Artykuł metodologiczny

Model sferoidalny 3D glejaka wielopostaciowego

17.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60998

⸱

9 kwietnia 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1University Bordeaux, LAMC, 2INSERM U1029, University Bordeaux, 3Department of Biomedicine, University of Bergen, 4CNRS, IBGC UMR5095, 5LP2N, CNRS UMR 5298, IOA, 6Institut d'Optique Graduate School, IOA

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy łatwy w użyciu test na inwazję glejaka. Ten test jest odpowiedni dla komórek macierzystych podobnych do glejaka. Opisano również makro Fidżi do łatwego ilościowego określania inwazji, migracji i proliferacji.

Streszczenie

Dwuwymiarowe (2D) hodowle komórkowe nie naśladują w zadowalający sposób wzrostu guza in vivo. W związku z tym opracowano trójwymiarowe (3D) modele sferoidalne hodowli. Modele te mogą być szczególnie istotne w dziedzinie neuroonkologii. Rzeczywiście, guzy mózgu mają tendencję do atakowania zdrowego środowiska mózgu. Opisujemy tutaj idealny test 3D oparty na sferoidach glejaka, który opracowaliśmy do badania inwazji guza. Zapewniamy wszystkie szczegóły techniczne i narzędzia analityczne, aby z powodzeniem przeprowadzić ten test.

Wprowadzenie

W większości badań z wykorzystaniem pierwotnych lub komercyjnie dostępnych linii komórkowych, testy są przeprowadzane na komórkach hodowanych na powierzchniach plastikowych jako hodowle jednowarstwowe. Zarządzanie hodowlą komórkową w 2D ma wady, ponieważ nie naśladuje środowiska komórkowego 3D in vivo. W hodowlach 2D cała powierzchnia komórki jest w bezpośrednim kontakcie z pożywką, co zmienia wzrost komórek i modyfikuje dostępność leków. Co więcej, niefizjologiczna powierzchnia z tworzywa sztucznego wyzwala różnicowanie komórek1. Aby przezwyciężyć te trudności, opracowano trójwymiarowe modele hodowli. Mają one tę zaletę, że naśladują wielokomórkową architekturę i heterogeniczność nowotworów2, a zatem mogą być uważane za bardziej odpowiedni model dla guzów litych3. Złożona morfologia sferoid przyczynia się do lepszej oceny penetracji i oporności leków4. Niejednorodność guza w sferoidzie wpływa na dyfuzję tlenu i składników odżywczych oraz odpowiedź na środki farmakologiczne (ryc. 1A). Dyfuzja tlenu zmienia się, gdy rozmiar sferoidy osiąga 300 μm, wywołując niedotlenienie środowiska w środku sferoidy (ryc. 1A,C). Metabolity są również mniej przenikające przez warstwy komórkowe i zachodzą kompensacyjne reakcje metaboliczne5. Gdy średnica sferoidy wzrasta, można zaobserwować nekrotyczne rdzenie, co dodatkowo naśladuje cechy występujące w wielu litych nowotworach, w tym w agresywnym glejaku mózgu (GBM)6.

Kilka testów inwazji 2D lub 3D na glejaka zostało zgłoszonych w literaturze7,8. Testy dwuwymiarowe służą głównie do badania inwazji w płaszczyźnie poziomej na cienkiej warstwie matrycy lub w teście komorowym Boydena9. Testy trójwymiarowe zostały opisane za pomocą hodowli sferoidalnych 3D przy użyciu klasycznych linii komórkowych glejaka10. Bardziej złożone warianty są reprezentowane przez inwazję organoidów mózgowych przez sferoidy nowotworowe w kulturach konfrontacji11. Jednak nadal ważne jest, aby opracować łatwy w użyciu i powtarzalny test dostępny dla każdego laboratorium. Opracowaliśmy protokół generowania komórek macierzystych podobnych do glejaka z próbek pobranych od pacjentów. Kwantyfikacja tych testów jest łatwa do opanowania i wymaga jedynie otwartego oprogramowania online. Krótko mówiąc, kawałki guza są cięte na małe kawałki i trawione enzymatycznie. Pojedyncze komórki pochodzące z trawienia są hodowane w pożywce neurobazalnej. Po 4-7 dniach spontanicznie tworzą się struktury sferoidalne. Po implantacji wewnątrzczaszkowej w modelach mysich tworzą one guzy wykazujące martwiczy rdzeń otoczony komórkami pseudo-palisadowymi12. Jest to bardzo podobne do cech występujących u pacjentów z GBM.

