Artykuł metodologiczny

Znakowanie balistyczne neuronów piramidowych w wycinkach mózgu i w pierwotnej hodowli komórkowej

DOI:

10.3791/60989

⸱

2 kwietnia 2020

 ,  ,  , 
1Program in Behavioral Neuroscience, Department of Psychology, University of South Carolina

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiamy protokół do oznaczania i analizowania neuronów piramidowych, który jest kluczowy dla oceny potencjalnych zmian morfologicznych w neuronach i kolcach dendrytycznych, które mogą leżeć u podstaw nieprawidłowości neurochemicznych i behawioralnych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Doniesiono, że rozmiar i kształt kolców dendrytycznych jest związany z ich plastycznością strukturalną. Aby zidentyfikować strukturę morfologiczną neuronów piramidowych i kolców dendrytycznych, można zastosować technikę znakowania balistycznego. W niniejszym protokole neurony piramidowe są znakowane barwnikiem DilC18(3) i analizowane za pomocą oprogramowania do rekonstrukcji neuronów w celu oceny morfologii neuronów i kolców dendrytycznych. Aby zbadać strukturę neuronów, przeprowadza się analizę rozgałęzień dendrytycznych i analizę Sholla, co pozwala naukowcom wyciągnąć wnioski odpowiednio na temat złożoności rozgałęzień dendrytycznych i złożoności trzpieni neuronalnych. Ocena kolców dendrytycznych jest przeprowadzana przy użyciu algorytmu automatycznej klasyfikacji wspomaganej integralnie z oprogramowaniem do rekonstrukcji, który klasyfikuje kolce do czterech kategorii (tj. cienkie, grzybowe, przysadziste, filopodia). Ponadto wybiera się dodatkowe trzy parametry (tj. długość, średnicę głowy i objętość) do oceny zmian w morfologii kolców dendrytycznych. Aby potwierdzić potencjał szerokiego zastosowania techniki znakowania balistycznego, z powodzeniem znakowano neurony piramidowe z hodowli komórkowych in vitro. Ogólnie rzecz biorąc, metoda etykietowania balistycznego jest wyjątkowa i przydatna do wizualizacji neuronów w różnych regionach mózgu u szczurów, co w połączeniu z zaawansowanym oprogramowaniem rekonstrukcyjnym pozwala naukowcom wyjaśnić możliwe mechanizmy leżące u podstaw dysfunkcji neurokognitywnej.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W 2000 roku Gan et al. opisali technikę szybkiego znakowania pojedynczych neuronów i komórek glejowych w układzie nerwowym, która łączyła różne barwniki lipofilowe, pozwalając na jednoczesne znakowanie wielu komórek mózgowych o różnych kolorach1,2. Niedawno technika znakowania balistycznego została opisana przez Seabold et al.3, która wprowadziła barwniki fluorescencyjne (Dil) do neuronów w wycinkach mózgu. Etykietowanie balistyczne to wszechstronna technika barwienia, ceniona ze względu na jej zdolność do stosowania u wielu gatunków zwierząt i w różnym wieku. Co więcej, można go połączyć z barwieniem immunologicznym w celu identyfikacji subpopulacji komórek mózgowych3. W porównaniu z tradycyjnymi technikami (np. impregnacja srebrem Golgiego-Coxa, mikroiniekcja)4, znakowanie balistyczne daje możliwość wyraźniejszego rozróżnienia cech morfologicznych, w tym kolców dendrytycznych, cechy, która ma kluczowe znaczenie dla wyciągania wniosków na temat złożoności neuronów i połączeń synaptycznych5.

