Artykuł metodologiczny

Przygotowanie próbki TMT do przedłożenia przez placówkę proteomiczną i późniejszej analizy danych

DOI:

10.3791/60970

⸱

8 czerwca 2020

 ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, University of Florida

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentujemy zoptymalizowany protokół etykietowania tandemowego znacznika masy (TMT), który zawiera szczegółowe informacje dla każdego z następujących etapów: ekstrakcja białka, kwantyfikacja, wytrącanie, trawienie, etykietowanie, przesyłanie do ośrodka proteomicznego i analiza danych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Technologie proteomiczne to potężne metodologie, które mogą pomóc nam zrozumieć mechanizmy działania w systemach biologicznych, dostarczając globalnego spojrzenia na wpływ choroby, leczenia lub innego stanu na proteom jako całość. Raport ten zawiera szczegółowy protokół ekstrakcji, kwantyfikacji, wytrącania, trawienia, etykietowania i późniejszej analizy danych próbek białek. Nasz zoptymalizowany protokół etykietowania TMT wymaga niższego stężenia etykiety i zapewnia niezmiennie wiarygodne dane. Wykorzystaliśmy ten protokół do oceny profili ekspresji białek w różnych tkankach myszy (tj. sercu, mięśniach szkieletowych i mózgu), a także w komórkach hodowanych in vitro. Ponadto pokazujemy, jak ocenić tysiące białek z wynikowego zestawu danych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Termin "proteomika" został po raz pierwszy zdefiniowany jako wielkoskalowa charakterystyka całego dopełniacza białkowego komórki, tkanki lub organizmu1. Analizy proteomiczne umożliwiają badanie mechanizmów i procesów komórkowych zaangażowanych w rozwój choroby, szlaków terapeutycznych i zdrowych systemów przy użyciu technik przeprowadzania względnej kwantyfikacji poziomów ekspresji białek2. Wstępne opisy takich badań zostały opublikowane w 1975 roku i wykazały zastosowanie w tym celu dwuwymiarowej elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (2D-PAGE)1,3. Metoda 2D rozdziela białka na podstawie ładunku (ogniskowanie izoelektryczne, IEF) i masy cząsteczkowej (elektroforeza w żelu poliakrylamidowym dodecylosiarczanu sodu lub SDS-PAGE)4. Przez lata połączenie 2D-PAGE i późniejszej tandemowej spektrometrii mas wykonywanej na każdym składniku żelu było najpowszechniejszą techniką przeprowadzanej analizy ekspresji białek bez ukierunkowanej metody i identyfikowało wiele nieznanych wcześniej profili ekspresji białek5,6. Ogólne wady podejścia 2D-PAGE polegają na tym, że jest ono czasochłonne, nie działa dobrze w przypadku białek hydrofobowych oraz że istnieje ograniczenie w całkowitej liczbie ocenianych białek ze względu na niską czułość7,8.

Metoda znakowania stabilnych izotopów za pomocą metody SILAC (aminokwasy w hodowli komórkowej) stała się kolejnym popularnym podejściem do identyfikacji i ilościowego określania obfitości białek w próbkach9. Polega na znakowaniu metabolicznym komórek, które są inkubowane w pożywce pozbawionej standardowego aminokwasu egzogennego i uzupełnione znakowaną izotopowo wersją tego konkretnego aminokwasu10. Zaletą tej techniki jest jej skuteczność i precyzyjne etykietowanie9. Głównym ograniczeniem podejścia SILAC jest przede wszystkim zmniejszone tempo wzrostu komórek spowodowane włączeniem znacznika izotopowego, co może być szczególnie trudne w przypadku stosunkowo wrażliwych linii komórkowych modelujących choroby ludzkie11.

W 2003 roku wprowadzono nowatorską i solidną technikę proteomiczną wykorzystującą tandemowe znaczniki masy (TMT) izobaryczne etykiety12. Znakowanie TMT jest potężną metodą ze względu na zwiększoną czułość wykrywania względnych poziomów ekspresji białek i modyfikacji potranslacyjnych13. Od tej daty publikacji opracowano zestawy TMT, które mogą jednocześnie oznaczać 6, 10, 11 lub 16 próbek. W rezultacie, możliwe jest mierzenie obfitości peptydów w wielu warunkach z replikami biologicznymi w tym samym czasie14,15,16. Niedawno użyliśmy TMT do scharakteryzowania profilu proteomicznego serca mysiego modelu zespołu Bartha (BTHS)17. W ten sposób byliśmy w stanie wykazać powszechną poprawę profili sercowych myszy z BTHS leczonych terapią genową i zidentyfikować nowe białka, na które wpływa BTHS, które ujawniły nowe szlaki terapeutyczne zaangażowane w kardiomiopatie.

