantów TFM⁹, w tym połączenie z mikroskopią superrozdzielczą (tj. STED¹⁰ lub SRRF¹¹), modyfikacja współczynnika załamania światła żelu, aby umożliwić mikroskopię TIRF¹², zastępując koraliki nanodrukowanymi wzorami¹³ oraz używając nanofilarów zamiast płaskiej powierzchni¹⁴. Aby uzyskać pełny przegląd tych odmian, zobacz Colin-York et al.¹⁵.

Przedstawiony tutaj protokół opisuje procedurę pomiaru sił wywieranych przez limfocyty B na podłoże pokryte antygenem. Siły te są przykładane do ligandów (antygenu) w celu ich zgrupowania, a następnie wyekstrahowania z substratu prezentującego antygen. Dostosowaliśmy standardowy protokół TFM, aby naśladować sztywność fizjologicznych substratów prezentujących antygen, rozmiar i odpowiednią powłokę dla komórek B. Protokół ten pozwala na badanie kilku komórek jednocześnie i może być stosowany w połączeniu z technikami mikroskopii fluorescencyjnej i zabiegami chemicznymi. Nie ma jednak na celu sondowania pomiarów siły pojedynczej cząsteczki, dla których bardziej odpowiednimi technikami są pęsety optyczne¹⁶, sondy napięcia molekularnego^17,18, sondy siły biomembranowej¹⁹ i mikroskopia sił atomowych²⁰ są bardziej odpowiednimi technikami. W porównaniu z innymi metodami pomiaru siły pojedynczej komórki (np. mikropipetami²¹ lub microplates²²) TFM pozwala na rekonstrukcję pełnej mapy sił wywieranych na synapsę z rozdzielczością ~300 nm. Jest to przydatne do identyfikacji wzorców czasoprzestrzennych w siłach wywieranych na powierzchnię, a ponieważ żel jest kompatybilny z obrazowaniem konfokalnym, do korelowania ich z rekrutacją określonych białek (na przykład cytoszkieletu i białek sygnałowych).

Chociaż 3D TFM jest możliwe, nie jest kompatybilne ze sztywnością i konfiguracją, której używaliśmy. Deformacje w 3D można osiągnąć za pomocą innych, bardziej złożonych konfiguracji, takich jak mikroskopia sił wypukłości (AFM skanuje odkształcalną membranę, na której komórki są platerowane)^23,24 i mikroskopia naprężeń interferencyjnych rezonatora sprężystego (ERISM, żel działający jak wnęka rezonansowa dla światła i podkreślający deformacje podłoża z dokładnością do kilku nanometrów)²⁵. Chociaż techniki te są bardzo obiecujące, nie zostały jeszcze zastosowane w komórkach B. Inne typy TFM, takie jak nanopillars¹⁴, mogą być używane do uzyskania bardziej powtarzalnych substratów. Jednak ta geometria nie jest dostosowana do komórek miękkich, ponieważ komórka przenika się z filarami, co komplikuje analizę. To podejście zostało rzeczywiście wykorzystane w komórkach T do obserwacji zdolności komórki do budowania struktur wokół filarów²⁶.

Pomimo swojej prostoty, TFM wykorzystujący żele poliakrylamidowe pozwala na jednoczesną obserwację wielu komórek i może być łatwo i tanio wdrożone w każdym laboratorium wyposażonym w stół i mikroskop epifluorescencyjny (chociaż zalecamy dysk konfokalny/wirujący).

Aby naśladować fizjologiczną sztywność APC, użyliśmy żeli poliakrylamidowych o sztywności ~500 Pa^{27 i funkcjonalizowaliśmy} żel antygenami aktywującymi. W tym protokole funkcjonalizowaliśmy powierzchnię żelu poliakrylowoamidowego lizozymem jaj kurzych (HEL). Pozwala to na pomiar sił generowanych przez stymulację BCR poprzez zaangażowanie miejsca wiązania antygenu. Zastosowanie tego antygenu i specyficznych dla hel limfocytów B myszy MD4 zapewnia stosunkowo równomierne generowanie siły w odpowiedzi na ligację antygenu²⁸. Jednak inne cząsteczki (takie jak anty-IgM dla myszy B6) mogą być szczepione w żelu, ale siły generowane w tych przypadkach mogą być bardziej niejednorodne i mniej intensywne. Ponieważ komórki B są małymi komórkami (średnica ~6 μm), liczba kulek została zoptymalizowana tak, aby była maksymalna, ale nadal możliwa do śledzenia. W przypadku dużych komórek, które wywierają siły ~kPa na swoje podłoża, można osiągnąć zadowalające wyniki przy użyciu stosunkowo rzadkich kulek lub wykonując prostą prędkość obrazu cząstek (PIV) w celu zrekonstruowania pola deformacji. Jednak w przypadku małych komórek, takich jak limfocyty B, które wywierają naprężenia o natężeniu tak małym jak ~50 Pa, wymagane jest zastosowanie śledzenia pojedynczych cząstek (prędkość śledzenia cząstek, PTV), aby osiągnąć pożądaną dokładność podczas rekonstrukcji pola deformacji. Aby niezawodnie śledzić koraliki indywidualnie, powiększenie soczewki obiektywu musi wynosić co najmniej 60x, a jej apertura numeryczna około 1,3. W związku z tym żele muszą być stosunkowo cienkie (<50 μm), w przeciwnym razie kulki nie są widoczne, ponieważ znajdują się powyżej odległości roboczej obiektywu.