Pobudzające neurony piramidowe charakteryzują się pojedynczym, dużym dendrytem wierzchołkowym, wieloma krótszymi dendrytami podstawowymi i tysiącami kolców dendrytycznych6. Neurony piramidowe znajdują się w wielu obszarach mózgu związanych z przetwarzaniem poznawczym wyższego rzędu, w tym w korze przedczołowej (PFC) i hipokampie. W PFC neurony piramidowe obserwuje się w warstwach II/III i warstwie V, z których każda wykazuje unikalną morfologię. W szczególności neurony piramidowe w warstwie II/III PFC mają krótszy dendryt wierzchołkowy i mniej rozgałęzione niż neurony piramidowe w warstwie V6. W hipokampie neurony piramidowe znajdują się zarówno w regionach CA1, jak i CA3, przy czym każdy z nich wykazuje odrębną morfologię. W szczególności neurony piramidowe w regionie CA1 wykazują bardziej charakterystyczny dendryt wierzchołkowy, z rozgałęzieniami występującymi dalej od somy, w stosunku do regionu CA36.

Kolce dendrytyczne na neuronach piramidowych zarówno w PFC, jak i hipokampie są głównym miejscem synaps pobudzających7. Cechy morfologiczne kolców dendrytycznych, które są klasycznie scharakteryzowane w trzech podstawowych kategoriach (tj. cienkie, przysadziste lub grzybowe8), zostały powiązane z wielkością synapsy pobudzającej9. Cienkie kolce, charakteryzujące się długą, cienką szyją, małą bulwiastą głową i mniejszymi gęstościami postsynaptycznymi, są bardziej niestabilne i rozwijają słabsze połączenia. Jednak kolce grzybów, które mają większą dendrytyczną głowę kręgosłupa, są znane z tworzenia silniejszych połączeń synaptycznych, co wynika z ich większych rozmiarów. W ostrym kontraście, przysadziste kolce są pozbawione szyi kręgosłupa, wykazując w przybliżeniu równy stosunek objętości głowy i szyi8. W obrębie hipokampa można również zaobserwować rozgałęzione kolce, przy czym kręgosłup ma wiele głów, które wyłaniają się z tej samej dendrytycznej szyi kręgosłupa10. W związku z tym zmiany morfologiczne kolców dendrytycznych mogą odzwierciedlać funkcjonalność i zdolność strukturalną. Co więcej, badania wykazały, że rozmiar i kształt kolców dendrytycznych odnosi się do ich plastyczności strukturalnej, co prowadzi do wniosku, że małe kolce są zaangażowane w uczenie się i uwagę, podczas gdy większe, bardziej stabilne kolce są zaangażowane w procesy długotrwałe, w tym memory11. Dodatkowo, rozmieszczenie kolców dendrytycznych wzdłuż dendrytu może być związane z łącznością synaptyczną5,12.

Tak więc, niniejszy artykuł metodologiczny ma trzy cele: 1) Przedstawić nasz protokół znakowania balistycznego, który został wykorzystany ze wskaźnikiem sukcesu (tj. neurony spełniające kryteria selekcji i odpowiednie do analizy) wynoszący 83,3%5,12,13 i w wielu regionach mózgu (tj. PFC, jądro półleżące, hipokamp); 2) Zademonstrować możliwość uogólnienia techniki i jej zastosowanie do neuronów hodowanych in vitro; 3) Szczegółowo opisz metodologię zastosowaną w oprogramowaniu do rekonstrukcji neuronów i wnioski, które można wyciągnąć z takich danych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie protokoły dotyczące zwierząt zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania na Uniwersytecie Południowej Karoliny (numer federalny: D16-00028).

