Badania przesiewowe na obecność fitoestrogenów przy użyciu komórkowego receptora estrogenowego β testu reporterowego

Summary

Zoptymalizowaliśmy dostępny na rynku test reporterowy receptora estrogenowego β do badania pokarmów dla naczelnych u ludzi i innych zwierząt pod kątem aktywności estrogenowej. Potwierdziliśmy ten test, pokazując, że znana estrogenna soja z ludzkiej żywności rejestruje się na wysokim poziomie, podczas gdy inne pokarmy nie wykazują żadnej aktywności.

Abstract

Rośliny są źródłem pożywienia dla wielu zwierząt i mogą produkować tysiące substancji chemicznych. Niektóre z tych związków wpływają na procesy fizjologiczne u kręgowców, które je spożywają, takie jak funkcje hormonalne. Fitoestrogeny, najlepiej przebadane fitochemikalia czynne endokrynologicznie, bezpośrednio oddziałują z osią podwzgórze-przysadka gonad układu hormonalnego kręgowców. W tym miejscu przedstawiamy nowatorskie zastosowanie testu komórkowego do badań przesiewowych ekstraktów roślinnych pod kątem obecności związków o estrogennej aktywności biologicznej. W teście tym wykorzystuje się komórki ssaków zmodyfikowane do wysokiej ekspresji receptora estrogenowego beta (ERβ) i które zostały transfekowane genem lucyferazy. Ekspozycja na związki o aktywności estrogenowej powoduje, że komórki wytwarzają światło. Ten test jest wiarygodnym i prostym sposobem testowania biologicznej aktywności estrogenowej. Ma kilka ulepszeń w stosunku do testów transfekcji przejściowej, w szczególności łatwość użycia, stabilność komórek i czułość testu.

Introduction

Rośliny są niezbędnym źródłem pożywienia dla wielu zwierząt, dostarczając kalorii i składników odżywczych niezbędnych do przetrwania, reprodukcji, wzrostu, rozwoju i zachowania¹. Rośliny wytwarzają tysiące substancji chemicznych, z których wiele jest adaptacją do własnego wzrostu, utrzymania stomatycznego i rozmnażania. Inne związki, uważane za roślinne metabolity wtórne (PSM), mają funkcje, które są mniej jasne, chociaż niektóre są toksyczne i prawdopodobnie używane jako obrona przed roślinożernością i pasożytnictwem (np. alkaloidy, garbniki)^2,3. Niektóre z tych substancji chemicznych mają zdolność wpływania na długoterminowe procesy fizjologiczne u zwierząt, takie jak funkcjonowanie układu hormonalnego, chociaż nadal nie jest jasne, dlaczego te aktywne hormonalnie fitochemikalia oddziałują z układem hormonalnym kręgowców^2,4.

Fitoestrogeny, najlepiej przebadane hormonalnie aktywne fitochemikalia, to polifenolowe PSM, które strukturalnie i funkcjonalnie naśladują estrogeny, bezpośrednio oddziałując z osią podwzgórzowo-przysadkową gonad układu hormonalnego kręgowców⁵. Spożywanie fitoestrogenów w diecie człowieka wiąże się z ochroną przed niektórymi nowotworami, chorobami serca i objawami menopauzy, chociaż inne skutki obejmują problemy z płodnością. W rzeczywistości fizjologiczne działanie tych związków zostało odkryte w latach czterdziestych XX wieku, kiedy niepłodność owiec przypisano ich wypasowi na bogatej w fitoestrogeny koniczynie (Trifolium subterrareum)⁶. Po spożyciu fitoestrogeny mogą przenikać do komórek i naśladować działanie estrogenu. Chociaż fitoestrogeny miały negatywny wpływ na płodność owiec, związek między fitoestrogenami a fizjologią nie jest prosty. Podobnie jak owce, nosorożec biały południowy wykazuje wrażliwość na związki estrogenowe w paszy pochodzącej z dużych ilości soi i lucerny. Córki samic karmionych tą dietą w czasie ciąży mają mniejsze szanse na rozmnażanie⁷. Jednak inne badania wykazały, że fitoestrogeny mogą mieć również pozytywne skutki, w tym dojrzewanie pęcherzyków jajnikowych u starszych myszy⁸, zapobieganie niektórym nowotworom, aktywność przeciwutleniająca i działanie antyproliferacyjne⁹.

