Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Retrowirusowa nadekspresja CXCR4 na mysich komórkach B-1A i transfer adoptywny w celu ukierunkowanej migracji komórek B-1A do szpiku kostnego i produkcji IgM

4.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61003

⸱

31 maja 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology, Immunology, Cancer Biology, University of Virginia, 2Cardiovascular Research Center, University of Virginia, 3Beirne B. Carter Center for Immunology Research, University of Virginia

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy metodę retrowirusowej nadekspresji i adoptywnego transferu mysich komórek B-1a w celu zbadania in vivo migracji i lokalizacji komórek B-1a. Protokół ten można rozszerzyć o różne dalsze testy funkcjonalne, w tym kwantyfikację lokalizacji komórek B-1a dawcy lub analizę czynników wydzielanych przez komórki dawcy po transferze adopcyjnym.

Streszczenie

Ponieważ na funkcję komórki wpływają specyficzne dla niszy czynniki w mikrośrodowisku komórkowym, metody analizy lokalizacji i migracji komórek mogą dostarczyć dalszych informacji na temat funkcji komórek. Komórki B-1a są unikalnym podzbiorem limfocytów B u myszy, które wytwarzają ochronne naturalne przeciwciała IgM przeciwko epitopom specyficznym dla utleniania, które powstają podczas zdrowia i choroby. Produkcja IgM komórek B-1a różni się w zależności od lokalizacji komórek B-1a, dlatego z terapeutycznego punktu widzenia przydatne staje się ukierunkowanie na lokalizację B-1a w niszach wspierających wysoką produkcję przeciwciał. W tym miejscu opisujemy metodę celowania w migrację komórek B-1a do szpiku kostnego poprzez nadekspresję receptora chemokiny 4 z motywem C-X-C za pośrednictwem retrowirusa (CXCR4). Indukcja genów w pierwotnych mysich komórkach B może być trudna i zazwyczaj daje niską skuteczność transfekcji wynoszącą 10-20%, w zależności od techniki. Tutaj pokazujemy, że transdukcja retrowirusowa pierwotnych mysich komórek B-1a powoduje 30-40% skuteczność transdukcji. Metoda ta wykorzystuje adoptywny transfer komórek transdukowanych komórek B-1a do myszy biorców z niedoborem komórek B, dzięki czemu można zobrazować migrację i lokalizację komórek B-1a dawcy. Protokół ten może być modyfikowany dla innych konstruktów retrowirusowych i może być stosowany w różnych testach funkcjonalnych transferu poadopcyjnego, w tym w analizie fenotypu i funkcji komórki dawcy lub komórki gospodarza lub analizie rozpuszczalnych czynników wydzielanych po transferze komórek B-1a. Zastosowanie odrębnych myszy dawców i biorców zróżnicowanych na podstawie allotypu CD45.1 i CD45.2 oraz obecności reportera GFP w plazmidzie retrowirusowym może również umożliwić wykrycie komórek dawcy w innych, immunologicznych modelach mysich zawierających endogenne populacje komórek B.

Wprowadzenie

Ostatnie badania wykazały znaczną niejednorodność fenotypową i funkcjonalną komórek odpornościowych, a w szczególności komórek B, w zależności od lokalizacji komórki1,2,3,4,5. Komórki B-1a są jedną z takich populacji o niejednorodnej zdolności do wytwarzania ochronnych przeciwciał IgM; Komórki B-1a szpiku kostnego wydzielają IgM konstytutywnie i znacząco przyczyniają się do miana IgM w osoczu6, podczas gdy komórki B-1a otrzewnej mają niski poziom wydzielania IgM w homeostazie i zamiast tego mogą być aktywowane przez wrodzony receptor toll-podobny (TLR) lub sygnalizację za pośrednictwem cytokin, aby szybko się namnażać, migrować i wydzielać IgM7,8,9,10. Przeciwciała IgM komórek B-1a rozpoznają epitopy specyficzne dla utleniania (OSE), które są obecne na patogenach, komórkach apoptotycznych i utlenionym LDL, a wiązanie IgM z OSE może zapobiegać sygnalizacji zapalnej w chorobach takich jak miażdżyca11. Dlatego strategie mające na celu zwiększenie produkcji IgM poprzez zwiększenie migracji komórek B-1a otrzewnej do miejsc takich jak szpik kostny mogą być przydatne terapeutycznie. Jednak ważne jest, aby takie strategie były ukierunkowane i specyficzne dla typu komórki, ponieważ efekty niezamierzone mogą negatywnie wpływać na funkcje odpornościowe lub zdrowie.