W tym artykule opisujemy nasz protokół wytwarzania sferoidów z określonej liczby komórek, aby zapewnić odtwarzalność. W tym celu można zastosować dwie komplementarne matryce: Matrigel i kolagen typu I. Matrigel jest wzbogacony w czynniki wzrostu i naśladuje błonę podstawną ssaków niezbędną do przyłączania i migracji komórek. Z drugiej strony kolagen typu I, element strukturalny zrębu, jest najczęstszą fibrylarną macierzą zewnątrzkomórkową i jest stosowany w testach inwazji komórek. W tym miejscu ilustrujemy nasz model sferoidalny GBM, wykonując testy migracji i proliferacji. Analizę przeprowadzono nie tylko w ustalonych punktach czasowych, ale także poprzez monitorowanie ekspansji sferoidowej i ruchu komórek za pomocą obrazowania na żywo. Ponadto przeprowadzono mikroskopię elektronową w celu uwidocznienia szczegółów morfologicznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Uzyskano świadomą pisemną zgodę od wszystkich pacjentów (ze Szpitala Haukeland, Bergen, Norwegia zgodnie z lokalnymi przepisami komisji etyki). Nasz protokół jest zgodny z wytycznymi komisji etycznej ds. badań klinicznych na ludziach w naszej instytucji.

1. Generowanie sferoidów guza o jednakowej wielkości

UWAGA: Komórki macierzyste są hodowane w pożywce neurobazalnej uzupełnionej suplementem B27, heparyną, FGF-2, penicyliną i streptomycyną, jak opisano w poprzednich artykułach12. Komórki te spontanicznie tworzą sferoidy w hodowli.

  1. Przemyć komórki nowotworowe 5 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i inkubować komórki z 0,5-1 ml enzymu dysocjacyjnego (patrz tabela materiałów) przez 5 minut w temperaturze 37 °C.
  2. Przemyć 4-4,5 ml PBS i dodać 10 ml kompletnej pożywki wzrostowej (kompletna pożywka nerwowo-podstawowa, cNBM).
  3. Policzyć komórki przy użyciu techniki automatycznego liczenia z błękitem trypanowym i szkiełkiem komory do liczenia komórek.
  4. Aby wygenerować 100 sferoid z 104 komórkami na sferoidę (w zależności od preferowanej wielkości), wymieszaj 106 komórek w 8 ml NBM z 2 ml 2% metylocelulozy.
  5. Przenieść zawiesinę do sterylnego pojemnika systemowego i dozować 100 μl/studzienkę za pomocą pipety wielokanałowej do 96-dołkowej okrągłej płytki dennej.
  6. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C, 5% CO2 i wilgotności 95%. Utworzą się sferoidy o równej wielkości i można je użyć po 3-4 dniach.

