Artykuł metodologiczny

Analiza cytometrii przepływowej podzbiorów komórek odpornościowych w mysiej śledzionie, szpiku kostnym, węzłach chłonnych i tkance maziowej w modelu choroby zwyrodnieniowej stawów

DOI:

10.3791/61008

⸱

24 kwietnia 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1Raymond Purves Bone and Joint Research Laboratory, Institute of Bone and Joint Research, Kolling Institute, Royal North Shore Hospital, University of Sydney, 2HTRG - Heidelberg Trauma Research Group, Center for Orthopedics, Trauma Surgery and Spinal Cord Injury, Trauma and Reconstructive Surgery, Heidelberg University Hospital, 3Department of Large Animal Clinical Sciences, College of Veterinary Medicine, Michigan State University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy szczegółowy i powtarzalny protokół cytometrii przepływowej do identyfikacji podzbiorów monocytów/makrofagów i limfocytów T za pomocą testów barwienia zarówno zewnątrzkomórkowego, jak i wewnątrzkomórkowego w obrębie śledziony myszy, szpiku kostnego, węzłów chłonnych i tkanki maziowej, wykorzystując sprawdzony model chirurgiczny mysiego zapalenia stawów.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Choroba zwyrodnieniowa stawów (OA) jest jedną z najbardziej rozpowszechnionych chorób układu mięśniowo-szkieletowego, dotykającą pacjentów cierpiących na ból i ograniczenia fizyczne. Najnowsze dowody wskazują na potencjalny składnik zapalny choroby, w którym zarówno limfocyty T, jak i monocyty/makrofagi mogą być potencjalnie związane z patogenezą choroby zwyrodnieniowej stawów. Dalsze badania postulowały ważną rolę podzbiorów obu linii komórek zapalnych, takich jak Th1, Th2, Th17 i limfocyty regulatorowe T, a także makrofagów M1, M2 i makrofagów rezydujących w tkance maziowej. Jednak interakcja między miejscową maziową i układową zapalną odpowiedzią komórkową a zmianami strukturalnymi w stawie jest nieznana. Aby w pełni zrozumieć, w jaki sposób limfocyty T i monocyty/makrofagi przyczyniają się do choroby zwyrodnieniowej stawów, ważne jest, aby móc ilościowo zidentyfikować te komórki i ich podzbiory jednocześnie w tkance maziowej, wtórnych narządach limfatycznych i ogólnoustrojowo (śledziona i szpik kostny). Obecnie różne podzbiory komórek zapalnych można zidentyfikować za pomocą kombinacji markerów powierzchni komórki, co sprawia, że wielokolorowa cytometria przepływowa jest potężną techniką badania tych procesów komórkowych. W tym protokole opisujemy szczegółowe kroki dotyczące pobierania tkanki maziowej i wtórnych narządów limfatycznych, a także wytwarzania zawiesin pojedynczych komórek. Ponadto przedstawiamy zarówno test barwienia zewnątrzkomórkowego w celu identyfikacji monocytów/makrofagów i ich podzbiorów, jak i test barwienia zewnątrz- i wewnątrzkomórkowego w celu identyfikacji limfocytów T i ich podzbiorów w śledzionie myszy, szpiku kostnym, węzłach chłonnych i tkance maziowej. Każdy etap tego protokołu został zoptymalizowany i przetestowany, w wyniku czego uzyskano wysoce powtarzalny test, który można wykorzystać w innych chirurgicznych i niechirurgicznych modelach myszy z chorobą zwyrodnieniową stawów.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Choroba zwyrodnieniowa stawów (OA) jest wyniszczającą i bolesną chorobą obejmującą różne patologie wszystkich tkanek związanych ze stawem1. Dotykając około 3,8% światowej populacji2, choroba zwyrodnieniowa stawów jest jedną z najbardziej rozpowszechnionych chorób układu mięśniowo-szkieletowego i do 2020 roku ma stać się czwartą najczęstszą przyczyną niepełnosprawności na świecie3. Pourazowa choroba zwyrodnieniowa stawów występuje po urazie stawu i stanowi co najmniej 12% wszystkich chorób zwyrodnieniowych stawów i do 25% choroby zwyrodnieniowej stawów podatnych, takich jak kolano4,5. Co więcej, uraz stawu zwiększa ryzyko choroby zwyrodnieniowej stawów o ponad pięciokrotne wydłużenie życia6. Nie wszystkie urazy z pozornie podobną niestabilnością rozwijają chorobę zwyrodnieniową stawów, dlatego zdefiniowanie czynników wpływających na długoterminowe ryzyko choroby zwyrodnieniowej stawów pozostaje wyzwaniem. Kluczowe znaczenie ma opracowanie skutecznych metod zapobiegania i/lub leczenia pourazowej choroby zwyrodnieniowej stawów, zbadanie i lepsze zdefiniowanie patologii, przyczyn i mechanizmów specyficznych dla urazu, które predysponują do choroby zwyrodnieniowej stawów1.