1. Przygotowanie rurki DiI/Tungsten

  1. Rozpuścić 100 mg poliwinylopirolidonu (PVP) w 10 ml ddH2O. Lekko wymieszać roztwór PVP.
  2. Napełnij rurkę roztworem PVP (patrz Tabela materiałów) i pozostaw ją na 20 minut. Następnie wylej roztwór PVP przez drugi koniec rurki za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml.
  3. Połącz 170 mg kulek wolframowych z 250 μl chlorku metylenu. Dokładnie wymieszaj zawiesinę koralików wolframowych.
  4. Połącz 6 mg lipofilowego barwnika DilC18(3) z 300 μl chlorku metylenu. Dokładnie wymieszać roztwór barwnika DilC18(3).
    UWAGA: Wykonaj kroki 1.3–1.4 w dygestorium.
  5. Odpipetować 250 μl zawiesiny kulki wolframowej na szkiełko podstawowe. Poczekaj, aż zawiesina wyschnie na powietrzu (~3 min).
  6. Dodać 300 μl roztworu barwnika DilC18(3) na wierzch warstwy zawiesiny kulek wolframu. Dokładnie wymieszaj roztwór barwnika DiIC18(3) i zawiesinę kulek wolframu za pomocą końcówki pipety i pozostaw mieszaninę do wyschnięcia na powietrzu (~3 min).
  7. Po wysuszeniu użyj żyletki, aby podzielić mieszaninę na dwie probówki wirówkowe o pojemności 1,5 ml. Napełnij rurki wodą.
  8. Sonikować w łaźni wodnej (Amp I, 100%) aż do uzyskania jednorodności (~5 min). Upewnij się, że końcówka sonikatora leży bezpośrednio na rurkach z zawiesiną kulki.
  9. Połączyć dwie 1,5 ml homogenizowanej mieszaniny w stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Sonikuj mieszaninę przez kolejne 3 minuty.
  10. Za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml narysuj mieszaninę barwników koralików wolframowych i DilC18(3) do rurki pokrytej PVP. Włóż rurkę do stacji przygotowawczej (patrz Tabela materiałów).
  11. Obracaj przez 1 minutę na stacji przygotowawczej. Ostrożnie usuń całą wodę z rurki za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml.
  12. Włącz gazowy azot i dostosuj przepływ azotu do około 0,5 litra na minutę (LPM), obróć rurkę w stacji przygotowawczej i susz azotem przez 30 minut.
  13. Wyjmij rurkę ze stacji przygotowawczej i pokrój na odcinki 13 mm (odpowiadające rozmiarowi załadunku wkładu) za pomocą obcinaka do rurek. Przechowywać 13 mm długości w fiolkach scyntylacyjnych w ciemności.

2. Przygotowanie sekcji mózgu

UWAGA: Dorosłe samce szczurów F344/N były trzymane w parach w kontrolowanym środowisku w cyklu 12/12 światło:ciemność z dostępem ad libitum do jedzenia i wody. Wszystkie zwierzęta były pod opieką zgodnie z wytycznymi ustalonymi przez National Institutes of Health w Przewodniku po opiece i użytkowaniu zwierząt laboratoryjnych.

  1. Głęboko znieczulij szczury za pomocą 5% sewofluranu.
  2. Przejdź do następnego kroku, gdy szczury nie reagują na szkodliwe bodźce i nie ma odruchów.
  3. Zabezpiecz szczura w pozycji leżącej na plecach w okapie oparów chemicznych.
  4. Wykonaj nacięcie przez skórę wzdłuż linii środkowej klatki piersiowej. Oddziel membranę i otwórz klatkę piersiową nożyczkami. Wprowadzić igłę o masie 20 g × 25 mm do lewej komory.
  5. Natychmiast wytnij prawy przedsionek nożyczkami. Uzyskujemy 50 ml 100 mM PBS z natężeniem przepływu 5 ml/min. Perfuzja 100 ml 4% paraformaldehydu buforowanego w 100 mM PBS.
  6. Usuń cały mózg szczura zaraz po perfuzji.
  7. Utrwalaj cały mózg przez 10 minut 4% paraformaldehydem.
    UWAGA: Nie należy dodawać 4% paraformaldehydu na dłużej niż 30 minut, ponieważ wpłynie to na etykietowanie.
  8. Wytnij odcinki koronalne o grubości 500 μm za pomocą matrycy mózgu szczura (patrz tabela materiałów). Wykonaj pierwsze cięcie i trzymaj ostrze na miejscu. Wykonaj drugie cięcie za pomocą drugiego ostrza i pionowo wyjmij pierwsze ostrze, trzymając tkankę na powierzchni ostrza.
  9. Umieść plastry mózgu na 24-dołkowej płytce z 1 ml 100 mM PBS w każdym dołku. Powtarzaj ten proces, aż wszystkie plastry zostaną pokrojone.

