Artykuł metodologiczny

Standaryzowana ocena histomorfometryczna choroby zwyrodnieniowej stawów w chirurgicznym modelu myszy

DOI:

10.3791/60991

⸱

6 maja 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Orthopedic Research and Translational Sciences, Department of Orthopedics and Rehabilitation, Pennsylvania State College of Medicine, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, Pennsylvania State College of Medicine, 3Department of Pharmacology, Pennsylvania State College of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecny protokół ustanawia rygorystyczną i powtarzalną metodę ilościowego oznaczania zmian morfologicznych stawów, które towarzyszą chorobie zwyrodnieniowej stawów. Zastosowanie tego protokołu może być cenne w monitorowaniu postępu choroby i ocenie interwencji terapeutycznych w chorobie zwyrodnieniowej stawów.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jedno z najbardziej rozpowszechnionych zaburzeń stawów w Stanach Zjednoczonych, choroba zwyrodnieniowa stawów (OA) charakteryzuje się postępującym zwyrodnieniem chrząstki stawowej, głównie w stawach biodrowych i kolanowych, co ma znaczący wpływ na mobilność pacjenta i jakość życia. Do tej pory nie ma istniejących terapii leczniczych choroby zwyrodnieniowej stawów, które mogłyby spowolnić lub zahamować degenerację chrząstki. Obecnie prowadzone są obszerne badania mające na celu zrozumienie patologii choroby zwyrodnieniowej stawów i odkrycie nowych podejść terapeutycznych lub środków, które mogą skutecznie spowolnić, zatrzymać, a nawet odwrócić chorobę zwyrodnieniową stawów. Dlatego tak ważne jest ilościowe i powtarzalne podejście, aby dokładnie ocenić zmiany patologiczne związane z chorobą zwyrodnieniową stawów w chrząstce stawowej, błonie maziowej i kości podchrzęstnej. Obecnie nasilenie i progresja choroby zwyrodnieniowej stawów są oceniane przede wszystkim za pomocą systemów punktacji Międzynarodowego Towarzystwa Badań nad Chorobą Zwyrodnieniową Stawów (OARSI) lub Mankin. Pomimo znaczenia tych systemów punktacji, są one półilościowe i może na nie wpływać subiektywność użytkownika. Co ważniejsze, nie są w stanie dokładnie ocenić subtelnych, ale ważnych zmian w chrząstce we wczesnych stanach chorobowych lub we wczesnych fazach leczenia. Protokół, który tutaj opisujemy, wykorzystuje skomputeryzowany i półautomatyczny system oprogramowania histomorfometrycznego w celu ustanowienia ustandaryzowanej, rygorystycznej i powtarzalnej metodologii ilościowej oceny wspólnych zmian w chorobie zwyrodnieniowej stawów. Protokół ten stanowi potężne uzupełnienie istniejących systemów i pozwala na skuteczniejsze wykrywanie zmian patologicznych w stawie.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jedno z najbardziej rozpowszechnionych zaburzeń stawów w Stanach Zjednoczonych, choroba zwyrodnieniowa stawów charakteryzuje się postępującym zwyrodnieniem chrząstki stawowej, głównie w stawach biodrowych i kolanowych, co ma znaczący wpływ na mobilność pacjenta i jakość życia1,2,3. Chrząstka stawowa to wyspecjalizowana tkanka łączna stawów biegunkowych, zaprojektowana w celu zminimalizowania tarcia, ułatwienia ruchu i wytrzymania ucisku stawu4. Chrząstka stawowa składa się z dwóch podstawowych elementów: chondrocytów i macierzy zewnątrzkomórkowej. Chondrocyty są wyspecjalizowanymi, metabolicznie aktywnymi komórkami, które odgrywają podstawową rolę w rozwoju, utrzymaniu i naprawie macierzy zewnątrzkomórkowej4. Przerost chondrocytów (CH) jest jednym z głównych patologicznych objawów rozwoju choroby zwyrodnieniowej stawów. Charakteryzuje się zwiększonym rozmiarem komórki, zmniejszoną produkcją proteoglikanów i zwiększoną produkcją enzymów rozkładających macierz chrząstki, które ostatecznie prowadzą do zwyrodnienia chrząstki5,6,7. Ponadto zmiany patologiczne w kości podchrzęstnej i błonie maziowej stawu odgrywają ważną rolę w rozwoju i progresji choroby zwyrodnieniowej stawów8,9,10,11,12. Do tej pory nie istnieją żadne terapie lecznicze, które hamowałyby zwyrodnienie chrząstki1,2,3,13,14. W związku z tym prowadzone są szeroko zakrojone badania, które mają na celu zrozumienie patologii choroby zwyrodnieniowej stawów i odkrycie nowych podejść terapeutycznych, które są w stanie spowolnić lub nawet zatrzymać chorobę zwyrodnieniową stawów. W związku z tym istnieje coraz większe zapotrzebowanie na ilościowe i powtarzalne podejście, które umożliwia dokładną ocenę związanych z chorobą zwyrodnieniową stawów zmian patologicznych w chrząstce, błonie maziowej i kości podchrzęstnej stawu.