Tutaj opisujemy metodę celowej i długotrwałej nadekspresji CXCR4 w pierwotnych mysich komórkach B-1a, a następnie transferu adoptywnego w celu wizualizacji migracji komórek i funkcjonalnej produkcji przeciwciał IgM (Rysunek 1). Manipulacja genetyczna pierwotnych limfocytów B jest ograniczona przez niską skuteczność transfekcji w porównaniu z transfekcją przekształconych linii komórkowych. Ponieważ jednak transformowane linie komórkowe mogą znacznie odbiegać od komórek pierwotnych12,13, użycie komórek pierwotnych prawdopodobnie zapewni wyniki, które będą bardziej zgodne z normalną fizjologią. Opisano kilka technik transferu genów w pierwotnych mysich komórkach B, w tym transdukcję retrowirusową, transdukcję adenowirusową, lipofekcję lub transfekcję opartą na elektroporacji, które mają różne poziomy wydajności, przemijalności i wpływu na zdrowie komórek13,14,15. Poniższa metoda wykorzystywała transdukcję retrowirusową, ponieważ zapewniała odpowiednią wydajność transferu genów na poziomie >30%, przy minimalnym wpływie na żywotność komórek. Retrowirus wykazujący ekspresję CXCR4 został wygenerowany przy użyciu wcześniej opisanego retrowirusowego konstruktu wirusa mysich komórek macierzystych - wewnętrznego rybosomalnego miejsca wejścia - zielonego białka fluorescencyjnego (MSCV-IRES-GFP; MigR1)16, do którego podklonowano mysi gen CXCR44. Cząstki retrowirusowe MigR1 (kontrola(Ctl)-GFP) i CXCR4-GFP zostały wygenerowane przy użyciu transfekcji fosforanu wapnia, jak opisano we wcześniej opublikowanych protokołach4,14.

Pomyślnie transdukowane komórki B-1a zostały następnie dożylnie przeniesione do myszy Rag1-/- z niedoborem limfocytów. Zarówno myszy-dawca, jak i biorca zawierały dodatkowo nokaut genu apolipoproteiny E (ApoE), co powoduje zwiększoną akumulację OSE i miażdżycę, zapewniając w ten sposób model aktywacji komórek B-1 in vivo i produkcji IgM. Co więcej, myszy dawcy i biorcy różniły się allotypem CD45; Komórki dawcy B-1 pochodziły od myszy ApoE-/- CD45.1 + i zostały przeniesione do biorców Rag1 - /- CD45.2 + ApoE-/-. Pozwoliło to na różnicowanie limfocytów B CD45.2 dawcy od biorcy CD45.2 po transferze bez konieczności dodatkowego barwienia w poszukiwaniu markerów limfocytów B podczas analizy cytometrii przepływowej. Przedstawione tutaj wyniki pokazują, że ukierunkowana nadekspresja CXCR4 na komórkach B-1a wiąże się ze zwiększoną zdolnością komórek B-1a do migracji do szpiku kostnego, co wiąże się ze zwiększonym poziomem IgM anty-OSE w osoczu. Dodatkowo przedstawiamy metodę wzbogacania komórek B-1 otrzewnej poprzez selekcję negatywną i wykazujemy wymóg aktywacji komórek B-1 w celu efektywnej transdukcji. Metoda ta może być zaadaptowana do innych konstruktów retrowirusowych w celu zbadania wpływu nadekspresji białka na migrację, fenotyp lub funkcję komórek B-1a. Co więcej, zastosowanie rozróżnienia allotypów CD45.1 i CD45.2 może teoretycznie umożliwić transfer do innych immunologicznych modeli mysich zawierających endogenne limfocyty B.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie protokoły dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na Uniwersytecie Wirginii.