Tutaj opisujemy szczegółową metodę przeprowadzania multipleksowych ilościowych analiz proteomicznych TMT przy użyciu próbek tkanek lub granulek komórkowych. Korzystne może być przygotowanie i etykietowanie próbki przed przesłaniem do rdzenia, ponieważ znakowane peptydy tryptyczne są bardziej stabilne niż surowe zamrożone próbki, nie wszystkie rdzenie mają doświadczenie w obsłudze wszystkich rodzajów próbek, a przygotowanie próbek w laboratorium może zaoszczędzić czas na rdzenie, które często mają długie zaległości. Szczegółowe opisy części tego procesu przeznaczonej dla spektroskopii mas można znaleźć w Kirshenbaum et al. i Perumal et al.18,19.

Protokół przygotowania próbki składa się z następujących głównych etapów: ekstrakcja, kwantyfikacja, wytrącanie, trawienie i etykietowanie. Głównymi zaletami tego zoptymalizowanego protokołu jest to, że zmniejsza on koszty etykietowania, poprawia ekstrakcję białek i konsekwentnie generuje dane wysokiej jakości. Ponadto opisujemy, jak analizować dane TMT w celu przesiewania tysięcy białek w krótkim czasie. Mamy nadzieję, że ten protokół zachęci inne grupy badawcze do rozważenia włączenia tej potężnej metodologii do swoich badań.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania z Uniwersytetu Florydy zatwierdził wszystkie badania na zwierzętach.

1. Przygotowanie odczynników

  1. Przygotuj bufor do lizy CHAPS (150 mM KCl, 50 mM HEPES pH = 7,4, 0,1% CHAPS i 1 tabletka koktajlowa inhibitora proteazy na 50 ml buforu). Bufor bez inhibitorów proteazy może być przechowywany w temperaturze 4 °C przez okres do 6 miesięcy lub bufor z inhibitorem proteazy przechowywany w temperaturze -20 °C do 1 roku.
  2. Przygotuj 100 mM wodorowęglanu trietyloamonu (TEAB): Dodaj 500 μl 1 M TEAB do 4,5 ml ultraczystej wody.
  3. Przygotować 200 mM chlorowodorku fosfiny tris (2-karboksyetylo) fosfiny (TCEP): Dodać 70 μl 0,5 M TCEP, odczynnika denaturującego, do 70 μl ultraczystej wody. Następnie dodać 35 μl 1 M TEAB.
  4. Przygotuj 5% hydroksyloaminy: Dodaj 50 μl 50% hydroksyloaminy do 450 μl 100 mM TEAB.

2. Ekstrakcja białka

  1. Odizoluj mięsień czworogłowy uda od myszy poddanej eutanazji zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez IACUC. Zamrażać i utrzymywać w temperaturze -80 °C lub kontynuować zgodnie z protokołem do natychmiastowego użycia.
  2. Pokrój, aby wyizolować około 10 mg świeżej lub mrożonej tkanki mięśnia czworogłowego uda. Oddziel włókna za pomocą pęsety podczas pracy z mięśniami szkieletowymi. Alternatywnie, jeśli pracujesz z kulturami komórkowymi, ponownie zawieś ~3 x 106 komórek w 300 μl buforu do lizy CHAPS i przejdź do kroku 2.4.
  3. Homogenizować tkankę za pomocą rozdzielacza kulek przy użyciu probówek o pojemności 2 ml wypełnionych około 200 μl kulek cyrkonu/krzemionki o średnicy 1 mm i 500 μl buforu do lizy CHAPS. Odpowiednio zwiększyć lub zmniejszyć skalę (np. 5 mg tkanki w 250 μl buforu do lizy CHAPS).
  4. Wykonaj sonikację (10x po 10 s z 50% amplitudą i 30-sekundowymi odstępami na lodzie), aby uwolnić białko związane z DNA. Te same wyniki degradacji DNA można osiągnąć albo za pomocą lizy strzykawki, przepuszczając lizat 10x przez igłę 21 G przymocowaną do strzykawki o pojemności 1 ml, albo przez inkubację benzonazy (44 U/ml) w temperaturze 37 °C przez 30 min.
  5. Odwirować lizat przy 16 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i przenieść supernatant do nowej probówki wirówkowej.