Obecnie, stopień choroby zwyrodnieniowej stawów i postęp choroby zwyrodnieniowej stawów są głównie oceniane za pomocą systemów punktacji OARSI lub Mankin15. Jednak te systemy punktacji są tylko półilościowe i może na nie wpływać subiektywność użytkownika. Co ważniejsze, nie są w stanie dokładnie ocenić subtelnych zmian, które zachodzą w stawie podczas choroby lub w odpowiedzi na manipulację genetyczną lub interwencję terapeutyczną. W literaturze można znaleźć sporadyczne doniesienia opisujące analizy histomorfometryczne chrząstki, błony maziowej lub kości podchrzęstnej16,17,18,19,20,21. Jednak nadal brakuje szczegółowego protokołu rygorystycznej i powtarzalnej analizy histomorfometrycznej wszystkich tych wspólnych elementów, co stwarza niezaspokojoną potrzebę w tej dziedzinie.

Aby zbadać patologiczne zmiany w chorobie zwyrodnieniowej stawów za pomocą analizy histomorfometrycznej, użyliśmy mysiego modelu chirurgicznej choroby zwyrodnieniowej stawów do wywołania choroby zwyrodnieniowej stawów poprzez destabilizację łąkotki przyśrodkowej (DMM). Spośród uznanych modeli mysiej choroby zwyrodnieniowej stawów, DMM został wybrany do naszego badania, ponieważ obejmuje mniej traumatyczny mechanizm urazu22,23,24,25,26. W porównaniu z operacjami uszkodzenia łąkotki i więzadła (MLI) lub urazu więzadła krzyżowego przedniego (ACLI), DMM sprzyja bardziej stopniowemu postępowi choroby zwyrodnieniowej stawów, podobnie jak rozwój choroby zwyrodnieniowej stawów u ludzi22,24,25,26. Myszy zostały poddane eutanazji dwanaście tygodni po operacji DMM w celu oceny zmian w chrząstce stawowej, kości podchrzęstnej i błonie maziowej.

Celem tego protokołu jest ustanowienie ustandaryzowanego, rygorystycznego i ilościowego podejścia do oceny wspólnych zmian, które towarzyszą OA.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dwunastotygodniowy samiec myszy C57BL/6 został zakupiony od Jax Labs. Wszystkie myszy trzymano w grupach po 3–5 myszy na klatkę z mikroizolatorem w pomieszczeniu z harmonogramem 12 godzin światła/ciemności. Wszystkie procedury na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z Przewodnikiem Narodowego Instytutu Zdrowia (NIH) dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych i zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Stanowego Pensylwanii.

1. Model chirurgiczny pourazowej choroby zwyrodnieniowej stawów (PTOA)

  1. Znieczulenie myszy za pomocą kombinacji ketaminy (100 mg/kg) i ksylazyny (10 mg/kg) we wstrzyknięciu dootrzewnowym, podanie buprenorfiny (1 mg/kg) we wstrzyknięciu dootrzewnowym w celu złagodzenia bólu i ogolenie włosów nad kolanem. Sprawdź, czy nie ma odruchu pedałowania przed rozpoczęciem operacji.
  2. Wykonaj operację destabilizacji łąkotki przyśrodkowej (DMM) zgodnie z wcześniejszym opisem22,23.
    UWAGA: Proszę zapoznać się z odniesieniami Glasson et al. i Singh et al., aby uzyskać bardziej szczegółowe informacje na temat protokołu chirurgicznego22,23.
    1. Wykonaj 3 mm podłużne nacięcie od dystalnej rzepki do bliższego płaskowyżu piszczelowego prawego stawu kolanowego. Użyj szwu, aby przemieścić ścięgno rzepki.
    2. Otwórz torebkę stawową przyśrodkowo do ścięgna i przesuń podrzepkową poduszkę tłuszczową, aby uwidocznić obszar międzykłykciowy, łąkotkę przyśrodkową i więzadło łąkotkowo-piszczelowe23.
    3. Przeciąć więzadło łąkotkowo-piszczelowe przyśrodkowe, aby ukończyć DMM i zdestabilizować staw22,23. Zamknij miejsce nacięcia zszywkami lub szwami.
  3. Wykonaj pozorowane operacje po podobnej procedurze, ale bez przecięcia więzadła łąkotkowo-piszczelowego przyśrodkowego.
    UWAGA: Myszy zostały losowo przydzielone do grupy otrzymującej DMM lub pozorowaną operację. Zgodnie z wcześniej opublikowaną literaturą, u myszy rozwija się znaczne PTOA 12 tygodni po operacji DMM22,23,24.

