Test ablacji i regeneracji laserowej oparty na mikroskopie konfokalnym w komórkach międzynerwowych danio pręgowanego

Podsumowanie

Laserowa ablacja jest szeroko stosowaną technologią do badania regeneracji w systemach biologicznych. Prezentowany protokół opisuje zastosowanie standardowego laserowo-skaningowego mikroskopu konfokalnego do ablacji laserowej, a następnie obrazowania poklatkowego regenerujących się komórek międzynerwowych w linii bocznej danio pręgowanego.

Streszczenie

Komórki rzęsate to komórki mechanosensoryczne, które pośredniczą w zmyśle słuchu. Komórki te nie regenerują się po uszkodzeniu u ludzi, ale są naturalnie uzupełniane u kręgowców innych niż ssaki, takich jak danio pręgowany. System linii bocznej danio pręgowanego jest użytecznym modelem do charakteryzowania sensorycznej regeneracji komórek rzęsatych. Linia boczna składa się z narządów zawierających komórki rzęsate zwanych neuromastami, które są połączone ze sobą ciągiem komórek międzynerwowych (INMC). INMC działają jak komórki progenitorowe, które podczas rozwoju dają początek nowym neuromastom. INMC mogą naprawiać luki w systemie linii bocznych powstałe w wyniku śmierci komórki. Opisano tutaj metodę selektywnej ablacji INMC przy użyciu konwencjonalnego laserowo-skaningowego mikroskopu konfokalnego i transgenicznych ryb, które wykazują ekspresję białka zielonej fluorescencji w INMC. Mikroskopia poklatkowa jest następnie wykorzystywana do monitorowania regeneracji INMC i określania szybkości zamykania luki. Jest to dostępny protokół ablacji komórek, który nie wymaga specjalistycznego sprzętu, takiego jak impulsowy laser ultrafioletowy o dużej mocy. Protokół ablacji może służyć szerszemu zainteresowaniu, ponieważ może być przydatny do ablacji dodatkowych typów komórek, przy użyciu zestawu narzędzi, który jest już dostępny dla wielu użytkowników. Technika ta umożliwi dalsze scharakteryzowanie regeneracji INMC w różnych warunkach i z różnych środowisk genetycznych, co przyczyni się do lepszego zrozumienia regeneracji sensorycznych komórek progenitorowych.

Wprowadzenie

U podstaw większości postępujących ubytków słuchu leży niszczenie czuciowych komórek rzęsatych, które przekształcają zewnętrzne bodźce słuchowe w impulsy nerwowe wykrywalne przez mózg. Śmierć komórek rzęsatych ślimaka powoduje trwałą utratę słuchu, ponieważ dorosłe ssaki nie mają zdolności do regeneracji tych komórek po uszkodzeniu. I odwrotnie, kręgowce inne niż ssaki, takie jak danio pręgowany, mogą regenerować komórki rzęsate utracone w wyniku urazu akustycznego lub ototoksycznego urazu. Mechanosensoryczna linia boczna danio pręgowanego to prosty i łatwy w obsłudze układ narządów, który może być używany do badania regeneracji komórek rzęsatych^1,2,3.

Linia boczna składa się z małych plam czuciowych zwanych neuromastami, które są połączone podczas rozwoju ciągiem wydłużonych komórek znanych jako komórki międzynerwowe (INMC). Biorąc pod uwagę ich zdolność do proliferacji jako pozornych komórek macierzystych, które dają początek nowym narządom zawierającym komórki rzęsate, zachowanie INMC jest bardzo interesujące dla społeczności^4,5. Wiele badań dotyczących INMC charakteryzowało tłumienie ich proliferacji przez pobliskie komórki Schwanna, które owijają się wokół nerwu linii bocznej, prawdopodobnie poprzez inhibitor sygnalizacji Wnt / β-kateniny. ^6,7,8. Podczas gdy regulacja proliferacji INMC i różnicowania się w nowe neuromasty została dobrze opisana, mechanizmy rządzące ponownym wzrostem INMC po ablacji nie zostały wyjaśnione. Protokół ten służy jako środek do ablacji poszczególnych INMC i analizy ich późniejszego zachowania regeneracyjnego.

Opublikowano różne metody niszczenia komórek rzęsatych, komórek podporowych i całych neuromastów, wraz z metodologiami monitorowania regeneracji. Ablacja chemiczna działa dobrze w przypadku komórek rzęsatych, ale dawki toksycznych substancji chemicznych, takich jak CuSO₄, muszą być znacznie zwiększone, aby usunąć inne typy komórek linii bocznej⁹. Chociaż elektroablacja pod mikroskopią fluorescencyjną jest skutecznym i prostym sposobem niszczenia INMC w celu zbadania regeneracji, trudno jest ją wąsko ukierunkować, a zatem może spowodować znaczne szkody uboczne. W rezultacie, może to maskować aspekty zachowań specyficznych dla INMC^10,11. Zastosowano protokoły ablacji laserowej, ale wymagają one użycia specjalistycznego sprzętu, który niekoniecznie jest obecny w przeciętnym laboratorium lub placówce obrazowania (np. impulsowe lasery UV o dużej mocy¹²). Opisana tutaj metoda może być wykonana za pomocą dowolnego skaningowego mikroskopu konfokalnego wyposażonego w powszechnie stosowany laser 405 nm, zwykle używany do obrazowania DAPI i innych niebieskich fluoroforów. Zaletą tej metody jest to, że obrazowanie konfokalne można wykonać bezpośrednio przed i po uszkodzeniu komórek bez angażowania dodatkowych systemów sterowania laserem lub przenoszenia do innego mikroskopu wyposażonego w laser impulsowy.