Główny protokół składa się z trzech sekcji: przygotowania żelu, funkcjonalizacji żelu i obrazowania; dwie kolejne sekcje są opcjonalne i są poświęcone ekstrakcji antygenu, kwantyfikacji i obrazowaniu komórek fluorescencyjnych.

Protocol

1. Przygotowanie żelu

1. Silanizacja podpory żelowej
   1. Aktywuj szkiełko nakrywkowe lub szalkę Petriego ze szklanym dnem (które będą używane jako podpora żelu) za pomocą lampy UV na 2 minuty (odczekaj 30 s przed wystawieniem na działanie lampy UV, aby uniknąć narażenia na resztkowy ozon).
   2. Silanizować szkiełko nakrywkowe/naczynie ze szklanym dnem za pomocą 200 μl aminopropylotrimetoksysilanu (APTMS) przez 5 minut. To przygotuje podparcie dla kowalencyjnego wiązania żelu.
   3. Dokładnie umyj szkiełko nakrywkowe/naczynie ze szklanym dnem ultraczystą wodą.
   4. Wysuszyć szkiełko nakrywkowe/naczynie ze szklanym dnem za pomocą aspiracji próżniowej.
2. Przygotowanie szkiełka nakrywkowego o średnicy 18 mm służącego do spłaszczania żelu
   1. Aby przygotować szkiełka nakrywkowe, najpierw włóż je do ceramicznego uchwytu na szkiełko nakrywkowe. Następnie umieścić uchwyt na szkiełko nakrywkowe w małej zlewce (50 ml) i wlać odczynnik silikonowy (przechowywany w temperaturze 4 °C, wielokrotnego użytku) na szkiełka nakrywkowe, upewniając się, że całkowicie je przykrył.
   2. Przykryj zlewkę folią aluminiową i inkubuj przez 3 minuty w temperaturze pokojowej. Czekając, napełnij dużą zlewkę (500 ml) ultraczystą wodą. Po 3 minutach inkubacji w odczynniku silikonowym przenieść uchwyt szkiełka nakrywkowego z szkiełkami nakrywkowymi do zlewki z wodą.
   3. Dokładnie spłucz szkiełka nakrywkowe ultraczystą wodą, dobrze je wysusz i trzymaj na chusteczkach papierowych. Aby uzyskać najlepsze wyniki, przejdź natychmiast do następnej sekcji.
3. Polimeryzacja żelu
   1. W przypadku żeli o natężeniu 0,5 kPa należy zmieszać 75 μl 40% akrylamidu z 30 μl 2% bisakryloamidu (środek sieciujący) i 895 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Premiks ten może być przechowywany przez okres do jednego miesiąca w temperaturze 4 °C.
   2. Do 167 μl premiksu żelowego o natężeniu 0,5 kPa należy dodać 1% (1,67 μL) kulek, wirować i sonikować przez 5 minut w kąpieli sonikatowej (standardowa stołowa myjka ultradźwiękowa o mocy 50–100 W i częstotliwości 40 kHz). Chroń mieszankę przed światłem za pomocą folii aluminiowej.
      UWAGA: Premiks nie polimeryzuje, dopóki nie zostanie dodany inicjator (TEMED).
   3. Aby katalizować polimeryzację, dodaj 1% (1,67 μl) 10% w/v nadsiarczanu amonu (APS).
   4. Aby zainicjować polimeryzację, dodaj 0,1% (0,2 μL) N,N,N′,N′-Tetrametyloetylenodiamina (TEMED). Wymieszać pipetą. Po dodaniu APS i TEMED żel szybko polimeryzuje, więc szybko przejdź do odlewania żelowego.
4. Odlewanie żelowe
   1. Odpipetuj 9 μl mieszanki żelowej na każde naczynie nakrywkowe/ze szklanym dnem (kropla w środku, Rysunek 1A)
   2. Umieść silanizowane/hydrofobowe szkiełko nakrywkowe i spłaszcz żel (Rysunek 1B). Za pomocą kleszczy dociśnij szkiełko nakrywkowe, aby upewnić się, że żel rozprowadza się po całej powierzchni szkiełka nakrywkowego (Rysunek 1C), aż zacznie wyciekać.
   3. Odwróć szkiełko nakrywkowe/naczynie ze szklanym dnem do dużej szalki Petriego i postukaj nim o ławkę, aby wymusić kulki przesuwające się w kierunku powierzchni żelu (Rysunek 1D).
   4. Przykryj folią aluminiową i pozostaw na 1 godzinę do polimeryzacji w temperaturze pokojowej w wilgotnej komorze (tj. umieść mokrą chusteczkę nad naczyniem, aby zapobiec parowaniu).
   5. Po upływie 1 godziny dodać PBS do próbki, aby ułatwić uwalnianie szkiełka nakrywkowego. Ostrożnie usuń szkiełko nakrywkowe za pomocą igły (powłoka z różnymi silanami powinna umożliwiać łatwe odklejanie się szkiełka nakrywkowego od żelu, Rysunek 1E).
   6. Pozostaw żel w PBS.
      UWAGA: Żele można teraz przechowywać w PBS w temperaturze 4 °C przez 5–7 dni, ale zaleca się ich zużycie w ciągu 48 godzin.