2. Eutanazja myszy i pobieranie próbek

  1. Eutanazja myszy
    1. Dwanaście tygodni po DMM znieczulij myszy za pomocą kombinacji ketaminy (100 mg / kg) / ksylazyny (10 mg / kg) poprzez wstrzyknięcie dootrzewnowe.
    2. Wykonaj nacięcie w linii środkowej przez skórę wzdłuż klatki piersiowej i cofnij klatkę piersiową, aby odsłonić serce do fiksacji perfuzji27.
      UWAGA: Zapoznaj się z odnośnikiem Gage et al., aby uzyskać dodatkowe informacje na temat protokołu prawidłowego mocowania gryzoni, a także wideo przedstawiające prawidłowy montaż sprzętu i procedury27.
    3. Ustaw aparat perfuzyjny zgodnie z protokołem producenta.
    4. Poddaj mysz eutanazji poprzez perfuzję heparynizowanej soli fizjologicznej przez lewą komorę, aż krew zostanie usunięta, a wątroba stanie się blada. Spulchnij mysz 10% neutralną, buforowaną formaliną, aż do osiągnięcia całkowitej fiksacji myszy.
      UWAGA: Mysz, która pomyślnie przeszła próbę, stanie się sztywna. Średni czas perfuzji przy użyciu automatycznego systemu pomp wynosi 5–7 minut.
  2. Pobieranie i przygotowanie próbek
    1. Odizoluj kolana, przecinając kość w połowie kości udowej i środkowej kości piszczelowej i wypreparuj otaczającą tkankę mięśniową.
    2. Kontynuuj utrwalanie, przechowując stawy kolanowe w 10% neutralnej buforowanej formalinie w temperaturze pokojowej przez 24 godziny, a następnie w temperaturze 4 °C przez 6 dni.
    3. Odwapnić kość, przechowując próbkę w buforze odwapniającym EDTA przez 1 tydzień w temperaturze pokojowej z łagodnym wstrząsaniem28. Zmieniaj roztwór buforowy odwapniający co 3 dni.
      UWAGA: Bufor odwapniający przygotowano przez rozpuszczenie 140 g ultraczystego tetrasodu EDTA w roztworze 850 ml wody destylowanej plus 15 ml lodowatego kwasu octowego. Wartość buforu wyrównano do 7,6 przez kroplowe dodawanie do roztworu lodowatego kwasu octowego. Po osiągnięciu pH = 7,6 bufor doprowadzono do 1 l całkowitej objętości wodą destylowaną. Bufor odwapniający przygotowywano na świeżo i zużywano w ciągu 1 tygodnia od przygotowania.
    4. Umyj kolana 50% etanolem, następnie 70% etanolem przez 15 minut każde, a następnie przetwórz do zatopienia.
      UWAGA: Przetwarzanie transferu płynów zostało przeprowadzone przez Molekularny i Histopatologiczny Rdzeń w Penn State Milton S. Hershey Medical Center. Skonsultuj się z centrum histologii instytucji, aby uzyskać zalecenia dotyczące optymalnego przetwarzania próbek.
    5. Osadź kolana myszy w parafinie tak, aby przyśrodkowa część stawu była skierowana w stronę dolnej powierzchni bloku parafinowego. Podczas osadzania należy lekko docisnąć piszczelową stronę stawu, aby upewnić się, że powierzchnia piszczelowa i udowa znajdują się jak najbliżej tej samej płaszczyzny.

3. Sekcja mikrotomów i wybór szkiełek

  1. Cięcie mikrotomowe
    1. Użyj pokręteł regulacji płaszczyzny na uchwycie bloku mikrotomu, aby zapewnić prawidłowe licowanie bloku próbki.
    2. Skieruj się w stronę bloku parafinowego tak, aby dystalny aspekt kości udowej, proksymalny obszar kości piszczelowej oraz przedni i tylny róg łąkotki przyśrodkowej znajdowały się w tej samej płaszczyźnie do pobrania sekcji (rysunek uzupełniający 1A). Rozpocznij zbieranie skrawków na szkiełkach, gdy przedni i tylny róg łąkotki przyśrodkowej zaczną się od siebie oddzielać.
    3. Upewnij się, że kość piszczelowa, kość udowa i łąkotki znajdują się w tej samej płaszczyźnie, porównując rozmiary struktur. Kość piszczelowa i udowa powinny być porównywalnej wielkości, przy czym oba rogi łąkotki powinny być podobne pod względem wielkości i kształtu (rysunek uzupełniający 1A). Jeśli konstrukcja wydaje się zbyt duża w porównaniu z jej odpowiednikiem, oznacza to, że potrzebna jest dodatkowa okładzina. Co ważne, upewnij się, że przestrzeń stawowa pozostaje nienaruszona.
    4. Pobrać strzałkowe skrawki kolan myszy zanurzonych w parafinie przez przedział stawu przyśrodkowego w odcinkach 5 μm i zebrać skrawki na szkiełkach. Zbierz około 30 skrawków na blok parafiny.
  2. Wybór slajdów
    1. Wybrać trzy reprezentatywne odcinki w odległości 50 μm od siebie dla każdej próbki, zaczynając od piątej sekcji (tj. szkiełka 5, 15 i 25). Wybrane preparaty zostaną wykorzystane do późniejszego barwienia, oceny OARSI i analizy histomorfometrycznej.
      UWAGA: Z bloku zawierającego łącznie 30 sekcji wybierz slajdy od początku (slajdy 5–10), środka (slajdy 15–20) i końca (slajdy 25–30) zestawu, aby wyraźnie przedstawić całą próbkę. Wybierz slajdy o podobnych poziomach głębokości między próbkami.