Podobna metoda została opisana do ablacji neuronów w rdzeniu kręgowym danio pręgowanego¹³. Jednak poprzednia metoda wymaga modułu FRAP do ablacji komórek, co nie jest wymagane w przypadku tego protokołu. Ponadto, biorąc pod uwagę różne właściwości różnych typów komórek (tj. jasność fluorescencji transgenu, głębokość w ciele i kształt komórki), prawdopodobne jest, że konieczne będą znaczne modyfikacje w zależności od użytego typu komórki. Opisany tutaj protokół jest bardziej prawdopodobny jako skuteczny w przypadku bardziej powierzchownych komórek, co potwierdza demonstracja ablacji czuciowych komórek rzęsatych przy użyciu tej samej metody. Przedstawiono również test regeneracji w celu oceny wskaźników odzysku INMC po ablacji, co nie było cechą wspomnianego badania.

Opisany tutaj protokół ablacji komórek oparty na laserze rejestruje zdolność regeneracyjną INMC poprzez optymalizację warunków laserowych, obrazowanie przed i po ablacji oraz mikroskopię poklatkową. Elementy te łączą się w całość, aby kompleksowo zobrazować odrastanie INMC i zamykanie luk. Chociaż protokół ten jest używany do niszczenia INMC, może być stosowany do innych prac, które wymagają wiarygodnej i skutecznej oceny ablacji komórkowej. Jest to również dostępna technologia, ponieważ można ją przeprowadzić na dowolnym mikroskopie konfokalnym wyposażonym w laser o długości fali 405 nm.

Protokół

Wszystkie prace nad zwierzętami zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Pace zgodnie z protokołem 2018-1.

1. Przygotowanie larw danio pręgowanego

1. Ustaw krycie na 3–5 dni przed przeprowadzeniem eksperymentu, tak aby larwy były w wieku od 2 dni po zapłodnieniu (dpf) do 4 dpf, gdy są zamontowane do ablacji laserowej.
   UWAGA: Linia pułapek wzmacniających Et(krt4:EGFP)sqEt20 (w skrócie ET20), w której komórki międzynerwowe są wyraźnie znakowane wzmocnionym białkiem zielonej fluorescencji (eGFP), pozwala na stosunkowo łatwą identyfikację komórek i ablację^11,14. W celu potwierdzenia swoistości i elastyczności ablacji laserowej, ryby ET20 są hodowane z rybami Tg(neuroD:tdTomato), w których nerw linii bocznej jest znakowany białkiem czerwonej fluorescencji lub Tg(myo6b:βaktyna-GFP) w celu znakowania sensorycznych komórek rzęsatych GFP^15,16.
2. Po pobraniu zarodków następnego dnia inkubować zarodki w temperaturze 28,5 °C w pożywce E3 zawierającej 0,0001% błękitu metylenowego, aż będą gotowe do znieczulenia i zamontowania.

2. Przygotowanie nisko żelujących roztworów agarozy i trikainy

1. Do szklanej kolby Erlenmeyera o pojemności 250 ml dodać 48 ml 1x pożywki E3, 2 ml 15 ml roztworu podstawowego trikainy i 0,5 g niskotopliwej agarozy.
2. Podgrzewaj roztwór w kuchence mikrofalowej na wysokich obrotach przez 30 sekund i wiruj (w rękawicach chroniących przed wysoką temperaturą), aby rozpuścić agarozę. Powtarzaj cykle ogrzewania przez 30 s, aż agaroza całkowicie się rozpuści.
3. Przechowywać agarozę w inkubatorze podgrzanym do temperatury 42 °C do momentu użycia.

3. Znieczulenie larw danio pręgowanego

1. Do stożkowej probówki o pojemności 50 ml dodać 24 ml 1x pożywki E3 i 1 ml roztworu podstawowego trikainy (15 mM) do końcowego stężenia 600 μM. Zamieszać do wymieszania.
2. Załadować do jednego z sześciu dołków płaskodennej płytki do hodowli komórkowej 8 ml E3 zawierającego 600 μM trikainy.
3. Użyj pipety transferowej, aby przenieść larwy danio pręgowanego do wkładki transferowej o siatkowym dnie 74 μm.
4. Przenieść wkładkę z siatkowym dnem do studzienki sześciodołkowej płytki zawierającej roztwór E3 + trikainy. Pozostaw larwy w studzience przez co najmniej 3 minuty lub do całkowitego znieczulenia. Przetestuj znieczulenie, stukając w wkładkę. Larwy nie powinny się przestraszyć i pływać w odpowiedzi na kran.