2. Funkcjonalizacja żelu

1. Przygotować roztwór 6-(4'-azydo-2'-nitrofenyloamino)heksanianu sulfosukcynimidylu (Sulfo SANPAH) o stężeniu 0,5 mg/ml w 10 mM buforze HEPES. Można go przechowywać w temperaturze 4 °C przykryty folią aluminiową do jednego tygodnia.
2. Odessać PBS z żeli.
3. Dodać 150 μl Sulfo SANPAH do żelu w temperaturze pokojowej (Rysunek 1F).
4. Wystaw żel na działanie promieniowania UV przez 2 minuty, aby fotoaktywować miejsca Sulfo SANPAH i sprawić, że przyklei się do powierzchni żelu.
5. Umyj PBS trzy razy (Rysunek 1G).
6. Powtórz kroki 2.2–2.5.
7. Dodaj 250 μl HEL (100 μg/ml) do każdego żelu i inkubuj przez noc w wilgotnej komorze w temperaturze 4 °C przez noc, przykrywając folią aluminiową (Rysunek 1H).
8. Usunąć antygen HEL i trzykrotnie przemyć PBS.
   UWAGA: HEL działa zarówno jako antygen, jak i jako cząsteczka adhezyjna. Może być zastąpiony przez inne cząsteczki, które wiążą się z receptorem (np. IgM anty-mysie, albumina surowicy bydlęcej, albumina jaja kurzego) lub zmieszany z ligandami integrynowymi (np. ICAM1 wiążący się z LFA1). W razie potrzeby ekstrakcję antygenu można zaobserwować za pomocą fluorescencyjnej wersji HEL (otrzymanej przez barwienie cząsteczki za pomocą zestawu do znakowania białek, patrz krok 4). Należy pamiętać, że dane stężenie luzem może nie dawać takiego samego stężenia powierzchniowego na żelu, jak na szkle: należy to określić ilościowo za pomocą wtórnego barwienia, jeśli wymagane jest bezpośrednie porównanie.

3. Ładowanie komórek i obrazowanie

1. Przed obrazowaniem usuń PBS z żeli i dodaj 500 μl pożywki z komórek B (RPMI 1640, 10% zdekomplementowana płodowa surowica cielęca, 1% penicylina-streptomycyna, 2% pirogronian sodu, 50uM merkaptoetanol i 1X aminokwasy endogenne) i pozwól im zrównoważyć się do RT.
2. Przygotowanie komórek
   1. Oczyść pierwotne limfocyty B ze śledziony zgodnie z protokołem selekcji negatywnej (patrz tabela materiałów). Typowa końcowa wydajność komórek B wynosi około 1 x 10⁷ komórek. Skoncentruj to do 3 x 10⁶ komórek/ml w pożywce z komórek B (RPMI-1640 uzupełniony 10% płodową surowicą cielęcą, 1% penicyliną-streptomycyną, 0,1% merkaptoetanolem i 2% pirogronianem sodu).
   2. Przechowuj komórki w razie potrzeby do 6 godzin w temperaturze 4 °C.
   3. Utrzymuj komórki w temperaturze 37 °C przez 30 minut przed pobraniem obrazu.
3. Obrazowania
   1. Użyj mikroskopu konfokalnego z kontrolą termiczną i (ewentualnie) CO₂ .
      UWAGA: Niezależnie od tego, czy używany jest mikroskop konfokalny czy z wirującym dyskiem, ważne jest, aby używać obiektywu/otworka, który pozwala na rozmiar piksela <200 nm, aby wygodnie śledzić kulki w fazie analizy (np. 60x, NA 1,3). Można również zastosować mikroskopię epifluorescencyjną, jednak zapewnia ona niższy stosunek sygnału do szumu i może utrudnić śledzenie poszczególnych kulek.
   2. Dwie główne warstwy koralików pojawią się na dole i na górze żelu. Skoncentruj się na płaszczyźnie żelu.
      UWAGA: Ładny żel pojawi się jako gwiaździste niebo, z koralikami w przybliżeniu równomiernie rozmieszczonymi na tej samej płaszczyźnie.
   3. Zaprogramuj akwizycję przez 30 minut z szybkością odświeżania 5 s (można ją dostosować do potrzeb eksperymentu, np. uzyskać inne kolory, uzyskać stos z itp.)
   4. Odessać pożywkę z żelu, pozostawiając na żelu około 200 μl pożywki. Umieść żel na mikroskopie i znajdź powierzchniową warstwę kulek i ładny równy obszar na żelu.
   5. Dodaj 80 μl komórek (unikaj dotykania żelu, aby utrzymać koncentrację).
   6. Upewnij się, że ostrość jest nadal prawidłowa i że komórki są widoczne opadające w obszarze (w świetle przechodzącym). Uruchom akwizycję, zanim komórki dotrą do żelu.
   7. W przypadku przypadkowego kontaktu z żelem, wibracji lub dryftu ostrości, wyreguluj ostrość.
      UWAGA: Bardzo ważne jest, aby zebrać obraz zrelaksowanego żelu i może to być dowolny obraz wykonany przed przybyciem komórek na żelu.