OA i definiujące go niszczenie chrząstki było wcześniej przypisywane wyłącznie obciążeniom mechanicznym, a zatem choroba zwyrodnieniowa stawów była uważana za chorobę niezapalną2. Jednak nowsze badania wykazały zapalny naciek błon maziowych i wzrost komórek zapalnych w tkance maziowej u pacjentów z chorobą zwyrodnieniową stawów w porównaniu ze zdrowymi osobami z grupy kontrolnej2, rzucając światło na komponent zapalny jako potencjalną siłę napędową choroby zwyrodnieniowej stawów. Dalsze badania wykazały, że nieprawidłowości zarówno w profilu limfocytów T CD4 +, jak i CD8 +, a także monocytów/makrofagów wrodzonego układu odpornościowego mogą przyczyniać się do patogenezy OA2,7. Szczegółowe badania tych nieprawidłowości ujawniły istotne role dla różnych podzbiorów limfocytów T2, takich jak Th18, Th29, Th178 i populacje regulatorowe T (Treg)10,11. Pomimo tych przekonujących dowodów, związek przyczynowy między zmianą odpowiedzi limfocytów T a rozwojem i progresją choroby zwyrodnieniowej stawów jest nadal nieznany2.

Oprócz specyficznych limfocytów T odgrywających rolę w chorobie zwyrodnieniowej stawów, ostatnie badania sugerują, że różnie spolaryzowane/aktywowane makrofagi mogą być związane z patogenezą OA12. W szczególności makrofagi pochodzące z monocytów krwi gromadzą się w błonie maziowej i polaryzują się na klasycznie aktywowane makrofagi (M1) lub alternatywnie aktywowane makrofagi (M2) podczas rozwoju choroby zwyrodnieniowej stawów, co sugeruje korelację między makrofagami pochodzącymi z monocytów a OA13. W przeciwieństwie do tego, niektóre podzbiory makrofagów zasiedlają narządy we wczesnym okresie rozwoju i samopodtrzymują swoją liczebność w materii niezależnej od monocytów14. Ostatnio wykazano funkcję ochronną stawów, w której pośredniczy bariera ścisłych połączeń, dla tych makrofagów rezydujących w tkance maziowej (STRM)14. Wyniki te wskazują, że nieprawidłowości w poszczególnych podzbiorach makrofagów mogą odgrywać kluczową rolę w rozwoju choroby zwyrodnieniowej stawów. Jednak interakcje między tą zapalną odpowiedzią komórkową a zmianami strukturalnymi w stawie po urazie są nieznane.

Historycznie rzecz biorąc, analiza komórek odpornościowych w tkance maziowej była ograniczona do immunohistochemii (IHC) lub ekspresji mRNA metodą reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją (RT-PCR)15,16. Jednak zarówno IHC, jak i RT-PCR nie mają możliwości jednoczesnej identyfikacji wielu różnych typów komórek i ich podzbiorów, co ogranicza możliwość zastosowania tych metod. Co więcej, IHC ogranicza się do analizy małych próbek tkanek i może pomijać ogniskowe nagromadzenie komórek zapalnych. W ciągu ostatnich kilku lat opracowano niezliczoną ilość markerów powierzchniowych dla różnych typów komórek, a podzbiory komórek odpornościowych można teraz niezawodnie zidentyfikować za pomocą różnych kombinacji tych markerów. Dzięki stałemu postępowi technicznemu cytometry przepływowe są obecnie w stanie identyfikować wiele różnych fluorochromów jednocześnie, umożliwiając analizę dużych, wielokolorowych paneli przeciwciał.

Cytometria przepływowa dostarcza badaczom potężnej techniki, która pozwala na jednoczesną identyfikację i kwantyfikację wielu komórek odpornościowych i ich podzbiorów na poziomie pojedynczej komórki. Opracowaliśmy i zoptymalizowaliśmy zarówno test barwienia zewnątrzkomórkowego w celu identyfikacji monocytów/makrofagów i ich podzbiorów, jak i test barwienia zewnątrz/wewnątrzkomórkowego w celu identyfikacji limfocytów T i ich podzbiorów w śledzionie myszy, szpiku kostnym, węzłach chłonnych i tkance maziowej. Każdy etap tego protokołu został zoptymalizowany i przetestowany, co zaowocowało wysoce powtarzalnym testem, który można wykorzystać w innych chirurgicznych i niechirurgicznych modelach myszy z chorobą zwyrodnieniową stawów17.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komisja ds. Etyki Zwierząt Lokalnego Okręgu Zdrowia w Północnym Sydney zatwierdziła wszystkie procedury wymienione w tym protokole. Myszy są trzymane i pielęgnowane zgodnie z Przewodnikiem opieki i wykorzystywania zwierząt laboratoryjnych (National Health and Medical Research Council of Australia, zaktualizowana w 2010 r.). We wszystkich eksperymentach wykorzystano 10-12-tygodniowe samce myszy C57BL/6.

UWAGA: Aby wywołać pourazową chorobę zwyrodnieniową stawów, przeprowadzono chirurgiczną destabilizację łąkotki przyśrodkowej (DMM) w prawym stawie kolanowym. Szczegółowe informacje na temat tego modelu zwierzęcego zostały opublikowane przez Glasson et al.18. Krótko mówiąc, znieczulenie ogólne jest wywoływane w komorze indukcyjnej za pomocą izofluranu, a następnie utrzymywane za pomocą stożka nosowego. Noga chirurgiczna jest golona żyletką, a miejsce operacji jest myte i przecierane etanolem, aby zminimalizować zanieczyszczenie. Zwierzę jest następnie przenoszone do mikroskopu operacyjnego i umieszczane na sterylnym ręczniku, a noga owijana sterylną papierową serwetą w celu odizolowania miejsca operacji i zminimalizowania zanieczyszczenia. Za pomocą mikroskopu wykonuje się artrotomię przyśrodkową przyśrodkową przyrzepki o długości 0,5 cm, rzepka zwichnęła się bocznie, a poduszeczka tłuszczowa infra-rzepka uniesiona w celu odsłonięcia przyśrodkowego więzadła łąkotkowo-piszczelowego, które jest przecięte kleszczami preparacyjnymi. Staw przepłukuje się sterylnym roztworem soli fizjologicznej w celu usunięcia krwi, a ranę zamyka się w trzech warstwach – torebki stawowej, tkanki podskórnej (przy użyciu materiału do szycia) i skóry (przy użyciu kleju do tkanek chirurgicznych). Metody opisane w tym protokole mogą być jednak stosowane do innych modeli i metod wywoływania choroby zwyrodnieniowej stawów. Choroba zwyrodnieniowa stawów może być wywołana po obu stronach zwierzęcia, a podczas pobierania tkanek ważne jest pobranie ipsilateralnych (drenujących) węzłów chłonnych.