3. Pomiar białka

  1. Oznaczyć stężenie białka w supernatantze przy użyciu ustalonych protokołów (patrz tabela materiałów).
    UWAGA: Najlepiej jest używać próbek o stężeniu ≥2 μg/μl, ale można również stosować próbki o mniejszym stężeniu. Jeżeli stosuje się próbkę o mniejszym stężeniu, konieczne będzie odpowiednie dostosowanie objętości odczynników redukujących/alkilujących w kroku 5.1.
  2. Przygotować rozcieńczenie krzywej wzorcowej BSA przy użyciu buforu do lizy CHAPS.
  3. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta, a po 15 minutach odczytaj absorbancję przy 750 nm.

4. Redukcja/alkilowanie odczynników

  1. Przenieś 200 μg białka na warunek do nowej probówki wirówkowej i dostosuj do końcowej objętości 100 μl za pomocą buforu do lizy CHAPS. Możliwe jest skalowanie do 200 μL, gdy stężenie białka jest zbyt niskie, ale nie należy zapominać o odpowiednim dostosowaniu objętości odczynnika redukującego/alkilującego .
  2. Dodać 5 μl 200 mM TCEP i inkubować próbki w temperaturze 55 °C przez 1 godzinę.
  3. Bezpośrednio przed użyciem należy przygotować 375 mM jodoacetamidu, rozpuszczając jedną probówkę jodoacetamidu (tj. 9 mg) w 132 μl 100 mM TEAB. Chroń to rozwiązanie przed światłem.
  4. Dodać 5 μl 375 mM jodoacetamidu do próbki i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej (RT), chroniąc przed światłem.

5. Strącanie metanolu/chloroformu20

  1. Dodać 400 μl metanolu do każdych 100 μl białka i krótko zawirować próbki.
  2. Wirować przy 9 000 x g przez 10 s w temperaturze pokojowej. Ma to na celu włączenie płynów osadzonych po bokach probówki z próbką.
  3. Do mieszaniny dodać 100 μl chloroformu i krótko wirować. Użyj 200 μl chloroformu, jeśli próbka ma wysokie stężenie fosfolipidów.
  4. Wirować przy 9 000 x g przez 10 s w temperaturze pokojowej. Ma to na celu włączenie płynów osadzonych po bokach probówki z próbką.
  5. Dodać 300 μl wody i energicznie mieszać. Ważne jest, aby uzyskać jednorodny roztwór.
  6. Wirować przy 9 000 x g przez 1 minutę przy wilgotności względnej. Należy zachować szczególną ostrożność, aby nie naruszyć warstw podczas przenoszenia probówki do stojaka.
    UWAGA: Probówka powinna teraz zawierać trzy fazy: 1) Górna warstwa (tj. supernatant), mieszanina wody i metanolu; 2) Warstwa środkowa (tj. interfaza), białe wytrącone białko; oraz 3) Dolna warstwa (tj. faza dolna), chloroform.
  7. Ostrożnie usunąć supernatant.
  8. Dodać 300 μl metanolu do pozostałej fazy międzyfazowej i dolnej. Wiruj energicznie.
  9. Wirować przy 9 000 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej. Zachowaj szczególną ostrożność, aby nie naruszyć warstw podczas przenoszenia probówki do stojaka.
  10. Ostrożnie usunąć supernatant.
  11. Delikatnie zassać jak najwięcej płynu pod strumieniem powietrza (np. za pomocą koncentratora próżniowego) przy temperaturze pokojowej, aż granulat będzie lekko wilgotny (~10 min). Ponieważ niezbędny czas może być różny dla każdej próbki, należy sprawdzać ją co 2 minuty w celu oceny. Przechowywać granulat w temperaturze -80 °C do czasu dalszej obróbki.