Zakres działania fitoestrogenów nie jest zaskakujący, biorąc pod uwagę, że estrogeny wpływają na szeroki zakres funkcji biologicznych, w tym wzrost, rozwój i regulację układu rozrodczego i ośrodkowego układu nerwowego¹⁰. Chociaż istnieje wiele mechanizmów działania, fitoestrogeny często mają zdolność modyfikowania, wzmacniania lub zakłócania sygnalizacji estrogenowej poprzez ich zdolność do działania jako ligandy dla wewnątrzjądrowych receptorów estrogenowych alfa i beta (ERα i ERβ). Wiele fitoestrogenów ma fenolową strukturę pierścieniową podobną do estrogenów, która pozwala im wiązać receptory estrogenowe. Te z agonistyczną aktywnością estrogenową działają jak estrogen, tworząc aktywowany kompleks ligandu ER, który może dimeryzować i wiązać się z elementem odpowiedzi estrogenowej (ERE) i wyzwalać transkrypcję genu¹¹. W ten sposób estrogeny i fitoestrogeny regulują aktywność komórek i funkcje systemu poprzez swoje działanie jako czynniki transkrypcyjne.

Tutaj prezentujemy nowatorskie zastosowanie testu komórkowego do badania ekstraktów roślinnych pod kątem obecności związków o estrogennej aktywności biologicznej. W tym teście wykorzystuje komórki CHO jajnika chomika chińskiego zmodyfikowane do wysokiej ekspresji ERβ, które zostały transfekowane genem lucyferazy świetlika (Photinus pyralis) połączonym z promotorem ERE ¹². Kiedy związki estrogenowe są obecne, wiążą się z ER, dimeryzują i wiążą się z ERE, co prowadzi do transkrypcji genu lucyferazy. Po dodaniu roztworu substratu lucyferazy katalizuje reakcję prowadzącą do emisji fotonów. W związku z tym próbki dodatnie dają światło, a próbki ujemne nie.

Ten komercyjnie dostępny test eliminuje potrzebę transfekcji komórek ssaków przez laboratoria za pomocą genu reporterowego i receptora estrogenowego^13,14, który był niestabilny i miał zmienną skuteczność. Test zapewnia stabilną platformę transfekcyjną, która pozwala szybko i prosto określić, czy roślina ma aktywność estrogenową poprzez wiązanie receptora.

Testujemy hipotezę, że soja ma wyższą aktywność estrogenową niż wszystkie inne produkty spożywcze, biorąc pod uwagę znane stężenia estrogenowych izoflawonów¹⁵, używając żywności dla ludzi z lokalnych sklepów spożywczych.

Protocol

1. Przygotowanie materiałów roślinnych

1. Liofilizuj produkty roślinne, które zostały zebrane świeże za pomocą liofilizatora.
   1. Aby chronić próbki przed światłem, podczas procesu suszenia należy przykryć komory folią aluminiową.
   2. Aby upewnić się, że próbki są całkowicie suche, liofilizuj do momentu, gdy komory przestaną być zimne w dotyku, a materiały roślinne nie będą tracić masy podczas ważenia.
   3. Przechowuj suszone rośliny w sterylnych torebkach o niskiej zawartości pozostałości przy braku światła do czasu zmielenia.
2. Drobno zmielić próbki za pomocą młynka z sitkiem o oczkach 0,85 mm.
   1. Zmielone próbki należy przechowywać w workach przy braku światła, aż do ekstrakcji.