2. Eksperymenty trójwymiarowe

  1. proliferacja
    1. preparat
      1. Zawiesić inhibitory (np. rotenon jak w Rysunek 4A) i chemikalia w 100 μl pożywki i dodać do 100 μl pożywki w każdym dołku (tj. jeden sferoid na studzienkę).
      2. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C, 5% CO2 i wilgotności 95%.
    2. Akwizycja i analiza obrazu
      1. Rób zdjęcia za pomocą mikroskopu wideo w jasnym polu, aby stworzyć serię warunków przy T0 i oczekiwanych czasach.
      2. Użyj Fidżi do analizy zdjęć ręcznie lub w sposób półautomatyczny. Aby zrobić to ręcznie, narysuj okrąg wokół rdzenia sferoidy za pomocą narzędzia do zaznaczania odręcznego i zmierz powierzchnię każdej sferoidy. Aby przeanalizować obrazy w sposób półautomatyczny, należy użyć makra pokazanego w dokumencie uzupełniającym 1 tylko z //Obszarem podstawowym.
  2. inwazja
    1. preparat
      1. Przygotuj matrycę kolagenową w probówce na lodzie z kolagenem typu I o stężeniu końcowym 1 mg/ml, 1x PBS,kolagenem 0,023xV, 1 M wodorotlenkiem sodu i sterylnymH2O. Inkubuj roztwór na lodzie przez 30 minut.
      2. Zebrać sferoidy z okrągłej płytki dołka do probówek o pojemności 500 μl i przemyć 2x 200 μl 1x PBS.
      3. Ostrożnie odpipetować sferoidy do 100 μl matrycy kolagenowej i włożyć do środka studzienki do normalnych 96-dołkowych płytek.
      4. Inkubować żel kolagenowy przez 30 minut w temperaturze 37 °C, a następnie dodać cNBM na wierzch żelu. Na tym etapie do pożywki można dodać inhibitory lub aktywatory (np. chlorowodór, jak pokazano na Rysunek 4B, 4C).
    2. Akwizycja i analiza obrazu
      1. Rób zdjęcia sekwencyjnie za pomocą mikroskopu wideo w trybie jasnego pola 24 godziny po włączeniu kolagenu.
      2. Użyj Fidżi do analizy zdjęć ręcznie lub w sposób półautomatyczny. Aby to zrobić ręcznie, narysuj wokół rdzenia i całkowitego obszaru sferoidy za pomocą narzędzia do zaznaczania odręcznego i zmierz obszar inwazyjny każdej sferoidy, odejmując całkowitą powierzchnię od powierzchni rdzenia. Aby przeanalizować obrazy w sposób półautomatyczny, należy użyć makra wskazanego w dokumencie uzupełniającym 1 w celu określenia obszaru inwazyjnego.
  3. migracja
    1. preparat
      1. Pokryć 6-dołkową płytkę Matrigelem (0,2 mg/ml) w NBM przez 30 minut w temperaturze 37 °C, następnie wyjąć Matrigel i dodać 2 ml cNBM.
      2. Przenieść sferoidy do 50 μl cNBM z płytki dołkowej z okrągłym dnem na płytkę 6-dołkową.
      3. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C i odczekać 30 minut, aż sferoidy się przylgną.
      4. Po 24 godzinach inkubacji wybarwić 10 ng/ml Hoechst i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
    2. Akwizycja i analiza obrazu
      1. Uzyskuj obrazy za pomocą mikroskopu wideo w jasnym polu. Laser o długości fali 405 nm służy do wizualizacji barwienia metodą Hoechst.
      2. Użyj oprogramowania Fidżi, aby przeanalizować zdjęcia i uruchomić makro, jak wskazano w dokumencie uzupełniającym 1.
        UWAGA: Dotknięcie dna studzienki lub całkowite usunięcie supernatantu uszkadza sferoidy. W przypadku obchodzenia się z żelem kolagenowym typu I należy trzymać żel na lodzie, aby uniknąć polimeryzacji kolagenu, nie dodawać składnika kwaśnego, ponieważ zmiana pH wpłynie na zwartość żelu i szybko pipetować komórki do kolagenu, aby zapobiec śmierci komórek i degradacji żelu.

3. Makro Fidżi

UWAGA: Fidżi to program do analizy obrazów opracowany w domenie publicznej, który pozwala na rozwój makr przyspieszających analizę obrazów. Możliwa jest również ręczna analiza, ale jest to powolny proces i może wprowadzać błędy systematyczne. Obrazy można importować metodą "przeciągnij i upuść" w oprogramowaniu i określać ilościowo za pomocą wtyczki ROI Manager Tools. Procedura zastosowana w tym badaniu została opisana poniżej:

  1. Otwórz okno makra: Wtyczki | Makra | Interaktywny tłumacz.
  2. Skopiuj i wklej następującą dostosowaną fioletową pętlę. Zachowaj fioletowe zdania i dodaj zielone zdania, które Cię interesują (Dokument uzupełniający 1).
  3. Aby przeanalizować całą serię, dostosuj parametry w kolorze czerwonym dla określonej kwantyfikacji i uruchom makro za pomocą punktu menu Makra | Uruchom makro lub naciśnij Ctrl+R.
  4. Sprawdź i, jeśli to konieczne, ręcznie dostosuj obszar zainteresowania (ROI).