6. Trawienie białek

  1. Zawiesić wytrącony osad białkowy w 100 μl buforu do lizy TEAB.
    UWAGA: Pomiar stężenia białka na tym etapie jest opcjonalny.
  2. Bezpośrednio przed użyciem należy przygotować 1 μg/μl trypsyny, dodając 100 μl roztworu do przechowywania trypsyny (50 mM kwasu octowego) na dno fiolki ze szklaną trypsyną 100 μg i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej stężenia. Pozostały odczynnik należy przechowywać w dawkach jednorazowego użytku w temperaturze -80 °C.
  3. Dodać 2,5 μl trypsyny na 100 μg białka. Próbkę trawić przez noc w temperaturze 37 °C. Ten etap ma kluczowe znaczenie dla całkowitego rozpuszczenia białka; Nie modyfikuj tych warunków. Po trawieniu opcjonalnie można zmierzyć stężenie białka za pomocą standardowych testów białkowych.

7. Etykietowanie peptydów

  1. Bezpośrednio przed użyciem należy zrównoważyć odczynniki z zestawu etykiet TMT do RT.
  2. Rozpuścić każdą z fiolek ze znacznikiem 0,8 mg TMT przez dodanie 41 μl bezwodnego acetonitrylu do każdej probówki. Inkubować odczynnik przez 5 minut w temperaturze pokojowej z okazjonalnym wirowaniem. Krótko odwirować probówki.
    UWAGA: Stężenie 0,8 mg znacznika TMT zwykle wystarcza do oznaczenia dwóch zestawów. Inni badacze wykazali jednak, że stężenie to można jeszcze bardziej zmniejszyć i nadal dostarczać wiarygodnych danych15.
  3. Ostrożnie dodać 41 μl odczynnika do etykiety TMT do każdej próbki o objętości 100 μl.
  4. Inkubować reakcję przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  5. Dodać 8 μl 5% hydroksyloaminy do próbki i inkubować przez 15 minut w celu wygaszenia reakcji.
  6. Podzielić próbki na równe ilości w nowej probówce wirówkowej i przechowywać w temperaturze -80 °C.
    UWAGA: Na tym etapie próbki są stabilne i mogą być przekazane do spektroskopii mas. Pomiar stężenia w tym momencie jest opcjonalny przy użyciu standardowych testów białkowych.

8. Spektroskopia mas

  1. Prześlij próbki do ośrodka proteomicznego (w tym badaniu wykorzystano obiekt UF ICBR Proteomics Core), gdzie wszystkie próbki są łączone i oczyszczane za pomocą kolumn wirowych C18.
    UWAGA: Przedyskutuj z główną placówką, w jaki sposób przesłać próbki przed ich przygotowaniem, aby potwierdzić dokładne kroki, które preferują przy składaniu próbek.
  2. Poproś o następujące procedury dla połączonej próbki multipleksowej: ekstrakcja do fazy stałej, HPLC (SCX, SE), końcówka zip i LC-MS/MS (2-godzinny gradient dla identyfikacji białka, jeśli >10QE Plus).
  3. Po zebraniu danych główny zakład będzie przetwarzał pliki RAW za pomocą dostarczonego przez dostawcę oprogramowania do identyfikacji białek.