4. Fluorescencyjne badanie przesiewowe znieczulonych larw danio pręgowanego

1. Odpipetować jedną znieczuloną larwę na studzienkę na 12 dobrze pokrytych hydrofobowymi szkiełkami w celu przesiewania. Upewnij się, że w każdym dołku szkiełka utworzy się minimalna krzywizna menisku, aby zmniejszyć zniekształcenia optyczne podczas badania przesiewowego. Można to zrobić, usuwając niewielką objętość E3 z każdej studzienki po umieszczeniu larw.
2. Pod obiektywem 10x na mikroskopie pionowym (wyposażonym w lampę rtęciową, lampę metalohalogenkową lub źródło światła LED i odpowiednią kostkę filtrującą) należy przeprowadzić badanie przesiewowe w poszukiwaniu larw wykazujących ekspresję eGFP w neuromastach i komórkach międzynerwowych układu linii bocznej.
   1. Wybierz larwy o silniejszej ekspresji, co skutkuje jaśniejszym eGFP, które przypuszczalnie są homozygotyczne pod względem transgenu.
      UWAGA: W linii ET20 eGFP ulega ekspresji w pierścieniu komórek płaszcza otaczających każdy neuromast, a także w wąskim pasie komórek międzynerwowych łączących te narządy. Silniejsza ekspresja eGFP (jaśniejsza fluorescencja) przyczynia się do skuteczniejszej ablacji.
   2. Aby zbadać specyficzność ablacji, należy użyć podwójnie transgenicznych larw z transgenami ET20 i Tg(neuroD:tdTomato). W przypadku badań przesiewowych w kierunku nosicielstwa Tg (neuroD:tdTomato) użyj zestawu sześcianów filtra RFP, aby zidentyfikować jaskrawoczerwoną plamę tuż za uchem, reprezentującą tylny zwój linii bocznej.
   3. Aby dokonać ablacji komórek rzęsatych w neuromastach linii bocznej, użyj linii transgenicznej Tg (myo6b: βaktyna-GFP) i badania przesiewowego lokalizacji GFP w środku każdego neuromastu.
3. Wybierz larwy ze stereotypowymi odstępami między neuromastami. Różnice w odstępach między neuromasztami mogą wskazywać na nieprawidłowe odkładanie się neuromastu podczas rozwoju, sugerując wadliwe zachowanie migracyjne lub proliferację komórek w zawiązku linii bocznej¹⁷. Takie defekty mogą również wpływać na migrację lub regenerację INMC po ablacji.
   UWAGA: Typowe wady odstępów obejmują niezwykle dużą odległość między najbardziej przednim neuromastem zdeponowanym przez pierwszy migrujący zawiązek (prim1L1) a drugim neuromasztem zdeponowanym przez ten sam zawiązek (prim1L2), często związanym ze stłoczeniem bardziej tylnych neuromasztów.

5. Montaż larw do ablacji laserowej i obrazowania

1. Odpipetować 3-4 znieczulone larwy do małej kropli roztworu E3/trikainy w środku naczynia z nakrywką z poślizgowym dnem (naczynie 35 mm z szkiełkiem nakrywkowym o średnicy 14 mm i numerem 1,5). Usuń nadmiar roztworu, aby larwy pozostały w małej kropli, wystarczająco dużej, aby je pomieścić.
2. Przenieś szalkę na stolik lornetkowego mikroskopu stereoskopowego i manipuluj zoomem i ostrością tak, aby wszystkie larwy znalazły się w polu widzenia.
3. Wyjąć kolbę Erlenmeyera zawierającą agarozę o niskiej temperaturze topnienia z ogrzewanego inkubatora. Za pomocą pipety transferowej przenieś roztwór agarozy na szkiełko przykrywki, aby uzyskać cienką warstwę. Odciągnij nadmiar agarozy, aż płyn wypełni studzienkę na dnie naczynia, uważając, aby nie zassać żadnych larw.
4. Szybko ułóż larwy w roztworze agarozy za pomocą noża do włosów lub pętli do włosów, tak aby były wyrównane ze sobą i zorientowane rostralem w lewo.
5. Delikatnie dociśnij larwy do szkła nożem do włosów, tak aby leżały z profilu prawymi stronami do dołu. Larwy starsze niż 3 dpf mają tendencję do unoszenia się na wodzie z powodu napompowanych pęcherzy pławnych, więc może być konieczne wielokrotne dociskanie ich do szkła, aż agaroza zacznie żelować.
6. Po około 60 s agaroza zacznie krzepnąć, a larwy nie będą mogły być ponownie zorientowane. Odczekać około 5 minut w temperaturze pokojowej, aby agaroza znajdująca się na szkiełku nakrywkowym całkowicie zastygła. Gdy agaroza stężeje, użyj pipety transferowej, aby napełnić naczynie do połowy E3 zawierającym 1x trikainę.