4. Eksperyment z ekstrakcją fluorescencyjną HEL

1. Przygotuj fluorescencyjny HEL, wiążąc barwnik fluorescencyjny (o kolorze innym niż koraliki, taki jak Alexa 555), patrz Tabela materiałów.
2. W kroku 2.7 zastąp konwencjonalny HEL fluorescencyjnym HEL.
3. Uzyskuj obrazy przy niskich ustawieniach oświetlenia lub niskiej liczbie klatek na sekundę (np. 2 klatki na minutę), aby uniknąć wybielania zdjęć.
4. Aby określić ilościowo ekstrakcję HEL, należy obliczyć intensywność całkowaną na powierzchni komórki dla każdej klatki I(t) skorygowaną i znormalizowaną przez intensywność I(0) klatki 0 zgodnie ze wzorem:
   
   UWAGA: Antygen sprzężony z fluoroforem nie jest widoczny (prawdopodobnie z powodu wygaszania fluoroforu na powierzchni żelu), ale jego obecność na żelu można zweryfikować za pomocą anty-HEL i fluorescencyjnego przeciwciała drugorzędowego. Można sprawdzić, czy fluorofor jest rzeczywiście fluorescencyjny po odłączeniu, usuwając go z żelu za pomocą szkiełka nakrywkowego pokrytego anty-HEL i odsłaniając go wtórnym przeciwciałem fluorescencyjnym (na szkiełku nakrywkowym)⁶. Sygnał wyekstrahowanego antygenu jest bardzo słaby i czasami jest maskowany przez wyciek kulek. Jeśli interesuje nas tylko ekstrakcja antygenu, zaleca się przygotowanie żelu bez kulek (pomiń kroki 1.3.2 i 1.4.3).

5. Obrazowanie fluorescencyjne

1. Uzyskać fluorescencyjne limfocyty B poprzez oczyszczenie komórek B ze śledziony genetycznie zmodyfikowanych myszy, tak jak to ma miejsce w przypadku typu dzikiego (np. Z myszy Lifeact-GFP lub Myosin II GFP).
2. Do obrazowania komórek fluorescencyjnych należy użyć (jeśli to możliwe) mikroskopu z wirującym dyskiem z obiektywem dalekiego zasięgu 40x–100x zanurzonym w wodzie.
3. Utrzymuj czas ekspozycji i liczbę klatek na sekundę na niskim poziomie, aby uniknąć wybielania.
   UWAGA: Funkcja rozpraszania punktowego w Z jest silnie zdegradowana przez obecność żelu, dlatego sugerujemy użycie obiektywu do zanurzenia w wodzie. Mikroskopia pionowa na żywo z obiektywami zanurzającymi w wodzie cierpi na silne aberracje sferyczne wywołane obecnością (sferycznej) komórki (i jądra komórkowego) na ścieżce emisji.

6. Analiza

UWAGA: Analiza danych jest zazwyczaj wykonywana poprzez najpierw skorygowanie całego stosu pod kątem dryfu, znalezienie koralików w każdej klatce, śledzenie ich ruchów względem układu odniesienia (podjętego przy braku komórek), interpolację pola przemieszczenia i odwrócenie problemu w celu uzyskania naprężenia za pomocą transformaty Fouriera²⁹. W tym celu sugerujemy użycie kombinacji programów ImageJ Macro i MATLAB, które można pobrać z repozytorium online³⁰.