9. Analiza danych

  1. Dane są zazwyczaj dostarczane z rdzenia z powrotem do użytkownika w formacie 7z, który może wymagać około 16 GB miejsca na dysku na każdy zestaw danych (w tym przypadku 11 próbek). Do przetwarzania danych upewnij się, że dostępny jest komputer o częstotliwości co najmniej 3,4 GHz.
  2. Wyodrębnij pliki za pomocą Menedżera plików 7-Zip. Te wyodrębnione pliki zawierają dane RAW, plik w formacie pdStudy i plik w formacie pdResultView. Zapisz wszystkie pliki do dalszych analiz.
  3. Otwórz plik za pomocą oprogramowania Proteome Discovery 2.2.
    UWAGA: Format pliku to "Nazwa pliku.pdStudy". Jeśli otwarty jest plik "Nazwa pliku.pdResultView", nie jest możliwe wybranie próbki kontrolnej.
  4. Wybierz próbki kontrolne w panelu "Próbki".
  5. Otwórz Wynik, wybierając ID w panelu "Wyniki analizy".
  6. Eksport do arkusza kalkulacyjnego.
  7. Zapisz surowe dane (wszystkie zidentyfikowane białka).
  8. Otwórz plik z oprogramowaniem arkusza kalkulacyjnego. Będzie on zawierał wszystkie zidentyfikowane białka.
  9. W pliku oprogramowania arkusza kalkulacyjnego użyj funkcji "Filtr", aby przefiltrować "Pewność białka FDR: Łączona" na wysoką (kolumna B), "#Unique peptydy" wyższą niż 2 (kolumna K) i jedną z "Współczynnika obfitości" wyłącznie pustą (kolumna S do W).
  10. Wstaw kolumnę do obliczenia "wartości p" za pomocą funkcji
    =TEST.Test(grupa kontrolna;grupa eksperymentalna;ogony;typ)
  11. Wstaw kolumnę "Istotność statystyczna" z funkcją
    =JEŻELI(wartość-p<0,05;"Istotność";"NS")
  12. Użyj funkcji "Filtruj", aby wyświetlić "Istotność statystyczna" pokazującą "Istotność". Uzyskany wynik przedstawia analizowane białka o istotności statystycznej w grupie kontrolnej i grupie eksperymentalnej.
  13. Określ znacznie wyższą lub niższą obfitość ekspresji białka w grupie eksperymentalnej w porównaniu z grupą kontrolną, wstaw kolumnę "Regulacja" z funkcją
    =JEŻELI(ŚREDNIA(grupa kontrolna)>ŚREDNIA(grupa eksperymentalna);"Regulacja w górę";"Obniżona")

10. Metody oceny znaczących trafień

  1. Aby zidentyfikować interakcje białko-białko między istotnymi trafieniami zidentyfikowanymi w badaniach TMT, użyj narzędzia Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins (STRING) wersja 11.021: https://string-db.org/
  2. Aby sklasyfikować według grup (tj. funkcji molekularnych, procesów biologicznych i klas białek), użyj oprogramowania do klasyfikacji ontologii Analizy Białek za pomocą Relacji Ewolucyjnych (PANTHER)22: http://www.pantherdb.org/
  3. Aby zidentyfikować interakcje białek w różnych szlakach, użyj oprogramowania do analizy ścieżek23.

11. Przesyłanie danych proteomicznych do banku repozytorium

  1. Aby przesłać dane proteomiczne do bazy danych Proteomics IDEntificantions Database (PRIDE) lub interaktywnego środowiska wirtualnego spektrometrii mas (MassIVE), należy dołączyć następujące informacje: pliki z listą pików (przetworzone pliki widma masowego w standardowym formacie, takim jak mzXML, mzML lub MGF), pliki wyników (identyfikacje widma w standardowym formacie, takim jak mzIdentML lub mzTab) oraz surowe pliki widma (surowe pliki widma masowego w formacie niestandardowym lub specyficznym dla instrumentu, takim jak . Pliki RAW lub . WIFF).
  2. Aby przesłać zgłoszenie, utwórz konto i dołącz informacje, takie jak przynależność i szczegóły projektu. Następnie wybierz pliki wymienione w kroku 11.1 i prześlij je.
  3. Aby utworzyć oficjalny zestaw danych, uruchom przepływ pracy przesyłania dla tych przesłanych plików.
    UWAGA: Po przesłaniu zestaw danych będzie prywatny w banku repozytorium. W przypadku opcji prywatnej dane są dostępne tylko dla uprawnionych użytkowników. Istnieją dwie dodatkowe opcje: 1) Współdzielony zestaw danych, który daje dostęp do recenzentów czasopisma i współpracowników; lub 2) Publiczny zbiór danych, który pojawi się w wyszukiwaniach w publicznych zbiorach danych. Kolejną ważną cechą tych repozytoriów jest możliwość aktualizacji wgranych danych i powiązania kolejnych publikacji z istniejącym zbiorem danych.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zdrowe i chore komórki zostały poddane lizie w buforze CHAPS, przygotowane zgodnie z naszą metodą znakowania TMT i przesłane do Interdyscyplinarnego Centrum Badań Biotechnologicznych Uniwersytetu Florydy (UF-ICBR) Proteomics Core for Liquid Chromatography z tandemową spektrometrią mas. Po pozyskaniu i dostarczeniu danych z rdzenia, zestaw danych został otwarty w oprogramowaniu dostarczonym przez dostawcę i zastosowano następujące filtry odcinające: ≥2 unikalne peptydy, jony reporterowe dla każdej próbki białka obecnej we wszystkich kanałach i zawierające tylko znacząco zmienione białka (p ≤ 0,05). Tabela 1 podsumowuje dane: 39 653 peptydy ogółem, z których 7 211 ma równe lub większe niż dwa unikalne peptydy, a 3 829 zawiera jony reporterowe dla wszystkich kanałów. Wartości p dla tych 3,829 peptydów zostały obliczone za pomocą testu t Studenta, a p ≤ 0,05 uznano za znaczące. Ponadto, do określenia względnej dystrybucji białek z komórek chorych w porównaniu ze zdrowymi zastosowano metodę odcięcia zmiany fałdowania: w dół (niebieski) lub w górę (czerwony) (Ryc. 1).