6. Lokalizowanie potencjalnych celów i obrazowanie przed ablacją

1. Włącz zasilanie systemu laserowej skaningowej mikroskopii konfokalnej i zainicjuj za pomocą zintegrowanego oprogramowania do obrazowania. Wybierz obiektyw immersyjny Plan-Apochromat z olejkiem 63x (apertura numeryczna 1,40) lub podobny. Nałóż olejek immersyjny i zabezpiecz naczynie w okrągłej wkładce etapowej tak, aby larwy były skierowane stroną rostralną w lewo.
2. W jasnym polu lub kontrastowym oświetleniu interferencyjnym wybierz jedną z zamontowanych larw do obrazowania. Wyreguluj ostrość za pomocą pokrętła ostrości w taki sposób, aby skóra po stronie ryby znajdującej się najbliżej szkiełka nakrywkowego była ostra, rozpoznawalna przez przypominający odcisk palca wzór komórek perydermy.
3. Po ustawieniu ostrości przełącz się na oświetlenie epifluorescencyjne w kanale GFP. Zlokalizuj tylną linię boczną za pomocą ekspresji GFP wzdłuż poziomej przegrody mięśniowej. Pierścienie komórek fluorescencyjnych wskazują na komórki płaszcza nerwianka, a wydłużone pasma komórek to komórki międzynerwowe.
4. Zaczynając od neuromastu primIL1, zwykle umieszczonego tylko grzbietowo do żółtka, użyj joysticka sterowania stopniem lub innego elementu sterującego ruchem sceny, aby wizualnie skanować doogonowo wzdłuż poziomej przegrody mięśniowej.
   1. Podążaj za ciągiem komórek międzynerwowych, aż dotrzesz do obszaru między neuromastami primIL3 i primIL4 (L3 i L4) (Rysunek 1A).
      UWAGA: Inne obszary mogą być również celowane, ale ta część tułowia i ogona jest zwykle najbliżej szkła nakrywkowego, a zatem jest najbardziej podatna na ablację.
   2. W przypadku obrazowania kilku larw ustaw pozycję pierwszego stopnia, a następnie dezaktywuj opcję wielu pozycji stadium, usuwając zaznaczenie odpowiedniego pola wyboru.
   3. Powtórz kroki 6.4.1–6.4.2. dla każdej żądanej pozycji stadium (każdej larwy).
5. Po zidentyfikowaniu ciał komórkowych w regionie L3–L4 przełącz się w tryb akwizycji.
   1. Aktywuj ścieżkę obrazowania GFP za pomocą lasera 488 nm lub 491 nm.
   2. Dodaj kanał światła przechodzącego (lampa fotopowielacza światła przechodzącego lub T-PMT) do aktywowanej ścieżki lasera 488 nm, aktywując pole wyboru T-PMT w menu rozwijanym "Ustawienia obrazowania".
   3. Ustaw moc lasera na 6%, rozmiar otworu na odpowiednik 1 jednostki Airy, a wzmocnienie cyfrowe na 750 do obrazowania larw ET20. Dokładne wzmocnienie i moc lasera mogą się różnić dla każdej larwy, w zależności od tego, jak blisko szkiełka nakrywkowego są zamontowane i jasności fluorescencji. Dostosuj wzmocnienie tak, aby ciała komórek były nasycone, aby uchwycić w przeciwnym razie przyćmione projekcje i filipodia.
   4. Dostosuj parametry do rozmiaru klatki 1024 x 1024 pikseli, zoomu cyfrowego 0,7 (rozmiar obrazu 145,2 μm x 145,2 μm). Ustaw średnią na 2, aby poprawić jakość obrazu.
6. Zaznacz pole z-stack, aby wyświetlić menu rozwijane z-position. Podczas szybkiego skanowania skup się, aż komórki międzynerwowe staną się nieostre. Ustaw pierwszy plasterek, a następnie skup się na próbce, aż komórki międzynerwowe ponownie ulegną rozmyciu. Ustaw ostatni plasterek. Upewnij się, że obejmuje on stos z o wielkości około 25 μm. Ustaw interwał obrazowania na 1 μm.
7. Rozpocznij eksperyment, aby uchwycić stos Z przed ablacją (Rysunek 1B). Jeśli pozycje stołu montażowego zostały dodane, dezaktywuj opcję pozycji, aby obrazowana była tylko bieżąca pozycja. Zapisz plik po jego przechwyceniu.

7. Laserowa ablacja ciał komórkowych

1. Kliknij "Pokaż wszystkie narzędzia". Ta opcja znajduje się w górnej części interfejsu akwizycji.
2. Kliknij menu rozwijane "Konfiguracja obrazowania". W "Imaging Set up" kliknij "Dodaj nową ścieżkę" (reprezentowaną jako "+").
3. W "Konfiguracja obrazowania" kliknij menu rozwijane "Barwnik". Wybierz DAPI jako barwnik.
4. Kliknij menu rozwijane "Kanały" i odznacz wszystkie inne ścieżki, odznaczając odpowiednie pola wyboru. Upewnij się, że wybrana jest tylko ścieżka DAPI.
5. Na ścieżce DAPI kliknij 405, aby przejść do "Ustawienia lasera". Zwiększ moc lasera do 75%. Odznacz kanał DAPI, aby wyłączyć laser podczas skanowania w poszukiwaniu ciał komórek kandydujących do ablacji.
6. Gdy ciało komórki międzynerwowej jest wyśrodkowane w polu widzenia, powiększ ramkę skanowania do 20x–22x. Może być konieczne dostosowanie położenia klatki, aby ciało komórki pozostało pośrodku podczas stosowania powiększenia. Zatrzymaj skanowanie na żywo, gdy tylko ciało komórki wypełni pole widzenia.
   UWAGA: Korpus komórki powinien zajmować całe pole widzenia. Na tym poziomie powiększenia GFP szybko się wybieli. Zminimalizuj czas ekspozycji lasera dzięki szybkiej pracy. Użyj powiększenia, zamiast wybierać obszar zainteresowania, aby zwiększyć rozkład mocy lasera na małym obszarze.
7. Sprawdź skrzynkę migawki laserowej 405 nm, aby aktywować ścieżkę. Dostosuj moc lasera do 75%. Ustaw timer na 45 s. Aktywuj ciągłe skanowanie i uruchom timer. Przerwij skanowanie natychmiast po 45 sekundach.