1. Otwórz film w ImageJ jako stos obrazów
2. Uruchom makro "Crop_and_save.ijm"
   1. Wybierz obszary zainteresowania (ROI) za pomocą narzędzia "Prostokąt" i dodaj je do listy ROI za pomocą "t".
   2. Podczas przycinania komórki pamiętaj, aby uwzględnić obszar o długości co najmniej 5–10 pikseli nieruchomych koralików. Wyklucz z analizy komórki, które znajdują się zbyt blisko granic lub innych komórek. Po zakończeniu kliknij "OK".
   3. Makro proponuje maskę komórki: jeśli jest to zadowalające, kliknij "OK". Jeśli nie jest to zadowalające, kliknij "Nie ok", a następnie ręcznie wybierz zamknięty region za pomocą dowolnego narzędzia do zaznaczania (np. "Odręczny" lub "Owal") i kliknij "Kontynuuj".
3. Otwórz MATLAB i uruchom "TFM_v1.m".
   1. Wprowadź wymagane parametry: w szczególności sprawdź właściwości obrazu (rozmiar piksela, przedział czasowy akwizycji) oraz właściwości żelu (moduł Younga E, współczynnik Poissona).
   2. Obraz referencyjny jest domyślnie ustawiony jako pierwszy. W razie potrzeby ustaw go na inną klatkę lub ustaw go na "0", aby załadować plik zewnętrzny.
   3. Zlokalizuj dane wyjściowe oprogramowania w tym samym katalogu, w którym znajduje się oryginalny plik (opis znajduje się w pliku User_notice.pdf). Obejmuje to wstępny ślad koralików ("FILENAME.fig"), wykres energii kurczenia się w czasie ("FILENAME_energy.fig"), tabelę kilku wielkości zintegrowanych na ogniwie (energia, powierzchnia, momenty, itp.) "FILENAME_finaltable.mat", strukturę zawierającą przemieszczenie i pole siłowe, filmy koralika, pole przemieszczenia, naprężenie i energię (które można otworzyć za pomocą dowolnego czytnika avi).
      UWAGA: W parametrach wejściowych "Rozmiar okna" to okno, w którym interpolowane jest przemieszczenie, stąd ostateczna rozdzielczość pola naprężeń i przemieszczeń. Jest to ustawione na kilka (domyślnie cztery) pikseli. Nie zaleca się zmniejszania tego, ponieważ spowodowałoby to sztuczne zwiększenie rozdzielczości poprzez interpolację obszarów, w których nie ma koralików.

Results

Biorąc pod uwagę rozmiar komórek, algorytmy, które wyodrębniają mapę przemieszczeń koralików za pomocą technik korelacyjnych (takich jak prędkość obrazu cząstek) są na ogół mało precyzyjne. Jednak w zależności od wymaganego stopnia rozdzielczości, można łatwo uzyskać wyniki jakościowe za pomocą bezpłatnej wtyczki Fiji/ImageJ^31,32. Chociaż to podejście jest wystarczające do porównania warunków stymulujących i niestymulujących, w celu dokładnej analizy zalecamy skorzystanie z naszego oprogramowania do pobrania z repozytorium online³⁰, które śledzi koraliki indywidualnie i udostępnia mapę pola przemieszczenia w danym punkcie czasowym jako interpolację poszczególnych przemieszczeń ściegów³³. W tym momencie możliwych jest kilka kwantyfikacji. Na przykład (zakładając, że przemieszczenie jest spowodowane tylko naprężeniem stycznym do powierzchni żelu) oprogramowanie podaje również naprężenie w każdym punkcie powodującym tę konkretną mapę przemieszczeń. Jest to rodzaj "problemu odwrócenia": przemieszczenie w pewnym punkcie zależy od sumy wszystkich sił przyłożonych do innych punktów. "Algorytm inwersji" uwzględnia parametry fizyczne podłoża: jego sztywność (moduł Younga) i współczynnik Poissona. Algorytmy bezpośrednie są zazwyczaj bardzo dokładne, ale kosztowne obliczeniowo. Algorytmy oparte na transformaty Fouriera, takie jak nasz, wykonują zasadniczo dekonwolucję w przestrzeni Fouriera i są bardziej wydajne, ale podatne na pewne błędy (głównie ze względu na krok interpolacji). Algorytmy te na ogół wymagają dostrojenia parametru, który zapobiega nadmiernemu znaczeniu małych lokalnych (i potencjalnie sztucznych) przemieszczeń w obliczeniach pola naprężeń (parametr regularyzacji Tichonowa^8,29; Zmienna "Regularization" w oknie dialogowym; tutaj zwykle ustawiamy wartość równą 5 x ^10-19). W celu bardziej zaawansowanej interpretacji i analizy, takiej jak korelacje czasoprzestrzenne, ruchy lokalne, korelacje z kanałami fluorescencyjnymi, zalecamy współpracę z ekspertami w tej dziedzinie. Aby zapoznać się z przeglądem metod obliczeniowych, zobacz Schwarz et al.⁹.