3. Znakowanie balistyczne i wizualizacja sekcji mózgu

  1. Usuń PBS z każdej docelowej studzienki.
  2. Załaduj wkład kawałkiem rurki DiI/Tungsten Bead i umieść go w aplikatorze.
  3. Umieść kawałek bibuły filtracyjnej między dwoma sitami siatkowymi. Podłącz aplikator do węża helowego. Dostosuj ciśnienie wyjściowe helu do 90 funtów na cal kwadratowy (psi).
  4. Umieść aplikator pionowo ręcznie na środku docelowej studzienki w odległości 1,5 cm między próbką a sitkiem siatkowym. Odpal rurkę z koralikami DiI/wolframu.
    UWAGA: Pamiętaj, aby usunąć wszystkie PBS z docelowych studzienek przed oddaniem strzału.
  5. Załaduj wkład z następną rurką DiI/Tungsten Bead. Kontynuuj wystrzeliwanie koralików DiI/wolframu z rurki na pozostałe plastry.
  6. Napełnij płytkę 24-dołkową 100 mM PBS. Umyć 500 μL świeżego 100 mM PBS 3x. Nie pozwól, aby plastry przewróciły się podczas mycia PBS.
  7. Dodać 500 μl świeżych 100 mM PBS i przechowywać plastry w temperaturze 4 °C w ciemności przez 3 godziny.
  8. Przenieś plastry mózgu na szkiełka za pomocą cienkiego pędzla.
    UWAGA: Na każde szkiełko można przenieść trzy sekcje mózgu.
  9. Natychmiast dodaj 1 ml środka montażowego zapobiegającego blaknięciu na każdą sekcję. Umieść szkiełko nakrywkowe o wymiarach 22 mm x 50 mm na sekcjach mózgu. Suszyć szkiełka w ciemności przez 2 dni.
  10. Włącz system mikroskopu konfokalnego i przełącz się na obiektyw 60×.
  11. Ustaw system mikroskopu konfokalnego tak, aby miał powiększenie 60× (A/1,4, olej) i odstęp w płaszczyźnie Z 0,15 μm (rozmiar otworka 30 μm, promień otworka rzutowanego wstecz 167 nm). Użyj długości fali 543 nm, aby uzyskać obrazy interesujących neuronów.
  12. Uzyskaj obrazy stosu Z dla docelowego typu neuronu w oparciu o granice regionów mózgu i cechy morfologiczne neuronów.
    UWAGA: Zdobądź co najmniej trzy obrazy z każdego zwierzęcia.

4. Wykorzystanie metodologii z hodowlą komórkową

  1. Wyizoluj pierwotne neurony korowe od szczurów F344/N w pierwszym dniu po urodzeniu, korzystając z wcześniej opisanej metodologii14.
  2. Hodowla pierwotnych neuronów korowych w naczyniu o szklanym dnie o średnicy 35 mm przez tydzień. Zamień połowę pożywki hodowlanej na świeżą pożywkę do wzrostu neuronów trzeciego dnia po izolacji. Umyj naczynie ze szklanym dnem 2x 1 ml 100 mM PBS.
  3. Utrwalić 4% paraformaldehydem przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Powtórz kroki 3.2–3.6, aby balistycznie oznaczyć komórki.
  4. Przemyć 1 ml 100 mM PBS 3x. Dodać 500 μl świeżego 100 mM PBS i przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemności przez 3 godziny.
  5. Dodać 200 μl podłoża mocującego zapobiegającego blaknięciu.
  6. Uzyskaj obrazy stosu Z dla każdego docelowego neuronu, korzystając z parametrów w kroku 3.10.