1. Magnetyczna separacja i wzbogacanie komórek B-1 otrzewnej

  1. Poddaj eutanazji 12-14-tygodniowego samca myszy CD45.1+ApoE-/- za pomocą CO2 .
  2. Wykonaj powierzchowne nacięcie w jamie brzusznej za pomocą prostych nożyczek chirurgicznych i złuszcz skórę za pomocą zakrzywionych nożyczek, aby odsłonić ścianę otrzewnej. Przepłukać jamę otrzewnową 10 ml pożywki RPMI-1640 o temperaturze 37 °C za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml i igły 25 G. Potrząśnij myszą, aby odłączyć komórki, chwytając ogon i dokładnie przesuwając mysz z boku na bok przez 15−20 s.
    UWAGA: Masowanie płukanej otrzewnej może również zmaksymalizować regenerację komórek.
  3. Zebrać płyn otrzewnowy za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml i igły 25 G, pobierając płyn w prawym dolnym rogu otrzewnej, tuż nad poziomem biodra, w pobliżu jelit. Unikaj zakłócania nabłonkowych magazynów tłuszczu i leżących pod nimi narządów. Należy unikać pobierania płynu z lewej strony myszy, ponieważ tłuszcz omentalny może być łatwo wciągnięty do strzykawki.
  4. Po zebraniu ~6-7 ml płynu dozuj do stożkowej probówki o pojemności 50 ml umieszczonej na lodzie. Następnie podnieś mysz pionowo, przytrzymując ścianę otrzewnej nad przeponą za pomocą kleszczy, tak aby pozostały płyn pozostał na dnie jamy otrzewnej. Wykonaj małe nacięcie w ścianie otrzewnej za pomocą nożyczek chirurgicznych nad wątrobą (uważaj, aby nie przeciąć wątroby) i zbierz pozostały płyn otrzewnowy za pomocą szklanej pipety i bańki.
  5. Zbierz komórki wypłukujące otrzewną ze wszystkich myszy CD45.1 + ApoE-/- (n = 15−20) w stożkowych probówkach o pojemności 50 ml i przechowuj na lodzie.
    UWAGA: Do obliczenia liczby potrzebnych myszy: Komórki B-1a stanowią 5-10% całkowitej populacji otrzewnej i dają około 2,5−5 x 105 komórek B-1a na mysz w rękach autorów. Wydajność transdukcji wynosi ~30−40%, jak pokazano poniżej.
  6. Policz żywe komórki za pomocą barwnika żywotności, takiego jak błękit trypanowy i hemocytometru (rozcieńczyć próbki w stosunku 1:5 w błękitu trypanowym i załadować 10 μl do komory hemocytometru). Pula komórek do 1 x 108 komórek na probówkę. Odwirować komórki przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, a następnie odessać supernatant.
  7. Zawiesić do 1 x 108 komórek w 1 ml przeciwciała anty-CD16 / CD32 (tabela materiałów) rozcieńczonego 1:50 w buforze testowym (1x sól fizjologiczna buforowana fosforanami [PBS], 0,5% albumina surowicy bydlęcej [BSA], 2 mM EDTA) w celu zablokowania receptorów Fc. Skaluj w razie potrzeby na podstawie liczby komórek. Inkubować na lodzie przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  8. Przygotować 2x główną mieszaninę biotynylowanych przeciwciał (Tabela 1) w buforze testowym w celu wyczerpania. 2x mieszanka główna odpowiada za objętość cieczy, w której komórki znajdują się już podczas inkubacji z anty-CD16/CD32. Na przykład, jeśli komórki inkubują się w 500 μl rozcieńczonego przeciwciała anty-CD16/CD32, dodaj 500 μl 2x głównej mieszanki zawierającej 10 μl biotynylowanych przeciwciał Ter119, Gr-1, CD23 i NK1.1 oraz 25 μl biotynylowanego przeciwciała F4/80, aby osiągnąć końcowe stężenia podane w tabeli 1. Dodać 2x master mix do komórek i bejcować przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
  9. Przemyć komórki 5 ml buforu do oznaczania i odwirować przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odessać supernatant.
  10. Zawiesić i inkubować komórki za pomocą mikrogranulek antybiotyny (tabela materiałów) rozcieńczonych w buforze testowym zgodnie ze stężeniem i protokołem zalecanym przez producenta.
  11. Przemyć 5 ml buforu do oznaczania i odwirować przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odessać supernatant i ponownie zawiesić maksymalnie 1 x 108 komórek w 500 μl buforu do oznaczania.
  12. Magnetyczne kolumny selekcyjne (tabela materiałów) należy zalać 3 ml buforu testowego. Przenieść komórki do zagruntowanych magnetycznych kolumn selekcyjnych i zebrać eluent zawierający wzbogacone komórki B-1 w stożkowej probówce o pojemności 15 ml na lodzie. Przemyć magnetyczną kolumnę selekcyjną dodatkowym buforem do oznaczania, aż całkowita zebrana objętość wyniesie 10 ml.
    UWAGA: Podwielokrotność wstępnie oczyszczonych i po oczyszczonych frakcji komórkowych powinna być oddzielnie analizowana za pomocą cytometrii przepływowej w celu uzyskania skuteczności oczyszczania przez barwienie komórek B CD19 +, makrofagów F480 + i limfocytów T CD5 +, jak pokazano na Rysunek 2.
  13. Policzyć frakcję komórkową po oczyszczeniu (eluent zawierający wzbogacone komórki B-1), licząc żywe komórki, jak w kroku 1.6, i ponownie zawiesić w stężeniu 1 x 106 komórek/ml w pożywce do hodowli komórek B (RPMI-1640, 10% inaktywowana termicznie płodowa surowica bydlęca [FBS], 10 mM HEPES, 1x aminokwasy endogenne, 1 mM pirogronian sodu, 50 μg/ml gentamycyny, 55 μM β-merkaptoetanolu).