1. Izolacja śledziony, przeciwległego szpiku kostnego, ipsilateralnych węzłów chłonnych drenujących kolano i tkankę maziową

  1. Poddaj mysz eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy. Umieść mysz w pozycji leżącej pod mikroskopem preparacyjnym i przetrzyj klatkę piersiową, brzuch i nogi 70% etanolem. Ostrożnie otwórz skórę na linii środkowej na całej długości brzucha za pomocą prostych nożyczek, pozostawiając nienaruszoną jamę brzuszną.
  2. Delikatnie odciągnij skórę po prawej stronie zwierzęcia od leżącego poniżej mięśnia, pozostawiając podskórną tkankę tłuszczową przyczepioną do skóry. Zwykle sama delikatna trakcja oddziela skórę i leżącą pod nią tkankę tłuszczową od mięśni. Sporadyczne zrosty należy przecinać cienkimi nożyczkami, aby ograniczyć do minimum napięcie niezbędne do oddzielenia tkanek i zmniejszyć ryzyko uszkodzenia węzłów chłonnych. Zidentyfikuj skrzyżowanie trzech naczyń, delikatnie usuwając tkankę tłuszczową znajdującą się przy udzie za pomocą dwóch zakrzywionych cienkich kleszczyków. Pachwinowy węzeł chłonny znajduje się na skrzyżowaniu i można go rozpoznać po jajowatym kształcie i nieco ciemniejszym kolorze.
  3. Usuń pachwinowy węzeł chłonny za pomocą cienkich kleszczy preparacyjnych. Należy uważać, aby nie rozerwać kapsułki. Usuń pozostały tłuszcz z powierzchni węzła chłonnego za pomocą kleszczy.
  4. Otwórz jamę brzuszną i zidentyfikuj śledzionę. Wytnij śledzionę cienkimi nożyczkami. Delikatnie odciągnij jelita na bok, aby odsłonić aortę i jej rozwidlenie, uważając, aby ich nie uszkodzić, aby zminimalizować ryzyko zanieczyszczenia. Węzeł chłonny biodrowy znajduje się w końcowym segmencie aorty brzusznej i początku tętnicy biodrowej wspólnej. Usunąć prawy węzeł chłonny biodrowy i postępować zgodnie z opisem w 1.3.
  5. Delikatnie usuń skórę z obu kończyn tylnych. Wypreparuj lewą kość udową, oczyszczając ją z tkanki mięśniowej za pomocą ostrza i drobnych nożyczek. Ostrożnie odłącz kolano i staw biodrowy, pozostawiając całą kość nienaruszoną i usuń kość udową.
  6. Zidentyfikuj ścięgno rzepki prawego stawu kolanowego, a następnie usuń przylegającą tkankę mięśniową proksymalnie do niej za pomocą cienkich nożyczek, aż odsłonięte zostanie około 5 mm ścięgna mięśnia czworogłowego bliższego rzepki. Następnie przetnij ścięgno mięśnia czworogłowego uda około 3-4 mm proksymalnie do rzepki, aby utworzyć uchwyt i za pomocą cienkich kleszczy delikatnie odciągnij je od stawu. Spowoduje to, że krawędzie przyczepu torebki stawowej do kości udowej będą widoczne i za pomocą ostrza skalpela ostrożnie przeciąć wzdłuż krawędzi torebki stawowej po obu stronach, zaczynając od kości udowej w kierunku kości piszczelowej, aby zmaksymalizować ilość błony maziowej, która jest pobierana. Podczas cięcia ważne jest, aby utrzymać delikatną przyczepność ścięgna mięśnia czworogłowego uda i zrobić przerwę, gdy blok tkanki maziowej jest przyczepiony tylko do kości piszczelowej. Na tym etapie dostawowa poduszeczka tłuszczowa jest teraz wyraźnie widoczna dystalnie w stosunku do rzepki i może być delikatnie odłączona od stawu i przedniej części łąkotki za pomocą ostrza. Następnie przeciąć pozostałą część torebki stawowej (część piszczelowa), aby usunąć blok tkanki maziowej.
    UWAGA: Ten krok należy wykonać bardzo precyzyjnie, aby uzyskać wiarygodne wyniki. Po zakończeniu preparacji "blok tkanki maziowej" powinien składać się z rzepki, ścięgna rzepki, poduszeczki tłuszczowej podrzepkowej, błony maziowej zachyłka nadrzepki i podrzepki oraz związanej z nią torebki stawowej przed więzadłami pobocznymi. Utrzymuj wszystkie tkanki wilgotne podczas sekcji, używając 0,9% roztworu soli fizjologicznej.
    UWAGA: Umieść każdą próbkę bloku tkanki maziowej w oddzielnym dołku znakowanej 24-dołkowej płytki zawierającej 1,5 ml pożywki RPMI 1640. Połącz zarówno biodrowy, jak i pachwinowy węzeł chłonny w jednej studzience i zbierz tkanki od dwóch myszy.