4. Mikroskopia elektronowa sferoid

UWAGA: Większość z poniższych kroków musi być wykonana w okapie chemicznym.

  1. Etap mocowania
    1. Zebrać sferoidę za pomocą przeciętej końcówki pipety, umieścić ją w probówce o pojemności 1,5 ml i przemyć 1x 0,1 M buforem fosforanowym (PB).
    2. Utrwalić sferoidę przez noc w temperaturze 4 °C w 2% aldehydzie glutarowym/2% paraformaldehydzie (PFA) w 0,1 M PB.
    3. Zastąp roztwór utrwalający roztworem 1% PFA w 0,1 M PB, a następnie przygotuj próbkę.
  2. Przygotowanie próbki
    1. Przenieś sferoidy do sitka i umieść je w szklanej zlewce, aby uniknąć uszkodzenia sferoidów.
    2. Ostrożnie umyć 3x 0,1 M PB.
    3. Inkubować z osmem przez 2 godziny w ciemności. Rozcieńczyć osm do 4% w 1% buforze 0,1 M PB.
    4. Ostrożnie umyć 3x 0,1 M PB.
      1. Odwodnić w następujący sposób: moczyć w 50% etanolu przez 10 min, 70% etanolu przez 10 min, 2x 90% etanolu przez 15 min, 2x 100% etanolu przez 20 min i 2x acetonie przez 30 min.
    5. Próbki należy inkubować w mieszaninie acetonu i żywicy w proporcji 50/50 przez 2 godziny. Na tym etapie przygotuj żywicę EPON (Embed-812: 11.25 g; DDSA: 9 g; NMA: 4,5 g).
    6. Wyrzuć mieszaninę acetonu i żywicy, zastąp świeżo przygotowaną żywicą i inkubuj przez noc.
    7. Wymień żywicę na nową i inkubuj przez 2-6 godzin.
    8. Dodaj sferoidy w żywicy do formy w temperaturze 60 °C przez 48-72 godziny.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Sferoidy przygotowano zgodnie z opisem w sekcji protokołów, a następnie przeprowadzono obserwacje dotyczące migracji, inwazji, proliferacji oraz analizę mikroskopową. W celu pomiaru hipoksji w poszczególnych obszarach struktury sferycznej, do określenia aktywności hipoksycznej zastosowano barwienie na bezwodnik węglowy IX (Rysunek 1A-C). W centrum sferoidu zaobserwowano więcej komórek wykazujących obecność CAIX (Rysunek 1...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Testy sferoidalne guza są dobrze przystosowane do badania cech guza, w tym proliferacji, inwazji i migracji, a także śmierci komórki i odpowiedzi na lek. Komórki rakowe atakują macierz 3D, tworząc inwazyjny mikroguz, jak widać na rycinie 4B,C. Podczas procesu inwazyjnego metaloproteinazy macierzy (MMP) trawią matryce otaczające komórki nowotworowe13, a inhibitory MMP (np. GM6001 lub Rebimastat) mogą upośledzać inwazję komórek, ale nie migrację

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Transcan 2017, ARC 2017, Ligue Contre le Cancer (Comité de la Gironde et de la Charente-Maritime). Joris Guyon jest stypendystą Szpitala Uniwersyteckiego w Tuluzie (CHU Toulouse).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
96-dołkowa płyta okrągłodennaFalcon08-772-212
AccutaseGibcoA11105-01Przechowywana w temperaturze 4 stopni; C, enzym dysocjacji sfery
B27Gibco12587Przechowywany w temperaturze -20 & deg; C, rozmrozić przed użyciem
Podstawowy czynnik wzrostu fibroblastówPeprotech100-18BPrzechowywany w temperaturze -20 & deg; C, rozmrozić przed użyciem
Szkiełka z komorą do liczenia komórek CountessInvitrogenC10283
DPBS 10XPan BiotechP04-53-500Przechowywane w temperaturze 4 & stopni; C
Oprogramowanie FijiImageJSłuży do analizy zdjęć
Kolba 75 cm2Falcon10497302
MatrigelCorning354230Przechowywany w temperaturze -20 ° C, rozcieńczony do końcowego stężenia 0,2 mg/ml w zimnym NBM
MetylocelulozaSigmaM0512Rozcieńczony w NBM dla 2% stężenia końcowego
NBMGibco21103-049Przechowywany w temperaturze 4 & stopni; C
Pożywka neuropodstawowaGibco21103049Przechowywany w temperaturze 4 & stopni; C
Penicylina - StreptomycynaGibco15140-122Przechowywany w temperaturze 4 & stopni; C
Trypan niebieski 0,4%ThermoFisherT10282Służy do liczenia komórek
Typ I KolagenCorning354236Przechowywany w temperaturze 4 & stopni; Z