2. Stymulacja komórek B-1 w otrzewnej

  1. Podziel komórki zbiorcze dla dwóch transdukowanych warunków (Ctl-GFP i CXCR4-GFP), jednocześnie odkładając na bok i posiewając co najmniej 10 x 106 komórek do kontroli bez transdukcji.
  2. Płytka do 150 μl (150 000 komórek) na dołek do 96-dołkowych płytek okrągłodennych.
  3. Dodaj 100 nM agonistycznego ODN1668 TLR9 do wszystkich studzienek, aby stymulować proliferację komórek.
  4. Inkubować przez 16−18 h w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .

3. Transdukcja retrowirusowa komórek B otrzewnowej

  1. Generuj cząstki retrowirusowe Ctl-GFP (MigR1) i CXCR4-GFP za pomocą transfekcji fosforanu wapnia, jak opisano w wcześniej opublikowanych protokołach14.
    UWAGA: Zajmie to kilka dni, dlatego przed rozpoczęciem tego protokołu należy przygotować i określić miano zapasów retrowirusowych oraz przechowywać podwielokrotności w temperaturze -80 °C.
  2. Rozmrozić zapasy retrowirusów na lodzie. Zużyć natychmiast i nie zamrażać ponownie, ponieważ miano wirusa znacznie się zmniejsza podczas cykli zamrażania i rozmrażania. Dodać supernatanty retrowirusowe Ctl-GFP lub CXCR4-GFP przy wielokrotności infekcji (MOI) 20:1 do komórek, w obecności 8 μg/ml polibrenu i świeżego β-merkaptoetanolu w końcowym stężeniu 55 μM. Nie należy dodawać szczepów wirusowych do komórek odłożonych do kontroli bez transdukcji.
  3. Przeprowadzić dezynfekcję, odwirowując płytki o sile 800 x g przez 90 minut w temperaturze pokojowej.
  4. Inkubować płytki z retrowirusem w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez dodatkowe 3 godziny.
  5. Zebrać i ponownie pokryć komórki na świeżym podłożu z komórek B i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez noc.