4. Hematoksylina, Safranina Pomarańczowa i Szybkie Zielone Barwienie

  1. Odparafinować wybrane szkiełka za pomocą trzech zmian ksylenu. Uwodnić szkiełka za pomocą dwóch zmian 100% etanolu, dwóch zmian 95% etanolu i jednej zmiany 70% etanolu.
  2. Szkiełka należy barwić hematoksyliną przez 7 minut, a następnie myć bieżącą wodą przez 10 minut. Barwić preparatem Fast Green przez 3 minuty i płukać w 1,0% lodowatym kwasie octowym przez 10 s. Barwić preparatem Safranin-O przez 5 minut i szybko spłukać, zanurzając go w 0,5% lodowatym kwasie octowym.
  3. Opłucz szkiełka w dwóch zmianach wody destylowanej i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu.
  4. Przezroczyste szkiełka w trzech zmianach ksylenu przez 5 minut każda, a następnie zamontuj za pomocą nośnika montażowego na bazie ksylenu i szkiełka nakrywkowego.
    UWAGA: Hematoksylina służy jako barwnik jądrowy do identyfikacji obszarów szpiku kostnego. Safranina-O służy do barwienia chrząstek, proteoglikanów, mucyny i granulek komórek tucznych. Fast Green jest stosowany jako przeciwbarwnik do kości.

5. Obrazowanie slajdów

  1. Zobrazuj szkiełka barwione Safranin-O i Fast Green za pomocą dostępnej kamery podłączonej do mikroskopu i komputerowego oprogramowania do obrazowania.
  2. Otwórz oprogramowanie do obrazowania (patrz Tabela materiałów) i ułóż obszar zainteresowania stawu kolanowego (ROI) na środku okna obrazowania. Jeśli używasz stolika do szkiełka mikroskopu rotacyjnego, ustaw szkiełko tak, aby powierzchnia piszczelowa rozciągała się na szerokość osi poziomej obszaru obrazowania.
  3. Ustaw balans bieli aparatu przed rozpoczęciem obrazowania zestawu próbek (Rysunek uzupełniający 2). Zobrazuj przedział stawowy zarówno w powiększeniu 4x, jak i 10x, upewniając się, że zarówno powierzchnia stawowa piszczelowa, jak i udowa oraz kość piszczelowa podchrzęstna są uwzględnione w każdym z ROI obrazu (rysunek uzupełniający 1A, B). Zapisz obrazy dla każdego z trzech wybranych poziomów, które mają być używane do oceniania OARSI.
    UWAGA: Ustawienie balansu bieli w aparacie zależy od używanego oprogramowania i systemów aparatu. Ogólnie rzecz biorąc, przejdź do karty Aparat lub głównego menu obrazowania i przewiń w dół do opcji Ustaw balans bieli. Wybierz opcję Ustaw balans bieli, a powinien pojawić się mały kursor lub ikona (Rysunek uzupełniający 2A). Za pomocą kursora wybierz obszar na obrazie/próbce, który jest wolny od plam, taki jak przestrzeń fug, aby ustawić balans bieli.

6. Punktacja Międzynarodowego Towarzystwa Badań nad Chorobą Zwyrodnieniową Stawów (OARSI)15

  1. Losowo wybierz trzy wybrane szkiełka barwione Safranin-O i Fast Green ze wszystkich próbek.
  2. Wykonuj punktację OARSI w sposób zaślepiony z trzema obserwatorami. Krótko mówiąc, wyświetlaj jeden obraz na raz w losowej kolejności i pozwól trzem obserwatorom ocenić każdy obraz, korelując z jednym z trzech poziomów wybranych dla każdej próbki.
    UWAGA: Szczegółowe opisy skali ocen można znaleźć w tabeli punktacji OARSI15.
  3. Oblicz średni wynik dla każdej sekcji, korzystając z indywidualnych wyników każdego obserwatora. Określ średni wynik na próbkę, biorąc średni wynik z trzech reprezentatywnych sekcji.

7. Analiza histomorfometryczna

UWAGA: Obrazy na żywo stawu kolanowego są wyświetlane na monitorze dotykowym za pomocą kamery mikroskopowej, a rysik służy do ręcznego śledzenia ROI. Wbudowane algorytmy oprogramowania do histomorfometrii kwantyfikują określone parametry (patrz protokół poniżej) w zdefiniowanych ROI. Co ważne, do analizy histomorfometrycznej wykorzystywane są te same wycinki barwione Safranin-O i Fast Green, które są używane w punktacji OARSI.