5. Analiza neuronalna i kwantyfikacja kolców dendrytycznych

  1. Ślepe neurony za pomocą numerów kodowych, aby zapobiec stronniczości eksperymentatora.
  2. Ustal kryteria wyboru neuronów na podstawie obszaru mózgu będącego przedmiotem zainteresowania.
    UWAGA: Kryteria wyboru neuronów obejmują ciągłe barwienie dendrytyczne, niskie tło, brak skupisk barwnika wewnątrz komórek, minimalną dyfuzję barwnika DiI do przestrzeni zewnątrzkomórkowej, prawidłową morfologię neuronów piramidowych (Ryc. 1).
  3. Otwórz oprogramowanie do rekonstrukcji neuronów (patrz załączony film 1).
  4. Załaduj plik obrazu, klikając obraz "Folder plików" w lewym górnym rogu.
  5. Kliknij "Soma" i zaznacz somę neuronów na obrazie.
  6. Kliknij "Drzewo" i wybierz "Obsługiwane przez użytkownika".
  7. Prześledź wszystkie interesujące nas gałęzie dendrytyczne.
    UWAGA: W przypadku neuronów piramidowych, które charakteryzują się jednym dendrytem wierzchołkowym i wieloma dendrytami podstawnymi, śledzony jest tylko dendryt wierzchołkowy. Upewnij się, że wszystkie łączące gałęzie są ze sobą połączone.
  8. Kliknij "Grzbiet".
  9. Zdefiniuj parametry wykrywania i kliknij "Wykryj wszystko".
    UWAGA: W przypadku wycinków mózgu spójne parametry stosowane w różnych regionach mózgu to: 2.0 (zakres zewnętrzny), 0.3 (minimalna wysokość), 100% (czułość detektora) i 10 (minimalna liczba). W przypadku hodowli komórkowej konieczne jest zwiększenie czułości detektora i zmniejszenie minimalnej liczby.
  10. Klasyfikuj kolce, wybierając opcję "Klasyfikuj wszystko".
    UWAGA: Kolce dendrytyczne są klasyfikowane za pomocą algorytmu integralnego z oprogramowaniem do rekonstrukcji neuronów15.
  11. Zapisz śledzenie, wybierając obraz dysku w lewym górnym rogu.
  12. Wykonywanie analiz morfologicznych neuronalnych i dendrytycznych kręgosłupów.
    1. Oprogramowanie do analizy ilościowej otwartej rekonstrukcji neuronów (patrz załączony film 2).
    2. Załaduj obraz, klikając "Plik" i "Otwórz plik danych".
    3. Kliknij "Analiza" i "Analiza struktury rozgałęzionej", aby przeanalizować morfologię neuronów i morfologię kolców dendrytycznych.
    4. W przypadku morfologii neuronów kliknij "Sumy drzew" i zaznacz pole "Sumy dendrytów".
    5. W przypadku morfologii kolców dendrytycznych kliknij "Kolce", a następnie zaznacz pole "Szczegóły kręgosłupa".
    6. Zapisz dane wyjściowe jako plik tekstowy (.txt), klikając prawym przyciskiem myszy tabelę wyjściową i wybierając opcję "Zapisz do pliku".
    7. Kliknij "Analizuj" i "Analiza Sholl".
    8. Ustaw promień początkowy na 10 μm, a przyrost promienia na 10 μm.
    9. Kliknij pole "Dendryty" i kliknij "Wyświetl".
    10. Zapisz dane wyjściowe jako plik tekstowy (.txt), klikając prawym przyciskiem myszy tabelę wyjściową i wybierając opcję "Zapisz do pliku".