2. Generowanie zawiesin pojedynczych komórek z każdej tkanki

UWAGA: Aby zapewnić wystarczającą liczbę komórek do analizy przepływu, tkanki maziowe dwóch myszy muszą zostać połączone. W obecnym protokole połącz wszystkie tkanki tych samych dwóch myszy, aby zachować analogię. Ponadto węzły chłonne biodrowe i pachwinowe połączono dla każdego zwierzęcia, co dało w sumie 4 węzły chłonne dla każdej próbki. Ogólnie rzecz biorąc, liczba komórek w śledzionie, szpiku kostnym i węzłach chłonnych jednego zwierzęcia jest wystarczająca do przeprowadzenia analizy przepływu i można zastosować protokół. Jednak w przypadku stosowania tkanek pochodzących tylko od jednego zwierzęcia może być konieczne dostosowanie czasu lizy.

  1. Śledziona
    1. Umieść dwie połączone śledziony na sitku do komórek o wielkości 70 μm na probówce o pojemności 15 ml. Delikatnie przetrzeć śledzionę przez filtr siatkowy za pomocą sterylnego tłoka strzykawki o pojemności 3 ml. Często przepłukuj sitko łącznie 6 ml pożywki RPMI 1640 uzupełnionej 10% FBS.
    2. Zawiruj komórki (500 x g, 5 min, RT) i ponownie zawieś osad w 5 ml buforu do lizy krwinek czerwonych (RBC). Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej i zatrzymać reakcję przez rozcieńczenie buforu do lizy w 10 ml PBS. Zakręć komórkami (500 x g, 5 min, RT) i powtórz ten krok raz lub do momentu, gdy w granulce nie będzie już żadnych erytrocytów.
      UWAGA: Przefiltruj zawiesinę za pomocą sitka komórkowego 30 μm do nowej probówki o pojemności 15 ml między dwiema rundami lizy w celu usunięcia skoagulowanych komórek.
    3. Po zakończeniu lizy odwirować komórki (500 x g, 5 min, RT), odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml PBS. Policz liczbę żywych komórek na hemocytometrze przy użyciu wykluczenia błękitu trypana.
  2. Węzły chłonne
    1. Umieść cztery połączone węzły chłonne na sitku do komórek o wielkości 70 μm na probówce o pojemności 15 ml. Delikatnie rozdzielić węzły chłonne w zawiesinę jednokomórkową, naciskając sterylnym tłokiem strzykawki o pojemności 3 ml. Często przepłukuj sitko łącznie 6 ml RPMI z 10% FBS.
    2. Odwirować komórki (500 x g, 5 min, RT), odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 500 μl PBS. Przefiltruj zawiesinę za pomocą sitka o wielkości 30 μm do nowej probówki o pojemności 15 ml w celu usunięcia zakrzepłych komórek. Policz liczbę żywych komórek na hemocytometrze przy użyciu wykluczenia błękitu trypana.
  3. Szpik kostny
    1. Ostrożnie chwyć nienaruszoną kość udową za pomocą kleszczy tkankowych do kciuków, nie łamiąc jej. Odetnij sam koniec bliższej części kości udowej ostrymi nożycami, aby ułatwić zaczerwienienie kości. Obrócić kość udową i umieścić igłę 23 G na środku wcięcia międzykłykciowego kości udowej. Delikatnie dociskając, obróć igłę między kciukiem a palcem wskazującym, aby wywiercić otwór w wcięciu międzykłykciowym, aby wejść do jamy kostnej.
      UWAGA: Czasami cząstki kości mogą zatkać igłę po wywierceniu otworu, aby uniknąć niepotrzebnego wysokiego ciśnienia podczas płukania, zaleca się zmianę igły przed płukaniem.
    2. Przepłukać kość 6 ml RPMI z 10% FBS (lub do momentu, gdy płukanie zmieni kolor na biały) za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml z igłą 23 G na sitku do komórek o pojemności 70 μm, które umieszcza się na probówce o pojemności 15 ml. Delikatnie przecisnąć szpik kostny przez sitko komórkowe za pomocą tłoka strzykawki o pojemności 3 ml i przepłukać sitko kolejnymi 3 ml RPMI.
      UWAGA: Kości powinny wydawać się białe, gdy cały szpik zostanie całkowicie wypłukany.
    3. Zakręć komórki (500 x g, 5 min, RT) i ponownie zawieś osad w 5 ml buforu do lizy RBC. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej i zatrzymać reakcję przez rozcieńczenie buforu do lizy w 10 ml PBS.
    4. Odwirować komórki (500 x g, 5 min, RT), odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml PBS. Przefiltruj zawiesinę za pomocą sitka o wielkości 30 μm do nowej probówki o pojemności 15 ml w celu usunięcia zakrzepłych komórek. Policz liczbę żywych komórek na hemocytometrze przy użyciu wykluczenia błękitu trypana.
  4. Tkanka maziowa
    1. Pokrój w kostkę dwa bloki tkanki maziowej na drobne kawałki za pomocą cienkich nożyczek chirurgicznych. Przenieść próbki z pożywką do probówki o pojemności 15 ml. Przepłucz starą studzienkę dodatkowym 0,5 ml RPMI, aby uzyskać pozostałe komórki i tkanki maziowe, przenieś do probówki sokoła (końcowa objętość 2 ml).
      WSKAZÓWKA: Użyj pipety transferowej i naciąć końcówkę w miejscu, w którym średnica się rozszerza na tym etapie.
    2. Enzym i podwielokrotność należy rozpuścić zgodnie z instrukcjami producenta (np. Liberase). Dodaj wystarczającą ilość enzymu, aby uzyskać końcowe stężenie 1 jednostki/ml (łącznie 2 jednostki na próbkę). Roztrawić w temperaturze 37 °C przez 2 godziny za pomocą rotatora MACS.
    3. Zatrzymaj trawienie, dodając 8 ml RPMI z 10% FBS i przefiltruj zawiesinę komórek przez sitko komórkowe 70 μm do nowej probówki o pojemności 15 ml. Przepłucz starą probówkę o pojemności 15 ml kolejnym 5 ml RPMI z 10% pożywką FCS i zawiesiną komórek filtrujących przez ten sam sitko do komórek do nowej probówki (15 ml końcowej objętości).
    4. Odwirować komórki (500 x g, 10 min, RT), odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 500 μl PBS. Policz liczbę żywych komórek na hemocytometrze przy użyciu wykluczenia błękitu trypana.