Jak wspomniano powyżej, poprawne obrazy koralików wyglądają jak "gwiaździste niebo", jednolity i losowy rozkład jasnych plam (Rysunek 2A). Dane i analizy nie są wiarygodne, gdy liczba koralików jest zbyt niska (Rysunek 2B) lub obraz jest nieostry (Rysunek 2C). Gdy limfocyty B osiądą na powierzchni żelu, kulki pod komórkami zaczynają się poruszać pod wpływem siły ciągnącej wywieranej przez komórkę na żel. Ramki, w przypadku których koraliki nie są możliwe do śledzenia, należy wyrzucić.

Dla porównania, można obserwować wzrokowo ruch koralików, porównując "układ odniesienia", zazwyczaj ten poprzedzający pierwszy kontakt komórki z podłożem. Przybliżone wyniki można uzyskać ze śledzenia pojedynczych cząstek (np. Trackmate, Fiji ³⁴), jak to zrobiono w Rysunek 3A. Analiza zapewnia segmentację koralików na obrazie referencyjnym ("FILENAME.fig") jako kontrolę.

Za pomocą oprogramowania, które proponujemy, można uzyskać przemieszczenie (Rysunek 3B) i pole naprężenia (wektor lokalnego naprężenia na każdym pikselu i w każdym punkcie czasowym uzyskany przez odwrócenie z pola przemieszczenia, Rysunek 3C). Iloczyn skalarny pól przemieszczenia i sił zintegrowanych na powierzchni komórki zapewnia całkowitą pracę wywieraną przez komórkę na podłoże (Rysunek 4A). To obliczenie wymaga maski komórki wprowadzonej w kroku 6.2 protokołu.

Aby porównać dwa warunki biologiczne (jak aktywujący HEL kontra nieaktywujący substrat BSA, lub dziki typ kontra knock-out), warto obliczyć średnią krzywą (Rysunek 4B) lub, jeszcze bardziej syntetycznie, średnią wartość z ostatnich punktów czasowych (20 min), w których energia osiąga plateau (Rysunek 4C). Gdy informacje przestrzenne sił są istotne, możliwe jest porównanie pojedynczych punktów czasowych każdego warunku ( Rysunek 4D). Zapoznaj się z Kumari et al.⁶ w celu uzyskania głębszej analizy.

Przykład upływu czasu ekstrakcji antygenu fluorescencyjnego jest pokazany w Rysunek 5A: postępujące pojawianie się sygnałów fluorescencyjnych w synapsie wskazywało na oderwanie antygenu od żelu. Średnia krzywa ekstrakcji wraz z jej przedziałem ufności (błąd standardowy średniej) dla 15 komórek jest pokazana w Rysunek 5B.

Rysunek 1: Schematyczne przedstawienie przygotowania żelu i jego funkcjonalizacji. Kroki są opisane w protokole. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Trzy przykłady obrazów koralików o różnych właściwościach. (A) Przykład obrazu koralika z prawidłowym stosunkiem sygnału do szumu i prawidłową gęstością. (B) Przykłady obrazów ze zbyt małą liczbą koralików i (C) poza płaszczyzną ostrości. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Przetwarzanie obrazów w celu wyodrębnienia pola siłowego. (A) Przykład obrazu koralików (kontur komórki w kolorze białym, wyodrębniony z obrazu transmisyjnego), śledzenie koralików w czasie t = 5 min (czerwona nakładka) i przemieszczenie (strzałki) względem czasu t = 0 min (podziałka 5 μm). (B) Interpolowane pole przemieszczenia (reprezentowane jako wektor drgań i mapa wielkości, strzałki są proporcjonalne do przemieszczenia [nm]; patrz kolorowy pasek po prawej stronie); Dół: Gładszy obraz wielkości (uzyskany przez interpolację z funkcją dwusześcienną). (C) Pole naprężeń z pola przemieszczenia w panelu B (reprezentowane jako wektor kołczanu i mapy wielkości; strzałki są proporcjonalne do naprężenia ścinającego [Pa]; patrz kolorowy pasek po prawej stronie); Dół: Gładszy obraz wielkości (uzyskany przez interpolację z funkcją dwusześcienną). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Przykład informacji, które można uzyskać z pól siły i przemieszczenia. (A) Przykład ewolucji energii w czasie dla pojedynczej komórki: faza plateau (zaznaczona na szaro) pojawia się po około 10 minutach. (B) Porównanie średnich krzywych energetycznych i (C) względnych poziomów plateau dla 65 komórek pokrytych żelem powlekanym HEL (aktywującym) i 35 komórek pokrytym żelem pokrytym BSA (nieaktywującym) (pokazano medianę ± przedziały międzykwartylowe, dla uzyskania istotności statystycznej zastosowano test Manna-Whitneya). (D) Poklatkowe kolorowe mapy naprężeń dla HEL i kontrolnego stanu BSA; Pokazane są zarówno wykresy wielkości, jak i kołczanów. Te obrazy zostały zaadaptowane z Kumari et al.⁶. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Przykład eksperymentów z antygenem fluorescencyjnym. (A) Upływ czasu ekstrakcji fluorescencyjnego HEL (poniżej: procent maksimum, podziałka = 3 μm). (B) Gromadzenie antygenu w czasie (średnia ± SEM, n = 15). Te obrazy zostały zaadaptowane z Kumari et al.⁶. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