8. Obrazowanie po ablacji i mikroskopia poklatkowa do badania regeneracji

1. Kliknij menu rozwijane "Kanały". W kanałach odznacz ścieżkę "DAPI", aby dezaktywować laser ablacyjny. Kliknij menu rozwijane "Tryb akwizycji".
2. W trybie akwizycji kliknij "Zoom".
3. Zmniejsz powiększenie do 0,7 za pomocą suwaka lub wpisując "0,7".
   1. Aby zapewnić pomyślną ablację komórek, zwiększ wzmocnienie do 900 i szybko skanuj pole widzenia.
      UWAGA: W docelowej komórce lub komórkach nie powinna być widoczna żadna GFP. Jeśli fluorescencja jest nadal obserwowana, wróć do kroków 7.1–7.3.
   2. Korzystając z tych samych lub podobnych ustawień, jak te opisane dla obrazowania przed ablacją, uchwyć i zapisz obraz po ablacji (Rysunek 1C). Jeśli obraz ujawnia pozostałości komórek fluorescencyjnych lub dodatkowe ciała komórkowe, które należy usunąć, powtórz kroki ablacji laserowej, aby utworzyć widoczną lukę w ciągu komórek międzynerwowych.
   3. Sprawdź obraz kanału T-PMT, aby dodatkowo potwierdzić uszkodzenie sieci komórkowej. Uszkodzone komórki będą miały ziarnisty wygląd, a często jądra pęcznieją lub stają się nieregularne (Rysunek 2).
4. Po przechwyceniu obrazu przed ablacją, ablacji komórek w razie potrzeby i przechwyceniu obrazu po ablacji dla każdej indywidualnej pozycji etapu, skonfiguruj mikroskopię poklatkową, aktywując zarówno pozycję etapu, jak i opcje czasu przechwytywania obrazu. Ustaw parametry czasu na 24 godziny lub inny żądany punkt końcowy i interwały 15 minut. Rozpocznij eksperyment, aby uzyskać obrazy i zapisać wynikowy plik po zakończeniu (następnego dnia).
5. Jeśli larwy mają być dalej badane lub hodowane, należy je ostrożnie usunąć z agarozy za pomocą cienkich kleszczy, a następnie przenieść do podłoża E3 bez tricainy w celu odzyskania. Jeśli nie mają być dalej wykorzystywane, poddaj je eutanazji zgodnie z zatwierdzonym protokołem dla zwierząt (powszechną metodą jest szybkie i długotrwałe zanurzenie w kąpieli lodowej) i zutylizuj je zgodnie z wymaganiami instytucji.

9. Analiza obrazu

1. Otwórz plik z-stack po ablacji w preferowanym oprogramowaniu do przetwarzania obrazu (Tabela materiałów). Podziel kanały w taki sposób, aby każdy kanał znajdował się w osobnym okienku wyświetlania.
2. W oknie kanału GFP użyj narzędzia linia, aby narysować linię prostą między końcówkami pozostałych INMC. Może to być wspomagane przez przewijanie stosu z w górę i w dół lub przez wykonanie projekcji o maksymalnej intensywności przed narysowaniem linii.
3. Użyj narzędzia "Zmierz", aby uzyskać odległość między końcami INMC w płaszczyznach x i y.
4. Przewiń wycinki z w oryginalnym stosie z, aby określić odległość między INMC w płaszczyźnie z.
5. Oblicz całkowitą odległość między końcami INMC za pomocą twierdzenia Pitagorasa (a² + b² = c²). Przeciwprostokątna to całkowita odległość (lub rozmiar szczeliny).
6. Wprowadź wynikowy pomiar odległości do aplikacji arkusza kalkulacyjnego w celu analizy danych.
7. Przejrzyj pliki mikroskopii poklatkowej zebrane w krokach 8.2–8.3 za pomocą zintegrowanego oprogramowania do obrazowania w systemie konfokalnym lub ogólnodostępnego oprogramowania do analizy obrazu. Zidentyfikuj punkt czasowy, w którym luka między komórkami międzynerwowymi została wypełniona przez projekcje komórkowe. Może to być wspomagane przez badanie wielu warstw Z w celu potwierdzenia zamknięcia szczeliny we wszystkich wymiarach.
8. Aby uzyskać najdokładniejszy pomiar czasu do zamknięcia luki, użyj znacznika czasu obrazu po ablacji (widocznego w Finderze lub Eksploratorze plików) jako zerowego punktu czasowego; pomiar czasu od początku stosu obrazów poklatkowych może skutkować niedoszacowaniem czasu do zamknięcia, w zależności od tego, ile czasu upłynęło podczas ablacji dodatkowych pozycji etapu, itd.
9. Wyznacz szybkość zamykania, po prostu dzieląc pierwotny rozmiar szczeliny (μm) przez godziny lub minuty wymagane do całkowitego zamknięcia szczeliny.

Wyniki

W celu ablacji INMC i zarejestrowania regeneracji, przebadane larwy danio pręgowanego z ekspresją GFP z transgenicznej linii ET20 zostały zamontowane na 2 lub 3 dniach po zapłodnieniu w celu ablacji, jak opisano w kroku 5.4. Kilka ryb może być zamontowanych jednocześnie, dzięki czemu można uchwycić wiele filmów poklatkowych w jednym eksperymencie. Zidentyfikowano obszar linii bocznej znajdujący się między neuromasztami primIL3 i primIL4 i wykonano obrazy przed ablacją, jak opisano w krokach 6.5–6.7 (Rysunek 1A,B).