  1. Konfiguracja oprogramowania i przygotowanie do pomiarów
    1. Włącz mikroskop, kamerę, komputer i monitor z ekranem dotykowym. Kliknij ikonę oprogramowania, aby uruchomić oprogramowanie. Umieść szkiełko na stoliku mikroskopu do view.
    2. Wyśrodkuj próbkę w oknie pomiaru. Upewnij się, że siatka pomiarowa jest ustawiona na odpowiednie powiększenie, aby pasowała do obiektywu używanego w mikroskopie (Rysunek uzupełniający 3).
    3. Przejdź do zakładki Plik u góry ekranu i przewiń w dół do opcji Ustawienia odczytu. Otwórz okno Ustawienia i wybierz odpowiedni plik ustawień dla parametrów, które mają być mierzone.
    4. Wybierz parametr do pomiaru z listy po prawej stronie ekranu (rysunek uzupełniający 3). Użyj rysika lub kursora myszy, aby obrysować obrazy zgodnie z krokami opisanymi poniżej, aby zmierzyć określony zwrot z inwestycji w tkanki. Po zakończeniu każdego pomiaru kliknij prawym przyciskiem myszy, aby zakończyć pomiar i przejdź do następnego parametru.
      UWAGA: Lista parametrów, które mają być mierzone, jest tworzona za pomocą odrębnego pliku preferencji, który jest konfigurowany w porozumieniu z firmą programistyczną w celu pomiaru opisanego zwrotu z inwestycji. Zapoznaj się z dyskusją, aby uzyskać więcej informacji na temat pełnej konfiguracji.
    5. Wykonaj wszystkie pomiary, a następnie przejdź do zakładki Dane podsumowujące u dołu ekranu oprogramowania (rysunek uzupełniający 3). Kliknij okno ekranu, naciśnij Insert na klawiaturze lub skopiuj i wklej dane do osobnego arkusza kalkulacyjnego.
      UWAGA: Analizę histomorfometryczną należy przeprowadzić w sposób losowy i zaślepiony. Po wykonaniu wszystkich pomiarów parametrów dla wszystkich próbek, uporządkuj dane i uśrednij pomiary z trzech slajdów z każdej próbki.
  2. Pomiary całkowitych, zwapniałych i niezwapnionych obszarów chrząstki
    UWAGA: Użyj dostępnego na rynku oprogramowania (patrz Spis materiałów), aby wykonać te kroki. Proszę zapoznać się z rysunkiem uzupełniającym 1B, C, aby uzyskać wyjaśnienia dotyczące obszarów chrząstki, połączeń i obszarów kości podchrzęstnych omówionych w tej sekcji.
    1. Narysuj linię w poprzek górnej krawędzi powierzchni chrząstki piszczelowej, w miejscu, w którym chrząstka styka się z przestrzenią stawową. Narysuj drugą linię na skrzyżowaniu chrzęstno-kostnym, gdzie zwapniała chrząstka styka się z kością podchrzęstną (Ryc. 1B). Użyj funkcji obszaru oprogramowania, aby automatycznie uzyskać pomiar całkowitej powierzchni chrząstki.
    2. Narysuj linię wzdłuż znaku pływowego, naturalnie występującą linię oddzielającą zwapniałe i niezwapnione obszary chrząstki. Narysuj drugą linię na skrzyżowaniu chrzęstno-kostnym, gdzie zwapniała chrząstka styka się z kością podchrzęstną (Ryc. 1B). Użyj funkcji obszaru oprogramowania, aby automatycznie uzyskać pomiar zwapniałej powierzchni chrząstki.
    3. Oblicz obszar niezwapniałej chrząstki, odejmując zwapniały obszar chrząstki od całkowitego obszaru chrząstki (Rysunek 1B).
  3. Oznaczanie liczby i fenotypu chondrocytów
    1. Utwórz oddzielne funkcje zliczania w ustawieniach w oprogramowaniu do histomorfometrii, aby odróżnić chondrocyty wytwarzające matrycę i niewytwarzające macierzy (Rysunek 1B).
    2. Określ liczbę matryc wytwarzających lub niewytwarzających chondrocytów, używając rysika, aby utworzyć małą kropkę nad każdym chondrocytem wyrażającym określony fenotyp (Rysunek 1B).
      UWAGA: Policz komórki zgodnie z ich fenotypem jako wytwarzające matrycę (tj. silne barwienie Safraniną-O) lub niewytwarzające macierzy (tj. bardzo słabe barwienie Safraniną-O lub bez niego).
  4. Pomiar obwodu powierzchni stawowej piszczelowej
    1. Zmierz bezwzględny obwód powierzchni stawowej piszczelowej, śledząc linię w poprzek powierzchni chrząstki piszczelowej, starannie definiując poszczególne migotanie (Rysunek 1C).
    2. Narysuj drugą linię wzdłuż znaku pływu, która będzie służyć jako wewnętrzna kontrola płaszczyzny każdej sekcji (Rysunek 1C).
    3. Oblicz wskaźnik migotania powierzchni stawowej piszczeli, dzieląc obwód powierzchni stawowej piszczeli przez obwód znacznika pływu.
      UWAGA: Obwody Tidemark są na ogół równe we wszystkich próbkach, więc różnica w obwodach powierzchni stawowej między pozorowanym a DMM była na ogół niewielka, niezależnie od tego, czy zastosowano bezwzględny obwód czy wskaźnik migotania.
  5. Pomiar obszarów podchrzęstnych kości i szpiku kostnego
    1. Zmierz obszar przestrzeni szpiku podchrzęstnego za pomocą funkcji Obszar, obrysowując regiony w regionie podchrzęstnym barwione tylko hematoksyliną (tj. ujemne dla Fast Green), aby określić całkowitą powierzchnię przestrzeni szpiku w kości podchrzęstnej. Narysuj linie na obwodzie tych obszarów, aby określić całkowitą powierzchnię całej przestrzeni szpiku w kości piszczelowej podchrzęstnej (Rysunek 2B).
    2. Zmierz całkowity obszar podchrzęstny za pomocą funkcji powierzchni, obrysowując obszar między połączeniem chrzęstno-kostnym a górną granicą płytki wzrostu, rozciągającą się bocznie do regionów przednich i tylnych osteofitów (Rysunek 2B).
    3. Oblicz obszar kości podchrzęstnej, odejmując obszar przestrzeni podchrzęstnej szpiku kostnego od całkowitego obszaru podchrzęstnego (Rysunek 2B, C).
  6. Pomiar przednich i tylnych obszarów osteofitu
    1. Aby zmierzyć obszar osteofitu, prześledź przednie i tylne osteofity bliższej kości piszczelowej za pomocą funkcji Obszar (Rysunek 2B,E,F).
      UWAGA: Osteofity to wypustki kostne, które tworzą się między chrząstką stawową a płytką wzrostową, przed lub za obszarem podchrzęstnym. Obszary osteofitów po przedniej i tylnej stronie kości piszczelowej określa się, śledząc obszar z przodu lub z tyłu do kości podchrzęstnej. Połączenie między osteofitami a kością podchrzęstną jest wyraźnie wyznaczone linią komórek rozciągającą się od chrząstki stawowej do płytki wzrostowej. Połączenie między osteofitem a błoną maziową jest zdefiniowane przez przejście między tkanką kostną a włóknistą.
  7. Pomiar grubości błony maziowej
    1. Zmierz grubość błony maziowej przedniej części kości udowej za pomocą funkcji Obszar, rysując linię od wewnętrznego punktu wstawiania przedniej błony maziowej na kości udowej w kierunku jej punktu przyczepu na łąkotce (Rysunek 3B).
    2. Narysuj drugą linię od zewnętrznego przyczepu błony maziowej na kości udowej w kierunku jej przyczepienia do łąkotki (Ryc. 3B).
    3. Oblicz grubość błony maziowej, dzieląc całkowity obszar mazi przez obwód błony maziowej.