3. Przydzielanie komórek

  1. Oznacz dwie 96-dołkowe płytki (kształt dna w kształcie litery U) rodzajem tkanki, identyfikatorem zwierzęcia i wyznaczonym panelem przeciwciał. W tym protokole stosuje się łącznie dwa panele przeciwciał: panel podzbioru monocytów (barwienie zewnątrzkomórkowe) i panel podzbioru komórek T (barwienie zewnątrzkomórkowe i wewnątrzkomórkowe).
  2. Dostarczyć 5 x 105 komórek na studzienkę, używając odpowiednich zawiesin jednokomórkowych.
    UWAGA: Podczas przygotowywania eksperymentu należy ocenić bezwzględną liczbę komórek, która jest oczekiwana dla każdej grupy i typu tkanki (zwierzęta poddane działaniu środka mają wyższą liczbę komórek w tkankach niż zwierzęta kontrolne). Podczas ponownego zawieszania osadu komórkowego na ostatnim etapie wytwarzania zawiesin pojedynczych komórek należy dobrać odpowiednią ilość PBS, aby uzyskać stężenie 5 x 105 na 200 μL. Zastosowana tutaj płytka 96-dołkowa może pomieścić maksymalnie 300 μl, a zazwyczaj 200 μl jest idealne, aby zminimalizować ryzyko zanieczyszczenia krzyżowego z powodu rozlania.
  3. Dla każdego panelu i typu tkanki rozmieścić co najmniej 5 x 105 komórek jako niebarwione kontrole w studzienkach, które zostały wyraźnie oznaczone.

4. Panel podzbioru monocytów

  1. Wykonać barwienie żywotności: Zawiruj komórki (500 x g, 5 min, 4 °C) za pomocą wirówki do płytek i umyj komórki raz 200 μl 1x PBS. Przygotować roztwór podstawowy barwnika niewrażliwego na obecność amin (barwienie żywotności) rozcieńczonego w stosunku 1:50 w 1x PBS. Następnie ponownie zawiesić granulki komórkowe ze 100 μl tego roztworu podstawowego, co daje bezwzględną objętość 2 μl barwie żywotności na studzienkę. Inkubować przez 15 minut w temperaturze 4 °C, chronić przed światłem.
    UWAGA: Optymalna ilość potrzebnego barwnika żywotności powinna być określona poprzez wykonanie krzywej miareczkowania dawki. Ponadto rozcieńczony roztwór podstawowy do barwienia żywotności należy zużyć w ciągu jednego dnia i nie należy go przechowywać. Zapoznaj się z instrukcjami producenta, aby uzyskać więcej informacji na temat odtwarzania, rozcieńczania i przechowywania plamy żywotności.
  2. Podczas inkubacji należy przygotować koktajl przeciwciał w odpowiedniej objętości buforu FACS (PBS wolny od Ca2+ i Mg+ zawierający 0,1% BSA i 0,02% azydku sodu). Przepłukać komórki dwukrotnie 200 μl buforu FACS, odwirować (500 x g, 5 min, 4 °C) i ponownie zawiesić każdą osadkę 100 μl mieszaniny przeciwciał lub odpowiedniej mieszaniny kontrolnej. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 °C, chronić przed światłem.
    UWAGA: Należy pamiętać, że azydek sodu jest toksyczny dla komórek. W obecnym protokole stężenie azydku sodu w buforze przepływowym jest bardzo niskie (0,02%), a próbki są badane natychmiast po barwieniu, dzięki czemu nie powodują żadnych problemów. Jeśli planowane są dalsze testy funkcjonalne posortowanych komórek, korzystne może być tworzenie nowego buforu FACS każdego dnia eksperymentów i niestosowanie azydku sodu. W przypadku stosowania wielu przeciwciał zaleca się dodanie odpowiedniej ilości "Brilliant Stain Buffer" do koktajlu przeciwciał w celu poprawy wyników.
  3. Przemyć komórki dwukrotnie 200 μl buforu FACS i ponownie zawiesić komórki w 250 μl buforu FACS + EDTA (bufor FACS zawierający 1 mM EDTA). Przenieś próbki do oznakowanych probówek FACS. Próbki należy przechowywać w temperaturze 4 °C i chronić przed światłem do momentu ich pobrania.
    UWAGA: Komórki odpornościowe mają tendencję do lepkości. W celu zminimalizowania zarówno ryzyka zatoru, jak i liczby dubletów, zaleca się dodanie 1 mM EDTA do końcowego bufora przepływu.