6. Analiza danych

  1. Przeanalizuj dane dotyczące morfologii neuronów (tj. złożoności rozgałęzień dendrytycznych).
    1. Dodaj liczbę dendrytów w każdej kolejności gałęzi i podziel przez całkowitą liczbę dendrytów. Pomnóż przez 100, aby obliczyć względne częstości dla liczby dendrytów w każdym rzędzie gałęzi.
  2. Przeanalizuj dane z analizy Sholla, aby zbadać złożoność neuronalnej altany i dendrytyczne połączenia kręgosłupa.
    1. Oblicz średnią i błąd standardowy średniej dla liczby skrzyżowań w każdym promieniu.
    2. Zsumuj liczbę kolców zależnych od typu kręgosłupa (np. cienki, przysadzisty, grzybowy) w każdym promieniu i podziel przez całkowitą liczbę kolców dla tego typu kręgosłupa. Pomnóż przez 100, aby obliczyć względne częstotliwości dla liczby kolców w każdym promieniu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W Rysunek 2A, typowe neurony piramidalne w okolicy hipokampa w sekcjach mózgu szczura zostały zidentyfikowane za pomocą technologii znakowania balistycznego, charakteryzującej się jednym dużym dendrytem wierzchołkowym i kilkoma mniejszymi dendrytami podstawnymi wokół somy. Rysunek 2B pokazuje neuron w oprogramowaniu do analizy ilościowej rekonstrukcji neuronów po wykryciu somy, prześledzeniu gałęzi dendrytycznych i wykryciu kolców. Następnie dane zostały przeanalizowane...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym protokole opisujemy wszechstronną technikę znakowania neuronów zarówno z mózgu szczura, jak i tych wyhodowanych in vitro. Ponadto przedstawiamy metodologię wykorzystania oprogramowania do rekonstrukcji neuronów i oprogramowania do analizy ilościowej rekonstrukcji neuronów do oceny morfologii neuronów i kolców dendrytycznych. Ocena morfologii neuronów i kolców dendrytycznych daje możliwość określenia zmian w złożoności rozgałęzień dendrytycznych, złożoności trzpieni neuronalnych, morfologii kolców dendrytycznych i ł...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Żaden z autorów nie ma do zadeklarowania konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została sfinansowana z grantów NIH HD043680, MH106392, DA013137 i NS100624.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Igła PrecisionGlide 20Gx25mmBD305175
24-dołkowa płytka do hodowli komórkowychCostar3562
35 mm Naczynia ze szklanym dnemMatTek CorporationP35G-1.5-20-C
Roztwór antybiotykowo-przeciwgrzybiczyCellgro30004CI100X
B-27 suplementLife Technologies17504-04450X
Wkładka lufyBIO-RAD165-2417
BoraksSigmaB9876
Kwas borowySigmaB0252
Uchwyt na kartuszBIO-RAD165-2426
Oprogramowanie do obrazowania konfokalnegoNikonEZ-C1wersja 3.81b
Mikroskop konfokalnyNikonTE-2000E
Okładka szkłoVWR637-137
DilC18(3)Fisher ScientificD282
DMEM/F12 mediumLife Technologies10565-018
Dumont #5 KleszczeWorld Precision Instruments14095
Dumont #7 KleszczeWorld Precision Instruments14097
F344 szczur(Harlan Laboratories, Indianapolis, IN)
GlukozaVWR101174Y
GlutaMaxLife Technologies35050-061100X
HBSSSigmaH464110X
Ekrany dyfuzyjne HeliosBIO-RAD165-2475
Zestaw pistoletu genowego HeliosBIO-RAD165-2411
System pistoletów genowych HeliosBIO-RAD165-2431
Zespół węża helowegoBIO-RAD165-2412
Kleszcze do przysłonyWorld Precision Instruments15914
Nożyczki do tęczówkiWorld Instrumenty precyzyjne500216
Chlorek metylenuFisher ScientificD150-1
Podłoże neuropodstawoweLife Technologies21103-049
Oprogramowanie Neurolucida 360mbf biosciencedendrytyczna analiza kręgosłupa
ParaformaldehydSigma-Aldrich158127-500G
ParaformaldehydSigmaP6148
Poli-L-LizynaSigmaP9155
PoliwinylopirolidonFisher Scientific5295
ProLong Gold odczynnik zapobiegający blaknięciuFisher ScientificP36930medium montażowe
Matryca mózgu szczura, 300 - 600g, Koronalna, 0.5mmTed Pella15047
SevofluraneMerritt Veterinary Supply347075
Wodorowęglan soduLife Technologies25080
Prowadnice SuperFrost PlusFisher Scientific12-550-154%
ZestawstrzykawekBIO-RAD165-2421
Rurka tefzelowaBIO-RAD165-2441
Trypsin-EDTALife Technologies15400-054
Obcinak do rurekBIO-RAD165-2422
Stacja przygotowania przewodówBIO-RAD165-2418
Wolfram M-25 Microcarrier 1,7 i mikro; mBIO-RAD165-2269
Vannas NożyczkiŚwiatowe instrumenty precyzyjne500086