Bibliografia

  1. Pelissier, F. A., et al. Age-related dysfunction in mechanotransduction impairs differentiation of human mammary epithelial progenitors. Cell Reports. 7, 1926-1939 (2014).
  2. Ishiguro, T., et al. Tumor-derived spheroids: Relevance to cancer stem cells and clinical applications. Cancer Science. 108, 283-289 (2017).
  3. Sutherland, R. M. Cell and environment interactions in tumor microregions: the multicell spheroid model. Science. 240, 177-184 (1988).
  4. Desoize, B., Jardillier, J. Multicellular resistance: a paradigm for clinical resistance? Critical Reviews in Oncology/Hematology. 36, 193-207 (2000).
  5. Corbet, C., Feron, O. Tumour acidosis: from the passenger to the driver's seat. Nature Reviews Cancer. 17, 577-593 (2017).
  6. Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again. Journal of Biotechnology. 148, 3-15 (2010).
  7. Berens, E. B., Holy, J. M., Riegel, A. T., Wellstein, A. A Cancer Cell Spheroid Assay to Assess Invasion in a 3D Setting. Journal of Visualized Experiments. (105), e53409(2015).
  8. Cavaco, A. C. M., Eble, J. A. A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies. Journal of Visualized Experiments. (150), e60122(2019).
  9. Boye, K., et al. The role of CXCR3/LRP1 cross-talk in the invasion of primary brain tumors. Nature Communications. 8, 1571(2017).
  10. Dejeans, N., et al. Autocrine control of glioma cells adhesion and migration through IRE1alpha-mediated cleavage of SPARC mRNA. Journal of Cell Science. 125, 4278-4287 (2012).
  11. Golembieski, W. A., Ge, S., Nelson, K., Mikkelsen, T., Rempel, S. A. Increased SPARC expression promotes U87 glioblastoma invasion in vitro. International Journal of Developmental Neuroscience. 17, 463-472 (1999).
  12. Daubon, T., et al. Deciphering the complex role of thrombospondin-1 in glioblastoma development. Nature Communications. 10, 1146(2019).
  13. Friedl, P., Wolf, K. Tube travel: the role of proteases in individual and collective cancer cell invasion. Cancer Research. 68, 7247-7249 (2008).
  14. Das, A., Monteiro, M., Barai, A., Kumar, S., Sen, S. MMP proteolytic activity regulates cancer invasiveness by modulating integrins. Scientific Reports. 7, 14219(2017).
  15. Schaeffer, D., Somarelli, J. A., Hanna, G., Palmer, G. M., Garcia-Blanco, M. A. Cellular migration and invasion uncoupled: increased migration is not an inexorable consequence of epithelial-to-mesenchymal transition. Molecular and Cellular Biology. 34, 3486-3499 (2014).
  16. de Gooijer, M. C., Guillen Navarro, M., Bernards, R., Wurdinger, T., van Tellingen, O. An Experimenter's Guide to Glioblastoma Invasion Pathways. Trends in Molecular Medicine. 24, 763-780 (2018).
  17. Daubon, T., et al. The invasive proteome of glioblastoma revealed by laser-capture microdissection. Neuro-Oncology Advances. 1 (1), vdz029(2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Tr jwymiarowy model sferoid wtest inwazji glejakatworzenie sferoid w nowotworowychinwazja w macierzy kolagenowejkonfokalna mikroskopia w polu jasnymanaliza obraz w w programie Fijibarwienie na anhydraz w glanow IXmitochondrialny a cuch oddechowyproliferacja kom rek w warunkach hipoksjiekspresja macierzy pozakom rkowej

Powiązane artykuły