5. Panel podzbioru komórek T

  1. Wykonać barwienie żywotności: Zawiruj komórki (500 x g, 5 min, 4 °C) za pomocą wirówki do płytek i umyj komórki raz 200 μl 1x PBS. Przygotować roztwór podstawowy barwnika niewrażliwego na obecność amin (barwienie żywotności) rozcieńczonego w stosunku 1:50 w 1x PBS. Następnie ponownie zawiesić granulki komórkowe ze 100 μl tego roztworu podstawowego, co daje bezwzględną objętość 2 μl barwie żywotności na studzienkę. Inkubować przez 15 minut w temperaturze 4 °C, chroniąc przed światłem.
  2. Podczas inkubacji próbek należy przygotować zewnątrzkomórkowy koktajl przeciwciał barwiących w odpowiedniej objętości 1x buforu FACS. Przemyć komórki dwukrotnie 200 μl 1x buforu FACS, odwirować je (500 x g, 5 min, 4 °C) i ponownie zawiesić każdą osadkę ze 100 μl mieszaniny przeciwciał lub odpowiedniej mieszaniny kontrolnej. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 °C, chroniąc przed światłem.
  3. Barwienie wewnątrzkomórkowe należy wykonać za pomocą zestawu do utrwalania i przepuszczalności, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Przemyć komórki dwukrotnie 200 μl 1x buforu FACS i ponownie zawiesić w 200 μl buforu utrwalającego. Inkubować przez 40 minut w temperaturze 4 °C, chronić przed światłem.
  4. Podczas inkubacji należy przygotować koktajl przeciwciał (barwienie wewnątrzkomórkowe) w odpowiedniej objętości 1x permeabilizacji i przepłukać bufor. Zebrać komórki przez wirowanie (750 x g, 5 min, 4 °C) i dwukrotnie przemyć komórki 200 μL 1x buforu do trwałej ondulacji/płukania.
    UWAGA: Utrwalanie i przepuszczalność powoduje powstawanie komórek, które są nieco trudniejsze do prawidłowego granulowania. W celu zminimalizowania utraty komórek podczas kolejnych etapów mycia należy zwiększyć siłę odśrodkową do 750 x g. Alternatywnie można również zastosować dłuższy cykl wirowania. Skutkowałoby to jednak znacznie dłuższym czasem potrzebnym na przygotowanie komórek.
  5. Odwirować komórki (750 x g, 5 min, 4 °C) i ponownie zawiesić każdą osadkę ze 100 μl mieszaniny przeciwciał lub odpowiedniej mieszaniny kontrolnej. Inkubować przez 40 minut w temperaturze 4 °C, chronić przed światłem.
  6. Przemyć komórki dwukrotnie 200 μl 1x buforu do trwałej ondulacji/płukania i ponownie zawiesić komórki w 250 μl buforu FACS + EDTA. Przenieś próbki do oznakowanych probówek FACS. Próbki należy przechowywać w temperaturze 4 °C i chronić przed światłem do momentu ich pobrania.
    UWAGA: Dla każdego przeciwciała należy określić optymalne stężenie, wykonując krzywą miareczkowania dawki. Stężenie między przeciwciałami może się drastycznie różnić: CD3 i CD80 stosowano ze współczynnikiem rozcieńczenia 1:1, podczas gdy CD11b i CD4 stosowano ze współczynnikiem rozcieńczenia 1:6400. Podczas miareczkowania stężenia przeciwciał należy użyć tej samej liczby komórek, która zostanie użyta podczas eksperymentów.