4. Sortowanie komórek transdukowanych komórek otrzewnowej B-1a

  1. Zbierz hodowane komórki i połącz je w trzech oddzielnych stożkowych probówkach o pojemności 50 ml dla każdego stanu: nietransdukowanego, transdukowanego Ctl-GFP i transdukowanego CXCR4-GFP.
  2. Policzyć żywe komórki jak w kroku 1.6, następnie odwirować przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i zassać supernatant.
  3. Zawieś komórki w ilości 100 000 komórek/μl w buforze sortującym (PBS + 1% BSA) zawierającym przeciwciało anty-CD16/CD32 w proporcji 1:50 (tabela materiałów) w celu zablokowania receptorów Fc. Inkubować na lodzie przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  4. Podwielokrotne komórki do kontroli kompensacji (~ 30 000 komórek na kontrolę kompensacyjną): dla kontroli niebarwionych i pojedynczych barwień podwielokrotność z próbki nietransdukowanej oraz dla kontroli pojedynczego barwienia GFP podwielokrotna z transdukowanych próbek.
    UWAGA: Dostępne na rynku koraliki kompensacyjne mogą być alternatywnie używane do kontroli pojedynczego barwienia, jeśli liczba komórek bez transdukcji jest niska.
  5. Przygotować 2x główną mieszaninę przeciwciał zawierającą przeciwciała sprzężone z fluoroforem w buforze sortującym (Tabela 1). Dodaj 2x master mix do próbek nietransdukowanych, transdukowanych CTL-GFP i CXCR4-GFP. Dodaj pojedyncze przeciwciała do kontroli pojedynczego barwienia. Inkubować przez 20 minut w temperaturze 4 °C w ciemności.
    UWAGA: 2x mieszanka główna uwzględnia objętość cieczy, w której komórki znajdują się już podczas inkubacji z anty-CD16/CD32, jak w kroku 1.8. Podwielokrotność komórek z każdego warunku może być oddzielnie barwiona dla CXCR4, aby potwierdzić nadekspresję CXCR4.
  6. Przemyć próbki 1 ml buforu sortującego i przecedzić przez filtry 70 μm do probówek polipropylenowych.
  7. Wirować przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i zasysać supernatant. Zawiesić próbki w ilości 50 000 komórek/μl w buforze sortującym.
  8. Przed sortowaniem komórek należy przygotować znakowane probówki do sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) zawierające 1 ml pożywki zbiorczej (RPMI-1640, 20% inaktywowany termicznie FBS, 10 mM HEPES, 1x aminokwasy endogenne, 1 mM pirogronianu sodu, 50 μg/ml gentamycyny, 55 μM β-merkaptoetanolu) dla każdej populacji, która ma być sortowana.
  9. Przed uruchomieniem próbek w sortowniku komórek dodać 2x DAPI (przygotowany jako rozcieńczenie 1:5000 w buforze sortującym) w celu rozróżnienia martwych komórek.
  10. Sortuj komórki GFP + B-1a do probówek FACS zawierających pożywkę zbiorczą jako komórki DAPI-CD19 + GFP + B220mid-lo CD23- IgM + CD5 + z próbek CTL-GFP i CXCR4-GFP. Użyj próbki nietransdukowanej, aby ustawić bramkę GFP+ i posortować nietransdukowane komórki B-1a DAPI- CD19+ GFP- B220mid-lo CD23- IgM+ CD5+.
    UWAGA: Alternatywnie, komórki nietransdukowane można również sortować z próbek CTL-GFP i CXCR4-GFP poprzez oddzielne bramkowanie komórek B-1a we frakcji GFP. Transdukowane lub nietransdukowane komórki B-1b można również sortować przy użyciu tej strategii sortowania jako komórki DAPI-CD19+ GFP+/- B220mid-lo CD23- IgM+ CD5-.