Trzy ciała komórkowe zostały wybrane do ablacji laserowej, aby utworzyć przerwę w łańcuchu INMC o długości około 40 μm. Skanowanie po ablacji z wysokim wzmocnieniem i późniejsze obrazowanie potwierdziło, że w obszarze po ablacji nie pozostały żadne ciała komórkowe, pozostawiając przerwę między wydłużonymi projekcjami sąsiednich INMC (Rysunek 1C). Śmierć komórki wykazano ponadto poprzez badanie kanału T-PMT po ablacji. Uszkodzone i umierające komórki charakteryzowały się spuchniętymi i nieregularnie ukształtowanymi jądrami, a także ziarnistym wyglądem (Ryc. 2, zarysowany). W niektórych przypadkach obrazowanie poklatkowe ujawniło również rekrutację dużych komórek ameboidalnych, które prawdopodobnie były makrofagami (Ryc. 2, gwiazdka). Ciemne obszary otaczające ablowane INMC wskazywały na fotowybielanie w leżących nad nimi komórkach perydermy. W tych eksperymentach komórki te nie wydawały się być uszkodzone lub zniszczone przez promieniowanie laserowe; raczej ich fluorescencja została tymczasowo zmniejszona. Mikroskopia poklatkowa ujawnia, że komórki te normalnie regenerują się po ablacji i nie zmieniają kształtu ani w inny sposób nie wydają się uszkodzone (niepublikowane wyniki, Volpe i wsp.).

Aby potwierdzić specyficzność niszczenia INMC, przeprowadzono ablacje na podwójnie transgenicznych larwach ET20 i Tg(neuroD:tdTomato), w których nerw linii bocznej (który biegnie zaledwie mikrony poniżej komórek międzynerwowych) jest znakowany czerwonym białkiem fluorescencyjnym. Ablacje kilku komórek, które utworzyły znaczne luki w strunie INMC, miały niewielki lub żaden wpływ na nerw linii bocznej oparty na czerwonej fluorescencji (Ryc. 3). Elastyczność techniki ablacji powierzchownie zlokalizowanych komórek wykazano poprzez selektywne niszczenie pojedynczych czuciowych komórek rzęsatych w obrębie neuromasztów linii bocznej. Stosując zasadniczo ten sam protokół opisany powyżej (sekcje 7 i 8), pojedyncze komórki rzęsate w transgenicznych larwach Tg(myo6b:βaktyna-GFP) zostały zniszczone bez widocznego uszkodzenia sąsiednich komórek (Ryc. 4). Ablowane komórki rzęsate nie odzyskały fluorescencji po mikroskopii poklatkowej, a ich jądra były zauważalnie ziarniste i zniekształcone po ekspozycji laserowej (Ryc. 4B). Podobnie jak w przypadku ablacji INMC, pozorne makrofagi były często rekrutowane do miejsca ekspozycji laserowej (niepublikowane wyniki, Volpe i wsp.).

Po wykonaniu ablacji laserowej i przechwyceniu obrazu po ablacji, rozmiar szczeliny został zmierzony za pomocą ogólnodostępnego oprogramowania do analizy obrazu. Narzędzie pomiarowe wykazało rozmiary szczelin od kilku mikronów do 100 mikronów, w zależności od szerokości poszczególnych INMC i liczby komórek wybranych do ablacji (Rysunek 5). Mikroskopia poklatkowa została wykorzystana do zarejestrowania zachowań INMC podczas regeneracji. W 50 badaniach 15 luk (30%) zostało wypełnionych przez regenerację w ciągu 24 godzin. W większości przypadków INMC, które były w stanie wyzdrowieć, zrobiły to w ciągu pierwszych kilku godzin od obrazowania. Odzysk zdefiniowano jako punkt czasowy, w którym zetknęły się wypustki z sąsiednich komórek, co nastąpiło 16 godzin po ablacji w przerwie około 40 μm (Filmik 1). Stosy Z zostały dokładnie zbadane, aby upewnić się, że kontakt komórka-komórka występuje w jednej płaszczyźnie Z, unikając możliwych artefaktów spowodowanych projekcjami Z. Analiza regresji logistycznej wykazała, że prawdopodobieństwo zamknięcia luki korelowało z wielkością luki (p = 0,0453), przy czym mniejsze luki miały większe szanse na zagojenie. Przerwa 55,5 μm dała prawdopodobieństwo zamknięcia na poziomie 50% (Rysunek 5).

W 70% przypadków INMC nie były w stanie całkowicie wypełnić luki powstałej w wyniku ablacji. Jednak nawet w tych przypadkach byliśmy w stanie monitorować powstawanie długich projekcji z sąsiednich INMC, które pod pewnymi względami przypominają rozciągające się stożki wzrostu neuronów (film 2). W związku z tym eksperymenty te mogą również dostarczyć wglądu w zachowania INMC po uszkodzeniu.