2. Ekstrakcja metabolitów wtórnych roślin

1. Aby wyekstrahować wtórne metabolity roślinne, należy użyć proporcji 1 g suchej próbki na 10 ml metanolu klasy HPLC.
   1. Zważyć próbkę na wadze analitycznej i dodać ją do kolby Erlenmeyera o odpowiedniej wielkości (125–250 ml). Następnie dodaj odpowiednią ilość metanolu. Zanotować masę wyekstrahowanej próbki.
   2. Przykryj roztwór roślinny metanolu folią aluminiową, a następnie ustaw tak, aby obracał się z prędkością 100 obr./min w temperaturze pokojowej (RT) przez 3 dni na wytrząsarce orbitalnej, pozwalając potencjalnie estrogennym związkom rozpuścić się w metanolu.
   3. Zdekantować supernatant do systemu filtracji kroplowej za pomocą bibuły filtracyjnej (125 mm).
   4. Za pomocą wyparki obrotowej suszyć ekstrakt roślinny aż do zagęszczenia, ale nadającego się do nalewania, w kolbie okrągłodennej o pojemności 300 ml. Wlać próbkę do kolby okrągłodennej o pojemności 50 ml, przepłukując dużą kolbę niewielką ilością metanolu. Kontynuować suszenie próbki w małej kolbie, aż metanol całkowicie odparuje.
   5. Zważyć pozostałość próbki za pomocą wagi analitycznej. Zapisać masę pozostałości.
   6. Ekstrakt roślinny rozpuścić w dimetylosulfotlenku (DMSO) w stężeniu 0,1 g ekstraktu na 2 ml DMSO. Wirować aż do homogenizacji.
   7. Roztwór ekstraktu roślinnego-DMSO należy przechowywać w temperaturze 4 °C w fiolkach ze szkła oranżowego do czasu przeprowadzenia testu.

UWAGA: Rośliny mogą wytwarzać nieznane biologicznie aktywne substancje chemiczne, a DMSO jest pojazdem, który może je transportować przez błony komórkowe. Podczas obchodzenia się z tymi próbkami należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej i zachować ostrożność.

3. Test transfekcji ludzkiego receptora estrogenowego β¹²

UWAGA: Technika aseptyczna i kaptur z przepływem laminarnym są wymagane w dniu 1 protokołu testu.

1. Przygotować rozcieńczenia 17β-estradiolu dla krzywej wzorcowej.
   1. Przenieś pożywkę do odzyskiwania komórek i złożoną pożywkę przesiewową (CSM) z zamrażarki i rozmroź w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
   2. Oznaczyć probówki do mikrowirówek Pośrednie 1 i 2 (INT1, INT2) oraz 1-8.
   3. Napełnij INT1 995 μl CSM, INT2 615 μl CSM, probówkę 1 900 μl CSM, a probówki 2-8 600 μl CSM. Odłóż rurkę 8 na bok.
   4. Przenieś 5 μl 100 μM 17β-estradiolu do INT1. Wyrzuć końcówkę. Wir.
   5. Przed każdym transferem przepłucz pipetę 3 razy, a następnie przenieś 10 μl z INT1 do INT2. Wyrzuć końcówkę.
   6. Przepłukać pipetę 3 razy, a następnie przenieść 100 μl z INT2 do probówki 1. Wyrzuć napiwek. Przenieść 300 μl z probówki 1 do probówki 2. Powtórz dla probówek od 3 do 7. Wyrzucić 300 μl z probówki 7 do pojemnika na odpady. Rurka 8 jest zerem i nie otrzymuje estradiolu. Końcowe stężenia platerowanych wzorców to: 400, 133,3, 44,44, 14,815, 4,938, 1,646, 0,5487 i 0 pM estradiolu.
2. Przygotować próbki związków.
   1. Próbki wirowe.
   2. Weź 4 μl każdej próbki rośliny w DMSO i dodaj do 496 μl CSM, aby uzyskać 0,8% roztwór DMSO.
3. Szybko rozmrozić komórki reporterowe.
   1. Pobrać probówkę z pożywką do odzyskiwania komórek z łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Zdezynfekuj powierzchnię zewnętrzną za pomocą 70% etanolu.
   2. Odzyskaj komórki reporterowe z magazynu w temperaturze -80 °C i rozmroź, przenosząc 10 ml wstępnie podgrzanego CRM do probówki z zamrożonymi komórkami.
   3. Zamknij probówkę Reporter Cells i przenieś do łaźni wodnej o temperaturze 37°C na 5-10 minut.
   4. Wyjmij probówkę z zawiesiną komórek reporterowych z łaźni wodnej. Kilkakrotnie delikatnie odwróć rurkę komórkową, aby rozbić agregaty komórek i wytworzyć jednorodną zawiesinę. Oczyść powierzchnię rurki 70% etanolem.
4. Posiewanie testowe
   1. Dozować 100 μl zawiesiny komórek reporterowych do każdej studzienki za pomocą pipety wielokanałowej.
   2. Dozować 100 μl próbek w trzech egzemplarzach do odpowiednich studzienek testowych.
   3. Przenieść płytkę do inkubatora o temperaturze 37 °C, nawilżonego 5% CO₂ na 22-24 godziny.
5. Rozmrozić substrat do wykrywania i bufor detekcyjny w ciemnej lodówce przez noc, aby przygotować się na Dzień 2.
6. Tuż przed zakończeniem inkubacji płytki wyjąć substrat detekcyjny i bufor detekcyjny z lodówki i umieścić w miejscu o słabym oświetleniu, aż do zrównoważenia do RT. Po osiągnięciu RT delikatnie odwróć każdą probówkę kilka razy, aby dokładnie wymieszać roztwory.
   1. Bezpośrednio przed zakończeniem inkubacji wlej całą zawartość buforu detekcyjnego do probówki z substratem detekcyjnym, aby utworzyć odczynnik do wykrywania lucyferazy. Delikatnie wymieszaj, aby nie wytworzyć piany.
   2. Po zakończeniu inkubacji odwrócić płytkę w celu wyrzucenia jej zawartości do odpowiedniego pojemnika na odpady. Delikatnie postukaj płytką o czysty, chłonny ręcznik papierowy, aby usunąć ostatnie kropelki z dołków.
   3. Dodaj 100 μl odczynnika do wykrywania lucyferazy do każdej studzienki. Pozostawić płytkę testową w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Nie potrząsaj talerzem.
7. Określ ilościowo luminescencję za pomocą 96-dołkowego luminometru do odczytu płytki.