5. Przeniesienie adopcyjne

  1. Po posortowaniu komórek odwirować komórki o sile 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i ostrożnie odessać supernatant.
  2. Zawieś komórki w zimnym sterylnym 1x PBS przy 1,000 komórek/μL.
  3. Znieczulić samce myszy Rag1-/- ApoE-/- za pomocą izofluranu i wstrzyknąć 100 μl (100 000 komórek) na mysz poprzez dożylne wstrzyknięcie do żyły zaoczodołowej lub ogonowej za pomocą ultracienkiej strzykawki insulinowej. Wstrzyknij kilku myszom 1x PBS jako kontrolę.

6. Kwantyfikacja komórek dawcy i IgM osocza

  1. W pożądanym czasie po transferze adopcyjnym przeanalizuj przeniesione komórki u myszy biorców za pomocą zbioru szpiku kostnego i tkanki śledziony4 i cytometrii przepływowej. Określ ilościowo lokalizację komórek dawcy i nadekspresję CXCR4 poprzez barwienie CD45.1, CD45.2 i CXCR4 oraz przeanalizuj wyniki cytometrii przepływowej za pomocą oprogramowania takiego jak Flowjo.
    UWAGA: Patrz Tabela 1, aby zapoznać się z przeciwciałami stosowanymi na tym etapie. Upewnij się, że nie używasz koniugatu przeciwciała, który fluoryzuje w kanale FITC, ponieważ GFP będzie obecny na transdukowanych komórkach dawcy.
  2. Wyizolować osocze, dodając 10 μl 0,5 M EDTA do krwi pełnej pobranej przez nakłucie serca w momencie uśmiercania zwierząt. Odwirować krew pełną o stężeniu 7 000 x g i podwielokrotność osocza do oddzielnych probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml. Przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu przeprowadzenia analizy wydzielanych czynników, takich jak IgM, metodą ELISA4.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przegląd protokołu przedstawiono w Rysunek 1. Rysunek 2 wykazuje wzbogacenie komórek B-1a otrzewnej po magnetycznym usuwaniu innych typów komórek otrzewnych. Żywe pojedyncze komórki we frakcji po usunięciu zawierają większą proporcję komórek B CD19+ w porównaniu do F4/80+ makrofagi, brak CD5Witaj CD19- limfocyty T oraz zawierają zwiększoną częstotliwość CD19+ CD5środek Komórki B-1a w porównaniu do frakcji pr...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Przedstawiona tutaj metoda umożliwia stabilne i stosunkowo skuteczne dostarczanie pierwotnego genu komórkowego B-1a, transfer adoptywny in vivo oraz identyfikację i lokalizację wstrzykniętych komórek. Komórki były w stanie zostać wykryte 17 tygodni po transferze komórek i zachowały zwiększoną ekspresję CXCR4. Dostarczanie za pośrednictwem retrowirusa zapewniło 30-40% wydajność transdukcji pierwotnych mysich komórek B-1a przy minimalnym wpływie na żywotność komórek w naszych rękach (Figura 4e...