8. Analiza statystyczna

  1. Zebrać zmierzone parametry i uśrednić wyniki z trzech reprezentatywnych sekcji dla każdej próbki. Przeanalizuj dane za pomocą niesparowanego testu t-Studenta, aby porównać dwie grupy lub jednoczynnikowej ANOVA, aby porównać trzy lub więcej grup.
  2. Wyświetla dane jako średnią ± błąd standardowy średnia.
    UWAGA: Istotność statystyczną uzyskano przy p ≤ 0,05.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Choroba zwyrodnieniowa stawów wywołana przez DMM powoduje zwyrodnienie chrząstki stawowej i utratę chondrocytów
Choroba zwyrodnieniowa stawów wywołana przez DMM skutkowała zwiększonym wynikiem OARSI w porównaniu z myszami pozorowanymi, wyraźnie charakteryzującymi się erozją powierzchniową i utratą chrząstki (Rysunek 1A,D). Opisany tutaj protokół histomorfometrii wykrył kilka zmian związanych z chorobą zwyrodnieniową stawów, w tym zmniejszenie całkowitej powierzchn...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niedawne badania nad chorobą zwyrodnieniową stawów poszerzyły naszą wiedzę na temat wzajemnych oddziaływań między różnymi tkankami w stawie oraz roli, jaką każda tkanka odgrywa w inicjacji lub progresji choroby 8,9,10,35,36. W związku z tym stało się oczywiste, że ocena choroby zwyrodnieniowej stawów nie powinna ograniczać się do analizy chrząstki, ale powinna...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować za pomoc personelowi Wydziału Medycyny Porównawczej oraz Centrum Molekularnemu i Histopatologii w Penn State Milton S. Hershey Medical Center. Źródła finansowania: NIH NIAMS 1RO1AR071968-01A1 (F.K.), ANRF Arthritis Research Grant (F.K.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
10% buforowany fosforan formalinyFisher ChemicalSF100-20Do utrwalania próbki po zbiorach
Kwas octowy, lodowaty (certyfikowany ACS)Fisher ChemicalA38S-212Do odwapniania Przygotowanie buforu i przygotowanie roztworu kwasu octowego do barwienia
Cintiq 27QHD Creative Pen DisplayWacomhttps://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touchDo analizy i obrazowania histomorfometrycznego
Cintiq Ergo stoiskoWacomhttps://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touchDo analizy i obrazowania histomorfometrycznego
Kwas etylenodiaminotetraoctowy, sól tetrasodowa dwuwodna, 99%Acros OrganicsAC446080010Do odwapniania Przygotowanie buforu
Fast Green BejcaSIGMA Life SciencesF7258Do barwienia próbek
Fisherbrand Superfrost Plus Szkiełka mikroskopoweFisher12-550-15Do pobierania próbek
HistoPrep XyleneFisherbrandHC-700-1GALDo deparrafinizacji i barwienia próbek
Kasety na tkanki Histosette II - kombinowana pokrywa i podstawaFisher15-182-701ADo przetwarzania próbek i osadzania
Stacja robocza HP Z440HPNumer produktu: Y5C77US#ABADo analizy i obrazowania histomorfometrycznego
Ręczny mikrotom obrotowyLeicaRM 2235Do Cięcie próbek
Pisaki do znakowaniaLeica3801880Do etykietowania próbek, kaset i szkiełek
Mikroskop OLYMPUS BX53OLYMPUShttps://www.olympus-lifescience.com/en/microscopes/upright/bx53f2/Do analizy i obrazowania histomorfometrycznego
Aparat mikroskopowy OLYMPUS DP 73OLYMPUShttps://www.olympus-lifescience.com/en/camera/color/dp73/Do analizy i obrazowania histomorfometrycznego (wycofane)
pH-metr ORION STAR A211Thermo ScientificSTARA2110Do odwapnienia Przygotowanie bufora
OprogramowanieOsteoMeasure OsteoMetricshttps://www.osteometrics.com/index.htmDo pomiarów i analiz histomorfometrycznych
Perfuzja Dwa Zautomatyzowany ciśnieniowy system perfuzyjnyLeicaModel # 39471005Dla myszy Żniwa kolana
Oprogramowanie PRISM 7GraphPadInstitutional Access AccountAnaliza statystyczna
Barwienie Safranin-OSIGMA Life SciencesS8884Do barwienia próbek
ThinkBoneStage - Stolik mikroskopu obrotowegoThink Bone Consulting Inc. - OsteoMetrics (dostawca)http://thinkboneconsulting.com/index_files/Slideholder.phpDo analizy i obrazowania histomorfometrycznego
Wacom Pro Pen StylusWacomhttps://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touchDo analizy histomorfometrycznej i obrazowania
Weigerts Iron Hematoxylin AFisher5029713Do barwienia hematoksyliną
Weigerts Iron Hematoxylin BFisher5029714Do barwienia hematoksyliną