Lista znacznie rozregulowanych ekspresji białek została oceniona za pomocą systemu klasyfikacji ontologii PANTHER i analiz STRING. Analizy Panther wykazały skategoryzowaną listę białek opartą na znacznie niższej (Ryc. 2A) lub wyższej liczebności w chorych komórkach w oparciu o funkcję molekularną (Figura 2B). Analizy ciągów białek o znacznie niższej (Rysunek 2C) i wyższej (Rysunek 2D) obfitości zidentyfikowały liczne interakcje i silne powiązania między białkami.

figure-results-1
Rycina 1: Wykres wulkaniczny przedstawiający białka, których obfitość nie uległa znaczącej zmianie (kolor), znacznemu obniżeniu (kolor niebieski) lub znacznemu wzrostowi (kolor czerwony) w chorych i zdrowych komórkach kontrolnych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rycina 2: Reprezentatywne oceny istotnie rozregulowanych trafień zidentyfikowanych przez PANTHER (A, B) i String (C, D) znacznie niższych lub wyższych białek obfitości. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Peptydy ogółemOgółem zidentyfikowane≥ 2 unikalne peptydyBiałka oznaczane ilościowoZnacząco zmienione białka
niskiwysoki
Numer katalogowy: 39653Zobacz materiał 7211Numer katalogowy: 4457Numer katalogowy: 3829Rozdział 296Rozdział 108

Tabela 1: Reprezentatywna tabela ilościowo oznaczonych białek według analizy zestawu danych.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby skutecznie przygotować próbki do analizy proteomicznej przy użyciu metodologii znakowania izobarycznych stabilnych izotopów opartych na TMT, kluczowe znaczenie ma bardzo ostrożne przeprowadzanie ekstrakcji białek w temperaturze 4 °C i stosowanie buforu do lizy, który zawiera koktajl inhibitorów proteazy 24,25. Koktajl inhibitorów proteazy jest kluczowym odczynnikiem pozwalającym uniknąć nieoczekiwanej degradacji białka podczas trawienia białka. Jedną z kluczowych różnic między naszym protokołem a obecnym protokołem dostarczonym przez dostawcę jest to, że zdecydowanie zalecamy stosowanie buforu do lizy CHAPS w oparciu o nasze doświadczenie z komórkami i tkankami ssaków. Sugerujemy również stosowanie podejścia do wytrącania białek metanolu/chloroformu zarówno w przypadku granulek komórkowych, jak i tkanek.

Idealnie byłoby, gdyby ekstrakcja białka, pomiar, odczynniki redukcyjne/alkilujące oraz wytrącanie metanolu/chloroformu były wykonywane tego samego dnia. Stosowanie się do tego zalecenia zaowocuje dokładniejszymi stężeniami białka do późniejszego znakowania. Etap wytrącania białek jest ważny dla usunięcia odczynników, które będą zakłócać tandemową spektrometrię mas. Uwzględnienie etapu opadów znacznie zwiększa rozdzielczość TMT26. Podsumowując, głównymi zaletami naszego protokołu TMT są wysoka skuteczność etykietowania dla różnych typów próbek, jego odtwarzalność i wiarygodne uzyskane dane.