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, W. T., Wong, R. O., Lichtman, J. W. Multicolor "DiOlistic" labeling of the nervous system using lipophilic dye combinations. Neuron. 27, 219-225 (2000).
  2. Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, R. O., Lichtman, J. W. Ballistic delivery of dyes for structural and functional studies of the nervous system. Cold Spring Harbor Protocol. 2009 (4), 5202(2009).
  3. Seabold, G. K., Daunais, J. B., Rau, A., Grant, K. A., Alvarez, V. A. DiOLISTIC labeling of neurons from rodent and non-human primate brain slices. Journal of Visualized Experiments. (41), (2010).
  4. Spacek, J. Dynamics of the Golgi method: a time-lapse study of the early stages of impregnation in single sections. Journal of Neurocytology. 18 (1), 27-38 (1989).
  5. McLaurin, K. A., Li, H., Booze, R. M., Mactutus, C. F. Disruption of Timing: NeuroHIV Progression in the Post-cART Era. Science Reports. 9 (1), 827(2019).
  6. Spruston, N. Pyramidal neurons: dendritic structure and synaptic integration. Nature Reviews Neurosciences. 9 (3), 206-221 (2008).
  7. Megias, M., Emri, Z., Freund, T. F., Gulyas, A. I. Total number and distribution of inhibitory and excitatory synapses on hippocampal CA1 pyramidal cells. Neuroscience. 102, 527-540 (2001).
  8. Peters, A., Kaiserman-Abramof, I. R. The small pyramidal neuron of the rat cerebral cortex. The perikaryon, dendrites and spines. American Journal of Anatomy. 127, 321-355 (1970).
  9. Harris, K. M., Sultan, P. Variation in the number, location, and size of synaptic vesicles provides an anatomical basis for the nonuniform probability of release at hippocampal CA1 synapses. Neuropharmacology. 34, 1387-1395 (1995).
  10. Sorra, K. E., Fiala, J. C., Harris, K. M. Critical assessment of the involvement of perforations, spinules, and spine branching in hippocampal synapse formation. Journal of Comparative Neurology. 398, 225-240 (1998).
  11. Mancuso, J. J., Chen, Y., Li, X., Xue, Z., Wong, S. T. C. Methods of dendritic spine detection: from Golgi to high-resolution optical imaging. Neuroscience. 251, 129-140 (2012).
  12. McLaurin, K. A., et al. Synaptic connectivity in medium spiny neurons of the nucleus accumbens: A sex-dependent mechanism underlying apathy in the HIV-1 transgenic rat. Frontiers in Behavior Neurosciences. 12, 285(2018).
  13. Roscoe, R. F. Jr, Mactutus, C. F., Booze, R. M. HIV-1 transgenic female rat: synaptodendritic alterations of medium spiny neurons in the nucleus accumbens. Journal of Neuroimmune Pharmacology. 9 (5), 642-653 (2014).
  14. Li, H., Aksenova, M., Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Booze, R. Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons. Journal of Visualized Experiments. (108), e53697(2016).
  15. Rodriguez, A., Ehlenberger, D. B., Dickstein, D. L., Hof, P. R., Wearne, S. L. Automated Three-Dimensional Detection and Shape Classification of Dendritic Spines from Fluorescence Microscopy Images. PLoS ONE. 3 (10), 1371(2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Kolce dendrytycznerekonstrukcja neuron wanaliza Shollamikroskopia konfokalnabarwnik DilC18 3wolframowe kulki mikrono ne

Powiązane artykuły