6. Kompensacja, odpowiednie sterowanie i bramkowanie

  1. Konfigurowanie eksperymentu
    1. Po ustaleniu optymalnego stężenia przeciwciał należy przeprowadzić niebarwione i pojedynczo barwione kontrole w celu kompensacji, aby dostosować się do nakładania się widma.
      UWAGA: Uruchom wszystkie kontrolki kompensacji zarówno z komórkami, jak i koralikami kompensacyjnymi. Do rekompensaty należy wykorzystać to, co generuje najjaśniejsze wyniki (najwyższy MFI pozytywnych zdarzeń). MFI oznacza średnią intensywność fluorescencji i jest często używany do opisania i zdefiniowania średniej intensywności generowanego sygnału, a tym samym poziomu ekspresji przeciwciał.
    2. Uruchom kontrole fluorescencji minus jeden (FMO) i kontrole izotypu podczas rozpoczynania nowego eksperymentu wielokolorowego. Więcej szczegółów na temat FMO zostało wcześniej opublikowanych19.
    3. Określ optymalne napięcie obszaru rozproszenia do przodu (FSC-A) i napięcia obszaru rozproszenia bocznego (SSC-A) w celu wykrycia populacji leukocytów w niebarwionych kontrolach każdego typu tkanki.
      UWAGA: Proces utrwalania i przepuszczalności zmienia wymiary komórki. W związku z tym napięcia FSC-A i SSC-A dla panelu podzbioru monocytów i panelu podzbiorów komórek T znacznie się różnią. Aby znaleźć optymalne napięcia dla panelu podzbiorów limfocytów T, należy użyć komórek, które zostały pojedynczo wybarwione CD3 i tylną bramką w kierunku populacji leukocytów, jednocześnie dostosowując wartości FSC-A i SSC-A.
  2. Strategia bramkowania
    1. Po określeniu optymalnego napięcia FSC-A i SSC-A należy ustawić bramkę pierwotną w populacji leukocytów.
      UWAGA: Przed każdym eksperymentem skalibruj cytometr za pomocą kulek kalibracyjnych zgodnie z instrukcjami producenta i uruchom niezabarwione kulki. Populacje leukocytów o różnych punktach czasowych powinny mieć porównywalne właściwości FSC i SSC (oczekiwane są niewielkie różnice między typami tkanek i są one normalne). Jeśli FSC i SSC znacznie się różnią, rozwiąż problemy z cytometrem i generowaniem próbki.
    2. Wyklucz dublety: Wykres FSC-A (oś y) i FSC-H (oś x). Podkoszulki pojawiają się jako przekątna tej działki. Bramka na podkoszulkach.
    3. Wyklucz martwą komórkę: Wykres FVS510 (barwienie żywotności) (oś x) i FSC-A (oś y). Martwe komórki pojawią się jako zdarzenia pozytywne, a więc brama na żywych komórkach.
      UWAGA: Prawdziwie ujemne komórki będą widoczne w niebarwionych kontrolkach. W związku z tym należy dostosować tę bramkę dla każdego zestawu próbek podczas uruchamiania niebarwionych kontrolek przed barwionymi próbkami. Dalsze bramkowanie zależy od panelu przeciwciał i typu badanej komórki. Strategie bramkowania dla każdego panelu używanego w tym protokole można znaleźć odpowiednio w Rysunek 1 i Rysunek 4.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Reprezentatywne wyniki zarówno z panelu podzbioru monocytów, jak i panelu podzbioru limfocytów T są opisane poniżej.

Rysunek 1 ilustruje hierarchiczną strategię bramkowania dla panelu podzbioru monocytów na komórkach odpornościowych pobranych ze szpiku kostnego zwierząt leczonych DMM. Ta sama strategia została zastosowana i zweryfikowana we wszystkich innych typach tkanek. Podczas przygotowywania eksperymentu określono napięcie obszaru rozproszenia do przodu (FSC-...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metody opisane w tym protokole zostały zaprojektowane i przetestowane w celu wiarygodnej identyfikacji różnych podzbiorów zarówno monocytów/makrofagów, jak i limfocytów T w mysiej śledzionie, szpiku kostnym, węzłach chłonnych i tkance maziowej w mysim modelu choroby zwyrodnieniowej stawów (OA). Obecny protokół może być łatwo zmodyfikowany w celu zbadania różnych typów tkanek lub innych typów komórek poprzez wymianę przeciwciał i może być stosowany w alternatywnych mysich modelach choroby zwyrodnieniowej stawów. Podczas t...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować Andrew Lim, Ph.D. i Gilesowi Bestowi, Ph.D. za ich pomoc w ustawieniu cytometru przepływowego. Projekt ten został wsparty przez Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) (DFG-HA 8481/1-1) przyznany PH.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
APC Anti-Mouse CD194 (CCR4)BioLegend131212T-Cell Panel
Brilliant Stain Buffer Plus 1000TstBD566385Buffers
Fixable Viability Stain 510, 100 µ gBD564406Panel T-Cell
Naprawialna bejca żywotności 510, 100 i mikro; gBD564406Panel monocytów
Liberaza, klasa badawczaEnzym Roche5401127001do tkanki maziowej
Ms CD11b APC-R700 M1/70, 100 i mikro; gPanel monocytowyBD564985
Ms CD11C PE-CF594 HL3, 100 & mikro; gPanel monocytowyBD562454
Ms CD183 BB700 CXCR3-173, 50 µ gPanel742274 T-cell
BD Ms CD206 Alexa 647 MR5D3, 25 i mikro; gBD565250Panel monocytowy
Ms CD25 BV605 PC61, 50 i mikro; gPanel563061 T-cell
BD Ms CD3e APC-CY7 145-2C11, 100 i mikro; gPanel komórek557596
BD Ms CD4 PE-Cy7 RM4-5, 100 i mikro; gPanel552775 T-cell
BD Ms CD44 APC-R700 IM7, 50 i mikro; gBD565480Panel T-Cell
Ms CD62L BB515 MEL-14, 100 i mikro; gPanel565261 T-Cell
BD Ms CD69 BV711 H1.2F3, 50 i mikro; gPanel740664T-cell
BD Ms CD80 BV650 16-10A1, 50 i mikro; gPanel monocytowyBD563687
Ms CD8a BV786 53-6.7, 50 µ gPanel T-cell563332
BD Ms F4/80 BV421 T45-2342, 50 µ gPanel monocytowyBD 565411
Ms Foxp3 PE MF23, 100 &mikro; gPanel T-Cell560408
BD Ms I-A I-E BV711 M5/114.15.2, 50 µ gPanel monocytowyBD563414
Ms Ly-6C PE-Cy7 AL-21, 50 µ gPanel monocytowyBD560593
Ms Ly-6G APC-CY7 1A8, 50 i mikro; gBD560600Panel monocytowy
Ms NK1.1 BV650 PK136, 50 µ gPanel komórek564143
BD Ms ROR Gamma T BV421 Q31-378, 50 i mikro; gBD562894Panel komórek T
Bufor lizujący czerwone krwinki
Zestaw czynnika transkrypcyjnego 100TstBD562574
T T Brak