Results

Dwadzieścia dwa ekstrakty z owoców i warzyw powszechnie występujących w diecie człowieka zostały przebadane pod kątem obecności związków estrogenowych. Badano różne produkty spożywcze, w tym rośliny strączkowe, takie jak soja, groszek śnieżny i groszek cukrowy, ponieważ groch siewny jest znanym źródłem fitoestrogenów¹⁶, a także figi, daktyle, kukurydza, marchew, jabłka, banany, truskawki, pomidory, jarmuż i kapusta. Związki zaburzające funkcjonowanie układu hormonalnego znajdują się w powszechnie ...

Discussion

Test reporterowy ERβ opracowany do indywidualnego badania przesiewowego środków farmaceutycznych nadaje się również do badań przesiewowych pokarmów roślinnych pod kątem fitoestrogenów biologicznie aktywnych przez ERβ. Ważne kwestie zawarte w protokole obejmują ostrożne traktowanie próbek roślin: świeży materiał roślinny musi być szybko wysuszony, aby zapobiec pleśnieniu lub innej degradacji biologicznej, i musi być trzymany z dala od światła, aby zapobiec fotolizie związków¹⁸. Protokół testu

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1000 &mikro; L pipeta
20 i mikro; L pipeta
200 &mikro; L pipeta
37 ° łaźnia
37 °, nawilżana 5% inkubator
70% etanolu
Waga
analityczna Kaptur z przepływem
Dimetylosulfotlenek
jednorazowy zbiornik na media, sterylny
system
Kolby			125 ml i 250 ml
metanol
Ludzki ER β Reporter Assay System, 1 x 96-dołkowy format testów	Indigo Biosciences	IB00411	Zestaw testowy - analizuje 24 próbki plus
liofilizator
wielokanałowa pipeta
wytrząsarka
luminometr
	rotacyjny Bioteck Synergy HTX
		okrągłodenne	50 ml i 300 ml
sterylne probówki do mikrowirówek lub sterylne wielokanałowe zbiorniki
sterylne końcówki			200 i mikro; L oraz 1000 &mikro; L
Worki
			Whatman klasy 1