Wraz z rozwojem multipleksowego charakteru tej strategii proteomicznej TMT, która będzie stopniowo zwiększać zdolność badaczy z wielu różnych dziedzin do dokonywania nowych odkryć. Szczególnie w dziedzinie biomedycyny, my i inni stwierdziliśmy, że ta technologia jest coraz bardziej pouczająca w badaniach badających nowe mechanizmy działania w chorobie i względne skutki różnych terapii. Z tych wszystkich powodów ta potężna technologia uzupełnia repertuar innych podejść OMICZNYCH stosowanych w nowoczesnych badaniach naukowych i dostarcza kluczowych informacji, które mogą ukierunkować dalszy rozwój terapii.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować ośrodkowi proteomiki UF-ICBR za przetwarzanie naszych próbek. Prace te były częściowo wspierane przez National Institutes of Health R01 HL136759-01A1 (CAP).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1 M wodorowęglan trietyloamonu (TEAB), 50 mlThermo Fisher90114Odczynnik do znakowania białek
50% hydroksyloaminy, 5 mlThermo Fisher90115Odczynnik do znakowania białek
Kwas octowySigmaA6283Odczynnik do trawienia białek
Bezwodny acetonitryl, LC-MS GradeThermo Fisher51101Odczynnik do znakowania białek
Nukleaza benzonazowaSigma-AldrichE1014Ścinanie DNA
Bond-Breaker TCEP roztwór, 5 mlThermo Fisher77720Odczynnik do znakowania białek
BSA standardThermo23209Odczynnik do pomiaru białka
CHAPSThermo Fisher28300Odczynnik do ekstrakcji białek
ChloroformFisherBP1145-1Odczynnik do wytrącania białek
cKompletny, wolny od EDTA Inhibitor proteazy w tabletcekoktajlowej Roche4693132001Odczynnik do ekstrakcji białek
Test białkowy DCBioRad500-0116Odczynnik do pomiaru białka
ExcelMicrosoft OfficeOprogramowanie do analizy danych
Blok grzewczyVWR analogowy12621-104Sprzęt do inkubacji trawienia białek
HEPESSigmaRDD002Odczynnik do ekstrakcji białek
MetanolFisher A452-4Odczynnik do wytrącania białek
Pierce Trypsin Protease, MS GradeThermo Fisher90058Odczynnik do trawienia białek
Chlorek potasuSigma46436Odczynnik do ekstrakcji białek
Sigma Plot 14.0Sigma Plot 14.0Oprogramowanie do analizy danych
SonicatorFisher ScientificFB120Ścinanie DNA
Spectra Max i3x Multi-Mode Detection PlatformUrządzenia molekularneCzytnik płytek do pomiaru białek
Thermo Scientific Pierce Ilościowy kolorymetryczny test peptydowyThermo Fisher23275Odczynnik do białka pomiar
Thermo Scientific Pierce Ilościowy test peptydów fluorescencyjnychThermo Fisher23290Odczynnik do pomiaru białek
Thermo Scientific Proteome Discoverer SoftwareThermo FisherOPTON-30945Oprogramowanie do analizy danych
TMT 10plex Isobaric Label Reagent Set 0,8 mg, odczynniki wystarczające na jeden eksperyment izobaryczny 10plexThermo Fisher90110Odczynnik do znakowanie białek
TMT11-131C Etykieta Odczynnik 5 mgThermo FisherA34807Odczynnik do znakowania białek
Woda, LC-MS GradeThermo Fisher51140Odczynnik do ekstrakcji białek