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez 1R01 HL107490, 1R01 HL136098, Projekt 3 P01 HL055798, P01 HL136275-01 (C.A. McNamara) i R01GM100776 (T.P. Bender). A. Upadhye był wspierany przez American Heart Association Pre-doctoral fellowship 16PRE30300002 i 5T32AI007496-20. Dziękujemy Joanne Lannigan, Mike'owi Soldze i Claude'owi Chew z University of Virginia Flow Cytometry Core za ich doskonałą pomoc techniczną.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Nasadki filtrujące 70 mikronówFalcon352235
mikrokulki antybiotynoweMiltenyi Biotec130-090-485
anty-CD16/CD32 lub blok FcLife TechnologiesMFCR00
B220 APCeBioscience17-0452-83Klon: RA3-6B2
Beta-merkaptoetanolGibco21985-023
CD19 APCef780eBioscience47-0193-82Klon: eBio1D3
CD23 biotynaeBioscience13-0232-81Klon: B3B4
CD23 PECy7eBioscience25-0232-82Klon: B3B4
CD3e biotynaeBioscience13-0033-85Klon: eBio500A2
CD45.1 ApoE-/- myszyN/AN/AWyhodowane w domu
CD45.1 PerCP-Cy5.5BD Biosciences560580Klon: A20
CD45.2 BV421BD Biosciences562895Klon: 104
CD45.2 Rag1-/- ApoE-/- myszyN/A N/AWyhodowane w domu
CD5 PEeBioscience12-0051-83Klon: 53-7.3
Retrowirus Ctl-GFPN/AN/AWygenerowany w domu przy użyciu plazmidu retrowirusowego MigR1 z ekspresją GFP dostarczonego przez dr T.P. Bender
CXCR4 APCeBioscience17-9991-82Klon: 2B11
CXCR4-GFPretrowirus NIEDOTYCZY NIE DOTYCZY Wygenerowanyw domu przez klonowanie myszy CXCR4 do retrowirusowego plazmidu MigR1
F4/80 biotynyLife TechnologiesMF48015Klon: BM8
Flowjo Software v. 9.9.6Treestar Inc.Wymagana
GentamycynaGibco15710-064
Gr-1 biotynaeBioscience13-5931-82Klon: RB6-8C5
inaktywowana termicznie płodowa surowica bydlęcaGibco16000-044
HEPESGibco15630-080
IgM PECF594BD Biosciences562565Klon: R6-60.2
Strzykawki insulinoweBD Biosciences329461
IsofluraneHenry Schein Zdrowie zwierząt029405
Żywe/Martwe YellowLife TechnologiesL34968
Kolumny LSMiltenyi Biotec130-042-401
NK1.1 biotynaBD Biosciences553163Klon: PK136
Aminokwasy endogenneGibco11140-050
ODN 1668InvivoGentlrl-1668
PBSGibco14190-144
RPMI-1640Gibco11875-093
Pirogronian soduGibco11360-070
Ter119 biotynaeBioscience13-5921-82Klon: Ter119
licencja