Rycina 1: Selektywna ablacja komórek międzynerwowych za pomocą promieniowania laserowego. (A) Komórki międzynerwowe między neuromastem primIL3 i primIL4 zostały wybrane do ablacji. Komórki te mają charakterystyczny kształt wrzeciona z wydłużonymi wypustkami zachodzącymi na sąsiednie ciała komórek. (B) Obrazowanie przed ablacją zidentyfikowało ciała komórkowe, które można poddać ablacji w celu wytworzenia luki. (C) Obrazowanie po ablacji potwierdza udaną ablację, na co wskazuje brak ciał komórkowych w obszarze przerwy. Podziałka = 10 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 2: Obrazowanie po ablacji pokazuje śmierć komórki w odpowiedzi na ekspozycję laserową w komórkach międzynerwowych znakowanych GFP. Obrazowanie fotopowielacza w świetle przechodzącym (T-PMT) wskazuje na obecność komórki martwiczej o ziarnistym wyglądzie (otoczonej), a także na rekrutację komórek o nieregularnych kształtach, które prawdopodobnie są makrofagami (*). Połączenie kanałów GFP i T-PMT potwierdza, że śmierć komórki i aktywność makrofagów nastąpiły w miejscu ablacji. Podziałka = 10 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 3: Swoistość ablacji międzynerwowo-mastolskiej. (A) Komórki międzynerwowe znakowane GFP przed ablacją (zielone) i nerwy linii bocznej znakowane tdPomidor (czerwone) w podwójnie transgenicznym Tg (ET20; NeuroD:tdTomato) larwa. Ciała komórkowe znajdujące się w bliskiej odległości od nerwu linii bocznej były celem ablacji. (B) Obrazowanie po ablacji wykazuje ablację docelowych ciał komórkowych z nienaruszonym nerwem linii bocznej. Podziałka = 10 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 4: Ablacja czuciowych komórek rzęsatych za pomocą mikroskopii konfokalnej. (A) Obrazowanie przed ablacją zidentyfikowało czuciową komórkę rzęsatą znakowaną GFP (*) przeznaczoną do ablacji u podwójnie transgenicznego Tg(ET20; myo6b:βaktyna-GFP) danio młodego. Obrazowanie w lampie fotopowielacza światła przechodzącego (T-PMT) ujawnia normalną morfologię komórek rzęsatych o okrągłym przekroju poprzecznym. (B) Obrazowanie po ablacji potwierdza udaną ablację docelowej komórki rzęsatej . Obraz T-PMT wskazuje na nieregularność kształtu komórek włosa i zwiększoną ziarnistość po ekspozycji laserowej, co sugeruje śmierć komórki, a nie fotowybielanie. Podziałka = 10 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Regresja logistyczna modeluje prawdopodobieństwo zamknięcia szczeliny w funkcji szerokości szczeliny (w μm). Wynik 0 oznacza całkowite zamknięcie luki, podczas gdy wynik 1 oznacza niepełne zamknięcie luki. Wyniki wskazują, że wpływ szerokości szczeliny na zdolność komórek międzynerwowych do zamykania poszczególnych szczelin jest istotny statystycznie (p = 0,0453, n = 24 ogółem; n = 12 zamkniętych przerw, n = 12 niecałkowicie zamkniętych przerw). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Film 1: Mikroskopia poklatkowa pokazująca zamknięcie luki (~40 μm) po 16 godzinach. Obrazy były rejestrowane co 15 minut, a projekcja z o maksymalnej intensywności została wykonana dla wszystkich punktów czasowych. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Film 2: Mikroskopia poklatkowa luki INMC, która się nie zamknęła. Pokazano wydłużone i rozgałęzione rzuty pozostałych INMC. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Dyskusja

Protokół opisuje wszechstronną metodę laserowej ablacji komórek, którą można wykonać na dowolnym mikroskopie konfokalnym wyposażonym w laser bliski ultrafioletowi (długość fali 405 nm). Protokół ten odnosi się do ograniczeń wcześniej stosowanych metod, takich jak elektroablacja (która powoduje bardziej rozległe uszkodzenia¹¹) i pulsacyjna ablacja laserem UV (która wymaga dodatkowego specjalistycznego sprzętu¹²). Obrazowanie konfokalne przed i po ablacji zapewnia szybką informację zwrotną na temat powodzenia eksperymentu. Późniejsza mikroskopia poklatkowa oferuje prosty test regeneracji w typie komórki, który ma kluczowe znaczenie dla rozwoju układu sensorycznego.

Niezwykle ważne jest przeprowadzenie badań przesiewowych w kierunku transgenicznego danio pręgowanego, u których występuje silna ekspresja GFP w neuromasztach i INMC. Larwy o jasnej fluorescencji i mniej więcej równych odstępach między neuromasztami pochodzącymi z primI są idealnymi kandydatami do ablacji laserowej. Nawet u tych ryb czasami występują ciemniejsze INMC, które mogą początkowo uniknąć wykrycia. Komórki te mogą pozostać w tyle po ablacji laserowej, zapobiegając powstaniu prawdziwej szczeliny między INMC. Wzmocnienie cyfrowe powinno być dostosowane tak, aby odsłonić te ściemniacze komórek podczas obrazowania przed ablacją, tak aby można je było również celować za pomocą lasera 405 nm (krok 8.2).