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ma, V. Y., Chan, L., Carruthers, K. J. Incidence, prevalence, costs, and impact on disability of common conditions requiring rehabilitation in the United States: stroke, spinal cord injury, traumatic brain injury, multiple sclerosis, osteoarthritis, rheumatoid arthritis, limb loss, and back pain. Archives of Physical Medicine and Rehabililation. 95 (5), 986-995 (2014).
  2. Hopman, W., et al. Associations between chronic disease, age and physical and mental health status. Journal of Chronic Diseases in Canada. 29 (3), 108-116 (2009).
  3. Lorenz, J., Grässel, S. Experimental osteoarthritis models in mice. Mouse Genetics. Methods in Molecular Biology. Singh, S., Coppola, V. 1194, Humana Press. New York, NY. 401-419 (2004).
  4. Sophia Fox, A. J., Bedi, A., Rodeo, S. A. The basic science of articular cartilage: structure, composition, and function. Journal of Sports Health. 1 (6), 461-468 (2009).
  5. Van der Kraan, P., Van den Berg, W. Chondrocyte hypertrophy and osteoarthritis: role in initiation and progression of cartilage degeneration. Osteoarthritis and Cartilage. 20 (3), 223-232 (2012).
  6. Hodsman, A. B., et al. Parathyroid hormone and teriparatide for the treatment of osteoporosis: a review of the evidence and suggested guidelines for its use. Endocrine Reviews. 26 (5), 688-703 (2005).
  7. Pitsillides, A. A., Beier, F. Cartilage biology in osteoarthritis-lessons from developmental biology. Nature Reviews Rheumatology. 7 (11), 654(2011).
  8. Yuan, X., et al. Bone-cartilage interface crosstalk in osteoarthritis: potential pathways and future therapeutic strategies. Osteoarthritis and Cartilage. 22 (8), 1077-1089 (2014).
  9. Goldring, S. R., Goldring, M. B. Changes in the osteochondral unit during osteoarthritis: structure, function and cartilage-bone crosstalk. Nature Reviews Rheumatology. 12 (11), 632(2016).
  10. Martel-Pelletier, J., et al. Osteoarthritis. Nature Reviews Disease Primers. 2 (1), 16072(2016).
  11. Goldring, M. B., Otero, M. Inflammation in osteoarthritis. Current Opinion in Rheumatology. 23 (5), 471(2011).
  12. Sellam, J., Berenbaum, F. The role of synovitis in pathophysiology and clinical symptoms of osteoarthritis. Nature Reviews Rheumatology. 6 (11), 625(2010).
  13. Ma, H., et al. Osteoarthritis severity is sex dependent in a surgical mouse model. Osteoarthritis and Cartilage. 15 (6), 695-700 (2007).
  14. Katon, W., Lin, E. H., Kroenke, K. The association of depression and anxiety with medical symptom burden in patients with chronic medical illness. General Hospital Psychiatry. 29 (2), 147-155 (2007).
  15. Glasson, S., Chambers, M., Van Den Berg, W., Little, C. The OARSI histopathology initiative-recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the mouse. Osteoarthritis and Cartilage. 18, 17-23 (2010).
  16. Pastoureau, P., Leduc, S., Chomel, A., De Ceuninck, F. Quantitative assessment of articular cartilage and subchondral bone histology in the meniscectomized guinea pig model of osteoarthritis. Osteoarthritis and Cartilage. 11 (6), 412-423 (2003).
  17. O'Driscoll, S. W., Marx, R. G., Fitzsimmons, J. S., Beaton, D. E. Method for automated cartilage histomorphometry. Tissue Engineering. 5 (1), 13-23 (1999).
  18. Matsui, H., Shimizu, M., Tsuji, H. Cartilage and subchondral bone interaction in osteoarthrosis of human knee joint: a histological and histomorphometric study. Microscopy Research Technique. 37 (4), 333-342 (1997).
  19. Hacker, S. A., Healey, R. M., Yoshioka, M., Coutts, R. D. A methodology for the quantitative assessment of articular cartilage histomorphometry. Osteoarthritis and Cartilage. 5 (5), 343-355 (1997).
  20. Pastoureau, P., Chomel, A. Methods for Cartilage and Subchondral Bone Histomorphometry. Cartilage and Osteoarthritis. Methods in Molecular Medicine. DeCeuninck, F., Sabatini, M., Pastoureau, P. 101, Humana Press. New York, NY. 79-91 (2004).
  21. McNulty, M. A., et al. A comprehensive histological assessment of osteoarthritis lesions in mice. Cartilage. 2 (4), 354-363 (2011).
  22. Glasson, S., Blanchet, T., Morris, E. The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse. Osteoarthritis and Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).