Bibliografia

  1. Baumgarth, N. B-1 Cell Heterogeneity and the Regulation of Natural and Antigen-Induced IgM Production. Frontiers in Immunology. 7, 324(2016).
  2. Holodick, N. E., Vizconde, T., Rothstein, T. L. B-1a cell diversity: nontemplated addition in B-1a cell Ig is determined by progenitor population and developmental location. Journal of Immunology. 192 (5), 2432-2441 (2014).
  3. Prohaska, T. A., et al. Massively Parallel Sequencing of Peritoneal and Splenic B Cell Repertoires Highlights Unique Properties of B-1 Cell Antibodies. Journal of Immunology. 200 (5), 1702-1717 (2018).
  4. Upadhye, A., et al. Diversification and CXCR4-Dependent Establishment of the Bone Marrow B-1a Cell Pool Governs Atheroprotective IgM Production Linked to Human Coronary Atherosclerosis. Circulation Research. 125 (10), 55-70 (2019).
  5. Yang, Y., et al. Distinct mechanisms define murine B cell lineage immunoglobulin heavy chain (IgH) repertoires. Elife. 4, 09083(2015).
  6. Choi, Y. S., Dieter, J. A., Rothaeusler, K., Luo, Z., Baumgarth, N. B-1 cells in the bone marrow are a significant source of natural IgM. European Journal of immunology. 42 (1), 120-129 (2012).
  7. Holodick, N. E., Tumang, J. R., Rothstein, T. L. Immunoglobulin secretion by B1 cells: Differential intensity and IRF4-dependence of spontaneous IgM secretion by peritoneal and splenic B1 cells. European Journal of Immunology. 40 (11), 3007-3016 (2010).
  8. Moon, H., Lee, J. G., Shin, S. H., Kim, T. J. LPS-induced migration of peritoneal B-1 cells is associated with upregulation of CXCR4 and increased migratory sensitivity to CXCL12. Journal of Korean Medical Science. 27 (1), 27-35 (2012).
  9. Wang, H., et al. Expression of plasma cell alloantigen 1 defines layered development of B-1a B-cell subsets with distinct innate-like functions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (49), 20077-20082 (2012).
  10. Yang, Y., Tung, J. W., Ghosn, E. E., Herzenberg, L. A., Herzenberg, L. A. Division and differentiation of natural antibody-producing cells in mouse spleen. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (11), 4542-4546 (2007).
  11. Tsiantoulas, D., Gruber, S., Binder, C. J. B-1 cell immunoglobulin directed against oxidation-specific epitopes. Frontiers in Immunology. 3, 415(2012).
  12. Kaur, G., Dufour, J. M. Cell lines: Valuable tools or useless artifacts. Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).
  13. McMahon, S. B., Norvell, A., Levine, K. J., Monroe, J. G. Transient transfection of murine B lymphocyte blasts as a method for examining gene regulation in primary B cells. Journal of Immunological Methods. 179 (2), 251-259 (1995).
  14. Lin, K. I., Calame, K. Introduction of genes into primary murine splenic B cells using retrovirus vectors. Methods in Molecular Biology. 271, 139-148 (2004).
  15. Moghimi, B., Zolotukhin, I., Sack, B. K., Herzog, R. W., Cao, O. High Efficiency Ex Vivo Gene Transfer to Primary Murine B Cells Using Plasmid or Viral Vectors. Journal of Genetic Syndromes and Gene Therapy. 2 (103), 1000103(2011).
  16. DeKoter, R. P., Lee, H. J., Singh, H. PU.1 regulates expression of the interleukin-7 receptor in lymphoid progenitors. Immunity. 16 (2), 297-309 (2002).
  17. Holodick, N. E., Vizconde, T., Hopkins, T. J., Rothstein, T. L. Age-Related Decline in Natural IgM Function: Diversification and Selection of the B-1a Cell Pool with Age. The Journal of Immunology. 196 (10), 4348-4357 (2016).
  18. Laurie, K. L., et al. Cell-specific and efficient expression in mouse and human B cells by a novel hybrid immunoglobulin promoter in a lentiviral vector. Gene Therapy. 14 (23), 1623-1631 (2007).
  19. Warncke, M., et al. Efficient in vitro transduction of naive murine B cells with lentiviral vectors. Biochemical and Biophysical Research Communications. 318 (3), 673-679 (2004).
  20. Moon, B. G., Takaki, S., Miyake, K., Takatsu, K. The role of IL-5 for mature B-1 cells in homeostatic proliferation, cell survival, and Ig production. Journal of Immunology. 172 (10), 6020-6029 (2004).
  21. Takatsu, K., Kouro, T., Nagai, Y. Interleukin 5 in the link between the innate and acquired immune response. Advances in Immunology. 101, 191-236 (2009).
  22. Baumgarth, N. The double life of a B-1 cell: self-reactivity selects for protective effector functions. Nature Reviews Immunology. 11 (1), 34-46 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Ekspresja CXCR4adoptywny transfer komóreklokalizacja w szpiku kostnympobieranie płynu otrzewnowegomagnetyczna separacja komórekstymulacja agonistą TLR9detekcja allotypu CD45
Retrowirusowa nadekspresja CXCR4 na mysich komórkach B-1A i transfer adoptywny w celu ukierunkowanej migracji komórek B-1A do szpiku kostnego i produkcji IgM
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.