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Graves, P. R., Haystead, T. A. Molecular biologist's guide to proteomics. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 66 (1), 39-63 (2002).
  2. Erdjument-Bromage, H., Huang, F. K., Neubert, T. A. Sample Preparation for Relative Quantitation of Proteins Using Tandem Mass Tags (TMT) and Mass Spectrometry (MS). Methods in Molecular Biology. 1741, 135-149 (2018).
  3. O'Farrell, P. H. High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. Journal of Biological Chemistry. 250 (10), 4007-4021 (1975).
  4. Rabilloud, T., Lelong, C. Two-dimensional gel electrophoresis in proteomics: a tutorial. Journal of Proteomics. 74 (10), 1829-1841 (2011).
  5. Ong, S. E., et al. Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).
  6. Anderson, N. G., Anderson, N. L. Twenty years of two-dimensional electrophoresis: Past, present and future. Electrophoresis. 17 (3), 443-453 (1996).
  7. Haynes, P. A., Yates, J. R. Proteome profiling-pitfalls and progress. Yeast. 17 (2), 81-87 (2000).
  8. Bunai, K., Yamane, K. Effectiveness and limitation of two-dimensional gel electrophoresis in bacterial membrane protein proteomics and perspectives. Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 815 (1-2), 227-236 (2005).
  9. Sury, M. D., Chen, J. X., Selbach, M. The SILAC fly allows for accurate protein quantification in vivo. Molecular & Cellular Proteomics. 9 (10), 2173-2183 (2010).
  10. Zhang, G., Neubert, T. A. Use of stable isotope labeling by amino acids in cell culture (SILAC) for phosphotyrosine protein identification and quantitation. Methods in Molecular Biology. 527, 79-92 (2009).
  11. Wang, X., et al. SILAC-based quantitative MS approach for real-time recording protein-mediated cell-cell interactions. Scientific Reports. 8 (1), 8441(2018).
  12. Thompson, A., et al. Tandem Mass Tags: A Novel Quantification Strategy for Comparative Analysis of Complex Protein Mixtures by MS/MS. Analytical Chemistry. 75, 1895-1904 (2003).
  13. Cheng, L., Pisitkun, T., Knepper, M. A., Hoffert, J. D. Peptide Labeling Using Isobaric Tagging Reagents for Quantitative Phosphoproteomics. Methods in Molecular Biology. 1355, 53-70 (2016).
  14. Navarrete-Perea, J., Yu, Q., Gygi, S. P., Paulo, J. A. Streamlined Tandem Mass Tag (SL-TMT) Protocol: An Efficient Strategy for Quantitative (Phospho)proteome Profiling Using Tandem Mass Tag-Synchronous Precursor Selection-MS3. Journal of Proteome Research. 17 (6), 2226-2236 (2018).
  15. Zecha, J., et al. TMT Labeling for the Masses: A Robust and Cost-efficient, In-solution Labeling Approach. Molecular & Cellular Proteomics. 18 (7), 1468-1478 (2019).
  16. Bachor, R., Waliczek, M., Stefanowicz, P., Szewczuk, Z. Trends in the Design of New Isobaric Labeling Reagents for Quantitative Proteomics. Molecules. 24 (4), E701(2019).
  17. Suzuki-Hatano, S., et al. AAV9-TAZ Gene Replacement Ameliorates Cardiac TMT Proteomic Profiles in a Mouse Model of Barth Syndrome. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 13, 167-179 (2019).
  18. Kirshenbaum, N., Michaelevski, I., Sharon, M. Analyzing large protein complexes by structural mass spectrometry. Journal of Visualized Experiments. (40), e1954(2010).
  19. Perumal, N., et al. Sample Preparation for Mass-spectrometry-based Proteomics Analysis of Ocular Microvessels. Journal of Visualized Experiments. (144), e59140(2019).
  20. Wessel, D., Flügge, U. I. A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids. Analytical Biochemistry. 138, 141-143 (1984).
  21. Jensen, L. J., et al. STRING 8--a global view on proteins and their functional interactions in 630 organisms. Nucleic Acids Research. 37, D412-D416 (2009).
  22. Mi, H., Muruganujan, A., Casagrande, J. T., Thomas, P. D. Large-scale gene function analysis with the PANTHER classification system. Nature Protocols. 8 (8), 1551-1566 (2013).
  23. Cirillo, E., Parnell, L. D., Evelo, C. T. A Review of Pathway-Based Analysis Tools That Visualize Genetic Variants. Frontiers in Genetics. 8, 174(2017).
  24. Plaxton, W. C. Avoiding Proteolysis during the Extraction and Purification of Active Plant Enzymes. Plant and Cell Physiology. 60 (4), 715-724 (2019).
  25. Ryan, B. J., Henehan, G. T. Protein Chromatography: Methods and Protocols. Walls, D., Loughran, S. T. , Springer. New York. 53-69 (2017).
  26. Fic, E., Kedracka-Krok, S., Jankowska, U., Pirog, A., Dziedzicka-Wasylewska, M. Comparison of protein precipitation methods for various rat brain structures prior to proteomic analysis. Electrophoresis. 31 (21), 3573-3579 (2010).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

TMT LabelingProtein ExtractionMethanol Chloroform PrecipitationTrypsin DigestionPeptide LabelingData AcquisitionPANTHER AnalysisString AnalysisProtein QuantificationProteomics Techniques

Powiązane artykuły