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Blaker, C. L., Clarke, E. C., Little, C. B. Using mouse models to investigate the pathophysiology, treatment, and prevention of post-traumatic osteoarthritis. Journal of Orthopaedic Research. 35 (3), 424-439 (2016).
  2. Li, Y. S., Luo, W., Zhu, S. A., Lei, G. H. T Cells in Osteoarthritis: Alterations and Beyond. Frontiers in Immunology. 8, 356(2017).
  3. Woolf, A. D., Pfleger, B. Burden of major musculoskeletal conditions. Bull World Health Organ. 81 (9), 646-656 (2003).
  4. Little, C. B., Hunter, D. J. Post-traumatic osteoarthritis: from mouse models to clinical trials. Nature Reviews Rheumatology. 9 (8), 485-497 (2013).
  5. Riordan, E. A., Little, C., Hunter, D. Pathogenesis of post-traumatic OA with a view to intervention. Best Practice & Research: Clinical Rheumatology. 28 (1), 17-30 (2014).
  6. Muthuri, S. G., McWilliams, D. F., Doherty, M., Zhang, W. History of knee injuries and knee osteoarthritis: a meta-analysis of observational studies. Osteoarthritis and Cartilage. 19 (11), 1286-1293 (2011).
  7. Leheita, O., Abed Elrazek, N. Y., Younes, S., Mahmoud, A. Z. Lymphocytes subsets in osteoarthritis versus rheumatoid arthritis. Egyptian Journal of Immunology. 12 (2), 113-124 (2005).
  8. Yamada, H., et al. Preferential accumulation of activated Th1 cells not only in rheumatoid arthritis but also in osteoarthritis joints. Journal of Rheumatology. 38 (8), 1569-1575 (2011).
  9. Sakkas, L. I., et al. T cells and T-cell cytokine transcripts in the synovial membrane in patients with osteoarthritis. Clinics and Diagnostics Laboratory Immunology. 5 (4), 430-437 (1998).
  10. Guo, S. Y., et al. Correlation of CD(4)(+) CD(2)(5)(+) Foxp(3)(+) Treg with the recovery of joint function after total knee replacement in rats with osteoarthritis. Genetics and Molecular Research. 14 (4), 7290-7296 (2015).
  11. Moradi, B., et al. CD4(+)CD25(+)/highCD127low/(-) regulatory T cells are enriched in rheumatoid arthritis and osteoarthritis joints--analysis of frequency and phenotype in synovial membrane, synovial fluid and peripheral blood. Arthritis Research & Therapy. 16 (2), 97(2014).
  12. Saito, I., Koshino, T., Nakashima, K., Uesugi, M., Saito, T. Increased cellular infiltrate in inflammatory synovia of osteoarthritic knees. Osteoarthritis and Cartilage. 10 (2), 156-162 (2002).
  13. Zhang, H., et al. Synovial macrophage M1 polarisation exacerbates experimental osteoarthritis partially through R-spondin-2. Annals of the Rheumatic Diseases. 77 (10), 1524-1534 (2018).
  14. Culemann, S., et al. Locally renewing resident synovial macrophages provide a protective barrier for the joint. Nature. 572, 670-675 (2019).
  15. Mocellin, S., et al. Use of quantitative real-time PCR to determine immune cell density and cytokine gene profile in the tumor microenvironment. Journal of Immunological Methods. 280 (1-2), 1-11 (2003).
  16. Ward, J. M., et al. Immunohistochemical markers for the rodent immune system. Toxicologic Pathology. 34 (5), 616-630 (2006).
  17. Blaker, C. L., Clarke, E. C., Little, C. B. Using mouse models to investigate the pathophysiology, treatment, and prevention of post-traumatic osteoarthritis. Journal of Orthopaedic Research. 35 (3), 424-439 (2017).
  18. Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse. Osteoarthritis and Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).
  19. Laroumanie, F., Dale, B. L., Saleh, M. A., Madhur, M. S. Intracellular Staining and Flow Cytometry to Identify Lymphocyte Subsets within Murine Aorta, Kidney and Lymph Nodes in a Model of Hypertension. Journal of Visualized Experiments. (119), e55266(2017).
  20. Yu, Y. R., et al. A Protocol for the Comprehensive Flow Cytometric Analysis of Immune Cells in Normal and Inflamed Murine Non-Lymphoid Tissues. PLoS One. 11 (3), 0150606(2016).
  21. Lorenz, J., Grassel, S. Experimental osteoarthritis models in mice. Methods in Molecular Biology. 1194, 401-419 (2014).
  22. Christiansen, B. A., et al. Non-invasive mouse models of post-traumatic osteoarthritis. Osteoarthritis and Cartilage. 23 (10), 1627-1638 (2015).
  23. Shi, J., et al. Distribution and alteration of lymphatic vessels in knee joints of normal and osteoarthritic mice. Arthritis & Rheumatology. 66 (3), 657-666 (2014).
  24. Harrell, M. I., Iritani, B. M., Ruddell, A. Lymph node mapping in the mouse. Journal of Immunological Methods. 332 (1-2), 170-174 (2008).
  25. Zhao, J., et al. A protocol for the culture and isolation of murine synovial fibroblasts. Biomedical Reports. 5 (2), 171-175 (2016).
  26. Belluzzi, E., et al. Contribution of Infrapatellar Fat Pad and Synovial Membrane to Knee Osteoarthritis Pain. BioMed Research International. 2019, 18(2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Jednokom rkowa zawiesinabarwienie zewn trzkom rkowebarwienie wewn trzkom rkowe

Powiązane artykuły