  23. Singh, S. R., Coppola, V. Mouse Genetics: Methods and Protocols. , Humana Press. New York, NY. (2004).
  24. Fang, H., Beier, F. Mouse models of osteoarthritis: modelling risk factors and assessing outcomes. Nature Reviews Rheumatology. 10 (7), 413(2014).
  25. Culley, K. L., et al. Mouse Models of Osteoarthritis: Surgical Model of Posttraumatic Osteoarthritis Induced by Destabilization of the Medial Meniscus. Osteoporosis and Osteoarthritis. Methods in Molecular Biology. Westendorf, J., van Wijnen, A. 1226, Humana Press. New York, NY. 143-173 (2015).
  26. Van der Kraan, P. Factors that influence outcome in experimental osteoarthritis. Osteoarthritis and Cartilage. 25 (3), 369-375 (2017).
  27. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564(2012).
  28. Callis, G., Sterchi, D. Decalcification of bone: literature review and practical study of various decalcifying agents. Methods, and their effects on bone histology. Journal of Histotechnology. 21 (1), 49-58 (1998).
  29. Lajeunesse, D., Massicotte, F., Pelletier, J. P., Martel-Pelletier, J. Subchondral bone sclerosis in osteoarthritis: not just an innocent bystander. Modern Rheumatology. 13 (1), 0007-0014 (2003).
  30. Li, G., et al. Subchondral bone in osteoarthritis: insight into risk factors and microstructural changes. Arthritis Research Therapy. 15 (6), 223(2013).
  31. Kapoor, M., Martel-Pelletier, J., Lajeunesse, D., Pelletier, J. P., Fahmi, H. Role of proinflammatory cytokines in the pathophysiology of osteoarthritis. Nature Reviews Rheumatology. 7 (1), 33(2011).
  32. Scanzello, C. R., Goldring, S. R. The role of synovitis in osteoarthritis pathogenesis. Bone. 51 (2), 249-257 (2012).
  33. Benito, M. J., Veale, D. J., FitzGerald, O., van den Berg, W. B., Bresnihan, B. Synovial tissue inflammation in early and late osteoarthritis. Annals of the Rheumatic Diseases. 64 (9), 1263-1267 (2005).
  34. De Lange-Brokaar, B. J., et al. Synovial inflammation, immune cells and their cytokines in osteoarthritis: a review. Osteoarthritis and Cartilage. 20 (12), 1454-1499 (2012).
  35. Findlay, D. M., Kuliwaba, J. S. Bone-cartilage crosstalk: a conversation for understanding osteoarthritis. Bone Research. 4, 16028(2016).
  36. Lories, R. J., Luyten, F. P. The bone-cartilage unit in osteoarthritis. Nature Reviews Rheumatology. 7 (1), 43(2011).
  37. Pritzker, K. P., et al. Osteoarthritis cartilage histopathology: grading and staging. Journal of Osteoarthritis and Cartilage. 14 (1), 13-29 (2006).
  38. Hayami, T., et al. Characterization of articular cartilage and subchondral bone changes in the rat anterior cruciate ligament transection and meniscectomized models of osteoarthritis. Bone. 38 (2), 234-243 (2006).
  39. Priemel, M., et al. mineralization defects and vitamin D deficiency: Histomorphometric analysis of iliac crest bone biopsies and circulating 25-hydroxyvitamin D in 675 patients. Journal of Bone and Mineral Research. 25 (2), 305-312 (2010).
  40. Yukata, K., et al. Continuous infusion of PTH 1–34 delayed fracture healing in mice. Scientific Reports. 8 (1), 13175(2018).
  41. Kawano, T., et al. LIM kinase 1 deficient mice have reduced bone mass. Bone. 52 (1), 70-82 (2013).
  42. Zhang, L., Chang, M., Beck, C. A., Schwarz, E. M., Boyce, B. F. Analysis of new bone, cartilage, and fibrosis tissue in healing murine allografts using whole slide imaging and a new automated histomorphometric algorithm. Bone Research. 4, 15037(2016).
  43. Wu, Q., et al. Induction of an osteoarthritis-like phenotype and degradation of phosphorylated Smad3 by Smurf2 in transgenic mice. Arthritis Rheumatism. 58 (10), 3132-3144 (2008).
  44. Hordon, L., et al. Trabecular architecture in women and men of similar bone mass with and without vertebral fracture: I. Two-dimensional histology. Bone. 27 (2), 271-276 (2000).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Mysi model choroby zwyrodnieniowej staw wanaliza histomorfometrycznapomiar powierzchni chrz stkiocena ko ci podchrz stnejkwantyfikacja powierzchni osteofit wocena grubo ci b ony maziowejzliczanie liczby chondrocyt wobliczanie indeksu fibrylacjiOA indukowana metod DMMilo ciowa ocena staw w

Powiązane artykuły