Podobnie, celowanie laserowe czasami nie zniszczy całkowicie komórki; raczej wybieli fluorescencję, co spowoduje, że nie uda się stworzyć prawdziwej szczeliny. Fluorescencja komórek tych na ogół wzrośnie podczas mikroskopii poklatkowej. Korekta wzmocnienia na etapie obrazowania po ablacji wraz z obrazowaniem T-PMT (ryc. 2) pomaga zapewnić, że wszystkie docelowe komórki zostały skutecznie usunięte. Często wymaga dwóch lub trzech pojedynczych ablacji komórek, aby wytworzyć przerwę w ciągu INMC. Śmierć komórki można wykryć przez pęcherzyki lub ziarniste pojawienie się w docelowych komórkach; Chociaż może to wymagać krótkiego okresu oczekiwania po namierzeniu laserowym (a w niektórych przypadkach wkrótce potem obserwuje się pozorne postacie apoptotyczne lub nekrotyczne).

Ograniczeniem tej procedury jest to, że może wymagać wielu prób eksperymentalnych, zanim warunki pracy lasera zostaną zoptymalizowane, a regeneracja INMC zakończy się sukcesem. Moc lasera i całkowity czas przebywania lasera mogą wymagać niewielkiej regulacji dla różnych próbek. Stwierdzono, że nadmierne zastosowanie lasera może osłabić zdolność linii bocznej do samonaprawy. Obejmuje to zarówno 1) nadmierną ekspozycję pojedynczych komórek na promieniowanie laserowe, przypuszczalnie powodujące dodatkowe uszkodzenia otaczających tkanek, jak i 2) ablację zbyt wielu komórek w sznurku, prowadzącą do większej szczeliny. Użytkownicy muszą osiągnąć równowagę między wystarczającym napromieniowaniem komórek, aby zapewnić ich zniszczenie, a nie prześwietlać komórek, co może spowolnić lub uniemożliwić regenerację. Przy odpowiednich ustawieniach stwierdzono, że INMC można usunąć bez widocznego uszkodzenia tylnego nerwu bocznego, co wskazuje, że uszkodzenia uboczne są zminimalizowane dzięki temu protokołowi, w przeciwieństwie do elektroablacji¹¹. W żadnym przypadku nie zaobserwowano nowych neuromasztów tworzących się w szczelinie, prawdopodobnie dlatego, że nerw linii bocznej pozostaje nienaruszony, a leżące pod nim komórki glejowe pozostają i hamują proliferację INMC 6,7,8,11.

Wykazano, że ta metoda konfokalnej ablacji laserowej może być stosowana również do innych typów komórek, szczególnie tych powierzchownie zlokalizowanych w ciele zwierzęcia, w tym czuciowych komórek rzęsatych (ryc. 4). Podobny protokół może być stosowany do ablacji komórek skóry w celu zbadania gojenia ran lub neuronów do badań nad regeneracją aksonów, jak opisano wcześniej¹³. Przewiduje się, że technika ta stanie się użytecznym dodatkiem do eksperymentalnego repertuaru laboratoriów, które dysponują mikroskopem konfokalnym, ale nie posiadają innego specjalistycznego sprzętu do ablacji laserowej.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
12-dołkowe szkiełka drukowane PTFE	Mikroskopia elektronowa Nauki	63425-05
15 mM Roztwór podstawowy trikainy	Sigma	E10521	15 mM Trikaina w wodzie z odwróconej osmozy
1X E3 + 600 &mikro; M Trikaina			Rozcieńczyć 15 mM Zapas Trikainy 25X w 1X pożywce
E3 1X Pożywka			Rozcieńczyć 60X pożywki E3 do 1X w wodzie z odwróconej osmozy (16,7 ml/L)
60 X E3	Wszystkie składniki zakupione od Sigma-Aldrich		34,4 g Nacl, 1,52 g Kcl, 5,8 g CaCl2,2H2O, 9,8 g MgSO4,7H20 w 1 litrze wody z odwróconej osmozy
Mikroskop złożony Bx60 z fluorescencyjną lampą łukową rtęciową	Olympus
LSM 700 wyposażony w lasery 405 nm, 488 nm i 555 lub 561 nm	Zeiss Microscopy, LLC		Do ablacji użyto lasera o długości fali 5 mW i długości fali 405 nm; Ablacje i obrazowanie przeprowadzono za pomocą 63-krotnego obiektywu planapochromatycznego o NA 1,40
FIJI/ImageJ Oprogramowanie do przetwarzania obrazu	Wielu współpracowników		Do pobrania pod adresem https://fiji.sc/
Igła preparcyjna zmodyfikowana w nóż do włosów	Fisher Scientific	19010	Rzęsa została przyklejona do końca igły preparacyjnej z drewnianą rękojeścią
Oprogramowanie Microsoft Excel	Microsoft Corp.		Arkusze Google to bezpłatna alternatywa dla Microsoft Excel
Talerze ze szklanym dnem 35 mm z szkiełkiem nakrywkowym nr 1,5, okienko 20 mm	Mattek Corporation	P35G-1.5-20-C	szalka Petriego 35 mm, szklane okienko 20 mm
Immersol 518F Olejek immersyjny	Fisher Scientific	12-624-66A
Agaroza o niskim stopniu żelowania	Sigma Life Science	A9414-256
Wkładka Corning Netwell z siatką poliestrową 74 um, wkładka 24 mm	Millipore Sigma	CLS3479-48EA
Oprogramowanie	Rstudio Rstudio PBC		do pobrania pod adresem https://rstudio.com/
SMX-168-BL Mikroskop stereoskopowy	Motic
	Oprogramowanie Fisher Scientific	13-711-7M
ZEN	Carl Zeiss Microscopy, LLC