Opisana tu metoda TFM pozwala na systematyczne badanie aktywnych zdolności mechanicznych limfocytów B. W kontekście limfocytów B jest to związane ze zdolnością do ekstrakcji i internalizacji antygenu. W porównaniu z innymi metodami TFM, przedstawiony tutaj protokół jest prosty i raczej powtarzalny: sztywność, mierzona przez wgłębienie szklanej mikrosfery i przy użyciu modelu Hertza, wynosi od 400 do 600 Pa. Podobne protokoły zostały z powodzeniem zastosowane nie tylko dla limfocytów B³⁵ , ale także dla limfocytów T³⁶. W porównaniu z nanofilarami (stosowanymi również w limfocytach T³⁷) zapewnia płaską, jednorodną powierzchnię, stąd wyniki są łatwiejsze do interpretacji, ponieważ oddziaływanie żelu jest głównie ograniczone do stycznej do powierzchni.

Opisany przez nas protokół daje dostęp do czasoprzestrzennej dynamiki sił wywieranych przez limfocyty B na substraty prezentujące antygen. Na poziomie przestrzennym dostarcza to informacji o lokalizacji sił, a w połączeniu z mikroskopią fluorescencyjną umożliwia eksperymentatorowi skorelowanie sił lokalnych z obecnością określonych cząsteczek (tj. składników cytoszkieletu lub kaskady sygnalizacyjnej BCR). Na poziomie czasowym możliwe jest zintegrowanie wielkości (takich jak energia całkowita lub naprężenie całkowite) w celu uzyskania jednej wartości na punkt czasowy i zmniejszenia szumu. Pozwala to na obserwację ewolucji siły trakcyjnej w czasie (wzrost i plateau) oraz obecność wzorców pulsacyjnych.

Krytyczne aspekty eksperymentalne dla analizy są opisane w następujący sposób. (i) Gęstość komórek: w celu przeprowadzenia prawidłowej analizy, komórki powinny być wystarczająco oddzielone. Uważamy, że komórka jest możliwa do analizy, jeśli ma wokół siebie pusty obszar o własnym rozmiarze. (ii) Obraz transmisyjny: zaleca się zebranie podczas eksperymentu co najmniej obrazu transmisyjnego komórek, który ma być wykorzystany jako maska w analizie. (iii) Liczba koralików na obrazie: sugerujemy analizowanie tylko obrazów, w których liczba koralików w synapsie wynosi od 30 do 200 (tj. 1–8 koralików/μm²). Mniejsze zagęszczenia nie pozwalają na odpowiednią rekonstrukcję przemieszczeń mapy. Duża gęstość ściegu sprawia, że śledzenie pojedynczych cząstek jest niewiarygodne. (iv) Liczba koralików powinna być stała podczas eksperymentu; Mogą jednak wystąpić wahania spowodowane niewielką zmiennością warunków obrazowania (zwłaszcza w przypadku kulek, które są zbyt blisko siebie). Przesunięcie ostrości, jeśli występuje, musi zostać skorygowane, a problematyczne klatki należy odrzucić. (v) Jakość żelu: żele ze zbyt dużą liczbą pęknięć, zmiennością w rozkładzie kulek lub żele, które są zbyt gęste, należy wyrzucić. (vi) W zależności od typu komórki, po wielokrotnej ekspozycji, komórki w późnych punktach czasowych (>300 klatek) mogą odczuwać efekty fototoksyczne. Wskazane jest uruchomienie programu na masce pozbawionej komórek jako "linii bazowej" do porównania z danymi. Określa to wielkość poziomu hałasu wynikającą wyłącznie z warunków doświadczalnych.

Żele stosowane do pomiaru siły uciągu w adhezji klasycznej pozwalają na badanie procesów zachodzących w adhezji ogniskowej (przepływy aktyny i rekrutacja cząsteczek sygnałowych) - punktach, w których przykładane są siły^38,39. Jednak siły w synapsie nie są przykładane przez zrosty ogniskowe. Czasoprzestrzenny wzorzec generowania siły w synapsie immunologicznej limfocytów B nie był do niedawna badany ilościowo przy użyciu tej metody. Korzystając z TFM, po raz pierwszy zaobserwowaliśmy wzorzec siły w synapsie immunologicznej komórek B, jak przedstawiono w naszym ostatnim badaniu⁶, otwierając zachęcające perspektywy w badaniu limfocytów.

Warto zauważyć, że metoda ta wykorzystuje obraz wykonany przed przybyciem komórek do żelu jako obraz referencyjny do obliczenia siły. Zwykłe protokoły TFM sugerują wykonanie obrazu referencyjnego pod koniec eksperymentu, po odłączeniu komórek trypsyną; Dzięki temu eksperymentator może poszukać regionu bogatego w komórki. Chociaż jest to możliwe również w tym przypadku, trypsyna jest raczej mało skuteczna w odrywaniu limfocytów B od żelu pokrytego antygenem, trzeba długo czekać na oderwanie, a ryzyko modyfikacji i ruchów żelu (które uniemożliwiają wykorzystanie całego zestawu danych) jest większe.

Przedstawiona tutaj metoda jest elastyczna i może być stosowana do badania wpływu innych sygnałów na synapsę immunologiczną, ponieważ pozwala na przeszczepianie innych białek na powierzchnię żelu (np. badano ligandy integrynowe i immunoglobuliny), a nawet antygenu fluorescencyjnego (patrz punkt 4). Co więcej, komórki pozostają dostępne dla eksperymentatora w celu leczenia farmakologicznego i miejscowych perturbacji. Wreszcie, metoda jest również kompatybilna z obrazowaniem komórek stałych. Do tych obserwacji zaleca się wykonanie żelu na szkiełku nakrywkowym, wybarwienie komórek, przyklejenie szkiełka nakrywkowego do szkiełka podstawowego i dopiero wtedy dodanie podłoża montażowego i kolejnego szkiełka nakrywkowego. Obserwacja zostanie następnie przeprowadzona z żelem na wierzchu, aby uniknąć degradacji obrazu przez żel.

Możliwe pułapki to zmienność żelu w polimeryzacji i powlekaniu. Problemy z polimeryzacją wynikają głównie z jakości inicjatora/katalizatora. Ponadto żel może się napompować, zwłaszcza jeśli nie jest używany zaraz po montażu. Wydaje się, że ten problem nie wpływa dramatycznie na właściwości mechaniczne żelu, ale może sprawić, że warstwa perełek będzie nieosiągalna dla celu, skutecznie czyniąc żel bezużytecznym. Zalecamy przygotowanie dodatkowych żeli dla każdego schorzenia, gdy pojawi się ten problem. Może również występować pewna zmienność w powłoce i bardzo ważne jest, aby mieć świeżo rozcieńczony Sulfo SANPAH.

Podsumowując, opisaliśmy prostą, tanią i powtarzalną metodę pomiaru sił wywieranych przez limfocyty B w synapsie immunologicznej po aktywacji przez ligand BCR. Może być przystosowany do badania reakcji na inne ligandy i inne rodzaje limfocytów (limfocyty B pamięci, limfocyty T itp.) z wykorzystaniem odpowiedniego liganda receptorowego.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-aminopropylotrimetoksysilan (APTMS)	Sigma-Aldrich	281778	Przechowywać w podzielonym na porcje, chronić przed wilgocią
40% roztwór akryloamidu Zestaw
Alexa555	Sondy molekularne	A30007
Nadsiarczan amonu (APS)	Sigma-Aldrich	A3678
Zestaw do izolacji komórek B, mysz	Miltenyi Biotec	130-090-862
B-merkaptoetanol	Gibco	31350-010
2% roztwór Bis Biorad		161-0142
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)	Euromedex	04-100-812-C
Szkiełko nakrywkowe 18mm	VWR	631-1580
Surowica cielęca płodu	PAA	A15-151	Dekomplementowana (40min @56° C)
Fluorodzy FD35	World Precision Instruments, Inc	FD35100
Fluosfera: modyfikowana karboksylanem, 0,2um, ciemnoczerwona	Sondy molekularne	F8807
Lizozym jaj kurzych	Sigma-Aldrich	L6876	Dostępny w podaniu 100 mg / ml
Roztwór aminokwasów endogennych MEM (100X)	Thermofisher/Gibco	11140035
N,N,N',N'-tetrametylotilendiammina(TEMED)	Euromedex	50406-B
PBS (sól fizjologiczna buforu fosforowego)	Gibco	10010-015
Penicylina– streptomycyna	Gibco	15140-010
RMPI 1640 – Glutamax I	Thermofisher	61870-010
Sigmacote	Sigma-Aldrich	SL2
Pirogronian sodu	Gibco	11360-039
6-(4'-azydo-2'-nitrofenyloamino)heksanian sulfosukcynimidylu (Sulfo-SANPAH)	Thermo Scientific	22589